CN104083904A - 功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱及其制备方法，固相萃取柱的基质为功能化的多孔硫化锌纳米微球，是由原始多孔硫化锌纳米微球经胺基化、羧基化共价化学修饰所得。该功能化多孔硫化锌纳米微球的填装高度为(0.6～1.2)cm。主要适于植物提取液、中药复方及生物样品中生物碱的富集和分离。本发明固相萃取柱具有对目标物质回收率高(92％-105％)，制备成本低，材料易得，功能化过程简单，适应性强，易于批量生产的特点，具有很好的应用前景。

Description

功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱及其制备方法

技术领域

本发明属于分析化学的样品前处理技术领域，涉及一种功能化多孔硫化锌纳米微球的固相萃取柱及制备方法，主要用于植物提取液、中药复方及生物样品中生物碱的富集和分离。

背景技术

植物提取液、各种中药复方及生物样品中基质一般具有复杂性和多样性，目标物的浓度通常情况下比较低，使精确分析复杂样品中的微量物质变得非常难。为了得到满意的分析测试结果，对样品进行预富集与净化是至关重要的。目前对样品前处理技术的研究也比较多，主要集中在固相萃取，液相萃取，超临界流体萃取，超滤离心和微波萃取等。其中固相萃取技术由于操作简单、快速、使用有机溶剂少、成本低、对环境的二次污染少等优点，已经成为目前植物提取液、中药复方及生物样品中生物碱预处理和富集的主要技术手段。

固相萃取根据吸附剂的不同可分为反相固相萃取、正相固相萃取、离子交换固相萃取和吸附固相萃取四种，需要根据所检测的物质的性质来选择不同吸附剂的固相萃取柱。固相萃取法，是主要通过固相填料对样品组分的选择性吸附及解吸过程，对样品的分离、纯化和富集，其主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。[参见：(a)Stevenson and D.Trends，Anal.Chem.1999，18，154-158.(b)Landis，M.S.J.Pharm.Biomed.Anal.2007，44，1029-1039.]

固相萃取的性能通常与其填料的特性紧密相关。C18键合硅胶发展较早，其普适性较强，对大多数化合物有比较好的富集，应用比较广泛。近年来，具有高度选择性的固相萃取填料的研究引起广泛的兴趣，怎样从复杂基体中获取较为纯净的对像分析物成为关注的焦点。与此相应的出现了建立在高选择性基础上的填料，免疫亲和吸附剂、分子印迹吸附剂等选择性填料相继被开发与应用。他们在应用中表现出了高的选择性，但同时也存在一定的缺陷，对于免疫型填料，纯度较高的抗体获取难，价格也比较昂贵，而且目前针对小分子化合物的抗体缺乏；对于分子印迹型填料，其合成与制备过程较长，操作繁琐，不易得到特异作用位点含量高的聚合物，在水溶液中选择性较差，传质慢。[参见：王洪允，江骥，胡蓓，等.固相萃取技术进展及在生物药物分析中的应用[J].药物分析杂志，2003，23(3)，236.]

硫化锌纳米微球由于在光电转换、生物传感和光催化领域卓越的表现而备受关注，特别是多孔硫化锌纳米微球，由于具有孔道结构而使得具有较大的比表面积，它还具有较强的机械性能和良好的生物相容性[参见：(a)D.Zhu，W.Li，H.-Mei Wen，J-R.Zhangand J-Jie Zhu.Anal.Methods，2013，5，4321.(b)P.Wu，Y.He，H.-F.Wang and X.-P.Yan，Anal.Chem.，2010，82，1427.(c)R.M.Xing and S.H.Liu，Nanoscale，2012，4，3135.(d)S.KLi，Z.G Wu，W.H Li，Y.Liu，R.F.Zhuo，D.Yan，W.Juna and P.X Yan Cryst.Eng.Comm，2013，15，1571.]。但目前为止，将多孔硫化锌纳米微球作为固相萃取剂应用于植物提取液、各种中药及生物样品中生物碱的富集、分离，未见报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于功能化多孔硫化锌纳米微球的固相萃取柱及其制备方法，能够用于富集和分离植物提取液、中药复方样品中的生物碱。

采用的技术方案：

一种功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱，所述的固相萃取柱的基质为功能化的多孔硫化锌纳米微球，多孔硫化锌纳米微球直径为50～150nm，平均孔径为4～5nm，固相萃取柱空管容积为1～6mL，填装高度为0.6～1.2cm，空管材质为聚烯烃。

制备所述的功能化多孔硫化锌纳米微球的方法，由原始多孔硫化锌纳米微球经胺基化、羧基化共价化学修饰所得，共价化学修饰按以下步骤进行：

(1)胺基化：在无水乙醇溶剂中加入多孔硫化锌纳米微球和β-巯基乙胺，多孔硫化锌纳米微球与β-巯基乙胺的质量比为2∶1～1∶5，多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N₂半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应10～24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的多孔硫化锌纳米微球；

(2)羧基化：在二甲基甲酰胺溶剂中加入胺基化的多孔硫化锌纳米微球和平均分子量为2000～4000的聚丙烯酸，胺基化的多孔硫化锌纳米微球和聚丙烯酸的质量比为1∶1～4∶1，胺基化的多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N₂半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于100～180℃条件下反应0.5～2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得最终功能化多孔硫化锌纳米微球。

所述的一种功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱，制备方法为：

(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；

(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化多孔硫化锌纳米微球干法填装入柱内；

(3)在填装的功能化多孔硫化锌纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.6～1.2cm，制备得到固相萃取柱。

所述功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱用于固相萃取的方法步骤包括：在进行萃取之前，首先用(5～20)mL甲醇、乙睛或者相应的缓冲溶液活化功能化多孔硫化锌纳米微球，然后在真空泵负压驱动下使样品溶液流过柱子，采用适量体积清洗液洗去基体的杂质，使用合适的洗脱液把分析物洗脱收集到容器中，然后进行定量分析。

与现有的固相萃取柱相比，本发明所提供的功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱具有以下优点：

(1)萃取剂用量少，萃取效率高：目前普遍使用的C18键合硅胶，其吸附性能较差，萃取容量较低；而本发明的固相萃取剂由于具有多孔结构，具有比较大的比表面积和强的吸附能力，萃取容量和吸附性能得到了很大提升；

(2)环境友好：本发明的多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱本身是环境友好的，并且在萃取过程中，只需消耗极少量的有机溶剂，不会引入其他有毒有害物质；

(3)稳定性好，可再生和重复利用。吸附在多孔硫化锌纳米微球上的目标物能容易地用少量有机溶剂洗脱下来，键合的官能团不会被破坏，可以重复利用。

(4)本发明提供一种能够将多种化学官能团键合到多孔硫化锌纳米微球孔道表面，制备出一种新型固相萃取剂。它可以用于植物提取液、中药复方样品中的生物碱的选择性富集，也可用于生物样品中的药物分子的预富集，并表现出大的穿透体积，样品承受量高，选择性好，可再生重复利用的特点。

(5)在完成发明的过程中，选择苦参碱和小檗碱作为研究目标物，对所述固相萃取柱的各项性能指标进行了反复测试。结果表明对于上述生物碱的加标回收率均能达到92％-105％，解吸过程简单，2mL的乙腈或者其盐溶液就可将上述物质洗脱下来，实验结束后，将固相萃取柱用乙腈、甲醇各5mL依次洗涤，无需其他操作，即可重复使用。

附图说明

图1为功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱示意图，图中为：固相萃取柱管1、上筛板2、下筛板3、多孔硫化锌纳米微球填料4；

图2为合成得到的多孔硫化锌纳米微球透射电镜图A(TEM)和高分辨透射电镜图B(HRTEM)；

图3为合成得到的多孔硫化锌纳米微球N₂吸附-脱附曲线(BET)图；

图4为功能化多孔硫化锌纳米微球红外光谱图；

图5为本发明的固相萃取柱萃取的苦参碱和小檗碱的色谱图；

图6为苦参碱和小檗碱的标准色谱图。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。

实施例1：功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取填料的制备

实验材料：六水硝酸锌，批号为：B1224002，购自上海阿拉丁试剂有限公司；阿拉伯胶粉，批号为20120825，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硫代乙酰胺，批号为：20010619，购自上海阿拉丁试剂有限公司；β-巯基乙胺，批号为：11325054，购自上海阿拉丁试剂有限公司；二甲基甲酰胺，批号为：F20061110，购自南京化学试剂有限公司；聚丙烯酸，批号为：J1225008，购自南京化学试剂有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。

实验仪器及设备：圆底烧瓶、KQ-500DE超声波清洗器、聚四氟乙烯反应釜、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、DF-101S磁力加热搅拌器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。

实验过程：

(1)原始多孔硫化锌纳米微球的制备

将1.2g六水硝酸锌与400mg的阿拉伯胶粉加入80mL水中溶解，超声波分散混匀，得到澄清溶液，再加入300mg的硫代乙酰胺混合均匀，将所得溶液放入高压釜的反应瓶中，于125℃条件下反应12h，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，洗涤3次，之后沉淀40℃下真空干燥，即得多孔硫化锌纳米微球。将所得产品进行电子透射显微镜进行表征，如图2所示。

(2)功能化多孔硫化锌纳米微球的制备

取上述所得产品200mg于圆底烧瓶中同时加入磁力搅拌子，加入无水乙醇40mL，通半小时N₂以排出空气，之后加入200mgβ-巯基乙胺，再通N₂半个小时，通完氮气加塞密封好之后在磁力搅拌器中水浴40℃条件下反应24小时，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的多孔硫化锌纳米微球；然后取100mg上述所得产品分散在40mL的二甲基甲酰胺中，加入50mg的聚丙烯酸(平均分子量为3000)，混合后通N₂半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于140℃条件下反应2小时，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化多孔硫化锌纳米微球。将所得产品进行BET测试，如图3所示，将所得产品进行红外表征，如图4所示。其图3、图4中PZNs指原始多孔硫化锌纳米微球，NH₂-PZNs指胺基化多孔硫化锌纳米微球，PAA-PZNs指羧基化多孔硫化锌纳米微球即最终功能化多孔硫化锌纳米微球填料。

实施例2：功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱的制备

A.萃取柱的准备

1、空柱材料和规格

现有的固相萃取小柱空柱规格从1～6mL不等。空柱材料为聚丙烯，小柱上下各有20μm孔径的聚乙烯筛板，上述空柱均可使用于本发明中。在下面的实验例中本发明采用3mL的规格。

2、固相萃取柱的填料

固相萃取柱的填料为功能化多孔硫化锌纳米微球，其直径为50～150nm，平均孔径4～5nm。

3、填装量和填装高度的选择

用前述A准备的材料填装3mL固相萃取柱，如附图1，将一片多孔性聚乙烯下筛板3置于固相萃取柱管1底部，称取相当于固相萃取柱空管容积二分之一的功能化多孔硫化锌纳米微球填料4放入固相萃取柱管1中，然后将多孔性上筛板2放在填料上部，压紧填料使填装柱高度保持在0.8cm，得到功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱。

实施例3：选择苦参碱和小檗碱作为研究目标物，对所述固相萃取柱的各项性能指标进行测试。

实验材料：苦参碱和小檗碱均购自中国食品药品检定研究院，苦参碱批号为110805-200508，小檗碱批号为110713-201212；乙酸铵购自上海上海阿拉丁试剂有限公司，批号为：20070622；高效液相色谱纯乙腈购自Merck公司，批号：1605030-138。

实验仪器和设备：Waters公司2695/2996高效液相色谱仪、AP-01P真空泵、按述实施例2中制备的功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱。

实验过程：

(1)取苦参碱和小檗碱分别配成0.1μg/mL的标准溶液备用。先将制得的功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱用4mL乙腈完全浸润填料保持5min，然后以1滴/s的速度放掉液体，处理完后小柱处于活化状态；搭好装置，开真空泵，调好真空度，以2mL/min的速度取(20～100)mL样品流过萃取柱，抽滤除去溶剂成分，再用2.5mg/mL的乙酸铵-80％乙腈4mL洗脱固相萃取柱，可以得到不同富集倍数的洗脱液，用高效液相色谱仪进行分析检测，得到色谱图如图5及图6。

高效液相色谱法测定条件如下：

苦参碱：Waters公司2695/2996高效液相色谱仪，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈/水(80∶20)，流速：1.000mL/min，柱温：25℃，紫外检测波长为210nm。

小檗碱：Waters公司2695/2996高效液相色谱仪，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈/0.2％磷酸水(30∶70)，流速：1.000mL/min，柱温：25℃，紫外检测波长为270nm。

结果表明对于上述生物碱的加标回收率均能达到92％-105％，解吸过程简单，2mL的乙腈或者其盐溶液就可将上述物质洗脱下来，实验结束后，将固相萃取柱用乙腈、甲醇各5mL依次洗涤，无需其他操作，即可重复使用。

以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (3)

1.一种功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱，其特征在于所述的固相萃取柱的基质为功能化的多孔硫化锌纳米微球，多孔硫化锌纳米微球直径为50～150nm，平均孔径为4～5nm，固相萃取柱空管容积为1～6mL，填装高度为0.6～1.2cm，空管材质为聚烯烃。

2.一种制备权利要求1所述的功能化多孔硫化锌纳米微球的方法，其特征在于由原始多孔硫化锌纳米微球经胺基化、羧基化共价化学修饰所得，共价化学修饰按以下步骤进行：

(1)胺基化：在无水乙醇溶剂中加入多孔硫化锌纳米微球和β-巯基乙胺，多孔硫化锌纳米微球与β-巯基乙胺的质量比为2∶1～1∶5，多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N₂半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应10～24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的多孔硫化锌纳米微球；

(2)羧基化：在二甲基甲酰胺溶剂中加入胺基化的多孔硫化锌纳米微球和平均分子量为2000～4000的聚丙烯酸，胺基化的多孔硫化锌纳米微球和聚丙烯酸的质量比为1∶1～4∶1，胺基化的多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N₂半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于100～180℃条件下反应0.5～2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得最终功能化多孔硫化锌纳米微球。

3.如权利要求1所述的一种功能化多孔硫化锌纳米微球固相萃取柱，其特征在于制备方法为：

(1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5～20μm；

(2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化多孔硫化锌纳米微球干法填装入柱内；

(3)在填装的功能化多孔硫化锌纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5～20μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.6～1.2cm，制备得到固相萃取柱。