CN108344872A - 一种基于荧光法的甲胎蛋白检测试剂盒及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种基于荧光CdTe量子点复合多孔ZnS纳米微球(ZnS‑CdTe)的甲胎蛋白检测试剂盒及其制备，从而实现对癌症肿瘤疾病的早期诊断。本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可用于检测血清或血浆中甲胎蛋白含量，适用于带有荧光功能的多功能酶标仪，本发明试剂盒检测甲胎蛋白的灵敏度可以达到0.02ng/mL，检测线性范围达0.1‑100ng/mL，具有很好的应用前景。

Description

一种基于荧光法的甲胎蛋白检测试剂盒及其制备
技术领域
本发明属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种基于荧光CdTe量子点复合多孔ZnS纳米微球(ZnS-CdTe)的甲胎蛋白检测试剂盒及其制备，从而实现对癌症肿瘤疾病的早期诊断。
背景技术
1944年已有人对甲胎蛋白的存在进行过研究，但直到1965年美国科学家Bergstyandh和Zar才观察到2例原发性肝癌患者血清能与抗胎儿血清的单价抗血清起反应，说明原发性肝癌患者血清中与人类胎儿血清中有一共同的特殊成分，并将这种特殊的蛋白成分称为甲种胎儿球蛋白(a-fetoprotein，AFP)。甲胎蛋白是一种致癌糖蛋白，作为一种成人生理状态的“分子标记”，并经常用作诊断肝细胞癌、卵黄囊肿瘤、生殖细胞肿瘤、胃癌的合适的“生物标志物”。
过去的几十年里，许多AFP检测技术建立了起来，目前检测AFP的方法主要有放射免疫分析法和酶联免疫法(ELISA)，各有优缺点，适用范围上也各有不同。ELISA法的灵敏度较低，而且耗力耗时，操作复杂，已经很难满足快速定量检测的要求。放射免疫分析法有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速、不能灭活降解酶、盐及pH有时会影响结果等缺点。
基于ZnS-CdTe纳米微球荧光法的基本原理是，首先将捕获抗体(抗体1)吸附在96孔板上，然后捕获检测目标抗原-甲胎蛋白，标记有ZnS-CdTe纳米微球的检测抗体与目标抗原相遇时，抗原抗体结合而使得ZnS-CdTe纳米微球聚集在96孔板内，通过荧光强度检测其抗原-甲胎蛋白的浓度。
本发明研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，单纯的CdTe量子点粒径小、联接的抗体有限，无法满足临床中对灵敏度小于1ng/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间10-30min)，无法达到快速检验的要求。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种基于荧光ZnS-CdTe纳米微球的甲胎蛋白检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。
采用的技术方案：
一种基于荧光CdTe量子点复合多孔ZnS纳米微球(ZnS-CdTe)的甲胎蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了甲胎蛋白抗体的ZnS-CdTe纳米颗粒的溶液，所述ZnS纳米颗粒的粒径为50～200nm，所述CdTe量子点颗粒的粒径为5～10nm，所述ZnS-CdTe纳米颗粒和抗体质量比在100∶(10～60)。所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.1～0.3％的聚乙二醇(PEG8000)，稳定剂为重量体积比为0.2～1％的牛血清白蛋白(BSA)，蔗糖的重量体积比为5～10％，甘油的重量体积比为5～10％。
更进一步地，所述荧光CdTe量子点复合多孔ZnS纳米微球(ZnS-CdTe)的甲胎蛋白检测试剂盒还包括起缓冲、稳定、捕获目标抗原-甲胎蛋白作用的试剂R1，所述试剂R1为含有体积比1-8μg/mL的捕获抗体、重量体积比0.1％的NaN3和重量体积比0.05％Tween20的，pH9.6的碳酸钠盐缓冲液。在本发明的试剂盒中，发明创新点主要在试剂R2，试剂R1也可以使用现有酶联免疫法(ELISA)的试剂R1。
上述试剂R2通过如下方法制备：
(1)制备ZnS-CdTe纳米颗粒：
a.多孔硫化锌纳米微球制备；
b.硫化锌纳米微球的巯基化：在无水乙醇溶剂中加入多孔硫化锌纳米微球和DL-二硫苏糖醇，多孔硫化锌纳米微球与DL-二硫苏糖醇的质量比为2∶1～1∶5，多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应10～24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的巯基化的多孔硫化锌纳米微球；
c.CdTe量子点在多孔ZnS纳米微球表面原位合成：20～100mg的巯基化的硫化锌纳米微球分散于20～100mL水中，随后加入2～10mL的0.04M的CdCl2和150～250mg的柠檬酸三钠，混合后在搅拌、通氮气条件下于10～40℃反应10～24小时，使得Cd2+尽可能吸附在ZnS纳米微球表面。随后，加入2～6mL0.01M的Na2TeO3、20～70mg的琥珀酸、20～70mg的NaBH4，强力搅拌。当溶液颜色转变为绿色时，在氮气保护下温度升高到100℃，然后反应4～24h。反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的表面具有COOH的ZnS-CdTe纳米微球；
(2)将抗体偶联到ZnS-CdTe纳米颗粒：
a.0.2～1ml浓度为0.5～5mg/ml上述羧基化的ZnS-CdTe纳米颗粒溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将100～250μL的抗体溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心。
b.偶联抗体的纳米ZnS-CdTe颗粒溶液中加入稳定剂。在上述偶联后的ZnS-CdTe纳米颗粒中加入重量体积比5～10％蔗糖、重量体积比0.1～0.3％PEG 8000、重量体积比0.2～1％牛血清白蛋白BSA和重量体积比5～10％甘油的pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬。
c.抗体的活性容易受到蛋白酶的分解、高温变性、渗透压等影响，可加入稳定剂来稳定抗体的结构和活性。所述稳定剂可以是蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；其中，所述蛋白质是优选牛血清白蛋白(BSA)或明胶；所述糖可以是单糖、二糖或者多糖，其中，单糖优选甘露糖、半乳糖、葡萄糖；二糖优选乳糖、蔗糖；多糖优选海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种；所述无机盐优选卤素碱金属和碱土金属的无机盐，更优选氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。
(3)本发明所提供试剂盒中R2可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、TriS缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种缓冲液体系；优选磷酸盐缓冲液体系。
与现有的标准分析方法ELISA法以及相继发展的荧光法、电化学发光法等相比，本发明所提供的基于ZnS-CdTe纳米微球荧光法具有以下优点：
(1)、本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可用于检测血清或血浆中甲胎蛋白含量，适用于带有荧光功能的多功能酶标仪，本发明试剂盒检测甲胎蛋白的灵敏度可以达到0.02ng/mL，检测线性范围达0.1-100ng/mL。
(2)、本发明的试剂盒采用ZnS-CdTe纳米微球标记抗体，降低了胶体金免疫比浊法以及ELISA的甲胎蛋白检测试剂盒的制造成本，具有较大的市场竞争力。
附图说明
图1为ZnS-CdTe纳米微球的TEM以及STEM-HAADF images and EDS-elementalmapping图；
图2为ZnS-CdTe纳米微球的激发荧光光谱-发射荧光光谱图；
图3为基于ZnS-CdTe纳米微球对甲胎蛋白检测结果-荧光光谱图；
图4为基于ZnS-CdTe纳米微球对甲胎蛋白检测结果-线性关系图；
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：荧光ZnS-CdTe纳米微球的制备
实验材料：六水硝酸锌，批号为：B1224002，购自上海阿拉丁试剂有限公司；阿拉伯胶粉，批号为20120825，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硫代乙酰胺，批号为：20010619，购自上海阿拉丁试剂有限公司；β-巯基乙胺，批号为：11325054，购自上海阿拉丁试剂有限公司；二甲基甲酰胺，批号为：F20061110，购自南京化学试剂有限公司；聚丙烯酸，批号为：J1225008，购自南京化学试剂有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。DL-二硫代苏糖醇，批号为MFCD00004877，购自上海生工试剂有限公司。
实验仪器及设备：圆底烧瓶、KQ-500DE超声波清洗器、聚四氟乙烯反应釜、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、DF-101S磁力加热搅拌器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：
(1)原始多孔硫化锌纳米微球的制备
将1.2g六水硝酸锌与400mg的阿拉伯胶粉加入80mL水中溶解，超声波分散混匀，得到澄清溶液，再加入300mg的硫代乙酰胺混合均匀，将所得溶液放入高压釜的反应瓶中，于125℃条件下反应12h，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，洗涤3次，之后沉淀40℃下真空干燥，即得多孔硫化锌纳米微球。
(2)硫化锌纳米微球的巯基官能团化
在100mL无水乙醇溶剂中加入多孔硫化锌纳米微球和DL-二硫苏糖醇，多孔硫化锌纳米微球与DL-二硫苏糖醇的质量比为2∶1，多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为5mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于室温条件下反应24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的巯基化的多孔硫化锌纳米微球。
(3)CdTe量子点在多孔ZnS纳米微球表面原位合成
50mg的巯基化的硫化锌纳米微球分散于80mL去离子水中，随后加入5mL的0.04M的CdCl2和200mg的柠檬酸三钠，混合后在搅拌、通氮气条件下于30℃反应24小时，使得Cd2+尽可能吸附在ZnS纳米微球表面。随后，加入3mL0.01M的Na2TeO3、40mg的琥珀酸、40mg的NaBH4，强力搅拌。当溶液颜色转变为绿色时，在氮气保护下温度升高到100℃，然后反应12h。反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的表面具有COOH的ZnS-CdTe纳米微球。制得的荧光ZnS-CdTe纳米微球进行透射电镜(TEM)、元素分布以及荧光光谱表征。如图1，图2所示。
实施例2：将抗体偶联到ZnS-CdTe纳米颗粒
实验材料：牛血清白蛋白，批号为140318，上海阿拉丁试剂有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，批号090M14531V，上海阿拉丁试剂有限公司；琥珀酰亚胺(NHS)，批号MKBG7914V，上海阿拉丁试剂有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
0.5ml浓度为2mg/ml羧基化的ZnS-CdTe纳米颗粒溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2mg及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将200μL的甲胎蛋白抗体溶液加入上述溶液中，在室温下反应24小时。反应完毕后，超滤离心，产物保存在含有0.5％牛血清蛋白BSA缓冲液中(pH7.4)。
实施例3：试剂盒中R2试剂的配置
实验材料：PEG 8000，批号为MFCD00081839，上海生工生物试剂有限公司；甘油，批号为MFCD00004722，上海生工生物试剂有限公司。
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
将偶联甲胎蛋白抗体的纳米ZnS-CdTe颗粒溶液中加入稳定剂。在上述偶联后的ZnS-CdTe纳米颗粒溶液中加入重量体积比10％蔗糖、重量体积比0.2％PEG 8000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油的pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬，搅拌10分钟，得到R2试剂，分装备用。
实施例4：基于ZnS-CdTe纳米微球的荧光法甲胎蛋白检测试剂盒的使用测定。
实验材料：甲胎蛋白抗体1，货号为D220050-0025，上海生工生物试剂有限公司；96孔板，货号为F605034-0001，黑色，上海生工生物试剂有限公司。
实验仪器及设备：移液枪，20～200μL，货号为F519603-0001，上海生工生物试剂有限公司；带有荧光功能的多功能酶标仪，Spark 10M，Tecan公司，激发波长：400nm，发射波长：650nm。
测定步骤：先用碳酸钠缓冲液(100mM，pH9.6)稀释抗-AFP(Ab1)为4μg/mL，在黑色96孔板孔中加入抗-AFP抗体(Ab1)100μL，4℃过夜。用Ph7.4PBS缓冲液洗涤5次后用200μL1％BSA溶液反应2小时以封闭活性点。然后用PBS缓冲液洗涤5次后，然后加入100μL样本溶液，96孔板在37℃下孵育反应1小时，用PBS缓冲液洗涤5次后，加入100μL的试剂R2，在37℃下孵育反应40分钟，用PBS缓冲溶液洗涤。用带有荧光功能的多功能读板仪测定，激发波长：400nm，发射波长：650nm。
计算方法：6点定标法，以样品函数为计算模式，根据荧光强度与参考血清的值做工作曲线，样品含量可根据其荧光强度值在工作曲线上算出。甲胎蛋白检测结果-荧光光谱图如图3，标准曲线如图4所示。
实施例5：基于荧光ZnS-CdTe纳米微球的甲胎蛋白检测试剂盒的灵敏度测定
实验材料：甲胎蛋白抗体1，货号为D220050-0025，上海生工生物试剂有限公司；96孔板，货号为F605034-0001，黑色，上海生工生物试剂有限公司。
实验仪器及设备：移液枪，20～200μL，货号为F519603-0001，上海生工生物试剂有限公司；带有荧光功能的多功能酶标仪，Spark 10M，Tecan公司，激发波长：400nm，发射波长：650nm。
测定步骤：先用碳酸钠缓冲液(100mM，pH9.6)稀释抗-AFP(Ab1)为4μg/mL，在黑色96孔板孔中加入抗-AFP抗体(Ab1)100μL，4℃过夜。用Ph7.4PBS缓冲液洗涤5次后用200μL1％BSA溶液反应2小时以封闭活性点。然后用PBS缓冲液洗涤5次后，然后加入100μL样本溶液，96孔板在37℃下孵育反应1小时，用PBS缓冲液洗涤5次后，加入100μL的试剂R2，在37℃下孵育反应40分钟，用PBS缓冲溶液洗涤。用带有荧光功能的多功能读板仪测定，激发波长：400nm，发射波长：650nm。
计算方法：6点定标法，以样品函数为计算模式，根据荧光强度与参考血清的值做工作曲线，样品含量可根据其荧光强度值在工作曲线上算出。以3倍空白标准偏差计算灵敏度，最佳灵敏度达0.02ng/mL，检测线性范围达0.1-100ng/mL。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (2)

1.一种甲胎蛋白检测试剂盒，所述试剂盒基于荧光CdTe量子点复合多孔ZnS纳米微球(ZnS-CdTe)荧光法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了甲胎蛋白抗体的ZnS-CdTe纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述ZnS纳米颗粒的粒径为50～200nm，所述CdTe量子点颗粒的粒径为5～10nm，所述ZnS-CdTe纳米颗粒和抗体质量比在100∶(10～60)。所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.1～0.3％的聚乙二醇(PEG 8000)，稳定剂为重量体积比为0.2～1％的牛血清白蛋白(BSA)，蔗糖的重量体积比为5～10％，甘油的重量体积比为5～10％。
2.制备权利要求1中所述试剂盒的方法，其特征在于，所述制备方法为：
(1)硫化锌纳米微球的巯基化：在无水乙醇溶剂中加入多孔硫化锌纳米微球和DL-二硫苏糖醇，多孔硫化锌纳米微球与DL-二硫苏糖醇的质量比为2∶1～1∶5，多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为2mg/mL～20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10～40℃条件下反应10～24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的巯基化的多孔硫化锌纳米微球；
(2)CdTe量子点在多孔ZnS纳米微球表面原位合成：20～100mg的巯基化的硫化锌纳米微球分散于20～100mL水中，随后加入2～10mL的0.04M的CdCl2和150～250mg的柠檬酸三钠，混合后在搅拌、通氮气条件下于10～40℃反应10～24小时，使得Cd2+尽可能吸附在ZnS纳米微球表面。随后，加入2～6mL0.01M的Na2TeO3、20～70mg的琥珀酸、20～70mg的NaBH4，强力搅拌。当溶液颜色转变为绿色时，在氮气保护下温度升高到100℃，然后反应4～24h。反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的表面具有COOH的ZnS-CdTe纳米微球；
(3)将抗体偶联到ZnS-CdTe纳米颗粒：0.2～1ml浓度为0.5～5mg/ml上述羧基化的ZnS-CdTe纳米颗粒溶液中添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)2～6mg及1～4mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下振荡60分钟，然后将100～250μL的抗体溶液加入上述溶液中，在室温下反应12～24小时。反应完毕后，超滤离心。
(4)试剂盒中R2试剂的配置：在上述偶联后的ZnS-CdTe纳米颗粒中加入重量体积比5～10％蔗糖、重量体积比0.1～0.3％PEG 8000、重量体积比0.2～1％牛血清白蛋白BSA和重量体积比5～10％甘油的pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬。
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