CN109112197A - 一种直接同时检测α与β地中海贫血的芯片、扩增试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明“用于直接同时检测α‑地中海贫血和β‑地中海贫血突变位点的芯片、扩增试剂及试剂盒”,属于分子诊断技术,其特征在于,基于直接多重PCR、Gap‑PCR和反向点杂交相结合的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针,以生物素标记引物,以氨基标记探针,并以基因芯片为基底,将探针固定在DNA芯片上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交,以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及α与β地中海贫血的分子诊断技术,特别是涉及一种直接PCR(DirectPCR)结合杂交技术同时检测6种α地中海贫血突变和19种点突变β地中海贫血的试剂盒。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia,简称地贫)是全球最常见的遗传病之一,其成因是血红蛋白(hemoglobin,Hb)四聚体组成的珠蛋白链的一条或多条肽链合成的减少或缺失。根据成人主要珠蛋白链(α2β2)所涉及的类型,该病被分为α-地贫和β-地贫。受累个体主要源于地中海地区、中东、外高加索、中亚、印度次大陆、东南亚和东亚,在我国长江以南如广东、广西、海南、台湾等地发病率高,大多以无明显症状的携带者形式广泛存在,受累人口超过2亿。据现有流行病学调查资料显示,以上地区人群中α地贫发生率高达4-15%;β地贫约1-6%。
α-地中海贫血(以下简称α-地贫)是最主要的地贫类型,编码α珠蛋白链的基因是16号染色体短臂末端的α珠蛋白基因簇。由于α-珠蛋白基因缺失或点突变而致α-珠蛋白链合成障碍的疾病,具高度的遗传异质性。就人类正常基因组而言,正常个体每条染色体上均有2个α珠蛋白基因(α2基因和αl基因),所以每个正常人均有4个α基因,一个α基因缺失者,称α地贫(即-α/αα),2个α基因均缺失者,为α0地贫(即--/αα)。根据造成α地贫的分子基础可将α地贫分为缺失型和非缺失型;95%以上为缺失型,是由于α珠蛋白基因大片段缺失所致。目前全球至少发现了35种缺失,,我国最常见的为--SEA、-3.7和-4.2缺失型突变。(2)非缺失型α地贫主要是由α珠蛋白基因点突变所致。目前全球已报道至少有46种的非缺失型α地贫的点突变类型。我国最常见非缺失型α地贫主要是Hb WS,Hb QS与Hb CS等点突变。在α地贫发病率最高的广西有45.8-53.3%的Hb H病患者携带其非缺失型α地贫。这类病人比那些缺失3个α珠蛋白基因所表现出更严重的临床症状。当夫妇双方均为她中海贫血基因缺失携带者时,其后代有25%的机会罹患Hb Bart's或HbH病。HbH病患者中至重度贫血,可丧失劳动力,严重影响生存质量;Hb Bart's水肿胎受累患儿因严重缺氧而胎死腹中或一出生即死亡,引起的产科并发症给产妇带来极大的身心伤害。这些都给家庭和社会造成巨大压力。
β地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一,在我国南方各省区高发,高发区人群基因携带率达到3-9%。β珠蛋白基因簇位于人体11号染色体的短臂上,包括ε、Gr、Ar、δ和β珠蛋白基因及2个假基因,总长度约为50kb;β珠蛋白肽链是由β珠蛋白基因所编码的146个氨基酸组成。β地中海贫血的主要分子病理学基础是β珠蛋白基因的点突变及小的插入或缺失,包括β珠蛋白基因的启动子序列突变或增强子突变都可引起β珠蛋白生成障碍性贫血,导致β珠蛋白基因转录、hnRNA加工或mRNA翻译异常引起,而相对过剩的α珠蛋白肤链的存在是β地中海贫血发生溶血、贫血和无效造血的根本原因。β珠蛋白基因含2个内含子及3个外显子。在其外显子1、外显子2、内含子1及3’端调控区集中了中国人群中发现的大部分突变。目前在全世界己报道约170种左右的β珠蛋白基因的突变类型,我国己发现至少有28种此类突变,最主要的有6种CD41-42,CD17,IVS-2nt654,TATAbox-28,CD71-72及CD26占中国人β地中海贫血突变基因总数的90%以上。β地中海贫血的纯合子或或β0β+的双重杂合子为致死性疾病。
目前地中海贫血仍无较理想的治疗手段,采用基因分析法进行产前诊断,可在妊娠早期对中、重型地中海贫血患儿做出诊断并及时终止妊娠,以避免中、重型地中海贫血患儿出生是目前预防地中海贫血非常有效的方法。
现在对地贫筛查方法如红细胞渗透脆性试验、血常规参数检测分析、血红蛋白电泳试验等特异性不高,较易产生假阴性。对于地中海贫血的分子诊断,PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-ASO)是最早用于检测点突变的一种方法,一次只能检测一种突变,对于多个突变位点的检测操作复杂,成本高而不适合常规检测。近年发展起来的单链构象多肽性分析(PCR-SSCP)、PCR-RFLP连锁分析、热变性高效液相法、等位基因特异性PCR、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、TaqMan探针荧光PCR法与高分辨熔解曲线检测技术(HRM)等,这些方法首先检测费用昂贵,且操作要求费时或不定性。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等,因而不利于临床广泛的推广应用。
采用基因检测方法的地贫检测产品有深圳益生堂的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、亚能生物的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、达安基因的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、潮州凯普的α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)。
并且这些技术均需DNA抽提的操作繁琐复杂、耗时、易交叉污染、实验需要DNA自动提取仪精密仪器和试剂耗材成本昂贵,在临床上无法普遍推广应用。而DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素,并且提取与纯化DNA过程极易污染,使得实验易出现假阴性或者假阳性,极易造成漏检或误检。
另外,这些技术所需样本量多,对于边远地带采集的标本运输必需冷链设备,需三级包装系统,标本储存空间大;生物安全风险系数高。对全血、羊水和DBS直接检测地贫的专利技术尚无,市场上尚无此类产品。
发明内容
根据上述领域存在的缺陷和需求,本发明采用直接PCR(Direct PCR)方法,提供一种直接同时检测6种α地贫突变和19种β地贫突变位点的基因检测试剂盒,本发明的关键构思在于:基于直接多重PCR、Gap-PCR和反向点杂交相结合的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针,以生物素标记引物,以氨基标记探针,并以基因芯片为基底,将探针固定在DNA芯片上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交,以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
本发明的技术方案如下:
一方面提供一种用于直接检测α-地中海贫血和β-地中海贫血突变位点的芯片,其特征在于,所述芯片上固定有:
用于检测三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:26-31所示,
用于检测三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:32-34,
和/或用于检β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:1-25所示。
优选地,所述芯片的基底材料选自:硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜和微缩磁珠组成的组。
在传统等位基因特异寡核苷酸探针点杂交基础上发展起来的PCR-反向点杂交(PCR-Reverse Dot Blot,PCR-RDB)技术,它与传统ASO不同是膜上固定靶DNA被固定探针取代,一次杂交即可对被检DNA的多个突变位点进行筛查,具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点。
另一方面提供3一种用于直接PCR检测缺失α-地中海非贫血基因与β-地中海贫血基因的扩增试剂,其特征在于,包括如下核苷酸序列的引物组:
APF:SEQ ID NO:36;
APR:SEQ ID NO:37;
B1F:SEQ ID NO:38;
B1R:SEQ ID NO:39;
B2F:SEQ ID NO:40;
B2R:SEQ ID NO:41;
所述引物组扩增的特征序列与权利要求1或2所述的基因芯片中的用于检测三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针以及用于检测β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针特异性结合:
所述扩增试剂中加入其它PCR扩增组分,通过一次PCR反应对待测样品或提取自待测样品的DNA直接进行三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS与β-地中海贫血基因的检测;
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃--80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等;
滤纸片是液体标本采集和运输的极好载体。全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑(Dried blood spots,DBS),有很好的生物稳定性和安全性,便于储存和运输。特别是当筛查范围扩大到一些地域偏远、医疗条件相对落后的地区时,应用滤纸干血斑(DBS)对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利。
优选地,用于一个反应的所述扩增试剂中,含有:
组分 | 体积(份体积) |
MightyAmp Taq | 0.1-1 |
2×MightyAmp Buffer | 10 |
HB1F | 0.1-1 |
HB1R | 0.1-1 |
HB2F | 0.1-1 |
HB2R | 0.1-1 |
APF | 0.1-1 |
APR | 0.1-1 |
使用时,添加无菌蒸馏水与待测样品或提取自待测样品的DNA以达到20份体积。
优选地,所述引物组中,各引物摩尔浓度比例为:
引物名称 | 摩尔浓度比例 |
B1F | 0.25 |
B1R | 0.25 |
B2F | 0.5 |
B2R | 0.5 |
APF | 0.35 |
APR | 0.35 |
优选地,
所述用于一个反应的所述PCR扩增试剂中,含有
基于相同的发明构思,本发明还提供一种用于直接PCR检测缺失α-地中海贫血基因的扩增试剂,其特征在于:包括如下核苷酸序列所示的引物组,其扩增的特征序列与权利要求1或2所述的基因芯片中的用于检测三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的特异性寡核苷酸探针特异性结合:
SEAF:SEQ ID NO.42;
SEAR:SEQ ID NO.43;
4.2F:SEQ ID NO.44;
4.2R:SEQ ID NO.45;
3.7F:SEQ ID NO.46;
3.7R:SEQ ID NO.47。
所述扩增试剂中加入其它PCR扩增组分,通过一次PCR反应对待测样品或提取自待测样品的DNA直接进行所述三种缺失α-地中海贫血基因—SEA、-α3.7与-α4.2的检测,所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃--80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等;
优选地,用于一个反应的所述PCR扩增试剂中,含有:
优选地,所述引物组中,各引物摩尔浓度比例为:
引物名称 | 摩尔浓度比例 |
3.7F | 0.4 |
3.7R | 0.4 |
4.2F | 0.3 |
4.2R | 0.3 |
SEA-F | 0.2 |
SEA-R | 0.2 |
优选地,用于一个反应的所述PCR扩增试剂中,含有
使用时,添加无菌蒸馏水与待测样品或提取自待测样品的DNA以达到20份体积。
优选地,上述任一扩增试剂中,所述引物的5′端标记有标记物,用于使扩增的条带带有所述标记物。
基于相同的发明构思,提供一种用于检测α和β地中海贫血基因的试剂盒,其特征在于,包含任一所述的芯片;以及
任一所述的扩增试剂。
本发明还提供上述的芯片的制备方法,步骤如下:
(1)配制探针工作液:将合成好的特异性探针稀释成10μM的工作液,以备点样用;
(2)固定探针:尼龙膜浸泡于10%的EDAC溶液中活化30分钟,纯水洗涤后室温晾干;在活化处理好的尼龙膜上点上所述工作液,每滴0.5μL;点膜结束后,将膜放置于室温进行反应;
(3)制备基因芯片:利用氢氧化钠停止反应,制得基因芯片;
其中,所述特异性探针指用于检测三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:26-31所示,
用于检测三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:32-34,
和/或用于检β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:1-25所示。
本发明所述试剂盒基于Direct PCR的快速检测25种地贫类型,6种α地贫突变和19种β地贫突变位点的基因,包括常见的6种α-地贫,3种α-珠蛋白基因缺失(--SEA、--THAI、-α4.2、-α3.7)和3种非缺失突变型(HbQS、HbWS、Hb CS);19种β-地贫常见的β-珠蛋白基因突变-32(C>A)、-30(T>C)、(-28(A>G)、-29(A>G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T>G)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、βE(G>A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TTCT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G>T)、IVS-I-5(G>C)、IVS-II-654(C>T)、CD37(G>A)、IVS-II-5(G>C))。
采用该试剂盒检测地中海贫血等位基因的方法包括以下步骤:
1)样本采集及PCR模板的制备:a)样本采集:标本来源于抗凝外周血,DBS样本、类似DBS处理的样本、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等;b)PCR模板的制备:上述标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
2)配制反应体系,具体为:
直接将样本(如外周血)或者样本提纯DNA加入PCR反应液、水和配制成反应体系;
3)样本检测:抗凝外周血,DBS样本、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板配制的反应体系与反应条件进行PCR扩增,得到扩增产物。优选的反应体系与反应条件见表1与表2。
4)膜芯片的制作
经活化液预处理尼龙膜30分钟后,激活表面羧基;同时,将自行设计合成的探针(5’或3’端带有氨基标记)用探针稀释液调节到适当的浓度后,按DNA芯片阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上,此时,氨基与活化的羧基发生反应生成稳定的共价键而固定探针在尼龙膜表面;最后,用封闭液处理尼龙膜,封闭未结合探针的表面羧基,完成膜芯片制备并低温保存。
5)杂交
将扩增产物与固定在膜芯片上的探针进行杂交,杂交温度与探针和PCR扩增片段长度、盐浓度、甲酰胺、GC含量等有关。在本发明的体系中48℃孵育1.5~4小时后可获得满意的杂交结果。
6)非特异性结合物的洗脱
利用不同的洗脱条件,如温度、盐浓度等最大限度的去除非特异性杂交。
7)显色反应
5’端带有的生物素PCR产物与标记有过氧化物酶(POD)的链霉亲和素(链霉抗生物素蛋白)特异结合,并在过氧化氢和棕色底物TMB(四甲基联苯胺)的作用下发生显色反应,膜条上对应探针位置呈现蓝色斑点。
8)检测结果判读
检测结果可以直接经肉眼观察判读。也可经阅读仪扫描阅读后,对信号与背景由相应的软件系统分析获得最终的杂交结果,并自动对结果进行保存和统计。
本发明所述地中海贫血基因检测试剂盒可以直接快速检测6种α地贫突变和19种β地贫突变位点。无需核酸提取,减少污染,节约人力和试剂成本,节约时间约1-2h。PCR扩增时间2.5h,比其他方法节约1h,与其他同类比,节约仪器和试剂成本。因此,本发明试剂盒具备检测时间短、成本低、操作方便,闭管操作,减少污染,对开展地贫人群筛查,遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
附图说明
以下是附图的说明,以便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片,每个位置代表不同的基因突变和对照,N代表正常型,M代表突变型。
图2琼脂糖凝胶电泳检测。M:50bp DNA Ladder(MD108)(TIANGEN);泳道1:阴性对照;泳道2:多重PCR扩增产物(目的带)。PCR反应液Ⅰ加入模板经PCR扩增,扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图2,从电泳结果可以观察到成功扩增出三条目的带:扩增条带片段长度分别为658bp、528bp、306bp。
图3.琼脂糖凝胶电泳检测。M:DNA Ladder(亚能生物);泳道1:阴性对照;泳道2:--SEA目的带;泳道3:-α4.2目的带;泳道3:-α3.7目的带。PCR反应液Ⅱ分别加入不同基因型模板经PCR扩增,扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图3,从电泳结果可以观察到成功分别扩增出目的带:扩增条带片段长度分别约为2.1kb(-α3.7)、1.5kb(-α4.2)、1.3kb(--SEA)。
图4地中海贫血检测结果
其中(1)βN/βN,αα/αα;(2)βN/βN,αα/ααWS;(3)βN/βN,αα/ααQS;(4)βN/βN,αα/ααCS;(5)βN/βN,--SEA/αα;(6)βN/βN,-α4.2/αα;(7)βN/βN,-α3.7/αα;(8)β-28/βN,αα/αα;(9)β-29/βN,αα/αα;(10)β-30/βN,αα/αα;(11)β71-72/βN,αα/αα;(12)β-32/βN,αα/αα;(13)β41-42/βN,αα/αα;
图5地中海贫血检测结果
其中(14)β43/βN,αα/αα;(15)β17/βN,αα/αα;(16)β14-15/βN,αα/αα;(17)ββE/βN,αα/αα;(18)β27-28/βN,αα/αα;(19)β654/βN,αα/αα;(20)β31(/βN),αα/αα;(21)β37(/βN),αα/αα;(22)βCAP(/βN),αα/αα;(23)βintM(/βN),αα/αα;(24)βIVSⅡ-5(/βN),αα/αα;(25)βIVSⅠ-1(/βN),αα/αα;(26)βIVSⅠ-5(/βN),αα/αα。
备注:由于一些少见类型地贫未设计对照,只能报告是否有突变。βM(/βN)表示有“M”这种类型β突变类型,是杂合子还是纯合子β突变需要进一步分析。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式予以说明。
实施例1:采用本发明所述试剂盒标本来源及PCR模板类型
1.1样本采集及PCR模板的制备:
a)样本采集:标本来源于抗凝外周血,DBS样本、胚胎绒毛组织、羊水、脐带血、末梢血、类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等;
b)PCR模板的制备:上述标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
1.2 DBS样本制备
上述1.1滤纸片干血斑样品(DBS)采集与制备如下:
①、使用Whatman903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。
②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑,采集部位为足弓、耳垂或手指。
用70%乙醇或酒精棉消毒采血部位,用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。
将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内,大约每孔需要50~80μl全血,保证滴满圆圈。
每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑,移液器吸取50~80μl抗凝血血样,对准滤纸片印圈的中心处,将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。
③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少4小时(在潮湿气候下至少24小时),不要加热血片或将他们堆叠在一起,干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后,将滤纸片放入密封袋中,避免滤纸之间标本的相互污染。
④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周。未及时检测的DBS样品存放冰箱在-20℃或以下待检。
本实施例中的DBS样品还可以替换成:滤纸片干羊水样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎的遗传物质样品、和/或滤纸片干基因组DNA样品等,上述各滤纸片干体液/胚胎的遗传物质/DNA样品制备方法同DBS样品的常规制备方式(如上所述),并且,采用相同的引物组、相同的PCR方法能获得相同的实验结果,本文中不再一一赘述。
实施例2.用于PCR扩增的特异性引物的设计及PCR反应体系确定
1.1引物设计
从GenBank数据库中获取α-珠蛋白和β-珠蛋白基因序列,根据α-珠蛋白和β-珠蛋白基因涵盖突变区域分别设计一个引物组用于PCR扩增,其中3对引物组合置于同一个反应管中进行直接多重PCR,同时扩增α-地贫与β-地贫基因非缺失突变;另外一个引物组亦同时置于另一个反应管中进行直接多重PCR扩增缺失型α-地贫;引物由专业生物公司合成。引物序列如表1:
表1特异性扩增α-地中海贫血基因与β-地中海贫血基因引物组
1.2多重PCR反应体系的确定
利用正交试验方法,通过大量的实验对比,通过大量实验对比,最终确定最优的PCR反应液Ⅰ与与PCR反应液Ⅱ配方见表2与3:PCR反应液18μl,外周血(绒毛、羊水或脐带血)加样量2μl,DBS样本1-3片(直径1-2mm)(补水2μl),反应总体积为20μl。
表2 PCR反应液Ⅰ配方体系与反应条件
表3 PCR反应液Ⅱ配方体系与反应条件
1.3多重PCR扩增程序的确定
经过大量实验对比优化,控制退火温度和退火时间可以做到特异性好,扩增效率高,最终确定的最佳扩增程序见表2与表3。
PCR反应液Ⅰ加入模板经PCR扩增,扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图2,从电泳结果可以观察到成功扩增出三条目的带:扩增条带片段长度分别为658bp、528bp、306bp。
PCR反应液Ⅱ分别加入不同基因型模板经PCR扩增,扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图3,从电泳结果可以观察到成功分别扩增出目的带:扩增条带片段长度分别约为2.1kb(-α3.7)、1.5kb(-α4.2)、1.3kb(--SEA)。
实施例3:寡核苷酸探针的设计、点样和固定
3.1.探针的设计及筛选
从GenBank数据库中获取α-珠蛋白与β-珠蛋白基因序列,根据α与β-地贫基因突变区域设计特异性识别α-地贫6种突变(QS、CS、WS、--SEA、-α3.7与-α4.2)和19种β地贫基因突变的寡核苷酸探针组合。由专业生物公司合成。具体各个寡核苷酸探针见表4与表5。
表4检测α-地贫6种突变寡核苷酸探针组
序列编号 | 序列名称 | 序列(5'to 3') |
SEQ ID NO.26 | WSN | GGAGGCGTGCACCGCA |
SEQ ID NO.27 | QSN | AACTTGTCCAGGGAGGCG |
SEQ ID NO.28 | CSN | CAAATACCGTTAAGCTGGAGCCT |
SEQ ID NO.29 | WSM | TGCGGTGCAGGCCTCC |
SEQ ID NO.30 | QSM | CGCCTCCCCGGACAAG |
SEQ ID NO.31 | CSM | CCAAATACCGTCAAGCTGGA |
SEQ ID NO.32 | SEA | CCAGCCTCCAAGTGAACC |
SEQ ID NO.33 | 4.2 | CATGCCTGTAAACCCACCTACT |
SEQ ID NO.34 | 3.7 | GGGATTTAACTCAACAGGC |
表5检测β地贫基因突变的寡核苷酸探针组
3.2.基因芯片的制备。
本发明所述基因芯片的制备方法,包括如下步骤:
(1)寡核苷酸探针的工作液的配制:将合成好的寡核苷酸探针用探针稀释液(pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液)混合稀释成工作液(10μM),以备点样用。
(2)固定探针:尼龙膜浸泡于10%的EDAC溶液中活化30分钟,纯水洗涤3次,每次2分钟,然后室温晾干。通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在在活化处理好的尼龙膜上,每滴0.5μL。
点膜结束后,将膜放置于室温30分钟,进行反应。
膜条上的探针序列如表4与5所示。特异性探针中用于检测没有发生突变的位点为正常探针(用N表示),用于检测发生突变的位点为突变探针(用M表示),膜条上的探针排列顺序如图1所示,由斑点显现的位置即可判断结果。检测的位点突变与正常对照关系如表6所示。检测位点包括α-突变:非缺失(αCSα、αQSα、αWSα)与缺失型(--SEA、-α3.7和-α4.2);检测位点还包括β-突变(19种β地贫基因突变)(-32(C>A)、-30(T>C)、(-28(A>G)、-29(A>G)、Cap(-AAAC)、Int(T>G)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、βE(G>A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TTCT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G>T)、IVS-I-5(G>C)、IVS-II-654(C>T)、CD37(G>A)、IVS-II-5(G>C))。
表6检测的位点突变与正常对照关系
(3)制备基因芯片:利用氢氧化钠停止反应,制得基因芯片。
将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟,停止反应。并用蒸馏水充分洗涤,室温晾干后保存于4℃备用。即制得基因芯片。
实施例4:杂交条件的确定、显色反应及结果判断。
将待测样品或样品DNA直接用直接PCR反应液及在相应扩增条件进行PCR反应扩增,其扩增产物用于反向斑点杂交。
反向斑点杂交过程包括以下几个步骤:核酸杂交、结合的核酸与酶交联及非特异性结合核酸的洗脱、与酶底物结合显色、杂交结果分析。下面详细说明各步骤的操作。
4.1杂交
标有样品编号的膜条置入15ml塑料离心管,加入杂交I液(2×SSC、0.1%SDS)5-6ml及PCR反应液中部分或者所有(5-20μL)PCR产物,拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟,取出拧紧盖子,放入杂交箱48℃杂交1.5小时以上,但不超过4小时。
取50ml塑料管,加入40ml杂交II液(0.5×SSC、0.1%SDS)于杂交箱(或者恒温水浴箱)中进行预热至48℃。
4.2洗膜
取出膜条,移至装有预热杂交II液的50ml管中,于48℃轻摇洗涤15分钟(每管40ml溶液,最多可同时洗涤4张膜)。
4.3显色
按杂交I液:POD=2000:1配制孵育液,室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用杂交I液室温轻摇洗两次,每次5分钟。室温用C液洗膜1-2分钟,同时新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色6至12分钟即可观察结果。
4.4结果判读
(1.1)杂交结果分析
弃去显色液,用蒸馏水洗涤两次,每次2-3分钟。吸水纸吸干基因芯片表面的水,肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。
(1.2)结果读取基本方式
膜条上相应探针位置显蓝色,说明膜条有相应信号;若膜条上的仅正常位点有信号,说明待检样品为野生型;膜条上的突变位点有信号,说明待检样品含有该类型突变;若该突变位点对应的正常对照也有信号,说明待检样品为该类型突变的杂合子;若该突变位点对应的正常对照没有信号,说明待检样品为该类型突变纯合子或单体型。
(1.3)质量控制
(1.31)阴性对照(以水代替样本)进行杂交,膜条上若有杂交斑点,提示为实验有污染,实验结果无效。
(1.32)样品膜条上没有一个斑点,该样品实验无效。
实施例5:试剂盒简要说明及具体实验方法
5.1试剂盒主要成份
(1)基因芯片,其上带有检测正常与突变位点探针及阴阳性对照探针及空白对照;(2)用于直接扩增的PCR反应液含多重PCR的引物;(3)杂交试剂如POD、TMB及30%H2O2。
本检测需要用到的其他主要试剂
10%SDS:20g SDS用180ml纯水溶解,用1N HCl调pH值至pH7.0,最后定容至200ml。常温保存。
20×SSC:175.3g NaCl、88.2g柠檬酸钠用750ml纯水溶解,用浓盐酸调pH值至pH7.0,最后定容至1000ml,并高压灭菌保存。常温保存。
1M柠檬酸钠:294g柠檬酸钠用700ml溶解,用浓HCl调pH值至pH5.0,最后定容至1000ml。常温保存。
杂交试剂由杂交I液、杂交II液、Ⅲ液、酶、显色液组成,其中杂交I液的组成为1~6×SSC,0.1%~1%SDS,其中优选的方案是2×SSC,0.5%SDS;杂交II液的组成为0.1~1×SSC,0.1%~1%SDS,其中优选的方案是0.5×SSC,0.5%SDS。酶为辣根过氧化物酶(Streptavidin-POD),用量为0.005~1U/ml,优选的用量为0.1U。与之相匹配的显色系统,辣根过氧化物酶的显色底物可以是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,简称TMB),显色液优选的方案为0.1M柠檬酸钠(pH4.9),0.42mMTMB,0.004%H2O2(v/v)。
杂交I液:100ml 20×SSC,10ml 10%SDS加纯水定容至1000ml。常温保存。
杂交II液:25ml 20×SSC,10ml 10%SDS加纯水定容至1000ml。常温保存。
杂交Ⅲ液:100ml 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000ml。常温保存。
显色液:19ml杂交Ⅲ液加入1ml TMB和2μl 30%H2O2。
5.2 PCR反应所用仪器:Bio-Rad热循环仪C1000或者T100或者杭州晶格基因等普通PCR扩增仪。
5.3样本采集及PCR模板要求:
a)样本采集:标本来源于抗凝外周血、DBS样本、绒毛、羊水、脐带血或其他体液标本等;
b)PCR模板要求:上述标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
c)血样保存:抗凝全血或脐带血、绒毛、羊水或其他体液标本等在室温放置不超过24小时,DBS样本在室温放置不超过2周,2~8℃保存不超过7-15天,-20℃以下保存不超过1-2年,-70℃可长期保存,冷冻保存时应避免反复冻融。
d)样品运输:抗凝全血或脐带血、绒毛、羊水或其他体液标本等运输时需用冰壶或加有冰袋的泡沫箱密封,应保证冰袋不化冻,且在途时限不宜超过72小时。DBS样本可以室温(不宜超过30℃)运输或运输时需用冰壶或加有冰袋的泡沫箱密封,且在途时限不宜超过72小时。
5.4检验方法
5.4.1 PCR扩增
从冰箱取出试剂盒,并从中取出所需PCR反应液,室温平衡溶解,在管壁上做好标记,于5000-10000rpm离心2-4秒,而后向PCR反应液中直接加入样本或者已提取的待测样品DNA1-4μL,反应总体系为20μL。
每次实验另取一管PCR反应液,以2μL纯水为模板,作空白对照。
PCR按表2和3所列的条件进行扩增。
5.4.2杂交
标有样品编号的膜条置入15ml塑料离心管,加入杂交I液(2×SSC、0.1%SDS)5-6ml及PCR反应液中部分或者所有(5-20μl)PCR产物,拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟,取出拧紧盖子,放入杂交箱48℃杂交1.5小时以上,但不超过4小时。
取50ml塑料管,加入40ml杂交II液(0.5×SSC、0.1%SDS)于杂交箱(或者恒温水浴箱)中进行预热至48℃。
5.4.3洗膜
取出膜条,移至装有预热杂交II液的50ml管中,于48℃轻摇洗涤15分钟(每管40ml溶液,最多可同时洗涤4张膜)。
5.4.4显色
按杂交I液:POD=2000:1配制孵育液,室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用杂交I液室温轻摇洗两次,每次5分钟。
再用杂交Ⅲ液室温洗涤膜条1-2分钟,同时新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色6至12分钟即可观察结果。
5.4.5杂交结果分析
弃去显色液,用蒸馏水洗涤两次,每次2-3分钟。吸水纸吸干基因芯片表面的水,依据表6,判定方法同实施例4,肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。
实施例6:采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
1、试剂盒的组成:
同实施例5。
2、实施方法:
采用双盲实验,其他同实施例5。
3、样本来源:
所有样本均来源自经第三方提供已确定的基因型(研究者不知道)不同类型样本。
4、数据分析及结果判定:依据表6,判定方法同实施例4,肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。本实施例的结果如图4和图5所示。
实施例7:本发明的产品性能验证
产品性能指标
1测定准确性
收集10份阴性样本和30份地贫样本,选择低、中、高3个浓度,每个浓度重复3次,分别用3批产品来检测,分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型,研究结果与采用深圳益生堂生物企业有限公司和亚能生物技术(深圳)有限公司的地中海贫血基因诊断试剂盒(PCR法)试剂盒检测结果完全符合,产品阳性符合率和阴性符合率都达100%。
2分析灵敏度
采用本发明试剂盒对地贫检测位点进行灵敏度分析,每个样本包含7个浓度梯度,确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL;
3分析特异性
通过干扰筛查试验,临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质;溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果;脂血样本中甘油三酯(14.1mmol/L)和黄疸样本(360.4mmol/L)对本品检测无干扰。
用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本,包括1例α-地贫与β-地贫阴性样本、3例缺铁性贫血临床样本、3例G-6-PD临床样本,1例感染弓形虫的全血样本,结果均为阴性,均无交叉反应。
4重复性
采用本发明试剂盒不同批号产品,不同人(2人)操作,同一天做2次,共做2天,每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型,结果显示一致。
采用直接PCR法闭管扩增6种α-地贫和19种β-地中海贫血突变。在同一条件下进行RDB试验,可以减少操作步骤,节约时间、人力、仪器和试剂成本,减少实验室污染,避免核酸抽提致使标本间交叉污染或DNA降解,降低漏检和/或误检率。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
Claims (10)
1.一种用于直接检测α-地中海贫血和β-地中海贫血突变位点的芯片,其特征在于,所述芯片上固定有:
用于检测三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:26-31所示,
用于检测三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:32-34,
和/或用于检β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:1-25所示。
2.根据权利要求1所述的基因芯片,其特征在于,所述芯片的基底材料选自:硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜和微缩磁珠组成的组。
3.一种用于直接PCR检测缺失α-地中海非贫血基因与β-地中海贫血基因的扩增试剂,其特征在于,包括如下核苷酸序列的引物组:
APF:SEQ ID NO:36;
APR:SEQ ID NO:37;
B1F:SEQ ID NO:38;
B1R:SEQ ID NO:39;
B2F:SEQ ID NO:40;
B2R:SEQ ID NO:41;
所述引物组扩增的特征序列与权利要求1或2所述的基因芯片中的用于检测三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针以及用于检测β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针特异性结合;
所述扩增试剂中加入其它PCR扩增组分,通过一次PCR反应对待测样品或提取自待测样品的DNA直接进行三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS与β-地中海贫血基因的检测;
所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃--80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等。
4.根据权利要求3所述的扩增试剂,其特征在于,用于一个反应的所述扩增试剂中,含有:
使用时,添加无菌蒸馏水与待测样品或提取自待测样品的DNA以达到20份体积。
5.根据权利要求3或4所述的扩增试剂,其特征在于,所述引物组中,各引物摩尔浓度比例为:
优选地,
所述用于一个反应的所述PCR扩增试剂中,含有
6.一种用于直接PCR检测缺失α-地中海贫血基因的扩增试剂,其特征在于:包括如下核苷酸序列所示的引物组,其扩增的特征序列与权利要求1或2所述的基因芯片中的用于检测三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的特异性寡核苷酸探针特异性结合:
SEAF:SEQ ID NO.42;
SEAR:SEQ ID NO.43;
4.2F:SEQ ID NO.44;
4.2R:SEQ ID NO.45;
3.7F:SEQ ID NO.46;
3.7R:SEQ ID NO.47。
所述扩增试剂中加入其它PCR扩增组分,通过一次PCR反应对待测样品或提取自待测样品的DNA直接进行所述三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的检测,所述待测样品选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃--80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、绒毛、羊水、脐带血、末梢血、DBS样本和/或类似DBS处理的样本、唾液、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等。
7.根据权利要求6所述的扩增试剂,其特征在于,用于一个反应的所述PCR扩增试剂中,含有:
8.根据权利要求6或7所述的扩增试剂,其特征在于,所述引物组中,各引物摩尔浓度比例为:
优选地,用于一个反应的所述PCR扩增试剂中,含有
使用时,添加无菌蒸馏水与待测样品或提取自待测样品的DNA以达到20份体积,
优选地,上述任一扩增试剂中,所述引物的5′端标记有标记物,用于使扩增的条带带有所述标记物。
9.一种用于检测α和β地中海贫血基因的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1-2任一所述的芯片;
权利要求3-5任一所述的扩增试剂,以及
权利要求6-8任一所述的扩增试剂。
10.权利要求1或2所述的芯片的制备方法,步骤如下:
(1)配制探针工作液:将合成好的特异性探针稀释成10μM的工作液,以备点样用;
(2)固定探针:尼龙膜浸泡于10%的EDAC溶液中活化30分钟,纯水洗涤后室温晾干;在活化处理好的尼龙膜上点上所述工作液,每滴0.5μL;点膜结束后,将膜放置于室温进行反应;
(3)制备基因芯片:利用氢氧化钠停止反应,制得基因芯片;
其中,所述特异性探针指用于检测三种非缺失α-地中海贫基因QS、CS、WS所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:26-31所示,
用于检测三种缺失α-地中海贫血基因--SEA、-α3.7与-α4.2的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:32-34,
和/或用于检β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:1-25所示。
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Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109112197A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110564843A (zh) * | 2019-10-12 | 2019-12-13 | 广西安仁欣生物科技有限公司 | 一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组、试剂盒及其应用 |
CN113249462A (zh) * | 2020-02-12 | 2021-08-13 | 苏州百源基因技术有限公司 | 一种地中海贫血筛查试剂盒 |
CN117487909A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-02-02 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种用于检测β-地中海贫血基因突变和/或缺失的引物探针组合及其应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010122160A1 (en) * | 2009-04-24 | 2010-10-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for diagnosing a hemoglobin-related disorder |
CN101899499A (zh) * | 2009-05-26 | 2010-12-01 | 厦门大学 | 一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法 |
CN102409100A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-04-11 | 潮州市中心医院 | 地中海贫血实时荧光定量pcr检测引物和试剂盒 |
CN103255225A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-21 | 钦州市妇幼保健院 | 一种基于荧光标记定量pcr技术的地中海贫血基因检测方法 |
CN104212910A (zh) * | 2014-09-28 | 2014-12-17 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒 |
CN106755329A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-05-31 | 广西壮族自治区妇幼保健院 | 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒 |
CN106868187A (zh) * | 2015-11-04 | 2017-06-20 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 多重pcr引物、试剂盒及用途 |
-
2017
- 2017-06-23 CN CN201710484663.9A patent/CN109112197A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010122160A1 (en) * | 2009-04-24 | 2010-10-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for diagnosing a hemoglobin-related disorder |
CN101899499A (zh) * | 2009-05-26 | 2010-12-01 | 厦门大学 | 一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法 |
CN102409100A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-04-11 | 潮州市中心医院 | 地中海贫血实时荧光定量pcr检测引物和试剂盒 |
CN103255225A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-21 | 钦州市妇幼保健院 | 一种基于荧光标记定量pcr技术的地中海贫血基因检测方法 |
CN104212910A (zh) * | 2014-09-28 | 2014-12-17 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 单管扩增同时检测α和β地中海贫血基因试剂盒 |
CN106868187A (zh) * | 2015-11-04 | 2017-06-20 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 多重pcr引物、试剂盒及用途 |
CN106755329A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-05-31 | 广西壮族自治区妇幼保健院 | 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
SITTICHAI PANYASAI ET AL.,: "A Simplified Screening for α-Thalassemia 1 (SEA Type) Using a Combination of a Modified Osmotic Fragility Test and a Direct PCR on Whole Blood Cell Lysates", 《ACTA HAEMATOL》 * |
彭建明等: "多重荧光定量 PCR 快速检测缺失型α地中海贫血", 《广东医学》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110564843A (zh) * | 2019-10-12 | 2019-12-13 | 广西安仁欣生物科技有限公司 | 一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组、试剂盒及其应用 |
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