CN102899411A - G6pd缺乏症基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒，包括：一个基因芯片，其上带有针对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变位点设计的突变检测探针和对应的正常对照探针，所述的突变检测探针为SEQ ID Nos：1-13中的至少一条序列或其反向互补的序列；正常对照探针为SEQ ID Nos：14-24中的至少一条序列或其反向互补的序列；还包含一组引物,用于扩增临床样本G6PD基因序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos.25-34。本发明可直接对待检者的基因型进行确诊，大大降低女性杂合子的漏诊率，将检测时间缩短为3.5小时左右，实现G6PD基因的快速检测。
Description
技术领域
[0001] 本发明涉及基因领域，具体是用于诊断人葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,缩略词为G6PD）缺乏症的基因检测试剂盒。
背景技术
[0002] G6PD缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病,俗称蚕豆病, 全世界约4亿人受累。我国是本病的高发区之一，约有1亿G6PD缺乏症患者，主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。该病特征是平时无症状，但患者的红细胞容易受到某些特定物质的破坏而发生溶血，导致溶血性贫血、药物性溶血、感染性溶血、蚕豆病等，最严重的是新生儿溶血，导致核黄疸从而发展为儿童终身智力低下或死亡。
G6PD基因突变是引起G6PD缺乏症的主要原因。G6PD基因定位于X染色体，男性只有一条X染色体，一旦有G6PD基因缺陷，则表现为G6PD严重缺乏。女性有两条X染色体，若一条染色有G6PD基因缺陷，则为杂合子，其临床表现变化很大，其酶活性可从正常至完全缺乏，给检出造成困难。如果2条X染色体都有G6PD基因缺陷，则为纯合子，表现为G6PD严重缺乏。在女性G6PD基因缺陷者中，多以致病基因携带者（杂合子）普遍存在人群中，且酶活性不定；但女性杂合子会将致病基因传给下一代，如在她们妊娠、生产、哺乳期发生急性溶血，会导致新生儿溶血、新生儿核黄疸或发育生长迟缓等。
目前临床上常用的G6PD缺乏症检测方法包括高铁血红蛋白实验、荧光斑点法、四氮唑蓝定性定量法、G-6-PD活性直接测定、G-6-PD/6-P-GD比值法等。这些化学试验方法虽然过程简单、价格低廉，适宜基层医院使用或普查，但其准确性不高，特别是对于女性杂合子检出率不足50%，容易造成漏诊。
发明内容
本发明目的是为了弥补现有化学试验方法对女性G6PD杂合子检出率的不足，提供一种G6PD缺乏症基因检测试剂盒。
本发明的G6PD缺乏症基因检测试剂盒，包括：
（1）一个基因芯片，其上带有针对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变位点设计的突变检测探针和对应的正常对照探针，所述的突变检测探针为SEQ ID Nos：1-13中的至少一条序列或其反向互补的序列；正常对照探针为SEQ ID Nos：14-24中的至少一条序列或其反向互补的序列，探针序列如下：
名称 序列 序列号
95M 5′- GATACACGCATATTCATC -3′ SEQ ID NO.1
392M 5′- TCCACCTGGTGTCACAG -3′ SEQ ID NO.2
493M 5′- CTGGGACCGCATCATC -3′ SEQ ID NO.3
592M 5′- ATCTACTGCATCGACCA -3′ SEQ ID NO.4
871M 5′- TCAGGTCAAGATGTTGAAA -3′ SEQ ID NO.5
1004M 5′- ACCACCGTCACTTTTG -3′ SEQ ID NO.6
1024M 5′- GCCGTCGTCTTCTATGT -3′ SEQ ID NO.7
1311M 5′- CCTGACGCCTATGAGC -3′ SEQ ID NO.8
1360M 5′- ACTTCGTGTGCAGGTGA -3′ SEQ ID NO.9
1376M 5′- CGACGAGCTCCTTGAG -3′ SEQ ID NO.10
1381M 5′- AGCTCCGTGAGACCTG -3′ SEQ ID NO.11
1387M 5′- CCTGGTGTATTTTCACC -3′ SEQ ID NO.12
1388M 5′- CCTGGCATATTTTCACCC -3′ SEQ ID NO.13
95N 5′- CGGATACACACATATTCATC -3′ SEQ ID NO.14
392N 5′- TCCACCTGGGGTCACAG -3′ SEQ ID NO.15
493N 5′- GCTGGAACCGCATCATC -3′ SEQ ID NO.16
592N 5′- CAGATCTACCGCATCGA -3′ SEQ ID NO.17
871N 5′- CAGGTCAAGGTGTTGAAA -3′ SEQ ID NO.18
1004N 5′- ACCACCGCCACTTTTG -3′ SEQ ID NO.19
1024N 5′- CCGTCGTCCTCTATGTG -3′ SEQ ID NO.20
1311N 5′- CCTGACGCCTACGAGC -3′ SEQ ID NO.21
1360N 5′- CACTTCGTGCGCAGGTG -3′ SEQ ID NO.22
1376/1381N 5′- CTCCGTGAGGCCTGG -3′ SEQ ID NO.23
1387/1388N 5′- CCTGGCGTATTTTCACC -3′ SEQ ID NO.24
（2）还包含一组引物(10条),用于扩增临床样本G6PD基因序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos.25-34，引物序列如下：
名称 序列 序列号
exon2-F 5′- TCAAGAAAGGGGCTAACTTCTCAA -3′ SEQ ID NO.25
exon2-R 5′- CACTTCCTGGCTTTTAAGATTGGG -3′ SEQ ID NO.26
exon5-F 5′- AAGCTGGAGGACTTCTTTGC -3′ SEQ ID NO.27
exon5-R 5′- ACACGCTCATAGAGTGGTGG -3′ SEQ ID NO.28
exon6-F 5′- TGGGAGGGCGTCTGAATGA -3′ SEQ ID NO.29
exon6-R 5′- GGGCAAGGTGGAGGAACTG -3′ SEQ ID NO.30
exon9-F 5′- ACACCCAAGGAGCCCATTC -3′ SEQ ID NO.31
exon9-R 5′- ACTGCTGGTGGAAGATGTCG -3′ SEQ ID NO.32
exon11/12-F 5′- TGGCATCAGCAAGACACTCTCT -3′ SEQ ID NO.33
exon11/12-R 5′- CCTTTCCTCACCTGCCATAAA -3′ SEQ ID NO.34
所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变位点为cDNA95（A>G）, cDNA392（G>A）, cDNA493（A>G）, cDNA592（C>T）, cDNA871（G>A）, cDNA1004（C>T）, cDNA1024（C>T）, cDNA1311（C>T）, cDNA1360（C>T）, cDNA1376（G>T）, cDNA1381（G>A）, cDNA1387（C>T）和cDNA1388（G>A）。
本发明上述的试剂盒，所述探针5′或3′端经过胺基化处理。
本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素。
本发明所述的基因芯片，其制备方法包括以下步骤：
（1）合成SEQ ID Nos：1-24序列或与SEQ ID Nos：1-24互补的序列，5′或3′端经过胺基化；
（2）将上述探针固定在经活化处理好的尼龙膜上；
（3）以步骤（2）所得的尼龙膜利用氢氧化钠停止反应,制得基因芯片。
利用本发明的试剂盒进行人G6PD基因检测的方法包括以下步骤：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增人基因组的DNA；对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。
具体步骤如下：
第一步：扩增样品
将临床样本中提取的DNA(人基因组DNA)通过试剂盒进行扩增，所用引物的5′端标记有生物素，扩增得到5′端带有生物素标记的DNA产物；
第二步：杂交
使用导流杂交技术，将上述扩增得到的DNA产物与基因芯片上面分布的DNA探针进行反应；
第三步：显色
在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系统显色，肉眼直接观察结果。
本发明与现有技术对比的有益效果:本发明是基于PCR-膜杂交技术的基因检测方法，一方面通过对固定在基底上的G6PD基因突变检测探针和正常对照探针进行杂交，显色，可直接对待检者的基因型（正常、女性杂合子、纯合子）进行确诊，大大降低女性杂合子的漏诊率。同时结合导流杂交技术平台，避免了传统杂交方法，操作麻烦，检测时间长（一般6小时以上）等缺点，将检测时间缩短为3.5小时左右，实现G6PD基因的快速检测。
附图说明
以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1表示本发明基因芯片上探针的类型和具体的分布位置，字母N代表正常对照探针，字母M代表突变检测探针。 “-—”代表空位置，不标记。
图2是表示本发明实施例的未检出G6PD基因突变样本结果示例，其基因型为：N/N。
图3是表示本发明实施例的G6PD基因突变杂合子样本结果示例，其基因型为：1388M/N。
图4是表示本发明实施例的G6PD基因突变纯合子样本结果示例，其基因型为：1376M/M。
图5是表示本发明实施例的G6PD基因突变纯合子样本结果示例,其基因型为：95M/M。
图6是表示本发明实施例的G6PD基因双重突变杂合子样本结果示例，其基因型为：1311M/N, 1360M/N。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细的说明。
实施例中，20%的EDAC溶液、0.1% SDS、 0.25%脱脂奶粉、0.05%硫柳汞、0.05% 叠氮钠均是指质量比，0.1% Tween 20 是指体积比。
步骤1 基因芯片的制备
根据G6PD基因突变位点cDNA95（A>G）, cDNA392（G>A）, cDNA493（A>G）, cDNA592（C>T）, cDNA871（G>A）, cDNA1004（C>T）, cDNA1024（C>T）, cDNA1311（C>T）, cDNA1360（C>T）, cDNA1376（G>T）, cDNA1381（G>A）, cDNA1387（C>T）和cDNA1388（G>A），共设计了13条突变位点探针（SEQ ID Nos：1-13）和11条正常对照突变探针（SEQ ID Nos：14-24）。探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5′或3′端进行胺基化处理。
DNA基因芯片的制作步骤如下：将制备的探针首先溶解在超纯水中，制成浓度为200μM的母液，然后溶解在pH=8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液中，使其最终浓度为5μM。
对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放进20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ml的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，装入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。
通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述处理过的尼龙膜上，每滴0.4 μl。点膜完成后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内放置12小时，即制得基因芯片。
步骤2 PCR扩增
步骤2-1 根据G6PD 基因13个突变位点的序列资料,我们设计了5对引物用于扩增（SEQ ID Nos.25-34）。引物合成方法为常规的DNA合成方法，引物的5′端带有生物素标记。
步骤2-2 提取模板DNA：使用其他商业化试剂盒从待检者的血液中提取基因组DNA,作为PCR扩增的模板。
步骤2-3 配制PCR反应液： 分两个PCR反应体系进行扩增，每30μL反应体系包括了27.5μl PCR MIX 、0.5μl DNA聚合酶、3μl处理好的样品DNA（10-30ng）。
步骤2-4 PCR扩增：PCR扩增程序为95°C 10min，95°C变性30 s、56°C退火30s、72°C延伸45s，共35个循环，最后一步72°C延伸5min。得到生物素化的DNA扩增产物。
步骤3 利用DNA基因芯片检测DNA扩增产物
利用导流杂交技术，将步骤2中扩增得到的DNA扩增产物用步骤1中制备的基因芯片进行检测，DNA扩增产物和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断。
将获得的G6PD基因的两管扩增产物在95°C下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到45°C的0.8 mL杂交液（2×SSC/0.1%SDS）中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于实施1制得的基因芯片，45°C杂交20分钟，然后用溶液WB1（0.5×SSC/0.1%SDS，42°C温浴）清洗3遍。加入0.5mL封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25°C封闭5分钟。抽干后加入0.5mL的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟。用0.8mL溶液A（TBS，0.1% Tween20及0.05%叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。
序列表
<110> 广东凯普生物科技股份有限公司
<120> G6PD缺乏症基因检测试剂盒
<160> 34
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 95M
<400> 1
gatacacgca tattcatc 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 392M
<400> 2
tccacctggt gtcacag 17
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 493M
<400> 3
ctgggaccgc atcatc 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 592M
<400> 4
atctactgca tcgacca 17
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 871M
<400> 5
tcaggtcaag atgttgaaa 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1004M
<400> 6
accaccgtca cttttg 16
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1024M
<400> 7
gccgtcgtct tctatgt 17
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1311M
<400> 8
cctgacgcct atgagc 16
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1360M
<400> 9
acttcgtgtg caggtga 17
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1376M
<400> 10
cgacgagctc cttgag 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1381M
<400> 11
agctccgtga gacctg 16
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1387M
<400> 12
cctggtgtat tttcacc 17
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1388M
<400> 13
cctggcatat tttcaccc 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 95N
<400> 14
cggatacaca catattcatc 20
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 392N
<400> 15
tccacctggg gtcacag 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 493N
<400> 16
gctggaaccg catcatc 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 592N
<400> 17
cagatctacc gcatcga 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 871N
<400> 18
caggtcaagg tgttgaaa 18
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1004N
<400> 19
accaccgcca cttttg 16
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1024N
<400> 20
ccgtcgtcct ctatgtg 17
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1311N
<400> 21
cctgacgcct acgagc 16
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1360N
<400> 22
cacttcgtgc gcaggtg 17
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1376/1381N
<400> 23
ctccgtgagg cctgg 15
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1387/1388N
<400> 24
cctggcgtat tttcacc 17
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon2-F
<400> 25
tcaagaaagg ggctaacttc tcaa 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon2-R
<400> 26
cacttcctgg cttttaagat tggg 24
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon5-F
<400> 27
aagctggagg acttctttgc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon5-R
<400> 28
acacgctcat agagtggtgg 20
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon6-F
<400> 29
tgggagggcg tctgaatga 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon6-R
<400> 30
gggcaaggtg gaggaactg 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon9-F
<400> 31
acacccaagg agcccattc 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon9-R
<400> 32
actgctggtg gaagatgtcg 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon11/12-F
<400> 33
tggcatcagc aagacactct ct 22
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> exon11/12-R
<400> 34
cctttcctca cctgccataa a 21
Claims (4)
1.G6PD缺乏症基因检测试剂盒，包括：
（1）一个基因芯片，其上带有针对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变位点设计的突变检测探针和对应的正常对照探针，所述的突变检测探针为SEQ ID Nos：1-13中的至少一条序列或其反向互补的序列；正常对照探针为SEQ ID Nos：14-24中的至少一条序列或其反向互补的序列；
（2）还包含一组引物,用于扩增临床样本G6PD基因序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos.25-34。
2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述探针5′或3′端经过胺基化处理。
3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
4.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5′端标记有生物素。
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