CN101419238B - 丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒,包括盒体,设在盒体内的酶标板和设在盒体内试剂及不干胶封片和使用说明书;其中所述酶标板为化学发光酶标板且其各孔包被有浓度为5ug/ml的包被抗体Mab1和Mab2;所述试剂包括:抗HCV-cAg酶结合物、HCV核心抗原标准品梯度溶液、阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、HCV-cAg样品稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B、20×浓缩洗涤液。本发明的检测试剂盒阳性检出率与PCR阳性检出率接近,同时具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点,适于在临床推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒抗原检测试剂盒,尤其涉及一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-coreAg)化学发光酶联免疫检测试剂盒及该试剂盒的制备方法。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染而引起的,主要经过血液传播。全世界有1.7亿人感染了HCV,预计我国HCV感染者3800万,而且每年的新发病例数不断上升。与乙肝相比,丙肝更容易转成慢性,约有70%的丙肝有可能发展成慢性肝炎,20%发展成肝硬化,12%发展成肝癌,危害十分地严重。目前,慢性丙肝除了干扰素有确切的疗效外,尚没有其它有效的治疗方法,而且疫苗的研制在短期内难有突破性的进展,因此,早发现、早诊断、早治疗对于丙肝患者有十分重要的意义。
现在常用的HCV检测技术主要是抗体的检测和RNA的检测,但是各有缺陷。自1989年,HCV抗体诊断试剂确诊出第一例HCV阳性感染者以来,抗体诊断试剂已经发展到了第四代。尽管检测灵敏度在不断提高,但是窗口期(即从病毒感染起直到可以检测出该病毒标志物之前的时期)仍然存在,这是输血安全的重大威胁之一。抗体检测也不能区分感染活动期患者和病情康复者,不能用于患者的疗效监测;RNA检测分为定性和定量两种,HCV RNA检测直接检测HCV病毒是否存在,其基本原理是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。虽然RNA检测可以早期诊断HCV感染,而且特异性好灵敏度高,但该方法在设备和技术上要求较高,且人员需要专职培训,操作繁琐,假阳性高,因此难以在常规工作和基层实验室中推广,限制了其应用。
HCV病毒核心抗原是HCV基因编码的结构蛋白之一,氨基酸序列十分保守,有研究表明其在血清中的滴度与HCV RNA水平密切地相关,而核心抗原与RNA动力学变化密切相关,因此可做为病程进展或抗病毒治疗的疗效监测的指标。HCV核心抗原的检测是一新型的检测方法,研究始于上世纪九十年代中期,应用最广泛的是酶免疫方法。美国Ortho公司已经推出了双抗体夹心法定性和定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原ELISA试剂盒,于2004年已经在欧洲上市。中国仅有湖南景达制药有限公司于2005年推出的核心抗原的ELISA检测试剂盒。但是HCV核心抗原的酶联免疫法灵敏度不高,因此其推广使用也受到局限。所以发明一种既操作简便又灵敏度高的试剂盒具有非常重要的临床意义。
发明内容
针对现有丙型肝炎抗体诊断试剂检测“窗口期”过长,且丙型肝炎抗原酶联免疫检测试剂盒灵敏度不高的不足,为避免现有检测方法的局限性,本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒。
本发明所述丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒,包括盒体,设在盒体内的酶标板和设在盒体内的抗HCV-cAg酶结合物、HCV核心抗原标准品梯度溶液、阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、HCV-cAg样品稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B、20×浓缩洗涤液及不干胶封片和使用说明书;其特征在于,所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96或48孔化学发光酶标板,且其各孔包被有浓度为5ug/ml的包被抗体Mab1和Mab2;所述抗HCV-cAg酶结合物是辣根过氧化酶标记的羊抗兔的Mab3和Mab4抗体;所述标准品溶液为5个浓度梯度,分别是:20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、lng/ml、20pg/ml;预处理液为体积比0.3%TritonX100、重量比1.5%SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL的混合液;化学发光底物液A是3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L对碘苯酚的混合液,化学发光底物液B为7.5mmol/L的双氧水。
上述的包被抗体Mab1包含HCV核心区20~35氨基酸位置,Mab2包含HCV核心区35~50氨基酸位置,Mab3包含HCV核心区100~115氨基酸位置,Mab4包含HCV核心区115~130氨基酸位置。
本发明中,所述阳性血清对照为从HCV感染者静脉采血后分离的血清,其制备方法是经EIA和分片段确认HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原均阴性;经PCR法测定HCV为阳性,抗HIV、HBsAg亦为阴性,60℃水浴1小时后除菌过滤,-20℃保存;所述阴性血清对照为正常献血员的血清,其制备方法是经HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原分别检测均为阴性、抗HIV、HBsAg及TP亦为阴性的人血清,除菌过滤后-20℃保存。
所述HCV-cAg样品稀释液的配方及制法是:
山羊血清 100ml
1%(重量比)硫柳汞 20ml
0.1M铁氰化鉀 10ml
吐温-20 0.5ml
10mg/ml庆大霉素 10ml
加0.01M PBS(PH7.4)至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
所述20×浓缩洗涤液的配方及制法是:
NaH2PO42H2O 2.96g
Na2HPO412H2O 29g
NaCl 234g
吐温-20 20ml
加双蒸水至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
本发明所述丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用方法,其检测程序为:
(1)平衡:样品及检测试剂盒内的试剂,于18~25℃平衡30±5分钟;
(2)配液:将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍,制成工作浓度洗涤液;
(3)样品预处理:预处理板上每孔按1:2的比例加入预处理液和样品,56℃振荡孵育30分钟,待用;
(4)加样:取96或48孔化学发光酶标板,预设置空白、阴性、阳性对照各3孔,空白对照每孔加入100μl样品稀释液,其余孔每孔中先加入50μl样品稀释液,然后阴、阳性对照孔每孔加入50μl相应对照血清,剩余孔样品检测孔,将经上述预处理的各待测样品按设定每孔中加入50μl;加样完毕后用不干胶封片封盖反应板,37℃振荡孵育60分钟;
(5)洗板:甩去板孔中的液体,在吸水纸上拍干;用工作浓度洗涤液洗板6次,最后拍干;
(6)加酶:每孔中加入100μl抗HCV-cAg酶结合物,用不干胶封片封盖反应板,37℃孵育30分钟;
(7)洗板:同步骤(5);
(8)加底物:每孔中先后加入化学发光底物液A、化学发光底物液B各50μl,避光显色至少2分钟;
(9)测定:显色反应后,将酶标板置化学发光仪上测出各孔相对发光度(RLU);
(10)以阴性对照发光度(RLU)的平均值+2500为临界值(CUT OFF);待检样品的RLU值>临界值(CUT OFF)为阳性,待测样品RLU值<临界值(CUT OFF)为阴性为判定标准进行判定。
与现有技术相比,本发明具有以下突出优点:
通常当HCV感染者体内出现HCV抗体并逐渐增加后,血清(或血浆)中的游离抗原量将随时间延长而逐渐降低甚至无法检出,因此限制了HCV核心游离抗原检测试剂对HCV后期诊断的临床应用。本发明的HCV核心抗原化学发光检测试剂盒以HCV核心抗原酶联免疫试剂盒为基础,在原有检测程序基础上加入对血清(或血浆)样品进行预处理的过程,该步骤不但消除了抗体分子和血清(或血浆)样本中类风湿因子、补体相关蛋白对检测结果的非特异性影响,关键是能使感染者血清(或血浆)中形成的自身HCV抗原/抗体复合物充分解离,暴露出HCV核心抗原,使可检测范围不仅仅局限于血清中存在的游离抗原,还包括从自身抗原/抗体复合物解离出的全部核心抗原(即核心总抗原),扩大抗原检出范围,显著提高感染者检出的特异性和灵敏度,摆脱了机体内因产生抗HCV抗体对抗原检出效果的影响,突破了HCV游离抗原可检出时间的局限性。HCV核心总抗原检测方法不但避免了因HCV抗体检测“窗口期”造成的漏检,更在以抗原为病毒标志物基础上实现了对HCV感染的全程检测。另外,本发明检测试剂盒的制备中还优化了抗HCV-cAg单克隆抗体的包被工艺,对样品稀释液、酶结合物等酶联免疫反应体系进行了配方改进和性能优化,使检测灵敏度、特异性有了明显提升(20pg/ml)。适用于在医院进行HCV现症感染者诊断、血液筛查和相关医学科研。
具体实施方式
优选实施例
本发明的丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒包括:
96人份或48人份抗HCV-cAg单克隆抗体包被化学发光板1块、抗HCV-cAg酶结合物、标准品6瓶、HCV-cAg阳性对照、HCV-cAg阴性对照、预处理液、HCV-cAg样品稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B、洗涤液(20×浓缩)各1瓶,说明书一份,不干胶纸片2张。
本发明所述丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒的制备方法及实际应用:
1、包被抗HCV-cAg单克隆抗体Mab1和Mab2成为化学发光反应板。
酶标板选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。
抗体检测板的最佳制备条件为,使用包被单克隆抗体以最佳包被抗体浓度(Mab1:5ug/ml,Mab2:5ug/ml),用pH4.6醋酸盐缓冲液稀释,每孔加100μl于检测板孔内,置4℃12小时。弃去包被液,用洗涤液充分洗涤各孔,每次180μl/孔,随之拍干。加入封闭液,150μl/孔,4℃封闭12小时,随后弃去封闭液拍干,室温干燥4小时。干燥后的化学发光板,迅速真空封口包装,将封装好的板存于2-8℃。
2、标准品的制备:将重组全长HCV核心抗原(氨基酸位置:2~180aa)(杭州隆基生物技术有限公司)用蛋白稳定剂(北京科跃中楷生物技术有限公司)稀释成5个梯度浓度,分别是:20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、lng/ml、20pg/ml。
3、HCV-cAg样品稀释液、浓缩洗涤液的配制:
A、样品稀释液:
山羊血清 100ml
1%(重量比)硫柳汞 20ml
0.1M铁氰化鉀 10ml
吐温-20 0.5ml
10mg/ml庆大霉素 10ml
加0.01M PBS(PH7.4)至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
B、洗涤液(20倍浓缩)
NaH2PO42H2O 2.96g
Na2HPO412H2O 29g
NaCl 234g
吐温-20 20ml
加双蒸水至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
4、样品预处理液的配制:
体积比0.3%TritonX100、重量比1.5%SDS、0.1M、pH8.0的Tris-HCL混合。也可以采用TritonX114、吐温80等非离子型表面活性剂代替。
5、化学发光底物的制备:
化学发光体系由发光剂(鲁米诺)、增强剂(对碘苯酚)及双氧水构成。
化学发光底物液A是3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L对碘苯酚的混合液,化学发光底物液B为7.5mmol/L的双氧水。
6、阳性对照和阴性对照的制备:
阳性对照为从HCV感染者静脉采血后分离血清,经EIA和分片段确认HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原均阴性;经PCR法测定HCV为阳性,抗HIV、HBsAg亦为阴性,60℃水浴1小时后除菌过滤,-20℃保存;
阴性对照为正常献血员血清,经HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原分别检测均为阴性、抗HIV、HBsAg及TP亦为阴性的人血清,除菌过滤后-20℃保存。
7、试剂盒检的应用及测操作程序
(1)平衡:从冷藏环境中取出的试剂及样品,应于室温(18~25℃)平衡约30分钟。
(2)配液:将浓缩洗涤液用蒸馏水作20倍稀释成工作浓度洗涤液,如产生结晶,应待其于室温溶解后再稀释。
(3)样品预处理:预处理板上每孔按1:2的比例加入预处理液和样品,56℃振荡孵育30分钟。
(4)加样:取96孔化学发光酶标板,预设置空白、阴性、阳性对照各3孔。每孔中先加入50μl样品稀释液(空白对照每孔加入100μl样品稀释液);然后阴、阳性对照孔加入50μl阴、阳性对照,其余孔按设定各加入50μl经预处理的待测样品;加样完毕后用不干胶封片封盖反应板,37℃振荡孵育60分钟。
(5)洗板:甩去板孔中的液体,在吸水纸上拍干;用工作浓度洗涤液洗板6次,最后拍干。
(6)加酶结合物:每孔加入100μl酶结合物(辣根过氧化酶标记的羊抗兔的Mab3和Mab4抗体),用不干胶封片封盖反应板,37℃孵育30分钟。
(7)洗板:同(5)。
(8)加底物:每孔先后加入化学发光底物液A、化学发光底物液B各50μl,避光显色至少2分钟。
(9)测定:加发光底物液后2-30分钟在化学发光仪上读出各孔相对发光度(RLU)。
(10)以阴性对照发光度(RLU)的平均值+2500为临界值(CUT OFF);待检样品的RLU值>临界值(CUT OFF)为阳性,待测样品RLU值<临界值(CUT OFF)为阴性为判定标准进行判定。
本发明中所述单克隆抗体购自北京友谊中联生物科技有限公司或上海美季生物技术有限公司。
8、试剂盒的特异性、灵敏度、精密度的检测
1)以阴、阳性血清作为质控测试试剂特异性及准确性。用5份阴性血清检定,无一例阳性;用5份阳性血清检定,无一例阴性。
结果统计见表1:
表1 特异性及准确性试验结果
2)精密性试验:
结果统计见表2:
表2 精密性试验结果
精密性:CV%=6.3%
3)灵敏度试验:以HCV抗原浓度梯度检测不同量抗原时试剂反应灵敏度。
结果统计见表3:
表3 灵敏度试验结果
试验结果表明,灵敏度为20pg;在所设定cut off临界值下,标本阳性符合率为100%,阴性符合率为100%,符合质控标准。
Claims (1)
1.一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒,包括盒体,设在盒体内的酶标板和设在盒体内的抗HCV-cAg酶结合物、HCV核心抗原标准品梯度溶液、阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、HCV-cAg样品稀释液、化学发光底物液A、化学发光底物液B、20×浓缩洗涤液及不干胶封片和使用说明书;其特征在于,所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96或48孔化学发光酶标板,且其各孔包被有浓度为5ug/ml的包被抗体Mab1和Mab2;所述抗HCV-cAg酶结合物是辣根过氧化酶标记的羊抗兔的Mab3和Mab4抗体;所述标准品溶液为5个浓度梯度,分别是:20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、20pg/ml;预处理液为体积比0.3%TritonX100、重量比1.5%SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL的混合液;化学发光底物液A是3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L对碘苯酚的混合液,化学发光底物液B为7.5mmol/L的双氧水;其中:
上述的包被抗体Mab1结合HCV核心区20~35位氨基酸,Mab2结合HCV核心区35~50位氨基酸,Mab3结合HCV核心区100~115位氨基酸,Mab4结合HCV核心区115~130位氨基酸;
上述HCV-cAg样品稀释液的配方及制法是:
加0.01M的PH7.4的PBS至1000ml,过滤除菌,4℃保存;
上述20×浓缩洗涤液的配方及制法是:
加双蒸水至1000ml,过滤除菌,4℃保存。
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