CN105606816A - 一种检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒 - Google Patents

一种检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是用于检测发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）包膜糖蛋白（Gn和Gc）特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒。本发明试剂盒包含包被SFTSV包膜糖蛋白优势线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。本发明试剂盒特异性高、重复性好，能够简单方便地用于SFTSV特异性抗体的检测，减少假阳性，能用于大规模血清学检测和流行病学调查，评估发热伴血小板减少综合征病毒的感染情况。

Description

一种检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是用于检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒。
背景技术
发热伴血小板减少综合征病毒(severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，SFTSV)也称新型布尼亚病毒，是布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，由蜱虫叮咬传播。该病临床上表现为起热急、乏力、恶心、呕吐等胃肠消化道症状，并伴有血小板减少、白细胞减少，部分病例有头痛甚至出血等症状，少数重症患者因多器官衰竭而死亡，病死率约为10％。
发热伴血小板减少综合征病毒为单股负链RNA病毒，其基因组由大片段(L)、中片段(M)、小片段(S)三个基因片段组成。其中M片段全长为3378个核苷酸，含有单一的开放读码框架，编码一个含1073个氨基酸的包膜蛋白前体，翻译后经宿主细胞内蛋白酶的修饰产生两个糖基化的包膜蛋白(Gn和Gc)，它们抗原性很强且均含有线性B细胞抗原决定簇位点，能够诱导机体产生特异性抗体。线性B细胞抗原决定簇由连续的氨基酸序列组成，可以与由完整抗原诱导产生的抗体发生结合作用。因此可利用这些抗原表位来捕获特异性抗体，实现抗体检测。
目前针对发热伴血小板减少综合征病毒的检测方法主要有核酸分子生物学检测法和免疫学检测法，如反转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)、中和试验等。RT-PCR技术依赖精密仪器，对操作人员要求较高，实验成本高，因此在大量样品检测中受到限制；中和试验的实验周期较长，灵敏度和特异性较差，在实际应用过程中存在一定局限性。因此迫切需要建立快捷有效的对发热伴血小板减少综合征病毒感染情况进行评估的检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，可用于检测发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体，评估发热伴血小板减少综合征病毒感染情况。用人工合成方法制备包含发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白优势线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，纯度高，特异性好，直接瞄准相应抗体，避免其他物质引起的非特异性反应，减少假阳性，提高检测准确性，具有灵敏度高，成本低，操作简便，速度快、特异性强等优点，能被基层单位广泛使用。
本发明涉及一种检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，包含包被发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白优势线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。其主要技术方案如下：人工合成发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白Gn上的RGGRSQVSYYPAENSYSR、GKSRTES、REHKTKWVQESSS、SESEEKAC、VNPPEQR、SSGKKSTEIHFH、NGEGNQDDVR七段和Gc上的KCKKSSS、EELKSKK、SSEESARTIK、RFERSHDSQ、HSSKNST、QVFRSRTKLA六段包含优势线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，用包被缓冲液将各多肽稀释至10微克/毫升；每种多肽溶液各取1毫升，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干后备用。该板与待测样品37℃孵育1小时，可以结合样品中的特异性抗体。同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔。洗涤3次后，加入稀释5000倍的HRP酶标抗体，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次，加入酶底物邻苯二胺(OPD)显色，轻拍混匀后37℃孵育10分钟。每孔加入终止液50微升，震荡10秒混匀，用酶标仪测定490纳米的吸光度值。以P/N比值法判定结果，样品吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，小于2.1为阴性。
本发明提供的检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒，可用于检测发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体。
本发明提供的检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒，可用于评估发热伴血小板减少综合征病毒感染情况，应用于血清学和流行病学研究等。
本发明检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-ELISA试剂盒的制备方法，工艺流程图(见附图1)，具体步骤如下：
(1)根据线性B细胞抗原决定簇抗原性强、表面性好、亲水性强的特点，使用生物信息学软件分析发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白(Gn和Gc)的氨基酸序列，预测并确定该病毒包膜糖蛋白上的优势线性B细胞抗原决定簇位点。
(2)人工合成Gn的RGGRSQVSYYPAENSYSR、GKSRTES、REHKTKWVQESSS、SESEEKAC、VNPPEQR、SSGKKSTEIHFH、NGEGNQDDVR七段和Gc的KCKKSSS、EELKSKK、SSEESARTIK、RFERSHDSQ、HSSKNST、QVFRSRTKLA六段包含Gn、Gc优势线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，并鉴定纯度。
(3)将合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液分别稀释到10微克/毫升，各取1毫升多肽溶液进行混合，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存，即为预先包被好抗原的酶标板。
(4)本试剂盒中所含阴性对照血清为正常血清样本，阳性对照血清为明确感染该病毒的患者血清样本，并已通过实验验证。
(5)本试剂盒涉及的其他试剂配制方法如下：
包被缓冲液(0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH9.6)：1000毫升蒸馏水中加入1.59克碳酸钠(Na2CO3)和2.93克碳酸氢钠(NaHCO3)，溶解混匀。
磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升PBS，pH7.4)：1000毫升蒸馏水中加入8.0克氯化钠(NaCl)，0.2克磷酸二氢钾(KH2PO4)，2.9克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和0.2克氯化钾(KCl)，溶解混匀。
封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
样品稀释液：PBS中加入1％牛血清白蛋白及0.1％吐温-20，pH7.4。
酶标抗体：HRP标记的抗体，市售，用样品稀释液稀释5000倍使用。
浓缩洗涤液：含有1％吐温-20，pH7.4的100毫摩尔/升PBS，洗涤时稀释10倍使用。
酶底物A溶液：5.1克柠檬酸(C6H8O7·H2O)，18.4克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加水定容到1000毫升后混匀。
酶底物B溶液：30％双氧水(H2O2)1毫升。
酶底物C：邻苯二胺(OPD)粉末1克。
终止液：2摩尔/升的硫酸溶液，取108.7毫升98％浓硫酸加入891.3毫升中，混匀冷却。
(6)使用本发明试剂盒检测样本的具体方法如下：
取出试剂盒中已经包被好发热伴血小板减少综合征病毒Gn、Gc蛋白线性B细胞抗原多肽的酶标板。用样品稀释液将各样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次。配置OPD显色液，称取酶底物C20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定490纳米处的吸光度值。使用P/N比值法判定结果，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，小于2.1为阴性。鉴定结果，样品1为阴性，其余为阳性(见附图2)。
本发明具有以下优点和效果：
(1)本发明试剂盒使用人工合成方法制备包含发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白优势线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，纯度高，特异性好，直接瞄准相应抗体，避免其他物质引起的非特异性反应，减少假阳性，提高检测准确性；
(2)本发明试剂盒能够检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体，快速评估发热伴血小板减少综合征病毒感染；
(3)本发明试剂盒具有成本低、操作简便、速度快、特异性强等优点，能够被基层单位广泛使用。
附图说明
图1为本发明试剂盒制备工艺流程图。
图2为本发明试剂盒检测血清中特异性抗体的多肽-ELISA结果。
具体实施方式
以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
实施例1：发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白(Gn、Gc)优势线性B胞抗原多肽的制备
根据线性B细胞抗原决定簇抗原性强、表面性好、亲水性强的特点，使用生物信息学软件分析发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白(Gn和Gc)氨基酸序列，预测并确定该病毒包膜糖蛋白上的优势线性B细胞抗原决定簇位点。人工合成包含Gn、Gc蛋白线性B细胞抗原决定簇位点的十三段多肽：Gn上的RGGRSQVSYYPAENSYSR、GKSRTES、REHKTKWVQESSS、SESEEKAC、VNPPEQR、SSGKKSTEIHFH、NGEGNQDDVR和Gc上的KCKKSSS、EELKSKK、SSEESARTIK、RFERSHDSQ、HSSKNST、QVFRSRTKLA，纯化后纯度为95％以上。
实施例2：预先包被多肽抗原的酶标板制备
将合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液分别稀释到10微克/毫升，各取1毫升多肽溶液进行混合，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃过夜后洗板3次。每孔加入200微升含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干，用密封袋封装酶标板，4℃保存备用。
所述溶液配方如下：
包被缓冲液(0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH9.6)：1000毫升蒸馏水中加入
1.59克碳酸钠(Na2CO3)和2.93克碳酸氢钠(NaHCO3)，溶解混匀。
磷酸盐缓冲液(0.01摩尔/升PBS，pH7.4)：1000毫升蒸馏水中加入8.0克氯化钠(NaCl)，0.2克磷酸二氢钾(KH2PO4)，2.9克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)和0.2克氯化钾(KCl)，溶解混匀。
封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
实施例3：试剂盒中其他溶液制备
样品稀释液：PBS中加入1％牛血清白蛋白及0.1％吐温-20，pH7.4。
酶标抗体：HRP标记的抗体，市售，用样品稀释液稀释5000倍使用。
浓缩洗涤液：含有1％吐温-20，pH7.4的100毫摩尔/升PBS，洗涤时稀释10倍使用。
酶底物A溶液：5.1克柠檬酸(C6H8O7·H2O)，18.4克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加水定容到1000毫升后混匀。
酶底物B溶液：30％双氧水1毫升。
酶底物C：邻苯二胺(OPD)粉末1克。
终止液：2摩尔/升的硫酸溶液，取108.7毫升98％浓硫酸加入891.3毫升水中，混匀冷却。
实施例4：使用该试剂盒检测样品中SFTSV包膜糖蛋白特异性抗体
样品孵育：取出试剂盒中已经包被好Gn、Gc蛋白抗原多肽的酶标板。用样品稀释液将各样品稀释100倍，加入预先制备好的酶标板孔中，每孔100微升，同时设立阴性对照孔、阳性对照孔和空白孔，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次。
二抗孵育：将酶标抗体用样品稀释液稀释5000倍，加入孔中，每孔100微升，37℃孵育30分钟后洗板3次。
显色读数：配置OPD显色液，称取酶底物C20毫克，溶于50毫升酶底物A中，加入20微升酶底物B，混匀后以每孔100微升加入酶标板各孔中，避光放置10分钟后以每孔50微升加入2摩尔/升硫酸终止反应，空白孔调零，用酶标仪测定490纳米处的吸光度值。
结果判定：P/N比值法，样品血清吸光度值/阴性对照吸光度值≥2.1为阳性，小于2.1为阴性。

Claims (3)

1.一种检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于试剂盒包含包被发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白优势线性B细胞抗原多肽的酶标板、样品稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、辣根过氧化物酶标记的抗体、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液；预先包被抗原的酶标板通过如下方法制备：人工合成发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白Gn上的RGGRSQVSYYPAENSYSR、GKSRTES、REHKTKWVQESSS、SESEEKAC、VNPPEQR、SSGKKSTEIHFH、NGEGNQDDVR七段和Gc上的KCKKSSS、EELKSKK、SSEESARTIK、RFERSHDSQ、HSSKNST、QVFRSRTKLA六段包含优势线性B细胞抗原决定簇位点的多肽，用包被缓冲液将各多肽稀释至10微克/毫升；每种多肽溶液各取1毫升，混匀后以100微升/孔的量包被于96孔酶标板中，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1小时后洗板3次，晾干后备用。
2.根据权利要求1所述的检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于试剂盒在检测发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体中的应用。
3.根据权利要求1所述的检测发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白特异性抗体的多肽-酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于试剂盒在对于发热伴血小板减少综合征病毒感染情况以及相应血清学和流行病学研究中的应用。
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