CN102070704A - 发热伴血小板减少综合征病毒的全基因序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的发热伴血小板减少综合征病毒，以及以湖北分离株HB29为代表的全基因序列、其编码蛋白的氨基酸序列及应用。对该病毒的全基因序列进行同源性分析，该病毒属于布尼亚病毒科，包括三个基因片段L、M和S，分别表达病毒的多聚酶、糖蛋白(Gn和Gc)和核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)，并且三个片段均在白蛉病毒属这一分支上，但与该属的其他病毒距离较远。可将本发明涉及的病毒全基因序列及其编码的蛋白用于研制预防和治疗由发热伴血小板减少综合征病毒所致传染病的药物、疫苗或诊断试剂。

Description

发热伴血小板减少综合征病毒的全基因序列及应用

技术领域

本发明涉及病毒学、分子生物技术领域，具体地说，涉及一种新的发热伴血小板减少综合征病毒的全基因序列及应用。

背景技术

布尼亚病毒是球形、有包膜和分节段负链RNA病毒。因首先从乌干达西部的布尼亚韦拉分离到该科的代表种-布尼亚韦拉病毒而得名。布尼亚韦拉病毒直径90～100纳米，从包膜伸出许多糖蛋白突起，内有3个螺旋对称的核壳，分别含大(L)、中(M)、小(S)3个RNA节段，其中L和M为负链RNA，分别编码病毒的多聚酶(RNA依赖的RNA多聚酶，RdRP)、糖蛋白(Gn和Gc)；S片段为双义RNA，编码核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)。根据血清学和生物化学分析，已确定有5个属，即布尼亚病毒属、白蛉病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和乌库病毒属，分别包含145、30、6、27和7个血清型。另有22个病毒被认为是本科的可能成员。

布尼亚病毒的自然感染见于许多脊椎动物和节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)，可感染小鼠，并能在一些哺乳类、鸟类和蚊细胞培养中生长；对人可引起类似流感或登革热的疾病、出血热(立夫特谷热和克里米亚-刚果出血热等)及脑炎(加利福尼亚脑炎)。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒三种传播类型。有些病毒在其节肢动物媒介中，可经卵、交配或胚胎期传播。

近年来，在我国河南、湖北、山东、江苏、辽宁等地陆续发现了发热伴血小板减少为主要临床表现的感染性病例，少数重症患者因多脏器损害，救治无效死亡。目前，这类患者病因尚不明确。该类病例临床表现为急性发热起病，多数患者伴有乏力、纳差、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，部分患者出现黑便、牙龈出血、皮肤瘀点或瘀斑、眼结膜充血等出血症状。绝大部分患者临床检查的结果为白细胞降低，血小板减少，部分患者谷丙/谷草转氨酶升高，尿蛋白呈阳性。为进一步明确该病的临床及流行病学特征，探索病因和防治手段，在湖北、山东、河南、江苏、辽宁等省部分地区开展监测工作。在对病原一无所知的情况下，通过非序列依赖的核酸扩增、病毒分离、核酸检测包括荧光定量PCR(Real-time PCR)和套式PCR、血清学检测等方法对上述地区的感染性病例进行病毒筛检和分离，同时进行病毒基因组学研究，对了解病毒来源、进化过程及分子流行病学有重要意义，同时也为疾病鉴别诊断以及疫苗的研制奠定了基础，具有巨大的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的发热伴血小板减少综合征病毒，以及以湖北分离株HB29为代表的全基因序列及其氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供该发热伴血小板减少综合征病毒的全基因序列及其编码的蛋白在制备预防或治疗由发热伴血小板减少综合征病毒所致传染病的药物、疫苗或诊断试剂中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的发热伴血小板减少综合征病毒，该病毒基因组编码：

I)a、SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的蛋白，或

b、SEQ ID No.4所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由a所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性区段，将第479位的V替换为I，不会影响蛋白的功能。

II)c、SEQ ID No.5所示氨基酸序列组成的蛋白，或

d、SEQ ID No.5所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由c所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性区段，将第13位的L替换为F，不会影响蛋白的功能。

III)e、SEQ ID No.6所示氨基酸序列组成的蛋白，或

f、SEQ ID No.6所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由e所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性区段，将第156位的A替换为T，不会影响蛋白的功能。

IV)g、SEQ ID No.7所示氨基酸序列组成的蛋白，或

h、SEQ ID No.7所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由g所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；例如在非活性区段，将第144位的R替换为Q，不会影响蛋白的功能。

前述的病毒，该病毒基因组包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列同源性在95％以上的核苷酸序列。

本发明还提供前述发热伴血小板减少综合征病毒产生的多聚酶(RdRP)、糖蛋白(Gn和Gc)、核蛋白(NP)或非结构蛋白(NSs)。

本发明还提供编码前述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白的基因。

本发明还提供含有前述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白编码基因的载体。

本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。

本发明进一步提供前述发热伴血小板减少综合征病毒，该病毒基因组编码的多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白，编码多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白的基因，含有多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白编码基因的载体或含有所述载体的宿主细胞在制备预防或治疗由发热伴血小板减少综合征病毒所致传染病的药物或疫苗中的应用。

另外，本发明提供用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的特异性引物和/或探针。根据所述病毒的基因组序列设计用于检测该病毒的特异性引物，经RT-PCR后检测扩增产物，可以通过凝胶电泳、测序等方式进行检测，引物序列一般为18～36个碱基的寡核苷酸链，本领域技术人员可以通过相关生物软件和在线工具进行设计。根据所述病毒的基因组序列，还可以设计相关特异性探针，针对RNA或DNA进行检测，并可结合基因芯片技术进行检测，探针一般为20～50个核苷酸。一种较佳的方式是通过荧光定量RT-PCR进行检测，包括特异性引物及相应的荧光探针。

优选地，所述引物和探针包括：

I)L-F-3：5’-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTC/TAG-3’；

L-R-3：5’-TGTAAGTTCGCCCTTTGTCCAT-3’；

L-探针-3：5’-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3’；和/或

II)M-F-3：5’-AAGAAGTGGCTGTTCATCATTATTG-3’；

M-R-3：5’-GCCTTAAGGACATTGGTGAGTA-3’；

M-探针-3：5’-TCATCCTCCTTGGATATGCAGGCCTCA-3’；和/或

III)S-F-3：5’-GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA-3’；

S-R-3：5’-TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT-3’；

S-探针-3：5’-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-3’。

本发明还提供含有上述引物和/或探针的检测试剂盒。

本发明从湖北、山东、河南、江苏、辽宁等地以发热伴血小板减少为主要临床表现的感染性病例中分离获得病毒(结合该病毒感染所导致的临床症状故命名为新的发热伴血小板减少综合征病毒)，并进一步获得该病毒的基因全系列。具体地说，本发明的技术方案是通过病毒分离培养，核酸检测包括荧光定量PCR(Real-time PCR)和套式PCR，血清学检测对上述感染性病例进行了病毒筛查检测、分离和鉴定，同时利用SISPA(核酸序列非依赖单引物扩增法)对湖北、山东、河南、江苏、辽宁等省份病例标本进行扩增；根据最初由序列非依赖单引物扩增(SISPA)得到的序列设计引物，进行目的基因的PCR扩增，进行PCR产物纯化并测序，最终获得以湖北病毒株HB29为代表共11株发热伴血小板减少综合征病毒的全部基因组序列。通过序列分析发现，该病毒属于布尼亚病毒科，包括三个基因片段L、M和S，分别表达病毒的多聚酶、糖蛋白(Gn和Gc)和核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)，并且三个片段均在白蛉病毒属这一分支上，但与该属的其他病毒距离较远，因此属于全新的布尼亚病毒科白蛉病毒属；此外，这11株病毒的序列高度同源：L片段的同源性在95.9-99.8％，M片段的同源性在95.3-99.6％，S片段的同源性在95.2-99.7％。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明首次阐明了以发热伴血小板减少为主要临床表现的一种新的布尼亚病毒科白蛉病毒属的全基因组序列，以及各结构基因、调控基因和各自编码的蛋白。

(2)由发热伴血小板减少综合征病毒各主要基因及其编码的蛋白研制的核酸诊断和血清学诊断试剂可分别用于该类新的发热伴血小板减少综合征病毒感染的鉴别诊断以及基因及工程疫苗的研制，具有巨大的经济和社会效益。

(3)本发明基于对湖北分离株HB29全基因序列的测定，有助于进一步了解与该病毒增殖及重要调控功能有关的基因结构和功能，研究其分子生理机制以及侵染宿主的关键点，寻找病毒致死基因或细胞受体，通过基因或基因转化制成核酸或蛋白类生物制剂，形成治疗该类病毒性传染病的有效手段。

(4)本发明涉及的发热伴血小板减少综合征病毒(湖北分离株HB29)的三个片段均在白蛉病毒属这一分支上，但与该属的其他病毒距离较远。L片段编码的氨基酸与其他的白蛉病毒的同源性为32-33％，M片段编码的糖蛋白的同源性在20-36％，S片段编码的NSs的同源性较低，在11.2-16.0％，因此本发明涉及的发热伴血小板减少综合征病毒为全新的布尼亚病毒科白蛉病毒属。

(5)本发明还涉及用于该类新的发热伴血小板减少综合征病毒检测的特异性引物和探针。根据已测定的11株病毒全基因序列，分别比对11株病毒的L、M、S序列，界定其保守区，利用Primer express 软件设计分别针对三个片段的引物和Taq man探针，通过多重Real-time PCR或套式PCR对感染性病例进行扩增，结果针对L、M、S片段的引物和探针均显示出较好的特异性。

(6)本发明还可用来研制血清学鉴别诊断试剂。根据发热伴血小板减少综合征病毒(HB29)全基因序列分析结果，三个基因片段L、M和S分别表达病毒的多聚酶、糖蛋白(Gn和Gc)和核蛋白及非结构蛋白(NSs)。可以分别构建表达核蛋白基因的原核表达系统和真核表达系统。

表达核蛋白基因的原核表达系统以原核表达质粒pET30a系列质粒为载体，设计酶切位点，将目的基因通过常规的PCR方法扩增后，克隆到pET30a系列质粒中，以大肠杆菌BL21为宿主菌，0.1-1.0mMIPTG作为诱导剂诱导表达重组蛋白，可得到分子量为约27KD的目的蛋白。表达产物经离子交换层析、亲和层析和分子筛等方法纯化后可用于制备血清学诊断试剂或基因工程亚单位疫苗。

另一方面，还可以分别构建表达核蛋白基因和糖蛋白基因的真核表达系统，以真核表达载体pcDNA3系列质粒或昆虫-杆状病毒表达载体pACUW51质粒为载体，设计好酶切位点，将目的基因通过常规的PCR方法扩增后，克隆到表达载体中，转染相应细胞株如293T，sf9细胞，使其在细胞中成功表达后，将表达阳性的细胞制备成抗原片，通过间接免疫荧光(IFA)对病人血清进行检测。

此外，本发明的发热伴血小板减少综合征病毒(HB29)全基因序列可用于构建该种新病毒感染性分子克隆。可对阳性的感染性分子克隆进行基因改造，用删除或人工诱变方法使毒力基因失活，从而得到非致病的感染性分子克隆，从而获得毒力减弱的毒株，用于减毒疫苗株或颗粒疫苗的研制。

附图说明

图1为本发明较佳实施例新型发热伴血小板减少综合征病毒的分离鉴定结果，A代表免疫荧光检测显示病毒感染细胞与病人血清反应呈阳性；B代表电镜下观察到的病毒形态。

图2为本发明较佳实施例新型发热伴血小板减少综合征病毒L基因片段进化树。

图3为本发明较佳实施例新型发热伴血小板减少综合征病毒M基因片段进化树。

图4为本发明较佳实施例新型发热伴血小板减少综合征病毒S基因片段进化树。

图5为本发明较佳实施例多重Real-time PCR检测病人血清扩增结果示意图。

图6为本发明表达HB29株的核蛋白(NP)，全长糖蛋白(G)，糖蛋白(Gc)的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞制成的抗原片与病人血清反应的结果示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1病毒分离

自2004年以来，浙江、江苏、安徽、山东、河南和湖北等省相继发现并报告发热伴血小板减少为主要表现的感染性疾病病例，其中少数严重患者发展为多脏器损害，甚至死亡，2010年5月以来国家CDC病毒病所自山东、湖北、河南、江苏、安徽和辽宁等6个省份采集197份具有类似症状患者血清标本。

采用常规组织培养法，对来源于上述6个省份的197份标本分别进行病毒分离检测。将100μL的病人血清用DMEM 1∶10稀释至1ml，接种至25cm²培养瓶vero细胞(Greiner Bio-One)中，37℃吸附1小时，补加4ml DMEM维持液(含2％胎牛血清及1000单位/mL青霉素和链霉素)，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天观察是否出现细胞病变(CPE)，培养7-10天后，将培养上清冻存于-80℃，取1ml传代，以表4所列引物探针进行多重RT-PCR检测细胞上清病毒核酸的方法监控病毒的复制情况，未接种病毒的正常细胞培养上清也同时进行收集和PCR检测，另外，将不同病毒感染时间的细胞固定制作抗原片，使用恢复期的病人血清进行免疫荧光试验来监控病毒的复制情况。

结果表明，本发明从6个省份的197份病人血清中分离获得包括HB29在内的共11株病毒，病毒分离过程中将病人血清接种于vero细胞培养7-10天后细胞病变不明显。如图1所示，以HB29分离株为代表，免疫荧光检测显示病毒感染细胞与病人血清反应呈阳性(A)；经电镜检查，新分离的布尼亚病毒颗粒呈粗糙圆球形，平均直径80-100nm，有致密的包膜及细的表面突起(B)。

实施例2序列非依赖单引物扩增(SISPA)

血清中病毒核酸的扩增是根据Allander等(2001)的方法并进行了一些改动。首先对2010年获得的第一份患者急性期血清标本HB29进行处理：140μL的血清用PBS(pH 7.4)进行两倍稀释，10,000g离心10分钟去除细胞碎片，并以孔径为0.2μm的滤膜去除细胞团块或细菌，然后在血清中加入14U DNA酶(Ambion)，20U benzonase核酸酶(Novagen)和20U RNA酶(Promega)，缓冲液使用1×DNA酶缓冲液(Ambion)，37℃消化2小时去除非病毒(无病毒颗粒保护)的核酸。采用病毒RNA分离试剂盒(Qiagen)，根据说明书从280μL稀释后的血清中提取RNA以40μL无RNase的水洗脱。第一链cDNA的合成：向13μL纯化RNA中加入2μL 10μM随机引物(Promega)得到15μL的混合物，70℃加热10分钟，4℃放置5分钟以解开RNA的二级结构，然后加入30U AMV逆转录酶(Promega)，加水至终体积为25μL，于37℃反应1小时。第二链cDNA的合成：取20μL的第一链产物，加入2.5X第二链cDNA反应缓冲液40μL，牛血清白蛋白(1mg/ml)5μL，E.coli DNA聚合酶I 23u(Promega)，RNase H 1u(Promega)，加水至终体积为100μL，14℃孵育2小时后，于70℃加热10分钟灭活DNA聚合酶I，再加入2UT4 DNA聚合酶(Promega)，于37℃反应10分钟，加入10μL 200mMEDTA终止反应，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)对其进行纯化，纯化后的产物加入磷酸化的平端接头E19(5’-AGCAATTCCGTTGCTGTCG-3’)和E12(5’-pCGACAGCAACGG-3’)，16℃连接4小时，以连接产物为模板，寡核苷酸E19为引物进行扩增，反应条件为94℃，3min；94℃，30s，55℃，1min，72℃，2min，40个循环，72℃，10min。PCR产物经凝胶电泳后呈弥散条带，2-500bp，500-1000bp及大于1000bp的弥散带分别用Qiagen试剂盒回收并克隆至pGEM T-easy载体(Promega)，人工挑选576个克隆并测序。

得到的序列通过blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行同源性分析，每个序列通过搜索标准非冗余数据库以及数据库的高通量基因组序列，氨基酸序列通过blastp进行同源性分析。

结果表明：对576个克隆的测序结果进行分析，先去掉两端引物序列，对得到的核苷酸序列进行blast分析，分析结果显示90％的克隆为人类基因组序列，还有一小部分为非培养细菌，少数为比对不出任何信息的未知序列；对这部分未知序列进一步进行氨基酸的比对分析，在推断其氨基酸序列时，用六种可能的读码框来推断其氨基酸序列，对得到的所有氨基酸序列在Genbank的数据库中进行蛋白比对。15个克隆得到有用的信息，其中11个克隆的氨基酸序列与白蛉病毒的L蛋白有一定的相似性，克隆E2-31、E2-117编码相同的氨基酸，其编码的氨基酸位点在Uukuniemi病毒(NP_941973.1)L蛋白的453-604区间，E2-91的位点在其1357-1526区间，E2-79在其(1366-1526)区间，E2-174在其(1373-1542)区间，E2-9、E2-12、E2-120、E2-86编码相同的氨基酸，位点在其1805-1978之间，E1-65在其(2025-2096)区间，E1-16与Toscana病毒(ACM92008.1)1127-1237区间相似；15个克隆中有2个克隆与白蛉病毒糖蛋白(GP)的部分氨基酸序列相似：E2-25与Rift Valley热病毒gb|ABD38829.1|的667-873区间相似，E2-123与Punta Toro病毒(gb|ABD92923.1|)的1081-1246区间相似；另外有两个克隆与白蛉病毒的S片段编码的氨基酸有相似性：E2-20与Punique病毒(gb|ACZ43796.1|)编码的NSs蛋白110-206区间有相似性(表1)。

这些数据均表明该病毒与白蛉病毒较接近，但相似度较低(BLAST的E值范围在1.4～4×10^-23之间)，表明该病毒可能为白蛉病毒属的一个新亚型。

表1SISPA方法发现的类白岭病属基因组序列及其定位

实施例3病毒全长基因组的扩增

根据最初由SISPA得到的序列设计引物，从相邻的两个片段设计RT-PCR的正向和反向引物(表2)，以获得两个相邻片段间的序列。病人血清的RNA的提取采用病毒RNA分离试剂盒(Qiagen)，逆转录使用cDNA合成试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，扩增使用

DNA聚合酶(Invitrogen)，经1.2％琼脂糖凝胶电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收扩增产物，不经克隆用PCR引物直接测序，测出的序列由DNAStar软件进行拼接。

为了确定病毒基因组3’和5’末端的序列，又进行了cDNA末端快速扩增(RACE)，操作依据试剂盒说明书进行，在进行5’RACE时，每个片段RNA的扩增使用3个基因特异引物5’GSP1、5’GSP2和5’GSP3(表2)，以及试剂盒提供的5’RACE接头引物(abridged anchor primer)和通用扩增引物(AUAP)；在进行3’RACE时，首先要加入腺苷酸多聚酶和ATP(New England Biolabs)，37℃孵育1小时，使RNA的3’末端加上poly(A)尾，逆转录则使用含oligo(dT)的接头引物AP(Invitrogen)，随后使用基因特异引物3’GSP1和3’GSP2(表2)以及试剂盒提供的通用扩增引物AUAP进行套式PCR，退火温度为55℃，延伸时间为2分钟，得到的扩增产物随后进行纯化、克隆、测序。

表2病毒基因组末端序列测定引物

引物名称	引物序列
		1PhLseq-F1-25：	5’-ACACAAAGACGCCAAGATGCTTTT-3’
1PhLseq-R1370-1348：	5’-AGAAAGGGCTCAATGTCTCATGG-3’
		2PhLseq-F1327-1350：	5’-CCAGAAGAAAGAGAAGGAGTCCCA-3’
2PhLseq-R1782-1805：	5’-AGCTCCCATTCCCCAGCATCAATG-3’
		3PhLseq-F 1708-1730：	5’-CATATCTTCTTCAGCTTGGGGAT-3’
3PhLseq-R 3494-3468：	5’-TTGATCGGACTTCATCCATGTCTG-3’
		4PhLseq-F 3426-3448：	5’-GCTCTGACGACTCAGCGATCATG-3’
4PhLseq-R 3749-3730：	5’-GCCCCTCCTTCCAAGCACTG-3’
		5PhLseq-F 3704-3727：	5’-AGAAGATTACTCCAACCTTCTGAC-3’
5PhLseq-R 4147-4124：	5’-TGCTCCACCCAGTCCTCAGGAAGG-3’
		6PhLseq-F4101-4120：	5’-CAGGCCTTGTTGAACAGGAT-3’
6PhLseq-R 4590-4568：	5’-TGCACCGCAAGTCCACTGGTTCT-3’
		7PhLseq-F 4527-4548：	5’-AGGGAGAGAAACATTGTCAGGA-3’
7PhLseq-R 5499-5476：	5’-TCCATGATCCTGACTGGACACCCG-3’
		8PhLseq-F 5437-5459：	5’-GCTGAGTGGATTCAAGATCAAGC-3’
8PhLseq-R 5939-5916：	5’-TGTTAAAGGAACTACATTCTTCTC-3’

9PhLseq-F 5860-5885：	5’-AAGGTTCTCTTAGAAAGCAAGGGC-3’
		9PhLseq-R 6343-6317：	5’-TCAACTGCGTTCCAACCGTGTTTCAAA-3’
9PhLseq-2R 6434-6411	5’-ACACAAAGTCCGCCAAGATGGAAG-3’
		3’L-GSP1	5’-AGAGCTGGATTGTGATCAACCCAG-3’
3’L-GSP2	5’-TGAGTCTGGCACAGCCCCTATGTCC-3’
		3’M-GSP1	5’-TGAAACAAGTTTAGAATCAGCATGG-3’
3’M-GSP2	5’-GCAAGCCCTATTGCTAGAATGGTCAGG-3’
		3’S-GSP1	5’-AGTAGCACCTCATGTCCTTGTAGTAC-3’
3’S-GSP2	5’-TAGAGATGGCTCAAGCCTGACAGTG-3
		5’L-GSP1	5’-TCTGTGTCTTGCATGGCAGATGCC-3’
5’L-GSP2	5’-TCTTTGGACGGACTCATCTCCATACC-3’
		5’L-GSP3	5’-AAATCTCCAATGTCTTCAACATCC-3’
5’M-GSP1	5’-TGAAACAAGTTTAGAATCAGCATGG-3’
		5’M-GSP2	5’-GCAAGCCCTATTGCTAGAATGGTCAGG-3’
5’M-GSP3	5’-TTACCCTTCTGGGTCTTGCCATCTC-3’
		5’S-GSP1	5’-TGTTCTTCTCCATCAAGAACAGCTG-3’
5’S-GSP2	5’-TCCAGATAGAGTCACTTGCAAGG-3’

将RACE扩增序列与SISPA获得的序列进行拼接得到L、M、S片段基因组全长序列。经比对，发现5’末端和3’末端的序列高度保守且与白蛉病毒属的末端序列相同，进一步表明该病毒为白蛉病毒。

为了避免克隆过程中的碱基突变，又根据已得到的L、M、S片段的序列设计全长测序引物重新扩增，使每一个扩增子的大小在500bp左右，将扩增产物直接回收，不经克隆测序进行拼接，最终获得HB29的全基因序列。结果为：L片段全长6368bp，编码聚合酶为2084aa；M片段长3378bp，编码为1073aa的糖蛋白；S片段长1744bp，有两个方向相反的读码框，分别编码核蛋白(246aa)和非结构蛋白NSs(294aa)。

利用上述测序引物，对随后分离到的病毒进行全长测序，累计获得包括HB29株在内的共11株病毒的基因全序列(Genbank号见表3)。这11株病毒的序列高度同源，L片段的同源性在95.9-99.8％，M片段的同源性在95.3-99.6％，S片段的同源性在95.2-99.7％。其中，HB29与SD24分离株L片段核苷酸序列(6368bp)在151(T-A)，1456(A-G)，1819(A-G)，2911(T-C)，4960(G-A)，5677(A-G)等12个位点有突变，同源性为99.8％；而所对应的编码蛋白聚合酶氨基酸序列(2084aa)在719(N-S)，1750(I-V)2个位点有突变，同源性高达99.9％。M片段核苷酸序列(3378bp)在354(T-C)，1171(T-A)，1938(C-T)，2496(C-T)，2828(A-G)，3341(T-C)等14个位点有突变，同源性为99.6％；而其编码的糖蛋白氨基酸序列(1073aa)在227(V-I)，385(S-T)，937(N-S)3个位点有突变，同源性高达99.7％。S片段核苷酸序列(1744bp)在448(T-A)，490(A-G)，517(G-A)，933(T-A)，1154(T-C)，1228(A-T)等6个位点有突变，同源性为99.6％；而其编码的核蛋白氨基酸序列(246aa)在159(S-T)有1个突变，同源性高达99.6％；而非结构蛋白NSs(294aa)同源性为100％。

表3分离病毒全基因组序列GenBank号

实施例4进化树分析

将病毒样序列与包含了布尼亚病毒科的五个属(布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属、白蛉病毒属、Tospovirus病毒属)完整基因组的数据库相比对，该数据库还包括了来自非人灵长类动物，如黑猩猩、猕猴的完整基因组。使用Mega4软件的ClustalW做序列比对，绘制系统进化树，并作bootstrap检验。

结果表明，以同源性高低判定病毒亚型归属，可以看出新病毒的三个片段均在白蛉病毒属这一分支上，但与该属的其他病毒距离较远。按同样的方法分析新病毒的氨基酸序列，也得出相同的结果。L片段编码的氨基酸与其他的白蛉病毒的同源性为32-33％(图2)，M片段编码的糖蛋白的同源性在20-36％(图3)，S片段编码的NSs的同源性较低，在11.2-16.0％(图4)。

实施例5多重RT-PCR诊断

分别比对11株病毒的L、M、S序列，界定其保守区，利用Primer express软件设计分别针对三个片段的引物和Taqman探针，为防止多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰，两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针，用DNAstar软件的Primer select程序对其进行评价，最后选出最优组合。其中L片段的探针5’端用HEX标记，M片段的探针5’端用FAM标记，S片段的探针5’端用TexasRed标记，具体的序列及位点见表4。

表4多重Real-time PCR检测引物探针

试剂盒采用invitrogen公司的一步法定量RT-PCR检测试剂盒，仪器使用Bio-Rad公司的CFX96实时定量PCR仪，反应体系如下：2X反应缓冲液12.5μl，将三重探针和引物放入一个反应体系，同时针对一个样本检测L、M、S三个基因片段，具体为：浓度为10μM的上、下游引物各1μl，各型特异性探针0.5μl，逆转录和铂金Taq聚合酶0.5μl，加水至总体积25μl。反应条件为：50℃15min；95℃2min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

结果表明(图5)，山东、河南、安徽、河北、江苏、辽宁六省地区的总病例数为197例，其中RT-PCR检测阳性的为133例，阳性检出率为67.5％(表5)；通过免疫荧光IFA，酶联免疫吸附试验ELISA，中和试验MNT进行病人双份血清抗体4倍增高验证，从而对RT-PCR法检测阳性病例进行复核确认(表6)。从表6所列数据表明RT-PCR法检出的阳性病例为33份，IFA检测病人双份血清4倍增高的阳性病例为23份，ELISA检测病人双份血清4倍增高的阳性病例为31份，复核率分别为69.7％和93.94％。

表5发热伴血小板减少综合症病例

实施例6酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断

PCR扩增HB29核蛋白(NP)基因即HB29-NP，所用上游引物为NP-F：5’-CGCCATATGTCGGAGTGGTCCAGGATT-3’；下游引物为NP-R：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCAGGTTTCTGTAAG-3’，引物两端引入NdeI/NotI酶切位点。经NdeI及NotI双酶切，克隆入pET30a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，37℃培养至OD₆₀₀值为0.7左右时按1∶1000的稀释度加入1M/L的IPTG，30℃，180rpm过夜诱导表达，可得到分子量为约27KD的核蛋白。通过Ni柱亲和层析并经过透析、复性，得到纯化后的HB29-NP。ELISA检测应用：用0.1M NaHCO₃(pH9.6)的溶液包被纯化HB29-NP，包被量为5ng/μl，在96孔板中每孔加入100μl，4℃过夜；4％脱脂奶封闭，37℃1h，加入待测样本血清，37℃1h；加入酶标抗人IgG二抗(美国Sigma，1∶2000稀释使用)，37℃1h；显色液显色，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测吸光度A值。利用核蛋白ELISA法共检测33份病人急性期和恢复期双份血清样本，结果如表6所列数据表明：总样本数33份，ELISA检测病人双份血清4倍增高的阳性病例为31份，急性期血清样本可检测到的最高稀释度为1；25600。

实施例7间接免疫荧光(IFA)诊断

分别PCR扩增HB29核蛋白基因(HB29-NP)，糖蛋白基因(HB29-G)，糖蛋白基因(HB29-Gc)。设计引物时，全长糖蛋白(G)和糖蛋白(Gc)的扩增引物分别为GP-F：

5’-CTAGCTAGCCACCATGATGAAAGTCATCTGGTTC-3’；GP-R：

5’-GGGGTACCCTAAGCCAGCTTCGTCCTCGATC-3’；以及G2-F：

5’-CTAGCTAGCATGGATGAGATGGTCCATGCTGATT-3’；G2-R：

5’-CCGCTCGAGCTAAGCCAGCTTCGTCCTCGAT-3’，两端均引入NheI/KpnI酶切位点。核蛋白基因(NP)扩增引物为NP-F：

5’-CGGGGTACCCACCATGTCGGAGTGGTCCAGG-3’；NP-R：

5’-CGAGCTCCTAATGGTGATGGTGATGGTGAGAACCGCGTGGCACCAGCAGGTTTCTGTAAGC-3’，引入KpnI/SacI酶切位点。纯化的扩增产物经双酶切，将酶切后的片段回收，直接克隆到同样经双酶切的杆状病毒表达载体pAcUW51中，使目的基因在多角体启动子的控制下，获得重组质粒。通过将重组质粒转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达，表达采用美国Pharmogen公司的BaculoGold共转染试剂盒。操作方法略述如下：将5μg的重组质粒DNA与0.5μg的BaculoGold线性DNA混合混合后，利用试剂盒中的转染试剂转染生长密度为50％的Sf9细胞，27℃培养4天后，收集上清作为重组病毒的毒种进行滴定和扩增，具体操作见《Baculovirus expression vector system》。获得的表达HB29株的核蛋白(NP)，全长糖蛋白(G)，糖蛋白(Gc)的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，4～5天后收获感染细胞制成抗原片。利用间接免疫荧光检测病人血清：加入待测血清，37℃温育30min，冲洗，加入FITC标记的抗人IgG抗体(美国Sigma)，37℃温育30min，冲洗，晾干，荧光显微镜下观察。结果如图6所示，HB29株的核蛋白(NP)，全长糖蛋白(G)，糖蛋白(Gc)重组表达的Sf9昆虫细胞抗原片与病人血清反应均为阳性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.发热伴血小板减少综合征病毒，该病毒基因组编码：

I)a、SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的蛋白，或

b、SEQ ID No.4所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由a所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；

II)c、SEQ ID No.5所示氨基酸序列组成的蛋白，或

d、SEQ ID No.5所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由c所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；

III)e、SEQ ID No.6所示氨基酸序列组成的蛋白，或

f、SEQ ID No.6所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由e所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白；以及

III)g、SEQ ID No.7所示氨基酸序列组成的蛋白，或

h、SEQ ID No.7所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的由g所述蛋白衍生的具有同等功能的蛋白。

2.如权利要求1所述的病毒，其特征在于，该病毒基因组包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列同源性在95％以上的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述病毒的基因组。

4.权利要求1或2所述发热伴血小板减少综合征病毒产生的多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白。

5.编码权利要求4所述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白的基因。

6.含有权利要求5所述基因的载体。

7.含有权利要求6所述载体的宿主细胞。

8.权利要求1或2所述病毒，权利要求4所述多聚酶、糖蛋白、核蛋白或非结构蛋白，权利要求5所述的基因，权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备预防或治疗由发热伴血小板减少综合征病毒所致传染病的药物或疫苗及诊断试剂中的应用。

9.用于检测权利要求1或2所述病毒的引物和/或探针。

10.如权利要求9所述的引物和探针，包括：

I)L-F-3：5’-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTC/TAG-3’；

L-R-3：5’-TGTAAGTTCGCCCTTTGTCCAT-3’；

L-探针-3：5’-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3’；和/或

II)M-F-3：5’-AAGAAGTGGCTGTTCATCATTATTG-3’；

M-R-3：5’-GCCTTAAGGACATTGGTGAGTA-3’；

M-探针-3：5’-TCATCCTCCTTGGATATGCAGGCCTCA-3’；和/或

III)S-F-3：5’-GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA-3’；

S-R-3：5’-TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT-3’；

S-探针-3：5’-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-3’；

11.含有权利要求9所述引物和/或探针的检测试剂盒。

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