CN103954756A - 一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，包括反应滴定微孔板和包含有阴性对照、阳性对照，样品稀释液，HRP-鼠抗人IgG,底物液、显色液和终止液的检测试剂，反应滴定微孔板上包被有0.2ug/ml~0.4ug/ml的rSFTSN蛋白,样品稀释液中含有5ug/ml~10ug/ml的rRVFN重组蛋白,HRP-鼠抗人IgG酶中含终浓度5ug/ml-10ug/ml的rRVFN重组蛋白。本发明还公开了该试剂盒在制备用于人群感染的流行病学观察和疫苗免疫后抗体水平进行评估的诊断试剂中的应用。使用本试剂盒检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG，灵敏度可达99.8%；分析内精密度为2.5%（n=10），分析间精密度为4.5%（n=10）；特异性：99.5%。

Description

一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，本发明还涉及该试剂盒在制备用于人群感染的流行病学观察和疫苗免疫后抗体水平进行评估的诊断试剂中的应用。
背景技术
布尼亚病毒科( Bunyaviride) 是一类有包膜的负链RNA 病毒，目前已知的病毒至少有350 种，是虫媒病毒中病毒数最多的一科，包括能感染人和动物的布尼亚病毒属( Orthobunyavirus) 、白蛉病毒属( Phlebovirus) 、内罗毕病毒属( Nairovirus) 、汉坦病毒属( Hantavirus) 和感染植物的番茄斑萎病病毒属( Tospovirus)。其中白蛉病毒属目前国际上公认分成两大组，一组是致病性的白蛉热组( Sandfly fever group) ，如立夫特谷热病毒( Rift VallyFever Virus) 等，另一组是非致病性的乌库病毒组( Uuku-niemi group) ，一般对人类不致病，如乌库病毒( Uukunie-mi Virus) 等。近年来，河南、江苏、湖北、安徽、山东、辽宁、浙江等地相继发生发热伴血小板减少综合征( se-vere fever with thrombocytopenia Syndrome，SFTS) 病例，经证实其病原体为一种新布尼亚病毒，被称为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒( severe fever with thrombocyto-penia Syndrome bunyavirus，SFTSV )。新 发 现 的SFTSV 为白蛉病毒属的第三组病毒。SFTSV 电镜下病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约 80 nm ～100 nm，其基因组由大( L) 、中( M) 、小( S) 3 个单股负链 RNA 片段组成。病人感染 SFTSV 后引起 SFTS，主要表现为急性起病、发热、恶心、呕吐、腹泻、乏力、全身不适、肌肉酸痛、头痛、头晕，WBC、PLT 进行性下降等，可因多器官功能衰竭死亡。SFTSV 可以通过蜱虫叮咬传播，也可通过接触病人血液等传播。
国家疾控中心对其进行了病原学、流行病学、临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明，基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是对SFTS的免疫学检测试剂还未完善，使得评价该病毒感染缺乏一个对PCR结果的印证方法，也无法评估群体的既往感染水平及疫苗的保护作用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，该试剂盒适用于流行病学调查，也可作为临床诊断中发热伴血小板减少综合征病毒感染的辅助诊断。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，包括反应滴定微孔板和包含有阴性对照、阳性对照，样品稀释液，HRP-鼠抗人IgG, 底物液、显色液和终止液的检测试剂，所述反应滴定微孔板上包被有0.2 ug/ml ~ 0.4ug/ml 的rSFTSN蛋白,所述样品稀释液中含有5ug/ml ~10ug/ml的rRVFN重组蛋白,HRP-鼠抗人IgG酶中含终浓度5 ug/ml-10ug/ml 的rRVFN重组蛋白。
所述rSFTSN蛋白的制备方法为：按照NCBI：4J4R_A中序列合成SFTSN蛋白读框序列，将扩增后的序列插入PET30A构建PET30A-rSFTSN表达质粒，然后用PET30A-rSFTSN转化BL21DE3，再采用常规IPTG诱导表达6HIS-rSFTSN重组蛋白，Hitrap纯化6HIS-rSFTSN重组蛋白即可得到rSFTSN蛋白，并包被于反应滴定微孔板上。
所述rRVFN重组蛋白的制备方法为：按照NCBI：EU574085中序列合成RVFN蛋白读框序列，将扩增后的序列插入PET30A构建PET30A-rRVFN表达质粒，然后用PET30A-rRVFN转化BL21DE3，再采用常规IPTG诱导表达6HIS-rRVFN重组蛋白，Hitrap纯化6HIS-rRVFN重组蛋白即可得到rRVFN重组蛋白，并添加到样品稀释液和酶稀释液中。
本发明所述的试剂盒在制备用于人群感染的流行病学观察和疫苗免疫后抗体水平进行评估的诊断试剂中的应用。
本发明试剂盒适用于对人血清或血浆样品中SFTSN-IgG抗体的定性检测。由于机体受发热伴血小板减少综合征病毒刺激时，SFTS-IgG抗体比SFTS-IgM抗体出现时间稍晚，在急性期过后，SFTS-IgM抗体较快下降，而SFTS-IgG抗体可能长时间存在。
本发明采用ELISA分析法对人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG进行检测，微孔条上包被rSFTSN抗原，可与样品中rSFTSN抗体反应，加入HRP标记的抗人IgG抗体后，将形成“包被抗原-抗体-酶标抗人IgG”复合物。加入底物剂，复合物上连接的HRP使显色剂生成蓝色产物，终止后变为黄色。显色强度与rSFTSN-IgG抗体含量成正比,当待检样品中无rSFTSN-IgG抗体存在时，不显色。
实验表明，使用本发明试剂盒检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG，各项指标可达到：灵敏度：99.8%；精密度：分析内精密度为2.5%（n=10），分析间精密度为4.5%（n=10）；特异性：99.5%。
本发明所述试剂盒的主要质量指标包括灵敏度、特异性、精密性、稳定性，试剂质量指标达到2010版《中国药典》第三部，体外诊断类规程中的要求。
以本发明制备的试剂其检测灵敏度：4mIU/ml；特异性验证：与其它同科布尼亚病毒IgG抗体无交叉反应；精密性验证；试剂批间差异（CV%）不高于15%。
具体实施方式
本发明试剂盒的具体制备方法如下：
一、rSFTSN蛋白的表达和纯化
参照NCBI（4J4R_A）中序列，合成其N蛋白的读码框并分别在5’添加酶切位点NdeI，3’添加酶切位点XhoI。采用常规分子生物学方法，将该阅读框插入细菌表达质粒PET30A(novagen)的和之间，得到细菌表达质粒PET30A-rSFTSN。将该质粒常规转化E.Coli BL21DE3(novagen),按照厂商推荐的方法诱导表达rSFTSN重组蛋白，并用Hitrap(novagen)常规纯化rSFTSN重组蛋白，SDS-PAGE检测蛋白分子量和纯度，常规蛋白定量备用。
二、rRVFN蛋白的表达和纯化
参照NCBI（EU574085）中序列，合成其N蛋白的读码框并分别在5’添加酶切位点NdeI，3’添加酶切位点XhoI。采用常规分子生物学方法，将该阅读框插入细菌表达质粒PET30A(novagen)的和之间，得到细菌表达质粒PET30A-rRVFN。将该质粒常规转化E.Coli BL21DE3(novagen),按照厂商推荐的方法诱导表达rRVFN重组蛋白，并用Hitrap(novagen)常规纯化rRVFN重组蛋白，SDS-PAGE检测蛋白分子量和纯度，常规蛋白定量备用。
三、HRP-鼠抗人IgG制备
抗体标记：取辣根过氧化物酶溶于三蒸水中，加入过碘酸钠溶液活化，加入乙二醇反应，将反应混合物装入透析袋，用醋酸缓冲液透析，加入待标记物（是鼠抗人IgG特异性抗体）混匀，碳酸缓冲液调pH至碱性，加入NaHB4溶液反应后，装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析，分装后加入蛋白保护剂(含终浓度50%的甘油)，-20度保存。
四、制备人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒
检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，包括包被有0.2 ug/ml~0.4 ug/ml rSFTSN蛋白的96孔酶免透明聚苯乙烯白色反应滴定微孔板，工作浓度为0.11μg/ml的辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG特异性抗体（含5ug/ml ~10ug/ml rRVFN重组蛋白）；96孔酶免透明聚苯乙烯反应滴定微孔板包被rSFTSN重组蛋白：包被缓冲液采用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液；包被浓度0.2ug/ml ~0.4μg/ml,包被量100μl/孔，0℃~4℃包被过夜；弃去孔内液体，使用PBS-Tween洗液洗板孔1次；用PH7.4 PBS-2% Casein(m/v), 100μl/孔，室温封闭2h。
样品稀释液： 0.02 mol PBS-2% Casein(m/v) PH7.4（含5ug/ml~10ug/ml rRVFN重组蛋白）。
阳性对照制备：用样品稀释液稀释，人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG阳性的血清，到OD值0.6左右。
阴性对照制备：正常人血清。
五、本发明试剂盒的使用方法
本试剂盒于2-8℃保存，有效期6个月。使用前将试剂盒平衡至室温（约30分钟）。未用完的微孔板条须与干燥剂及其用自封袋密封2-8℃保存。实验前将液体试剂轻轻振荡混匀，使用后立即密闭放回2-8℃保存。
适用仪器
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm酶标仪。
样本要求
1）本试剂使用人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。
2）不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物、重度溶血的样品。
3）样品中应无微生物，无菌分离的样品可在2-8℃存储一周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。
4）使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冻存样品实验前需混匀。
试验前准备
1）取1包固体洗液用500ml蒸馏水溶解后备用。
2）取出试剂盒及待测样品，将所有试剂及样品恢复至室温（18-25℃）。
3）将恒温箱或水浴锅调至反应温度。
4）提前30分钟将发光底物A、B液等比例混合至本次试验所需体积。
实验步骤
1）配液：将固体洗涤剂用蒸馏水或去离子水（5g固体洗涤剂/500ml蒸馏水或去离子水）倍稀释。
2）编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔（用双波长检测，可不设空白对照孔）。
3）加稀释液：每孔加入样品稀释液100ul，空白孔除外。
4）加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照10ul，轻轻振荡混匀。
5）温浴：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟。
6）洗版：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤6遍，最后一次尽量扣干。
7）加酶：每孔加入酶标试剂100ul，空白孔除外，轻轻振荡混匀。
8）温浴：操作同5。
9）洗板：操作同6。
10）显色：每孔加入底物液、显色液各50ul轻轻振荡混匀，37℃避光显色10分钟。
11）测定：每孔加终止液50ul，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议用双波长450nm/600nm检测），用空白孔调零点后测定各孔的值。
六、检验结果
1）阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值≤0.10。（若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复实验）。
2）阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔A值≥0.4。
3）临界值（CUTOFF）计算：临界值=0.1+阴性对照孔评均值OD值阴性对照孔低于0.05者按0.05计算)。
有效性判断：阳性对照OD值≥0.4，阴性对照OD值≤0.1。
4）阴性判定：样品A值＜临界值（CUTOFF）者为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒-IgG抗体阴性。
5）阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF）者为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒-IgG抗体阳性。
6）检测标本情况（部分数据）：
标本 OD值
阳性对照 0.56
阴性对照 0.08
临床确认阳性标本 1.45
临床确认阳性标本 1.49
临床确认阳性标本 2.21
临床确认阳性标本 1.13
临床确认阳性标本 2.27
临床确认阳性标本 1.13
临床确认阳性标本 2.13
临床确认阳性标本 1.62
临床确认阳性标本 1.74
临床确认阳性标本 0.46
临床确认阳性标本 0.55
临床确认阳性标本 1.53
临床确认阳性标本 1.16
临床确认阴性标本 0.10
临床确认阴性标本 0.07
七、结论
本发明试剂盒检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG，各项指标可达到：灵敏度：99.8%；精密度：分析内精密度为2.5%（n=10），分析间精密度为4.5%（n=10）；特异性：99.5%。

Claims (4)

1.一种检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，包括反应滴定微孔板和包含有阴性对照、阳性对照，样品稀释液，HRP-鼠抗人IgG, 底物液、显色液和终止液的检测试剂，其特征在于：所述反应滴定微孔板上包被有0.2 ug/ml ~ 0.4ug/ml 的rSFTSN蛋白,所述样品稀释液中含有5ug/ml ~10ug/ml的rRVFN重组蛋白,HRP-鼠抗人IgG酶中含终浓度5 ug/ml-10ug/ml 的rRVFN重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，其特征在于：所述rSFTSN蛋白的制备方法为：按照NCBI：4J4R_A中序列合成SFTSN蛋白读框序列，将扩增后的序列插入PET30A构建PET30A-NP表达质粒，然后用PET30A-SFTSN转化BL21DE3，再采用常规IPTG诱导表达6HIS-rSFTSN重组蛋白，Hitrap纯化6HIS-rSFTSN重组蛋白即可得到rSFTSN蛋白。
3.根据权利要求1所述的检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒，其特征在于：所述rRVFN重组蛋白的制备方法为：按照NCBI：EU574085中序列合成RVFN蛋白读框序列，将扩增后的序列插入PET30A构建PET30A-rRVFN表达质粒，然后用PET30A-rRVFN转化BL21DE3，再采用常规IPTG诱导表达6HIS-rRVFN重组蛋白，Hitrap纯化6HIS-rRVFN重组蛋白即可得到rRVFN重组蛋白。
4.如权利要求1所述的检测人发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG的试剂盒在制备用于人群感染的流行病学观察和疫苗免疫后抗体水平进行评估的诊断试剂中的应用。
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CN108956588A (zh) * 2018-07-09 2018-12-07 东南大学 电化学发光免疫传感器用于制备严重发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒的应用

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