CN102368071B - 检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明“检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒”，属于医学检测试剂。包括抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的微孔板，异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物。该方法优势在于本底背景低、特异性高、亲和力强，同时有效降低批间差异，在免疫检测领域具有较大的应用价值。

Description

检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检测试剂，特别是一种检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)于1962年自非典型肺炎患者痰液中分离首次分离出，是一类介于细菌与病毒之间、无细胞壁、能在无生命培养基上生长繁殖的原核细胞生物，属于原生生物门、柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性非典型肺炎、社区获得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)的重要病原体，感染后还可引起脑炎、心肌炎、免疫性溶血性贫血、神经系统损害、肾脏损害、传染性单核细胞增多症和川崎病等并发症。

MP通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，可在全球范围内引起散发呼吸道感染或小流行，每间隔3-7年可发生一次地区性流行。MP感染发病率随研究对象、季节、诊断方法不同而变化。人类对MP普遍易感，其中5-20岁为高发人群。据估计，在门诊患儿中约有20-40％患儿感染MP，而住院CAP患儿中感染率为10-20％，CAP患儿MP感染阳性率与患儿年龄增高呈正相关。MP与其他病原的混合感染常使病程迁延，与肺炎链球菌混合感染率约为10％，与肺炎支原体混合感染率约为8.8％。

肺炎支原体感染人体后，经过2-3周的潜伏期，表现临床症状。发病初期有咽痛、头痛、发热、乏力、肌肉酸痛、食欲减退、恶心、呕吐等症状，一般中等热度，2-3天后出现明显的呼吸道症状，突出表现为阵发性刺激性咳嗽，以夜间为重，咳少量黏痰或黏液脓性痰，有时痰中带血，也可有呼吸困难、胸痛。除呼吸系统的表现外，支原体肺炎可伴发多系统、多器官损害。皮肤损害可表现为斑丘疹、结节性红斑、水疱疹等，胃肠道系统可见呕吐、腹泻和肝功损害，血液系统损害较常见溶血性贫血，中枢神经系统损害可见多发性神经根炎、脑膜脑炎及小脑损伤等，心血管系统病变偶有心肌炎及心包炎。因此，MP感染早期诊断对于尽早发现和治疗MP感染性疾病非常重要。

目前对MP的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、核酸检测技术、血清学诊断技术等方法。其中病原体分离培养技术由于技术条件要求高，操作繁琐，所需时间长等限制，不能解决临床快速诊断的需要，已逐渐为其他快速检测方法所取代。PCR法敏感性高、特异性强，尤其适用于MP早期快速诊断。但PCR因其敏感易受污染、易出现假阳性结果，且技术要求高，需要专门的仪器设备和技术人员，价格昂贵等原因限制了其在临床的普及发展。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用，成为最广泛应用的检测方法之一。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是近年来继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速等优点，作为放射性免疫分析、酶免疫分析的替代者，是当前最理想的免疫分析方法。目前没有见到基于化学发光免疫分析检测肺炎支原体的灵敏度高，稳定性好的试剂盒。

发明内容

本发明根据上述领域的存在的空白和需求，提供一种检测肺炎支原体IgM抗体的试剂盒，实验证明，具有本底背景低、特异性高、亲和力强，同时有效降低批间差异，在免疫检测领域具有较大的应用价值。

检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒，包括抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的固相载体，异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物，所述化学发光底物包括底物液A和底物液B，其中A液为的组成为：pH值为7.2～8.5，浓度为10～30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02～0.1％Proclin300，0.1～1.0％吐温-20和10mM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02～0.1％Proclin300，1.0～3.0mM的4-碘苯酚，0.1％～1％的BSA，0.1～1％的溴化十六烷基三甲基铵，10～50mM鲁米诺溶液。

所述抗异硫氰酸荧光素的单抗包被微孔板的包被浓度为：2ug/ml。

所述抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的微孔板通过以下步骤制得：用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成2ug/ml的抗异硫氰酸荧光素单抗包被液包被微孔板。

所述异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原通过以下步骤制得：

(1)肺炎支原体抗原用50mmol/L pH 9.6碳酸缓冲液在2～8℃条件下透析，

(2)异硫氰酸荧光素溶于二甲基亚砜中，终浓度为1mg/mL，

(3)按肺炎支原体抗原∶异硫氰酸荧光素为1mg∶150μg的比例将步骤(2)的溶液缓慢加入肺炎支原体抗原溶液中混合均匀，避光4℃反应8小时，加入NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时，

(4)将异硫氰酸荧光素标记抗原溶液在0.05mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液中透析，加入含0.1％(W/W)NaN3、1％(W/W)牛血清白蛋白，浓度为10mmol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存。

所述试剂盒还包括稀释液，洗涤液，支原体抗体IgM阴性对照、阳性对照、校准品，辣根过氧化物酶标记的抗人IgM。

所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗。

本发明以异硫氰酸荧光素(FITC)标记肺炎支原体抗原，同时以抗FITC单抗包被固相载体，建立间接包被肺炎支原体化学发光检测方法，该方法优势在于本底背景低、特异性高、亲和力强，同时有效降低批间差异，在免疫检测领域具有较大的应用价值。

本发明的试剂盒采用FITC单抗包被微孔板，与FITC标记抗原和待测样本中肺炎支原体IgM形成固相FITC单抗-FITC标记抗原-抗体复合物，再与标记的抗人IgM形成固相FITC单抗-FITC标记抗原-抗体-标记二抗夹心复合物，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，定性或半定量检测待测样本中肺炎支原体IgM抗体，从而避免了酶免试剂存在的灵敏度低、部分底物有毒或致癌等缺点，该试剂盒具有反应速度快、光信号不受温度变化影响、成本低、易储存、特异性高、产品批间差异小、生产方便等优势，可为临床肺炎支原体相关的急性呼吸道疾病辅助诊断提供更为特异、快速、可靠的诊断依据。

本发明的了一个主要的贡献在于提供了一种新的化学发光底物液配方，与采用现有常规底物液配方的试剂盒相比，具有灵敏度高，稳定性好等优点。

具体实施方式

实施例1、本发明的试剂盒制备方法

1、本发明的试剂盒包括：

1)肺炎支原体IgM阳性对照；2)肺炎支原体IgM阴性对照；3)肺炎支原体IgM校准品；4)包被FITC单抗的微孔板；5)FITC标记的肺炎支原体抗原；6)抗人IgM酶标记物；7)20倍浓缩洗涤液；以及8)化学发光底物液。

其中，微孔板为24、48或96孔的微孔板条；所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗；所述酶辣根过氧化物酶。

2、本发明I号试剂盒的制备方法：

以肺炎支原体IgM阳性血清配制阳性对照，以健康人血清配制阴性对照，以肺炎支原体IgM阳性血清配制校准品，微孔板包被FITC单抗，FITC标记肺炎支原体抗原，酶标记抗人IgM，配制化学发光底物，分装上述组份，以及组装为成品。

2.1微孔板包被抗FITC单抗：

2.1.1包被

用50mM pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成包被浓度为2ug/ml的FITC单抗包被液，并将包被液负载于微孔板(100ul/孔)，2-8℃包被18-24小时。

2.1.2封闭用含5％BSA，pH值为7.0-7.5，浓度为10mM的Tris缓冲液作为封闭液封闭上述洗涤后的固相载体。

2.2酶标抗人IgM抗体的制备采用改良的过碘酸钠法。具体步骤参见《生物化学与生物物理学报》16卷1984年第6期，骆加里等“过碘酸钠氧化辣根过氧化物酶(HRP)中的若干问题及高效果的标记方法”。

2.3FITC标记肺炎支原体抗原的制备

将肺炎支原体(购自广州贵翔)2mg用50mmol/L pH 9.6碳酸缓冲液在2～8℃条件下透析，将FITC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，终浓度为1mg/mL，按抗原∶FITC＝1mg∶150μg的比例将FITC二甲基亚砜溶液缓慢加入待标记抗原溶液中混合均匀，暗处4℃反应8小时，加入5mol/L的NH4Cl溶液至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时，将FITC标记抗原溶液在0.05mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液中透析至透析液清亮，加入0.1％(重量)NaN3、1％(重量)牛血清白蛋白(BSA)pH 7.2的10mmol/L磷酸盐缓冲液中，4℃暗处保存。

2.4FITC标记抗原、酶标记抗体稀释液的配制

2.5FITC标记支原体抗原和酶标记抗人IgM工作液的配制

将制备的FITC标记抗原、酶标记抗人IgM抗体用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度标记抗原、标记抗体工作浓度为(V/V)1∶3000，1∶6000。

2.620倍洗涤液

2.7HRP化学发光底物

A液和B液各1瓶，A液和B液各1瓶，其中A液为的组成为：pH值为8.0，浓度为10mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.02％Proclin300，1.0％吐温-20和10mM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.02％Proclin300，2mM的4-碘苯酚，0.1％的BSA，0.1％的溴化十六烷基三甲基铵，10Mm鲁米诺溶液。

II号试剂盒：

其它同I号试剂盒，HRP化学发光底物的配方为：A液和B液各1瓶，其中A液为的组成为：pH值为8.0，浓度为30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.05％Proclin300，0.5％吐温-20和10mM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.05％Proclin300，3mM的4-碘苯酚，1％的BSA，1％的溴化十六烷基三甲基铵，50mM鲁米诺溶液。

III号试剂盒：

其它同I号试剂盒，HRP化学发光底物的配方为：A液和B液各1瓶，其中A液为的组成为：pH值为8.0，浓度为20mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度(V/V)为0.04％Proclin300，0.1％吐温-20和10mM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCI缓冲液中加入终浓度(W/V)为0.04％Proclin300，2mM的4-碘苯酚，0.7％的BSA，0.4％的溴化十六烷基三甲基铵，30mM鲁米诺溶液。

对照试剂盒：其它同I号试剂盒，而化学反光底物为市售化学发光底物(A液为过氧化脲溶液，B液为鲁米诺溶液，购自湖州英创生物科技有限公司)。

3、本发明的试剂盒的使用方法

1)自2-8℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

2)取出包被板条，插入板架上。

3)每次试验设阴性对照、阴性对照、校准品各2孔每孔50ul，预稀释(1∶100)的待测样本50ul，然后每孔加入50ul FITC标记抗原，振荡混匀后37℃温育30分钟。

4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

5)每孔分别加入100μL酶标记物，37℃温育20分钟。

6)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

7)各孔加化学发光底物液A、B各50μL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20～25℃)避光反应5分钟。

8)必须于加化学发光底物液后的第5～30分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

9)以校准品临界值，定性或半定量判定待测样本中是否存在肺炎支原体IgM抗体或其含量

4、本发明的试剂盒与酶联免疫试剂的平行对比试验

对正常对照样本358例，呼吸道感染样本254例(源自梧州市肿瘤防治研究所)采用本发明的试剂盒(化学发光法)与肺炎支原体IgM抗体检测试剂(酶联免疫法)(试剂盒购自广州贵翔)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。

表1.肺炎支原体IgM抗体检测试剂(酶联免疫法)测定结果

表2.本发明的试剂盒测定结果

表3.本发明试剂盒与肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)比对

表1-3所述数据表明，本发明试剂盒与对比酶联免疫检测试剂盒的阳性符合率为90.4％，阴性符合率为99.6％，两种检验方法的符合率为98.2％。经验证，酶联免疫检测试剂盒检出2份假阳性、9份假阴性，而本发明试剂盒检测结果与临床结果完全相符。

II号试剂盒、III号试剂盒对比检测实验结果与I号试剂盒相符。

实施例2.本发明试剂盒发光底物与市售化学发光底物液对比试验

对照试剂盒：与实施例1的试剂盒相同，区别在于化学发光底物采用市售常规的化学发光底物液(购自湖州英创生物科技有限公司)。

步骤1.检测样本为实施例1中呼吸道感染样本254例及健康人血样。

检测操作步骤同实施例1步骤3的使用方法。结果如下表所示。

表4.本发明I号试剂盒化学发光底物与市场销售的化学发光底物比对

表4所述数据表明，本发明I号试剂盒化学发光底物与对比化学发光底物的阳性符合率为91.5％，阴性符合率为100％，两种检验方法的符合率为98.7％。经验证，对比发光底物检出8份假阴性，而本发明试剂盒检测结果与临床结果完全相符。

II号试剂盒、III号试剂盒对比检测实验结果与I号试剂盒相符，说明本发明比采用对照发光底物的试剂盒具有更高的检测灵敏性。

步骤2.本发明的I号试剂盒、II号试剂盒、III号试剂盒2-8℃保存6个月后，用于检测步骤1的同一批样本，结果显示，阳性检出率未发生变化，与临床验证结果相符率为100％。而采用对照发光底物的试剂盒，2-8℃保存6个月后，假阴性比例由8/94提高到11/94，说明本发明的试剂盒中化学发光底物具有良好的稳定性，适于批量大量生产，检测结果稳定可靠。

Claims (6)

1.检测肺炎支原体IgM抗体的化学发光免疫试剂盒，包括抗异硫氰酸荧光素的单抗包被的微孔板，异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原、辣根过氧化物酶标记的抗人IgM和化学发光底物，所述化学发光底物包括底物液A和底物液B，其中A液的组成为：pH值为8.0，浓度为10～30mM的磷酸盐缓冲液中加入终浓度为0.02～0.05%(W/V)Proclin300，0.1～1.0%(W/V)吐温-20和10mM过氧化脲溶液；B液为50mM的Tris-HCl缓冲液中加入终浓度为0.02～0.05%(W/V)的Proclin300，2.0～3.0mM的4-碘苯酚，0.1%～1%(W/V)的BSA，0.1～1%(W/V)的溴化十六烷基三甲基铵，10～50mM鲁米诺溶液。

2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述抗异硫氰酸荧光素的单抗包被微孔板的包被浓度为：2μg/mL。

3.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述抗异硫氰酸荧光素单抗包被的微孔板通过以下步骤制得：用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成2μg/mL的抗异硫氰酸荧光素单抗包被液包被微孔板。

4.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述异硫氰酸荧光素标记的肺炎支原体抗原通过以下步骤制得：

（1）肺炎支原体抗原用50mmol/L pH9.6碳酸缓冲液在2～8℃条件下透析，

（2）异硫氰酸荧光素溶于二甲基亚砜中，终浓度为1mg/mL，

（3）按肺炎支原体抗原：异硫氰酸荧光素为1mg:150μg的比例将步骤（2）的溶液缓慢加入肺炎支原体抗原溶液中混合均匀，避光4℃反应8小时，加入NH₄Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时，

（4）将异硫氰酸荧光素标记抗原溶液在0.05mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液中透析，加入含0.1%（W/W）NaN₃、1%（W/W）牛血清白蛋白，浓度为10mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存。

5.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述试剂盒还包括稀释液，洗涤液，支原体抗体IgM阴性对照、支原体抗体IgM阳性对照、支原体抗体IgM校准品，辣根过氧化物酶标记的抗人IgM。

6.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，所述抗人IgM为羊抗人IgM多抗、兔抗人IgM多抗或鼠抗人IgM单抗。