CN103937910A - 检测巴贾病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒和方法，检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒中包括2×RT-PCR Buffer，25×RT-PCRenzymeMix，上下游引物，探针，所用引物和探针的核酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；阴性对照，阳性对照。本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测巴贾病毒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒和方法。
背景技术
巴贾病毒(Bhanja Virus)属于布尼亚病毒科巴贾病毒组成员，最近被分到白蛉病毒属中。该病毒于1954年在印度的蜱中被分离到，主要分布于亚洲、非洲和欧洲等地。人和家畜可被携带有该病毒的蜱虫叮咬而感染，出现中枢神经系统症状，不但造成人类疾病和死亡，更会造成家畜死亡，导致经济损失，引起公共卫生问题。
目前，巴贾病毒检测的金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、在实际工作中难以推广应用。近年来应用广泛的常规核酸扩增及实时荧光定量PCR在病毒的检测方面发挥了重要作用。但是，鉴于蜱虫样本中病原载量较低等原因，建立一种快速、灵敏的检测技术，更利于蜱中载量较低的病毒检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测巴贾病毒的核酸序列。本发明利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，建立一种快速、敏感的检测方法，应用于巴贾病毒的监测检测。
本发明还提供一种用于检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。
本发明采用以下技术方案：
一种用于RT-PCR检测巴贾病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。
一组用于检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述作为阳性对照为包含有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
一种检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括：
2×RT-PCR buffer；
25×RT-PCRenzymeMix；
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；
阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
阳性对照：包含有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的基因。
如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3中任一一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMARA、BHQ2中任一一种。
一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR方法检测巴贾病毒的非诊断性方法，该方法包括以下步骤：
(1)从样品中提取病毒RNA；
(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下配制：1×RT-PCR Buffer，1×RT-PCR Enzyme Mix，上游引物：核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针：核苷酸序列如SEQID No.3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度为0.01～1μM，样品RNA；同时设置无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照；
实时荧光RT-PCR反应程序：
(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了比较高效、灵敏的巴贾病毒的快速检测方法，提供实时荧光RT-PCR检测试剂盒。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病毒分离来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。本发明的检测试剂盒最低检出限为0.85×10-6ng/μL。
附图说明
图1为巴贾病毒普通PCR检测的电泳图。
图2为本发明荧光定量PCR试剂盒检测巴贾病毒的扩增曲线。
图3为本发明荧光定量PCR试剂盒检测巴贾病毒的扩增标准曲线。
图4为巴贾病毒荧光定量PCR特异性扩增曲线。
图5为利用本发明试剂盒对样品的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1普通PCR检测巴贾病毒
在本发明引物和探针设计中，筛选巴贾病毒S基因片段的保守序列，设计一对寡聚核苷酸序列(引物)和探针，利用引物可特异地扩增巴贾病毒的S基因片段，引物扩增片段大小为166bp，核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。SEQ IDNo.4：GATGGTTGCATACACTGATATCCTTAAGGAGTTCGGTGAGGACATCATCGATGATGAGGTCGTTGGCGGTCTGGAGGCGCTGTTTGCCTATCAAGGCTTTGACCCAACCAGGATGCTGAAGAAGATGGCTGACATTGACAAGGATGGCTGGAAAGATGATGCCAAG。
设计的引物和探针如下：
BHAV-F(SEQ IDNo.1)：5′-GATGGTTGCATACACTGA-3′
BHAV-R(SEQ IDNo.2)：5′-CTTGGCATCATCTTTCCA-3′
BHAV-P(SEQ IDNo.3)：5′-ATCCTTAAGGAGTTCGGTGAGGA-3′
应用设计的引物对巴贾病毒进行普通PCR扩增，采用25μL反应体系：BHAV-F、BHAV-R引物终浓度各为0.4×103nmol/L；Mg2+终浓度2mmol/L；dNTP终浓度为0.8×106μmol/L；1×PCRbuffer；Taq聚合酶用量1unit，模板2μL。
PCR扩增反应条件为：
94℃预变性2分钟，接着进行循环反应：94℃变性20秒，54℃退火10秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟；
对扩增产物进行电泳：阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为携带有如序列表SEQ ID No.4所示序列的质粒DNA，起始浓度为8.5ng/μL，并按10倍比进行梯度稀释。
结果如图1所示，所设计的引物可有效扩增巴贾病毒。
实施例2巴贾病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒制备
巴贾病毒实时荧光RT-PCR检测试剂和包括以下成分：
2×RT-PCR Buffer；
25×RT-PCRenzymeMix；
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
其中，所述2×RT-PCR Buffer和25×RT-PCRenzymeMix可选用ABI公司AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit；引物、探针、质粒委托上海英骏生物技术有限公司合成，探针在合成时探针5＇端连接FAM荧光基团和3＇端连接BHQ1淬灭基团。
实施例3巴贾病毒实时荧光RT-PCR检测的方法
本发明检测巴贾病毒方法包括以下步骤：
(1)病毒RNA提取
病毒RNA提取可选用QIAamp Viral RNA提取试剂盒进行提取。
(2)RT-PCR扩增
采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表1。
表1反应体系
扩增条件：采用以下扩增条件。
(3)收集荧光信号信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，即样品中含有巴贾病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
本发明所述的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为FAM-BHQ1，其它荧光淬灭基团组合也同样适用，比如，CY3-TAMARA、CY3-BHQ2、FAM-BHQ2、CY3-BHQ1等，检测时选择相应的荧光检测模式。
上述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。
实施例4本发明试剂盒灵敏度的检测
选择含有扩增序列的巴贾病毒质粒作为阳性标准品，将提取的DNA从10-1依次稀释到10-6进行检测；巴贾病毒质粒由上海生工合成。
1)阴性对照：巴贾病毒阴性的蜱RNA；
2)NTC：无核酸酶水；
3)反应体系按照实施例3中表2进行配制，每个梯度做三个平行样。
检测结果如图2所示。图2中1-5曲线从左往右分别为标准品用无核酸酶水浓度稀释度为10-1-10-5扩增的曲线。结果判定：Ct值低于35为阳性结果，超过38为阴性结果。
我们从图中可以得出结论引物和探针检测阳性标准品的检测灵敏度为0.85×10-5ng/μL。
实施例5本发明试剂盒的特异性检测
1)选择巴贾病毒HB29株做为阳性对照(PTC)；
2)阴性对照：无核酸酶水；
3)模板：选择发热伴血小板减少综合征病毒、汉滩病毒、汉城病毒进行非特异性测试，上述模板均由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所提供。
4)反应体系按照实施例3中表2进行配制。
检测结果如图2，结果表明，所建立的巴贾病毒通用型实时荧光PCR方法及其试剂盒对于除巴贾病毒外的其他病毒没有特异性的扩增，表明引物及探针设计特异性强。
实施例6巴贾病毒实时荧光PCR标准曲线的制作
1)选择巴贾病毒阳性质粒做为标准品，将其浓度从0.85ng/μL依次稀释到0.85×10-6ng/μL，选择10-1-10-6作为模板；
2)阴性对照：灭菌超纯水；
3)反应体系按照实施例3中表2进行配制。
检测结果如图3所示，巴贾病毒通用型实时荧光PCR的标准曲线为：R2＝0.989；其中，X轴表示相应的校正后报告荧光强度的对数，Y轴循环次数。
实施例7：本发明试剂盒检测未知样本
利用本发明试剂盒，对黑山头蜱虫样本88份进行检测，具体实验步骤如下：
(1)病毒RNA提取
病毒RNA提取可选用天跟DNA、RNA共提取试剂盒进行提取。
a.匀浆处理：
在蜱虫样本中加入适量裂解液RLplus，用电动或玻璃匀浆器将样品彻底研磨，涡旋震荡30sec。
b.12,000rpm(13,400×g)离心3-5min，小心吸取上清至吸附柱CB3(吸附柱CB3放在2ml离心管中)，12,000rpm(13,400×g)离心。
总RNA提取
c.向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀。
d.得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
e.向吸附柱CR3中加入700μl去蛋白液RW1，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
f.向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
g.重复步骤f。
h.12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
i.将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml RNase-Free离心管中，加入30-100μlRNase-FreeddH2O室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。
(2)实时荧光RT-PCR扩增
采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表1。
表1反应体系
扩增条件：采用以下扩增条件。
(3)收集荧光信号信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，即样品中含有巴贾病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
本发明所述的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为FAM-BHQ1。
在黑山头蜱虫样本88份中，共检测出一个阳性样本，检测结果如图5所示，经测序验证结果正确，证明本发明试剂盒检测结果准确、可靠。
Claims (5)
1.一种用于RT-PCR检测巴贾病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
2.一组用于检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，其特征在于，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述作为阳性对照为包含有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
3.一种检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
2×RT-PCR buffer；
25×RT-PCRenzymeMix；
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；
阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
阳性对照：包含有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的基因。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM、CY3中任一一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMARA、BHQ2中任一一种。
5.一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR方法检测巴贾病毒的非诊断性方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)从样品中提取病毒RNA；
(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下配制：1×RT-PCR Buffer，1×RT-PCR Enzyme Mix，上游引物：核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度为0.01～1μM，样品RNA；同时设置无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照；
实时荧光RT-PCR反应程序：
(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
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