CN103320524B - 简套式荧光rt-pcr法检测sftsv用的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供的简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，其中包含有两种外引物和两种内引物和一种探针，它们的DNA序列分别为：外引物一P1：5’-agt tca cag cag cat gga gag gat -3’外引物二P2：5’-agg ttg atg gca ctc cag gag aaa -3’内引物一P3：5’- agt tca cag cag cat gga gag gat -3’内引物二P4：5’- act ctc tgt ggc aag atg cct tca -3’探针：5’-FAM-ttg ctg gct ccg cgc atc ttc aca tt-TAMRA -3’。与现有技术相比，本发明试剂盒在应用中有高度的特异性、高度的敏感性与重现性并且快速、简单、可靠，检测时间从8小时缩减到3小时。

Description

简套式荧光RT-PCR法检测SFTSV用的试剂盒

技术领域

本发明涉及的是一种简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的测试盒。

背景技术

2009年中国疾病预防控制控中心专家在河南省提供的一份患者血液标本中分离到一株新型布尼亚病毒。2010年，中国疾病预防控制控中心通过对多省出现的不明原因发热伴血小板减少综合征（SFTS）病例的监测，通过序列非依赖核酸扩增技术从患者血清中同时发现新型布尼亚病毒基因序列，经对新型布尼亚病毒全基因组信息的解析并结合电子显微镜形态学分析，确定为该新型布尼亚病毒为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（Sever fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV）。流行病学调查发现，从事野外作业人群易被病毒感染，潜伏期7-9天，始于3月，高峰期在5-7月，可以延续至11月份。主要临床表现为突然起病、发热、乏力、纳差、恶心、呕吐等，部份有头痛、肌肉酸痛、腹泻等症状病情严重者会出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭弥漫性血管内凝血（DIC）等多脏器衰竭死亡，死亡率约12%，SFTS疑似患者血清阳性检出率在70%左右。对于因SFTSV感染引起的SFTS，目前没有有效的疫苗可供使用也无特异性治疗手段，主要为对症支持疗法，因此快速、敏感、特异的检测诊断尤为重要。

人类在传染病控制中，诊断、治疗和预防是三个关键环节，其中及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础也是制定正确预防策略的依据。

目前用于新型布尼亚病毒RNA的检测方法主要有荧光RT-PCR，荧光RT-PCR是20世纪90年代未发展起来的一种检测方法，与常规RT-PCR、ELISA等检测方法相比具有操作简单、实时快速、定性定量、特异敏感、重复性好、不易污染、高通量等优点，是目前各种病毒检测诊断的主流方法。虽然荧光RT-PCR具有上述优点，但针对发热伴血小板减少综合征病人血清中新型布尼亚病毒的检测敏感性不甚理想。如在2012年中国舟山市发现的由新型布尼亚病毒引起的SFTS病人为20例，多数病人血清中病毒载量偏低，荧光RT-PCR方法易造成漏诊，病人入院后首份血清荧光RT-PCR检测结果，Ct值＜30的占20.0%、Ct值在30—35的占40.0%、Ct值＞35的占40.0%。荧光RT-PCR检测方法的阳性判定阈值一般设置在Ct值＜35左右，对于Ct值＞35的样本需重新检测或判为阴性，由此造成的不能及时诊断或漏诊现象给临床治疗与疾病控制带来较大的困难，因此建立比荧光RT-PCR更为敏感的方法势在必行。

另一种可以用于新型布尼亚病毒RNA的检测的方法是套式RT-PCR，套式RT-PCR方法具有高度敏感、高度特异的优点。套式PCR技术是上世纪80年代发展起来的，多用于普通检测方法难以检查到的浓度极低的范本（一个或数个拷贝），能大大增加扩增的效率和忠实性，对样品中微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于发热伴血小板减少征病人急性期血清与蜱虫、啮齿类动物等传播媒介体内新型布尼亚病毒微量模板的扩增，但套式RT-PCR方法存在结果判断需要电泳、操作相对繁琐、检测时间长（8小时左右）、容易污染等缺点。

发明内容

针对上述不足，本发明所要解决的技术问题是如何适应集上述荧光RT-PCR和套式RT-PCR两种方法优点并去除其缺点而提出的简套式荧光RT-PCR的要求，以使对SFTSV的检测具有高度敏感特异、不易污染、操作简单、实时快速、重复性好等优点，设计出一套简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒。

本发明提供的简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，其中包含有两种外引物和两种内引物和一种探针，其中两种外引物的DNA序列分别为：

外引物一P1：5’-agt tca cag cag cat gga gag gat -3’

外引物二P2：5’-agg ttg atg gca ctc cag gag aaa -3’

两种内引物的DNA序列分别为：

内引物一P3：5’- agt tca cag cag cat gga gag gat -3’

内引物二P4：5’- act ctc tgt ggc aag atg cct tca -3’

探针的DNA序列为：5’-FAM-ttg ctg gct ccg cgc atc ttcaca tt-TAMRA -3’。

使用本发明简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

A：提取待检样品RNA。

B：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（P1、P2）进行一步法RT-PCR。

C：以上述一步法RT-PCR产物为范本，将内引物（P3、P4）及探针和反应组分置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应。

D：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集荧光曲线形态和Ct值判定结果。

为了提高荧光PCR反应的灵敏度和特异性，确定最佳退火温度和循环次数，上述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为：50℃ 30min，94℃2min，1个循环；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，20个循环；72℃延伸5min。

上述步骤C中荧光PCR的反应参数为：95℃ 15s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 31s，45个循环后收集荧光。

所述步骤B中阳性对照设立方法为：选取新型布尼亚病毒（HM802204.1）S基因上1084-1459的序列构建成质粒DNA片段然后导入JM109感受态细胞增殖，提取JM109感受态细胞中的质粒DNA，按一定浓度稀释后作为阳性对照；采用5份正常人群等量混合血清提取的RNA液作阴性对照。

所说外引物一P1的浓度为20μM，外引物二P2的浓度为20μM；所说内引物一P3的浓度为10μM，内引物二P4的浓度为10μM；探针浓度为5μM。

本发明提供的简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，还包含有阳性对照、阴性对照、PCR反应体系试剂，以及包含两种外引物和两种内引物和一种探针在内的PCR反应体系试剂，其中PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系；

所说一步法RT-PCR反应体系的组分包括：20μM的外引物一P1和20μM的外引物二P2各0.5μL的混合液1.0μL，Prime Script Step Enzyme Mix 1.0μL，2×Step Buffer 12.5μL，DEPC处理水5.5μL，范本RNA溶液5.0μL，总量25μL；

所说荧光PCR反应体系的组分包括：10μM的内引物一P3和10μM的内引物二P4和5μM探针各0.5μL的混合液1.5μL，50×ROX Reference0.5μL，2×Premix Ex Taq 12.5μL，DEPC 处理水8.0μL，范本RNA溶液2.5μL，总量25μL；

所说范本RNA是样品RNA或样本RNA的第一次扩增液或阳性对照或阴性对照，但所说范本RNA不包括在试剂盒中的PCR反应体系试剂中。

为解决发热伴血小板减少征病人急性期血清中病毒载量偏低以及传播媒介蜱虫啮齿类动物体内新型布尼亚病毒较难检出等实际情况，以本发明为基础建立的简套式荧光RT-PCR方法兼并了荧光定量RT-PCR操作简单、实时快速、不易污染以及套式RT-PCR的高度特异、高度敏感的各自优点，与现有技术相比，其先进性主要体现在以下几点：

1、高度的特异性：简套式RT-PCR经过第一轮扩增（外套引物）基本排除了非靶基因核酸序列，其产物已是比较纯的第二轮扩增用的范本。另外，内引物的使用可有效地避免了引物设计而产生的非特异性扩增，这样在第二轮扩增中错误扩增的可能性降至极低，明显减少了引物的非特异行扩增，增加了对靶基因检测的可靠性，荧光探针经去羟基化处理，不会在Taq酶作用下发生延伸，它只能与待检模板完全匹配的结合才会发生荧光报告基团的切割，产生荧光信号，排除了引物的非特异性扩增而导致的假阳性。一般情况下，TaqMan探针与范本之间的碱基错配超过4个以上就无法与范本结合，而第二轮PCR循环（收集荧光步骤）较高的退火温度（60℃），排除了范本的非特异性扩增，使得本方法具有高度特异性，可准确地检测新型布尼亚病毒而Hanta病毒、甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16等病毒检测均为阴性。

2、高度的敏感性与重现性：套式RT-PCR外引物与内引物的使用，使得靶基因经过两次PCR有效扩增，十分明显地增加了检测的敏感度，套式RT-PCR比普通RT-PCR更敏感，敏感性是普通RT-PCR的100-1000倍，因此套式RT-PCR方法对样品中极微量靶基因扩增非常有效。另外，荧光检测的敏感度显著高于肉眼观察电泳条带的敏感度，其敏感度约是肉眼观察的100倍，用荧光信号作为指示剂显示扩增产物的量能获得较高的检测精度。因此简套式荧光RT-PCR具有比荧光RT-PCR、套式RT-PCR更高的敏感性与重现性。

3、快速、简单、可靠：简套式荧光RT-PCR改变了经典套式RT-PCR方方法第一次扩增的参数，由30个PCR循环（放大倍数=2³⁰，约为100万倍）减少为20个循环（放大倍数=2²⁰），这不仅缩短了检测时间还避免了经典套式PCR的超大剂量放大带来的产物污染问题同时还能把受检的大多数样品Ct值控制在15—30之间，使检测样品的扩增曲线形态呈典型的‘S’形，另外，简套式荧光RT-PCR还改变了经典套式法需两次扩增两次电泳的步骤，直接用外套扩增产物加入到荧光PCR的反应体系中进行内套引物扩增，使整个检测过程与检测结果比套式RT-PCR更为简单、快速与可靠。

4、检测时间：简套式RT-PCR的检测时间；病毒核酸提取需30分钟，一步法RT-PCR需90分钟，荧光定量PCR需45分钟，因此从收到血清样本到获得检测结果3小时内即可完成，而经典的套式RT-PCR则需8小时左右。对传染病应急检测方法评估指标除了特异、敏感外检测时间长短也是重要指标。

具体实施方式

本发明配制简单、质量可靠：本试剂盒关键组分（引物、探针、阳性对照、阴性对照、DEPC处理水）由本实验室配制外，其余组分（逆转录酶、Taq酶、Buffer等）均购自宝生物工程（大连）有限公司，因此使繁复的RT-PCR反应体系配制转变成十分简单与稳定，从而达到质量可靠的目的。

1、一试剂盒，内含简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的引物和探针共5支，具体是：

2、一试剂盒，除上例试剂外，还包含有标准cDNA模板（重组质粒pMD-19T-SFTSV）或阳性对照、阴性对照。

所说阳性对照是重组质粒经过浓度调整的产物，即标准cDNA模板和阳性对照都源自重组质粒。

A、阳性对照的建立：

将靶序列（376bp）进行基因合成，再将合成的靶基因片段与pMD-19T载体连接，然后导入JM109感受态细胞，构建重组质粒，并经测序确认后完成。

新型布尼亚病毒（HM802204.1）阳性对照范本RNA的建立方法，是先根据新型布尼亚病毒（HM802204.1）S基因上1084-1459的序列，人工合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段。把完整的双链DNA片段连接到质粒pMD-19T，再把连接液全量转化至E.coli Competent Cell JM109。对平板上的E.coliCompetent Cell JM109菌落用M13-47/RV-M引物进行PCR，检测所含质粒(pMD-19T-SFTSV)中插入片段的长度大小，经测序鉴定插入片段与新型布尼亚病毒（HM802204.1）S基因上1084—1459的序列完全一致，长度为376bp，与引物设计时的预计扩增长度相符，重组质粒测序结果如下：

1084 agttcac agcagcatgg agaggatccc tgaaggagtt gtaaacttct gtcttgctgg

1141 ctccgcgcat cttcacattg atagtcttgg tgaaggcatc ttgccacaga gagtaggcct

1201 ccatcagggt cttggttgtg gcttcagata cccccgcagt tggaatcagg gacccaaagg

1261 ccatgcacat catctcaggg ggataattct cgaccttcag gttcatgacg gctggcccca

1321 ctgggagata ctcctttaag gctgctgcag cagcacatgt ccaagtggga aggctctgcg

1381 ctaccctcac aggagtgatt gagagcctgg tctctgccct ctcaaccagt ccatatttct

1441 cctggagtgc catcaacct

将上述序列提交NCBI BLAST Server进行比对，比对结果显示：本试验所扩增的片段在GenBank上登录的中国各省新型布尼亚病毒S基因的相应片段高度同源性，覆盖范围（Query coverge）为100％、最大相似率(MAX ident)为96—100%，由此表明：构建的阳性质粒可在中国各省使用，即构建的重组质粒pMD-19T-SFTSV也可以作为标准cDNA模板。为避免重组质粒模板浓度太高造成样品之间污染，使用前需按一定浓度稀释后作为阳性对照，一般该重组质粒用无菌DEPC处理水稀释至10^-6左右，或对阳性对照的Ct值控制在25左右。该阳性对照具有使用方便、性质稳定、无生物安全风险。

B、阴性对照的建立：用5份正常人群血清等量混合后用RNA提取试剂QIAGEN:74104（德国QIAGEN公司出品）提取的RNA液作阴性对照，该提取液经简套式荧光RT-PCR 3次检测均为阴性。

3、一试剂盒，除上两例试剂外，还包含有2×Step Buffer、PrimeScript Step Enzyme Mix、2×预混反应液（Premix Ex Taq）、50×ROX Reference Dye、DEPC处理水。

4、一试剂盒，有20μM外引物一P1、20μM外引物二P2、10μM内引物一P3、10μM内引物二P4、5μM探针各一支，每次各13μL，共25个人份。

5、一试剂盒，包含有阳性对照和阴性对照，还有分组放置的一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系所用试剂的同一反应次数的量，每次反应所用的试剂及量包括：

一步法RT-PCR反应体系试剂：20μM的外引物一P1和20μM的外引物二P2各0.5μL的混合液1.0μL，Prime Script Step Enzyme Mix1.0μL，2×Step Buffer 12.5μL，DEPC处理水5.5μL。

荧光PCR反应体系试剂：10μM的内引物一P3和10μM的内引物二P4和5μM探针各0.5μL的混合液1.5μL，50×ROX Reference 0.5μL，2×Premix Ex Taq 12.5μL，DEPC 处理水8.0μL。

6、PCR反应

A套式荧光RT-PCR步骤：

①一步法RT-PCR

取待检样本（血清、血浆、等）提取病毒RNA模板，及上述制备的阳性和阴性对照。提取样本RNA采用德国QIAGEN公司的病毒RNA提取试剂盒（QIAGEN:74104），并按其说明书进行。以2×Step Buffer 12.5μL、Prime Script  Step Enzyme Mix 1.0μL 、20μM的外引物一P1和20μM外引物二P2各0.5μL的混合液1.0μL、所提取的RNA范本5.0μL和DEPC处理水5.5μL配制成反应混合液25μL，进行一步法RT-PCR。反应参数为：50℃ 30min，94℃2min，1个循环；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s,20个循环；72℃延伸5min。

②荧光PCR

以一步法RT-PCR的产物为范本。将于Eppendoff管中充分混匀后的荧光PCR反应体系分装到ABI7500荧光PCR仪专用板孔中（22.5μL/孔），其中每孔包含有2×Premix Ex Taq 12.5μL、50×ROX Reference0.5μL、10μM内引物一P3和10μM内引物二P4和5μM探针各0.5μL的混合液1.5μL、DEPC 处理水8.0μ。然后每孔加RNA范本2.5μL，再离心1分钟后放入ABI7500荧光PCR仪，记录样品摆放顺序，在96孔板内设置被检样品后进行扩增反应。反应参数：95℃ 15s（不收集荧光信号），1个循环；95℃ 5s（不收集荧光信号），60℃ 31s（收集荧光信号），40个循环。

检测结束后，根据噪声情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定实验是否有效，反应结束后保存文件并打开分析软件，仪器自动分析实验结果，给出Ct值及扩增图像。当阴性对照的检测结果无数值或Ct值＞35，阳性对照的Ct值＜28时实验有效。样品Ct值＜30且扩增曲线形态良好可直接判为阳性，Ct值＞35样品判为阴性，Ct值在30—35之间的样品需重新检测，每个样品作三个平行测定，测定结果有二以上个平行样本Ct值均＜35且扩增曲线良好可判为阳性，有二以上个平行样本Ct值均＞35且扩增曲线形态不好判为阴性，其它结果需结合流行病学、临床症状重新采样检测。

7、特异性、敏感性、重复性试验：

特异性试验：分别提取新型布尼亚病毒株（ZJZS1/China/2012）、Hanta病毒、甲型H1N1病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16、阴性对照血清的RNA进行PCR反应作特异性试验，试验结束除新型布尼亚病毒和可观察到明显的荧光增加信号（典型的S型扩增曲线）而Hanta病毒、甲型H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16和阴性对照均未观察到荧光增加信号曲线，试验结果见下表：

敏感性试验：

（1）将构建的质粒载体外标准品稀释成3.0×10³拷贝/μL—3.0×10^-2拷贝/μl时，简套式RT-PCR检测极限为3.0×10^-1拷贝／μL，也就是在25μL反应体系中有1.5个模板（0.3个拷贝/μL×5μL）就能检出。

（2）与荧光RT-PCR比较：将新型布尼亚病毒株（ZJZS1/China/2012）的Vero细胞培养液从10^-4稀释到10^-11 ，分别提取各浓度细胞培养液中病毒的RNA，配制反应混合液后进行简套式RT-PCR与荧光RT-PCR的两种方法敏感性比较。结果：简套式荧光RT-PCR的敏感性比荧光RT-PCR高100倍，见下表：荧光RT-PCR与简套式荧光RT-PCR检测敏感性比较（Ct值）。

重复性试验：新型布尼亚病毒毒株（ZJZS1/China/2012）按10倍梯度稀释成4个不同浓度，对每一个浓度作3个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.11—0.21之间，变异系数（cv）在0.11%—0.21%之间，说明本发明具有良好的重复性，见下表

临床样品检测评价：2012年5—7月份(发热伴血小板减少综合征流行高峰期)共收到本地医院上送的20例临床疑似病人的血清和血浆，25份健康人群体检血清，28份监测样本为鼠肺、鼠肾，直接提取血清和血浆中的新型布尼亚病毒RNA，鼠肺与鼠肾需在低温下研磨成匀浆离心后取上清再提取新型布尼亚病毒RNA。用荧光RT-PCR和简套式荧光RT-PCR两种种方法对上述提取液平行检测，结果荧光RT-PCR检出阳性率为75%（30/40）、简套式荧光RT-PCR检出阳性率为95%（38/40），荧光RT-PCR检测阴性而简套式荧光RT-PCR检测阳性的8份样本经核酸序列测定及病人双份血清检测结果均证明为新布尼亚病毒感染。25份体检健康人群血清和28份监测样本为鼠肺、鼠肾检测结果均为阴性。简套式荧光RT-PCR对上述阳性样本检测结果很容易判定：Ct值在15-30之间，扩增曲线均呈典型的“S”型，而荧光RT-PCR在检测结果阳性样本中有40%样品的检测Ct值在35—40之间，这些样品的扩增曲线的高度明显偏低，对检测结果判定造成一定困难，常被误判成阴性。

应用本发明的简套式荧光RT-PCR法，PCR反应中利用两套PCR引物（1对外套引物和1对内套引物）进行两轮PCR扩增的方法，即将外套引物进行PCR扩增后的产物作为内套引物进行PCR扩增的模板，内套引物与模板DNA的结合位点处于外套引物扩增出的DNA片段上游，套式RT-PCR对减少或消除非特异性扩增、提高敏感度、降低PCR反应过程中阻抑物质累积及保持Taq酶活力均非常有效。通过上述试验表明：本发明建立的简套式荧光RT-PCR既保留了荧光PCR的实时快速、不易污染、重复性好、操作简单等优点又吸收了套式PCR的高度敏感、高度特异的特点，可准确地检测新型布尼亚病毒株(ZDZS1/China/2012)，而与临床症状相似的Hanta病毒、甲型H1N1流感病毒和H3N2甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道病毒EV71型和柯萨奇病毒A16检测均为阴性。新型布尼亚病毒简套式荧光RT-PCR检测敏感度比目前常用的荧光RT-PCR要高100倍并可使那些荧光RT-PC检测难以判定的样品（Ct值在35—40之间，扩增曲线明显偏低）获得轻易判定（Ct值缩小至20—25之间，扩增曲线呈典型的S型），非常适用于荧光RT-PCR难以判定的、无法检出的发热伴血小板减少综合征病人血清中以及蜱虫、老鼠等病媒生物体内的新型布尼亚病毒RNA。

<110>舟山医院

王忠发

<120>简套式荧光RT-PCR法检测SFTSV用的试剂盒

<140>201210529676.0

<141>2012-12-06

<160>1

<211>1744

<212>RNA

<213>新型布尼亚病毒（HM802204.1）S基因上1084—1459的序列

<400>1084

   agttcac agcagcatgg agaggatccc tgaaggagtt gtaaacttct gtcttgctgg 1140

ctccgcgcat cttcacattg atagtcttgg tgaaggcatc ttgccacaga gagtaggcct 1200

ccatcagggt cttggttgtg gcttcagata cccccgcagt tggaatcagg gacccaaagg 1260

ccatgcacat catctcaggg ggataattct cgaccttcag gttcatgacg gctggcccca 1320

ctgggagata ctcctttaag gctgctgcag cagcacatgt ccaagtggga aggctctgcg 1380

ctaccctcac aggagtgatt gagagcctgg tctctgccct ctcaaccagt ccatatttct 1440

cctggagtgc catcaacct                                             1459

 

Claims (3)

1.一种简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，其中包含有两种外引物和两种内引物和一种探针，其特征是两种外引物的DNA序列分别为：

外引物一P1：5’-agt tca cag cag cat gga gag gat -3’

外引物二P2：5’-agg ttg atg gca ctc cag gag aaa -3’

两种内引物的DNA序列分别为：

内引物一P3：5’- agt tca cag cag cat gga gag gat -3’

内引物二P4：5’- act ctc tgt ggc aag atg cct tca -3’

探针的DNA序列为：5’-FAM-ttg ctg gct ccg cgc atc ttcaca tt-TAMRA -3’。

2.如权利要求1所述的简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，其特征是所说外引物一P1的浓度为20μM，外引物二P2的浓度为20μM；所说内引物一P3的浓度为10μM，内引物二P4的浓度为10μM；探针浓度为5μM。

3.如权利要求1所述的简套式荧光RT-PCR法检SFTSV用的试剂盒，其特征是还包含有阳性对照和阴性对照，以及包含两种外引物和两种内引物和一种探针在内的PCR反应体系试剂，其中PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系；

所说一步法RT-PCR反应体系的组分包括：20μM的外引物一P1和20μM的外引物二P2各0.5μL的混合液1.0μL，Prime Script Step Enzyme Mix 1.0μL，2×Step Buffer 12.5μL，DEPC处理水5.5μL，范本RNA溶液5.0μL，总量25μL；

所说荧光PCR反应体系的组分包括：10μM的内引物一P3和10μM的内引物二P4和5μM探针各0.5μL的混合液1.5μL，50×ROX Reference0.5μL，2×Premix Ex Taq 12.5μL，DEPC 处理水8.0μL，范本RNA溶液2.5μL，总量25μL；

所说范本RNA不包括在试剂盒中的PCR反应体系试剂中。