CN101975857A - 病毒解裂剂及解裂病毒抗原抗体复合物并检测hcv抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种病毒解裂剂及解裂病毒抗原抗体复合物并检测HCV抗原的方法，其特征在于每100ml裂解剂中含有：去垢剂0.1～1ml，蛋白变性剂0～20g，还原剂0.01～1ml，脂溶剂0.1～1ml，基础液余量。以对待检血样或抗血清与病毒抗原经中和反应后得到的抗原抗体复合物进行裂解处理成游离组分，或将病毒核心抗原得以充分暴露，并保留其抗原反应性，不仅使灵敏度较现有的HCV核心抗原检测法明显提高，而且由于抗原检测窗口期比抗HCV抗体窗口期平均缩短49天，在HCV-RNA出现后的1～2d内出现，可有效缩短血清转换前的窗口期，对于提高窗口期感染者的检出率、提高输血和血制品的安全性具有重要意义。本发明提供的病毒裂解剂适用于包括丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)在内的常见病毒抗原抗体复合物的解裂。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒解裂剂，以及用该裂解剂裂解病毒抗原抗体复合物的方法，以快速、准确检测丙型肝炎病毒HCV抗原，属于生物技术领域。
背景技术
丙型肝炎病毒HCV为嗜肝性慢性病毒。丙型肝炎病毒HCV感染者除部分(大约10％-20％)可以自愈外，绝大多数都将转为慢性感染，自然病程长达20-30年，其中约有20％的慢性感染者会发展为肝硬化，又有20％的感染者会发展为肝细胞癌，慢性化发生率明显高于乙型肝炎，死亡率较高。因此，丙型肝炎病毒HCV的检测对丙型肝炎病毒感染的早期诊断和指导临床治疗具有重大的意义。现有的检测技术包含HCV抗体检测、HCV核酸检测、HCV核心抗原检测三种方法：
HCV抗体检测：由于HCV抗体试剂盒增加了HCV基因组Nss区表达的蛋白作为抗原，进一步提高了试剂的敏感性，所以抗HCV抗体检测已广泛应用于丙型肝炎病毒HCV感染的诊断及大规模血液筛查。但由于丙型肝炎病毒HCV感染窗口期较长，平均70天，有的患者窗口期可延长至6-9月或更长，故存在“窗口期”漏检的问题。还有约1-3％的患者因抗HCV抗体的持续阴性以及某些耐受人群未发生血清转化等等，使抗HCV抗体检测不能准确反映患者体内HCV的感染状态。再有，由于各厂家试剂间的灵敏度和特异性存在着一定差异，从而导致抗HCV抗体检测结果不一致，易产生假阳性或漏检等情况。
目前公认的HCV感染诊断的金标准是HCV核酸HCV-RNA的检测。HCV基因组的复制出现得很早，在感染后数天即可出现病毒血症。外周血中检测出HCV-RNA是病毒复制的直接标志，提示血液中有HCV存在。HCV-RNA的检测可以缩短感染后抗体阳转前的检测窗口期，以实现HCV感染的早期诊断。由于HCV-RNA检测灵敏度高、特异性强，具有早期诊断的意义。但是PCR法检测HCV-RNA的影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求：HCV-RNA易被血细胞中的RNA酶降解，因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将出现假阴性而影响检测结果；HCV-RNA还会受进食的影响，即所进食物会与血中脂质及脂蛋白结合而降低检出率；另外，RT-PCR操作复杂，所需设备昂贵，需要专门认证的实验室和操作人员才能完成，因此RT-PCR方法难以在基层实验室普遍应用。
HCV核心抗原包括多种蛋白(核心蛋白C、膜蛋白、非结构蛋白NS2、NS3、NS4及NS5)，核心蛋白及NS3在肝细胞胞浆中表达，可游离存在于血清中，其保守性相对较高，目前已用于血清学诊断。与抗HCV抗体检测相比，HCV核心抗原检测可使窗口期缩短49天，减少HCV感染者在窗口区献血的风险。对于某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者，和某些不产生抗体的携带者，HCV核心抗原的检测还有利于HCV感染患者的早期发现。与RT-PCR方法相比，HCV核心抗原检测具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期丙型肝炎诊断、抗HCV抗体阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析。在实际应用中，由于血清中游离的核心抗原非常微量，且核心抗原被包膜蛋白包裹，同时血清中可能含有一种或多种不同的抗原，有的抗原也因含量太低而不易测出，因而影响了抗原的检测，是导致现有的抗原检测法检出率低，阳性率较低的重要原因。
发明内容
为将病毒抗原抗体复合物解裂成游离组分，或将包膜病毒核心抗原得以充分暴露，以便能快速、准确检测病毒抗原，本发明提供一种病毒裂解剂。
本发明的第二个目的在于：用所述病毒裂解剂裂解血样中病毒抗原抗体复合物的方法。
本发明的第三个目的在于提供一种用上述病毒裂解剂裂解丙型肝炎病毒HCV抗原抗体复合物，并高效、快速检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法。
本发明提供的是这样一种病毒裂解剂，其特征在于每100ml裂解剂中含有：
去垢剂 0.1～1ml
蛋白变性剂 0～20g
还原剂 0.01～1ml
脂溶剂 0.1～1ml
基础液 余量。
所述基础液采用酸性缓冲液，优选pH 2.8、浓度0.1～0.5M/L的常规甘氨酸盐酸缓冲液。
所述去垢剂为常规阴离子去垢剂SDS，或常规两性离子去垢剂CHAPS，或常规中性去垢剂中的Tritonn-X100或NP40，优选CHAPS或NP40。
所述蛋白变性剂为常规的尿素、盐酸胍中的一种，优选尿素。
所述还原剂优选常规的二巯基乙醇。
所述脂溶剂采用常规的乙醚、氯仿、丙酮、氟碳化合物、正丁醇中的一种，优选氯仿、丙酮。
本发明提供的用上述病毒裂解剂裂解病毒抗原抗体复合物的方法是：将病毒裂解剂与血样，按1∶1的体积比混合后，于37℃温度下反应20-40min，将血样中的病毒抗原抗体复合物裂解成游离组分，其中，所述病毒裂解剂是：每100ml裂解剂中含有：
去垢剂 0.1～1ml
蛋白变性剂 0～20g
还原剂 0.01～1ml
脂溶剂 0.1～1ml
pH 2.8、浓度0.1～0.5M/L的基础液 余量。
本发明的第三个目的通过下列技术方案完成：一种用病毒裂解剂裂解丙型肝炎病毒HCV抗原抗体复合物并高效、快速检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于经过下列步骤：
A、在空白微孔板中加入病毒裂解剂150ul/孔，再等体积加入待检样品150ul/孔，充分混匀，用封片封板后，于37℃温度下反应20～40min，将待检血样中的丙型肝炎病毒HCV抗原抗体复合物裂解成游离组分，其中，所述病毒裂解剂是：每100ml裂解剂中含有：
去垢剂 0.1～1ml
蛋白变性剂 0～20g
还原剂 0.01～1ml
脂溶剂 0.1～1ml
pH 2.8、浓度0.1～0.5M/L的基础液 余量；
B、在HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液100μl/孔，再分别加入经A步骤裂解的待检样品100μl/孔，抗原阳性、阴性对照各2孔，设空白调零孔1孔，之后放入湿盒中，37℃保温1-2小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
C、在B步骤的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-1小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；再在检测板的孔中加入常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-1小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
或者
C1、在B步骤的检测板的孔中加入辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-1小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
D、在C或C1的检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各100μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10分钟，之后加入终止液，50μl/孔；
E、用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值；
F、结果判定：
阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，表明检测成立，反之重试；Cutoff值＝阴性对照的平均A值×2.1，其中，阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算；阴性对照的平均A值小于0.05按0.05算；样品A值≥Cutoff值，该样品判定为HCV抗原阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV抗原阴性样品。
所述B步骤的HCV抗原检测板经过下列方法制得：将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至20μg/ml，按200μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按200μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，4℃过夜，洗板，晾干，4℃保存，即得HCV抗原检测板；其中，所述纯化的抗HCV多克隆抗体经过下列方法制得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为512-1024Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液10ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。
所述C步骤的生物素标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规HCV单克隆抗体或多克隆抗体按1∶10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或4℃冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20℃以下保存备用，得生物素标记的HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释生物素标记的HCV抗体至1∶500～1∶5000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液。
所述C1步骤的辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：按照常规方法将常规单克隆HCV抗体或多克隆HCV抗体与常规辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液至1∶1000～1∶20000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：用本发明提供的裂解剂对待检血样或抗血清与病毒抗原经中和反应后得到的抗原抗体复合物进行裂解处理，可以将病毒抗原抗体复合物解裂成游离组分，或将病毒核心抗原得以充分暴露，并保留其抗原反应性，不仅使灵敏度较现有的HCV核心抗原检测法明显提高，而且由于抗原检测窗口期比抗HCV抗体窗口期平均缩短49天，在HCV-RNA出现后的1～2d内出现，可有效缩短血清转换前的窗口期，对于提高窗口期感染者的检出率、提高输血和血制品的安全性具有重要意义。本发明具有操作简便、快速，不需要特殊的仪器、费用低廉、适应性强、易于推广使用的特点。
本发明提供的病毒裂解剂适用于包括丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)在内的常见病毒抗原抗体复合物的解裂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
每100ml裂解剂中含有：NP40：0.1ml，二巯基乙醇：0.01ml，氯仿：0.1ml，pH为2.8、浓度为0.1M/L的甘氨酸盐酸缓冲液99.79ml。
实施例2
每100ml裂解剂中含有：CHAPS：0.5ml，尿素：20g，二巯基乙醇：0.5ml，氯仿：0.5ml，pH为2.8、浓度为0.1M/L的甘氨酸盐酸缓冲液88.5ml。
实施例3
每100ml裂解剂中含有：NP40：1ml，尿素：10g，二巯基乙醇：1ml，丙酮：1ml，pH为2.8、浓度为0.5M/L的甘氨酸盐酸缓冲液92ml。
实施例4
HCV抗原检测板的获得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为512Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液2ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体；
B3、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检测，同时用HCV分片段抗体试剂盒进行特异性检测，结果表明该纯化的抗HCV多克隆抗体能与HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原特异性结合；
B4、用lowrry法测定纯化的抗HCV多克隆抗体蛋白含量为6.15mg/ml，能够满足酶联免疫(ELISA)检测试剂盒包被及酶标记的需要，将纯化的抗HCV多克隆抗体于-20℃以下保存备用；
B5、经纯化的IgG，效价为1∶8 000-1∶16 000，与纯化前基本一致，表明所选择的纯化方法对抗体活性损伤较小；
B6、条件试验筛选使用浓度在5-50μg/ml间；
C、HCV抗原检测板包被
C1、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至20μg/ml，按200μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
C2、在C1的聚苯乙烯板的孔中，按150μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以对检测板进行封闭，4℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次，晾干，4℃保存备用，即得HCV抗原检测板。
实施例5
生物素标记的HCV抗体使用液的的制备：将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规HCV单克隆抗体按1∶10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或4℃冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20℃以下保存备用，得生物素标记HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白所构成的酶结合物稀释液，稀释生物素标记的HCV抗体至1∶500～1∶2000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液，4℃保存备用。
实施例6
辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液的的制备：
所述辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：按照常规的方法将多克隆HCV抗体与辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白所构成的酶结合物稀释液，稀释辣根过氧化物酶标记HCV抗体原液至1∶5000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液，4℃保存备用。
实施例7
用实施例1提供的裂解剂对丙型肝炎病毒重组HCV抗原抗体复合物进行裂解，并高效、快速检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，经过下列步骤：
本实施例7所用的待检样品为：
A、将纯化的重组HCV抗原0.5ml与抗HCV血清0.5ml等体积混匀，37℃，60分钟中和反应，得HCV抗原抗体复合物待检样品。
B、30份健康人血清，30份HCV-RNA阳性血清。
1.将待检样品A、B与实施例4的HCV抗原检测板及实施例5、实施例6及其它配套试剂从冰箱取出，室温平衡30分钟；
2、在空白微孔板中加入实施例1的病毒裂解剂150ul/孔，再分别等体积加入待检样品A、B，150ul/孔，充分混匀，用封片封板后，于37℃温度下反应30min，从而将待检样品中的丙型肝炎病毒HCV抗原抗体复合物裂解成游离组分；
3、先在实施例4的HCV抗原检测板的孔中，加入样品缓冲液100μl/孔，在其中的27个孔中加入经2步骤裂解的待检样品100μl/孔、2个孔中加入抗原阳性对照、2个孔中加入阴性对照，1个孔作为空白调零孔，另外的27个孔中加入待检样品A(100μl/孔)作为未裂解样品A对照，余下的27个孔中加入待检样品B(100μl/孔)作为未裂解样品B对照，之后放入湿盒中，37℃保温1.5小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
4.在上述3步骤的HCV抗原检测板的各个孔中，加入实施例5的生物素标记的HCV抗体使用液，200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
5.在上述4步骤的HCV抗原检测板的各个孔中加入市购的常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
6.在上述5步骤的HCV抗原检测板的各个孔中加入TMB显色液A液、B液各100μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10分钟；
7.在上述6步骤的HCV抗原检测板的各个孔中加入终止液，50μl/孔；
8.用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值，结果见表1、表2、表3。
9、结果判定：
阳性对照平均A值(1.927)-阴性对照平均A值(0.053)≥0.4，本次试验成立。Cutoff值＝阴性对照的平均A值(0.053)×2.1＝0.111，(阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算，阴性对照的平均A值小于0.05按0.05算)。样品A值≥Cutoff值，该样品判定为HCV阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV阴性样品。
表1 重组HCV抗原抗体复合物裂解反应比较
表2 30份健康人血浆样品检测结果对比
表3 30份HCV-RNA阳性样品检测结果比较
从表2可看出，30份健康人血浆经过实施例1提供的病毒裂解剂裂解处理的检测和未经过裂解处理直接进行的检测，其HCV抗原检测结果全部为阴性，两种方法无显著的统计学差异(P＞0.05)，表明本专利检测方法具有较好的特异性。
从表3中可以看出，30份HCV-RNA阳性样品经过实施例1所供的病毒裂解剂裂解处理的检测和未经裂解处理直接进行的检测，其检测结果有明显差异，未经过裂解处理直接进行的检测，其测出抗原阳性样品数为20份，而使用实施例1提供的病毒裂解剂进行裂解处理的检测，其测出的抗原阳性样品数提高至25份，阳性检出率由原来的66.67％提升至83.33％，样品检测前是否裂解，其检测结果有显著性差异(P＜0.05)，且解裂样品的P/N值高于未解裂样品(8.29＞4.87)，本发明在阳性检出率提高的同时具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点，可改善HCV抗原检测试剂的灵敏度。
溶液配方
(1)PBS储液
磷酸氢2钠 58g
磷酸2氢钾 4g
氯化钠 160g
加注射用水至1000ml
(2)样品缓冲液pH 8.5
牛血清白蛋白(BSA) 1g
灭活牛血清 10ml
0.1mol/L Tris-HCL 90ml
(3)PBST洗液
将PBS储液稀释后，加入0.05％ Tween20即可。
(4)碳酸缓冲液
无水碳酸钠 1.6g
碳酸氢钠 2.93g
加注射用水至1000ml
(5)终止液
硫酸54ml
加注射用水至500ml
(6)TMB A液
TMB 50mg
二丙基亚砜50ml
加注射用水50ml
(7)TMB B液
醋酸钠 6g
醋酸 0.2ml
双氧水 2.5ml
加注射用水至50ml。
Claims (8)
1.一种病毒裂解剂，其特征在于每100ml裂解剂中含有：
去垢剂 0.1～1ml
蛋白变性剂 0～20g
还原剂 0.01～1ml
脂溶剂 0.1～1ml
基础液 余量。
2.如权利要求1所述的病毒裂解剂，其特征在于所述基础液采用酸性缓冲液，优选pH 2.8、浓度0.1～0.5M/L的常规甘氨酸盐酸缓冲液。
3.如权利要求1所述的病毒裂解剂，其特征在于所述去垢剂为常规阴离子去垢剂SDS，或常规两性离子去垢剂CHAPS，或常规中性去垢剂中的Tritonn-X100或NP40，优选CHAPS或NP40；所述蛋白变性剂为常规的尿素、盐酸胍中的一种，优选尿素；所述还原剂优选常规的二巯基乙醇；所述脂溶剂采用常规的乙醚、氯仿、丙酮、氟碳化合物、正丁醇中的一种，优选氯仿、丙酮。
4.一种用权利要求1所述病毒裂解剂裂解病毒抗原抗体复合物的方法，其特征是：将病毒裂解剂与血样，按1∶1的体积比混合后，于37℃温度下反应20-40min，即将血样中的病毒抗原抗体复合物裂解成游离组分，其中，所述病毒裂解剂是：每100ml裂解剂中含有：
去垢剂 0.1～1ml
蛋白变性剂 0～20g
还原剂 0.01～1ml
脂溶剂 0.1～1ml
pH 2.8、浓度0.1～0.5M/L的基础液 余量。
5.一种用病毒裂解剂裂解丙型肝炎病毒HCV抗原抗体复合物并高效、快速检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于经过下列步骤：
A、在空白微孔板中加入病毒裂解剂150ul/孔，再等体积加入待检样品150ul/孔，充分混匀，用封片封板后，于37℃温度下反应20～40min，将待检血样中的丙型肝炎病毒HCV抗原抗体复合物裂解成游离组分，其中，所述病毒裂解剂是：每100ml裂解剂中含有：
去垢剂 0.1～1ml
蛋白变性剂 0～20g
还原剂 0.01～1ml
脂溶剂 0.1～1ml
pH 2.8、浓度0.1～0.5M/L的基础液 余量；
B、在HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液100μl/孔，再分别加入经A步骤裂解的待检样品100μl/孔，抗原阳性、阴性对照各2孔，设空白调零孔1孔，之后放入湿盒中，37℃保温1-2小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
C、在B步骤的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-1小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；再在检测板的孔中加入常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-1小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
或者
C1、在B步骤的检测板的孔中加入辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液200μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-1小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
D、在C或C1的检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各100μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10分钟，之后加入终止液，50μl/孔；
E、用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值；
F、结果判定：
阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，表明检测成立，反之重试；Cutoff值＝阴性对照的平均A值×2.1，其中，阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算；阴性对照的平均A值小于0.05按0.05算；样品A值≥Cutoff值，该样品判定为HCV抗原阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV抗原阴性样品。
6.如权利要求5所述的检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于所述B步骤的HCV抗原检测板经过下列方法制得：将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至20μg/ml，按200μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按200μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，4℃过夜，洗板，晾干，4℃保存，即得HCV抗原检测板；其中，所述纯化的抗HCV多克隆抗体经过下列方法制得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为512-1024Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液10ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。
7.如权利要求5所述的检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于所述C步骤的生物素标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规HCV单克隆抗体或多克隆抗体按1∶10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或4℃冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20℃以下保存备用，得生物素标记的HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释生物素标记的HCV抗体至1∶500～1∶5000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液。
8.如权利要求5所述的检测丙型肝炎病毒HCV抗原的方法，其特征在于所述C1步骤的辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：按照常规方法将常规单克隆HCV抗体或多克隆HCV抗体与常规辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液至1∶1000～1∶20000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液。
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