一种新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析检测技术领域,尤其是涉及一种新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒。
背景技术
冠状病毒属于单股正链RNA病毒,既往已知感染人的冠状病毒有 6种,即HCoV-229E、HCoV-OC43、SARSr-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERSr-CoV。新型冠状病毒(2019-nCoV)属于第7种。
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎,其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒,即2019新型冠状病毒。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径,在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况中存在经气溶胶传播的可能。患者初始症状多为发热,乏力和干咳,并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好,部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克,甚至死亡。
目前临床实验室的检测方法主要依靠核酸检测,但核酸检测要在有条件和资质的实验室进行,存在检测时间长、样本采集要求高、步骤多、场地和设备要求高等不足,难以大规模开展。而用胶体金技术进行抗体检测,可在样本量少或初诊使用。解决核酸检测误诊和漏诊、速度慢、通量低、成本高、实验室条件要求高的问题。胶体金检测试剂便携,不需要专用设备,可在流动车上使用。IgM/IgG可用于新型冠状病毒感染肺炎原发感染中后期临床辅助诊断或者流行病学监测。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒,与现有核酸检测试剂盒相比具有操作简便,速度快,成本低,对实验室要求低,可肉眼判读结果等特点。
一种新型冠状病毒IgM胶体金检测试剂盒,包括设有包被板以及样品垫的检测卡,包被板的金标区包被有胶体金标记抗人IgM,检测区包被有新型冠状病毒重组抗原,质控区包被羊抗鼠IgG;其中,新型冠状病毒重组抗原是N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白,氨基酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6。
新型冠状病毒重组抗原具有如表1所示氨基酸序列:
表1 重组抗原的氨基酸系列信息
优选的,所述样品垫上涂有样本处理液,所述样本处理液为含BSA的质量浓度为0.5-1.5%、蔗糖的质量浓度为0.3-1.0%、海藻糖的质量浓度为0.1-1.0% 、Procline的体积浓度为 0.05-0.3%、tween-20 体积浓度为0.05-0.5%的pH为7.0-7.6的PBS缓冲液;且样品垫的制备方法如下,将样品垫处理液以40-100微升每平方厘米的量,喷涂或浸泡玻纤膜或聚酯膜,37-45℃条件下,烘干8-16小时。
优选的,胶体金标记抗人IgM的制备包括如下步骤,向均一的胶体金溶液中添加K2CO3,调节pH至6.0-7.5,向调好pH的溶液中添加抗人IgM,使其蛋白含量为15-60μg/mL,偶联1-4小时,向其中添加终止液,终止偶联反应,终止液的终浓度为1-1.5%;终止反应后的0.5-2小时后离心处理,离心参数为12000-18000RPM,离心处理15-30min,弃上清,沉淀用复溶液复溶,2-8℃保存备用;。
优选的,所述终止液为质量浓度10%的牛血清蛋白或甘氨酸或PEG;所述复溶液为0.02-0.05M Tris或PB缓冲液,pH为7.4-8.2 ,向其中加入NaCl 质量体积比为0.5-1%, 海藻糖质量体积比为0.2-1%,牛血清蛋白质量体积比为0.5-3%,Triton X-405体积浓度0.5-1%。
优选的,所述检测卡的制备,将胶体金标记抗人IgM铺匀在标记垫上,37-45℃条件下,烘干8-16小时,得到标记垫;分别将新型冠状病毒重组抗原以及羊抗鼠IgG配制成一定浓度的溶液,重组抗原的浓度应在0.5-2.0mg/mL,羊抗鼠IgG的浓度应在0.3-1.5mg/mL,使用划膜喷金仪分别包被在T线和C线的位置37-45℃干燥后得到包被的硝酸纤维素膜;将吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴在PVC板上。
本发明还提供一种新型冠状病毒IgG胶体金检测试剂盒,其特征在于:包括设有包被板以及样品垫的检测卡,包被板的金标区包被有胶体金标记抗人IgG,检测区包被有新型冠状病毒重组抗原,质控区包被羊抗鼠IgG;其中,新型冠状病毒重组抗原是N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白,氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。
优选的,所述样品垫上涂有样本处理液,所述样本处理液为含BSA的质量浓度为0.1-1.8%、蔗糖的质量浓度为0.1-0.8%、海藻糖的质量浓度为0.1-1.5% 、Proclin300的体积浓度为0.01-0.1%、tween-20 体积浓度为0.01-0.1%的pH为7.4-8.0的PBS缓冲液;且样品垫的制备方法如下,将样品垫处理液以40-100微升每平方厘米的量,喷涂或浸泡玻纤膜或聚酯膜,37-45℃条件下,烘干8-16小时。
优选的,胶体金标记抗人IgG的制备包括如下步骤,向均一的胶体金溶液中添加K2CO3,调节pH至7.4-8.5,向调好pH的溶液中添加抗人IgG,使其蛋白含量为30-60μg/mL,偶联1-4小时,向其中添加终止液,终止偶联反应,终止液的终浓度为0.8-1.5%;终止反应后的0.5-2小时后离心处理,离心参数为12000-18000RPM,离心处理15-30min,弃上清,沉淀用复溶液复溶,2-8℃保存备用。
优选的,所述终止液为质量浓度10%的牛血清蛋白或甘氨酸或PEG;所述复溶液为0.05-0.1M MES或BB缓冲液,pH 6.5-8.0 ,向其中加入 NaCl 质量浓度0.5-1%,蔗糖质量浓度1-3%,牛血清蛋白质量浓度0.5-3%,tw-20体积浓度0.3-1.5% ,PEG20000质量浓度0.1-0.3%。
优选的,所述检测卡的制备,将胶体金标记抗人IgG铺匀在标记垫上,37-45℃条件下,烘干8-16小时,得到标记垫;分别将新型冠状病毒重组抗原以及羊抗鼠IgG配制成一定浓度的溶液,使用划膜喷金仪分别在T线包被新型冠状病毒重组抗原,包被浓度为0.5-2.0mg/mL;C线的位置包被羊抗鼠IgG,包被浓度为0.3-2.0mg/mL;37-45℃干燥后得到包被的硝酸纤维素膜;将吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴在PVC板上。
优选的,还包括样本稀释液,0.05-0.1M CB或PB缓冲液,pH为8-10,向其中加入NaCl质量体积比为 0.5-1%,蔗糖质量体积比为1-3%,牛血清蛋白质量体积比为0.5-3%,tw-20体积比为 0.3-2%中的一种或两种以上。
优选的,所述滤血膜经过抗RBC抗体处理后使用,处理浓度在0.01-0.1mg/mL,处理量为40-100微升每平方厘米,37-45℃条件下,烘干8-16小时。
优选的,所述胶体金溶液通过如下方法制备,将氯金酸配制成质量体积比为1%-10%的溶液,再向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之一到万分之四的上述溶液,继续煮沸2-5分钟,将0.1M的柠檬酸钠,按每100mL氯金酸溶液中添加500-800微升的量,继续搅拌加热10-20分钟,制备出粒径均一的胶体金溶液。
优选的,所述滤血膜经过抗RBC抗体处理后使用,处理浓度在0.01-0.1mg/mL,处理量为40-100微升每平方厘米,37-45℃条件下,烘干8-16小时。
本发明试剂盒的组装包括以下步骤:
1、贴板:将包被板与样品垫按顺序粘贴组成试剂板。
2、切条:用斩切机将试剂板分切成4.0±0.2mm的试剂条。
3、装卡:将试剂条装入卡中扣合。
4、贴签:按要求在试剂卡、铝箔袋、包装盒、缓冲液管上粘贴对应的标签。
5、装袋封口:将试剂卡及干燥剂装入铝箔袋中,使用连续封口机封口。
6、分装:将配好的缓冲液按照规格分装至管中,旋紧管盖。
7、装盒:按照产品规格将检测卡及缓冲液装入试剂盒中。
还可以根据需要提供参考品,包括阴性参考品,阳性参考品,最低检出限参考品,精密度参考品。
阴性参考品,对10份阴性参考品进行检测,结果不得出现假阳性。制备方法,经过核酸多次检测的10份正常人2019-nCoV-IgM阴性血清,灭活后,每份分装量为0.5mL,-20℃保存。
阳性参考品,对10份阳性参考品进行检测,结果不得出现假阴性。制备方法,经过核酸多次检测后的10份2019-nCoV-IgM抗体阳性血清,灭活后,每份分装量为0.5mL,-20℃保存。
最低检出限参考品,对参考品中的灵敏度参考品进行检测,结果是参考品的最低检出限不低于L2。制备方法,将1份2019-nCoV-IgM抗体阳性血清灭活后,用含有牛血清的稀释液进行系列稀释(L1-L4),要求最低检出限的参考品不低于L2。每份灵敏度参考品分装量为0.5mL,-20℃保存。
精密度参考品,对精密性参考品进行检测,10次反应结果均为阳性,且T线显色度均一。制备方法,取2019-nCoV-IgM抗体阳性样本,灭活后作为精密性参考品,每份分装量为0.5mL,-20℃保存。
本发明的原理是,
本试剂盒采用免疫层析法,将需要检测的血液样本加入到检测卡上,样本中的新型冠状病毒IgM/IgG抗体、非新型冠状病毒IgM/IgG抗体,均与胶体金标记的抗人IgM/IgG结合,形成新型冠状病毒IgM/IgG抗体-抗人IgM/IgG抗体复合物,非新型冠状病毒IgM/IgG抗体-抗人IgM/IgG抗体复合物,免疫复合物在毛细作用下沿检测卡向前移动,新型冠状病毒IgM/IgG抗体-抗人IgM/IgG抗体复合物会被包被在膜上检测区的新型冠状病毒重组抗原捕获,形成紫红色的条带,非新型冠状病毒IgM/IgG-IgM/IgG抗体复合物继续向前移动,与质控区羊抗鼠结合,形成紫红色的条带,显示新型冠状病毒IgM/IgG抗体阳性。
相对于现有技术,本发明所述的新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒,具有以下优势。
表2 IgM胶体金检测试剂盒的优势
表3 IgG胶体金检测试剂盒的优势
附图说明
图1为实施例中试剂盒的制备流程图;
图2为实例例中检测条情况分析。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例一
一种新型冠状病毒IgM胶体金检测试剂盒,包括设有包被板以及样品垫的检测卡,包被板的金标区包被有胶体金标记抗人IgM,检测区包被有新型冠状病毒重组抗原,质控区包被羊抗鼠IgG。
新型冠状病毒重组抗原是N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白,其氨基序列如表1所示。
所述样品垫上涂有样本处理液,所述样本处理液为含BSA的质量浓度为1%、蔗糖的质量浓度为0.5%、海藻糖的质量浓度为0.5% 、Proclin 300的体积浓度为 0.08%、tween-20体积浓度为0.08%的pH为7.4的PBS缓冲液;且样品垫的制备方法如下,将样品垫处理液以60微升每平方厘米的量,喷涂或浸泡玻纤膜或聚酯膜,37℃条件下,烘干12小时。
胶体金标记抗人IgM的制备包括如下步骤,向均一的胶体金溶液中添加K2CO3,调节pH至7.5,向调好pH的溶液中添加抗人IgM,使其蛋白含量为25μg/mL,偶联1.5小时,向其中添加终止液,终止偶联反应;终止反应后的0.5小时后离心处理,离心参数为12000RPM,离心处理20min,弃上清,沉淀用复溶液复溶,2-8℃保存备用;。
所述终止液为质量浓度10%的牛血清蛋白或甘氨酸或PEG;所述复溶液为0.02MPB缓冲液,pH为8.0,向其中加入 NaCl 0.9%, 海藻糖0.8%,牛血清蛋白2.5%,Triton X-4050.5%。
所述胶体金溶液通过如下方法制备,将氯金酸配制成10%的溶液,再向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之二点五的上述溶液,继续煮沸3分钟,将0.1M的柠檬酸钠,按每100mL氯金酸溶液中添加580微升的量,继续搅拌加热10分钟,冷却至室温,即制备出粒径均一的胶体金溶液,2-8℃保存备用。
所述检测卡的制备,将胶体金标记抗人IgM铺匀在标记垫上,37℃条件下,烘干12小时,得到标记垫;分别将新型冠状病毒重组抗原以及羊抗鼠IgG配制成一定浓度的溶液,使用划膜喷金仪分别包被在T线和C线的位置37℃干燥后得到包被的硝酸纤维素膜;将吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴在PVC板上。
所述滤血膜经过抗RBC抗体处理后使用,处理浓度在0.1mg/mL,处理量为60微升每平方厘米,37℃条件下,烘干12小时。可起到拦截血液样本中的红细胞的作用。
还包括样本稀释液,0.05PB缓冲液,pH为8.0 ,向其中加入 NaCl0.9%,蔗糖2%。
本发明试剂盒的反应步骤:
实验过程
1 如果样本冷藏或者冷冻储存,将待测样本及所需试剂从储存条件下取出,平衡至室温(20-30℃)。融化后将待测样本充分混匀;
2 准备检测时,从撕口处打开铝箔袋,将检测卡取出,平放于水平桌面上;
3 在检测卡上标注样本编号;
4 用移液器或滴管从样本管中吸取待测样本10μL,并滴加100μL缓冲液,保证操作过程没有气泡。
5 计时15分钟,判读结果,超过20分钟以后的判读结果无效。
检验结果的解释
1 阴性结果,当仅出现质控线C,检测线T未显色,说明没有检测到新型冠状病毒抗体IgM,结果为阴性,如下图2中(a)所示;
2 阳性结果,当质控线C和检测线T均出现,说明检测到了新型冠状病毒抗体IgM,如图2中(b)所示;
3 无效结果,当未能观测到质控线C,无论T是否出现,均为无效结果,如图2中(c/d)应重新检测。
核酸多次检测,确诊病例538例,排除病例250例,分别用新型冠状病毒抗体IgM胶体金试剂盒进行检测,检测结果以核酸检测阳性和作为参考。评价检测灵敏度和分析特异性,试验结果显示,该产品临床灵敏度85.1%、特异度为95.2%。
表4实施例一检测结果与核酸检测结果对比
将三批连续生产的产品存放在37℃温箱,分别在第0天、第7天、第21天、第30天和第35天进行检测,检测产品的物理性能、最低检出限、精密度和准确性。
表5实施例一检测结果
表6实施例一具体检测数据
实施例二
一种新型冠状病毒IgG胶体金检测试剂盒,包括设有包被板以及样品垫的检测卡,包被板的金标区包被有胶体金标记抗人IgG,检测区包被有新型冠状病毒重组抗原,质控区包被羊抗鼠IgG。
新型冠状病毒重组抗原是N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白,其氨基酸序列如表1所示。
所述样品垫上涂有样本处理液,所述样本处理液为含BSA的质量浓度为1%、蔗糖的质量浓度为0.5%、海藻糖的质量浓度为0.5% 、Proclin300的体积浓度为 0.08%、tween-20体积浓度为0.08%的pH为7.4的PBS缓冲液;且样品垫的制备方法如下,将样品垫处理液以55微升每平方厘米的量,喷涂或浸泡玻纤膜或聚酯膜,37℃条件下,烘干12小时。
胶体金标记抗人IgG的制备包括如下步骤,向均一的胶体金溶液中添加K2CO3,调节pH至8.0,向调好pH的溶液中添加抗人IgG,使其蛋白含量为40μg/mL,偶联2小时,向其中添加终止液,终止偶联反应,终止液的终浓度为1%;终止反应后的0.5小时后离心处理,离心参数为12000RPM,离心处理15min,弃上清,沉淀用复溶液复溶,2-8℃保存备用;。
所述终止液为质量浓度10%的牛血清蛋白或甘氨酸或PEG;所述复溶液为0.05MES,pH 6.5 ,向其中加入 NaCl0.9%,蔗糖1.5%,牛血清蛋白0.5%,tw-20 0.3% ,PEG200000.15%。
所述胶体金溶液通过如下方法制备,将氯金酸配制成10%的溶液,再向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之四的上述溶液,继续煮沸2分钟,将质量体积分数为10%的柠檬酸钠,按每100mL氯金酸溶液中添加550微升的量,继续搅拌加热12分钟,制备出粒径均一的胶体金溶液。
所述检测卡的制备,将胶体金标记抗人IgG铺匀在标记垫上,37℃条件下,烘干12小时,得到标记垫;分别将新型冠状病毒重组抗原配制成1.0mg/mL包被在T线位置以及羊抗鼠IgG配制成0.5mg/mL,包被在C线位置,37℃干燥后得到包被的硝酸纤维素膜;将吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴在PVC板上。
所述滤血膜过抗RBC抗体处理后使用,处理浓度在0.05mg/mL,处理量为60微升每平方厘米,37℃条件下,烘干12小时。可起到拦截血液样本中的红细胞的作用。
样本稀释液,0.05MPB缓冲液,pH为8.0,向其中加入 NaCl质量浓度 0.9%,蔗糖质量浓度1%,牛血清蛋白质量浓度0.5%,tween-20 0.3%。
本发明试剂盒的反应步骤:
实验过程
6 如果样本冷藏或者冷冻储存,将待测样本及所需试剂从储存条件下取出,平衡至室温(20-30℃)。融化后将待测样本充分混匀;
7 准备检测时,从撕口处打开铝箔袋,将检测卡取出,平放于水平桌面上;
8 在检测卡上标注样本编号;
9 用移液器或滴管从样本管中吸取待测样本10μL,并追加100μL缓冲液,保证操作过程没有气泡。
10 计时15分钟,判读结果,超过20分钟以后的判读结果无效。
检验结果的解释
3 阴性结果,当仅出现质控线C,检测线T未显色,说明 没有检测到新型冠状病毒抗体IgM,结果为阴性,如下图2中(a)所示;
4 阳性结果,当质控线C和检测线T均出现,说明检测到了新型冠状病毒抗体IgM,如图2中(b)所示;
3 无效结果,当未能观测到质控线C,无论T是否出现,均为无效结果,如图2中(c/d)应重新检测。
核酸多次检测,确诊病例470例,排除病例256例,分别用新型冠状病毒抗体IgG试剂盒进行检测,检测结果以核酸检测阳性和作为参考。评价检测灵敏度和分析特异性,试验结果显示,该产品临床灵敏度91.9%、特异度为93%。
表7 实施例二检测结果与核酸检测结果对比
将三批连续生产的产品存放在37℃温箱,分别在第0天、第7天、第21天、第30天和第35天进行检测,检测产品的物理性能、最低检出限、精密度和准确性。
表8 实施例二检测结果
表9 实施例二具体检测数据
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 博奥赛斯(天津)生物科技有限公司重庆医科大学
<120> 一种新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly
195 200
<210> 2
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg
1 5 10 15
Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro
20 25 30
Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser
65 70 75 80
Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr
85 90 95
Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly
100 105 110
Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln
115 120 125
Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg
130 135 140
Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala
145 150 155 160
Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile
165 170 175
Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu
180 185 190
Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro
195 200 205
Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp
210 215 220
Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp
225 230 235 240
Ser Thr Gln Ala
<210> 3
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser
325
<210> 4
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
20 25 30
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
35 40 45
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
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