CN111944026A - 一种新冠病毒rbd特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用 - Google Patents

一种新冠病毒rbd特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫技术领域，具体公开了一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。本发明还公开了上述新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位的应用。本发明得到的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位对新冠肺炎疫苗研发以及小分子药物的研发、诊断、预防和治疗具有重要意义。

Description

一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用
技术领域
本发明属于免疫技术领域，尤其涉及一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用。
背景技术
SARS-CoV-2属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，是目前人类已知的RNA病毒中基因组最大的病毒，其长度为27至32kb，并具有至少4个主要结构蛋白，包括刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)，病毒进入细胞取决于S蛋白和S蛋白的受体结合域(RBD)，S蛋白有S1和S2两个亚基，受体结合位点(RBD)位于S1亚基上，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合；N蛋白是一种碱性磷蛋白，其中央区与病毒基因组RNA结合，形成卷曲的核衣壳螺旋，是包裏病毒遗传物质的核心结构，是在感染细胞中是表达量最高的病毒蛋白之一。
新冠病毒抗原表位的研究对于新冠病毒的预防、检测、诊断和治疗均具有重要意义。申请公开号为CN111440229A的中国发明专利申请公开了一种新冠病毒T细胞表位，该专利利用IEDB资源Class I Immunogenicity工具预测了新冠病毒N蛋白的T细胞表位，分析了600个具有免疫原性、181个不具有免疫原性的9mer肽，但是目前还未有文献报道B细胞识别的线性抗原表位。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够被B细胞识别的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，具有如下氨基酸序列：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。
本发明还提供了一种编码线性抗原表位的核酸。
本发明还提供了一种包括核酸的重组载体。
本发明还提供了一种上述核酸或导入了上述重组载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种疫苗，包括以下任一项：(1)以本发明所提供的线性抗原表位作为有效成分；(2)以本发明所提供的核酸作为有效成分；(3)以本发明所提供的重组载体作为有效成分。
本发明还提供了一种检测试纸或者检测试剂，包括本发明所提供的线性抗原表位。
本发明的原理和有益效果在于：
本发明获得的线性表位对于新冠病毒检测、诊断、疫苗研发和治疗药物的研发均具有广泛的应用前景，例如，使用本发明所提供的线性表位检测患者体内的抗体滴度，检测接种新冠疫苗后的体液免疫反应状态，可以用于小分子药物开发、疫苗研发等。
附图说明
图1为实验一中新冠病毒RBD特异性抗体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3抗原结合的ELISA结果图；
图2为实验二中新冠病毒线性表位SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与患者血浆结合，而与健康人不结合的实验结果图；
图3为实验三中新冠病毒线性表位SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与RBD受体ACE2结合的实验结果图；
图4为采用流式细胞仪分析RBD特异性记忆B细胞的细胞分选图
图5为采用流式细胞仪分析RBD特异性记忆B细胞的细胞分选图；
图6为单细胞抗体基因PCR产物凝胶电泳图；
图7为PCR扩增包含CMV启动子、WPRE-γ或WPRE-κ元件抗体基因表达盒后的琼脂糖凝胶电泳图；
图8为CQTS050和CQTS074的RBD特异性检测结果图；
图9为CQTS126的RBD特异性检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1
本实施例提供一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。
本实施例还提供上述新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位在制备核酸、重组载体、宿主细胞、组合物、疫苗、检测试纸、检测试剂或者单克隆抗体方面的应用。
实施例2和实施例3
实施例2、实施例3与实施例1的区别在于：氨基酸序列不同，实施例2和实施例3的序列如下表所示：
实验组 氨基酸序列(N'-C')
实施例1-SEQ ID NO:1 NLCPFGEVFNATRFASVYAW
实施例2-SEQ ID NO:2 NNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKP
实施例3-SEQ ID NO:3 PTNGVGYQPYRVVVLSFELL
实验一：实施例1-3提供的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，通过以下方法得到：
目前，有多篇文献报道通过结构分析新冠病毒S蛋白、RBD蛋白或其抗体与其受体ACE2的空间结构的关键氨基酸或氨基酸位点，但是有关新冠抗体线性表位的报道很少，例如Mining of epitopes on spike protein of SARS-CoV-2from COVID-19 patients(Cell Research(2020)0:1–3；https://doi.org/10.1038/s41422-020-0366-x)是通过软件预测S蛋白的抗原表位，通过新冠肺炎患者恢复期血液分析，但不是通过单克隆抗体验证的。本实施例是RBD蛋白进行抗原线性表位段的合成而获得线性氨基酸肽段。本实施例从设计抗原表位方法不同，同时发现的线性抗原表位也不一样，具体包括以下步骤：
1.设计RBD抗原肽段并合成实施例1-3的氨基酸肽；
2.ELISA法检测抗原线性表位的抗体结合能力，筛选线性抗原表位，具体原理在于：若抗体表位为空间表位，经SDS，巯基乙醇、DTT等处理后，空间构象被破坏，此时抗体不能识别。若为线性表位，则抗体依然能结合。
(1)耗材和试剂：链霉亲和素涂层板(Thermo Fisher，P#15504)；Wash Buffer(使用
Figure BDA0002641054490000031
Protein-Free Blocking Buffers配制，P#37573)，在上述Buffer的基础上加入0.1％BSA(biofroxx,P#)；山羊F(ab')2抗人IgG(Fab')2的购买信息为AlkalinePhosphatase、Abcam,P#ab98532；PNPP Substrate的购买信息为Thermo Fisher、P#34045。
(2)第一天：RBD化学合成的抗原肽使用PBS稀释(终浓度20μg/ml)，10μl/孔，包被384孔ELISA板在4℃下过夜或37℃下包被2h(本实施例优选在4℃下过夜)。NOTE：加完后瞬时离心。
包被板的购买信息为CORNING，High Binding，Lot#20519008。
(3)第二天：
(a1)配制PBST(0.05％Tween 20，Cat#TB220)：1L的PBS中加入0.5ml的Tween 20；
PBST机洗板子(Thermo Scientific wellwash versa)或者手洗(机洗完的板子依然要手动拍板/使用微孔板离心机(MPC-P25)离心1min，使板子看不见有水和气泡)；
(a2)封闭：80μl 5％BSA(BioFroxx,Cat.NO:4240GR100)(PBST配制)37℃下封闭1h；
(a3)加入新冠病毒RBD特异性单克隆抗体10μl/孔(20μg/ml)，室温1小时后洗板5次；
(a4)加入50ul山羊F(ab')2抗人IgG(Fab')2(Alkaline Phosphatase)(Abcam,P#ab98532)，室温30分钟；
(a5)100ul wash buffer清洗5次，加50ul反应底物PNPP；
(a6)检测吸光度值(OD405nm)。
结论：如图1所示，通过是否与新冠病毒RBD特异性单克隆抗体CQTS050、CQTS074和CQTS126结合的实验结果，筛选线性表位SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
实验二：线性抗原表位检测新冠肺炎患者恢复期血清抗体
(1)耗材和试剂：链霉亲和素涂层板(Thermo Fisher，P#15504)；Wash Buffer(使用
Figure BDA0002641054490000041
Protein-Free Blocking Buffers配制，P#37573)，在上述Buffer的基础上加入0.1％BSA(biofroxx,P#)；山羊F(ab')2抗人IgG(Fab')2(Alkaline Phosphatase)(Abcam,P#ab98532)；PNPP Substrate(Thermo Fisher,P#34045)；
(2)第一天：RBD化学合成的抗原肽使用PBS稀释(终浓度20μg/ml)，10μl/孔，包被384孔ELISA板在4℃下过夜或37℃下包被2h(本实施例优选在4℃下过夜)。NOTE：加完后瞬时离心。
包被板的购买信息为CORNING，High Binding，Lot#20519008。
(3)第二天：
(a1)配制PBST(0.05％Tween 20，Cat#TB220)：1L的PBS中加入0.5ml的Tween 20；
PBST机洗板子(Thermo Scientific wellwash versa)或者手洗(机洗完的板子依然要手动拍板/使用微孔板离心机(MPC-P25)离心1min，使板子看不见有水和气泡)；
(a2)封闭：80μl 5％BSA(BioFroxx,Cat.NO:4240GR100)(PBST配制)37℃下封闭1h；
(a3)加入新冠肺炎患者恢复期血浆和正常健康者(阴性对照)10μl/孔(原浓度)，室温1小时后洗板5次；
(a4)加入50ul山羊F(ab')2抗人IgG(Fab')2(Alkaline Phosphatase)(Abcam,P#ab98532)，室温30分钟；
(a5)100ul wash buffer清洗5次，加50ul反应底物PNPP；
(a6)检测吸光度值(OD405nm)。
结论：如图2所示，新冠病毒线性表位SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与患者血浆结合，而与健康人不结合的实验结果图。
实验三：线性抗原表位与ACE2结合的实验
(1)第一天：ACE2蛋白(从碧云天购入)使用PBS稀释(终浓度2μg/ml)，10μl/孔，包被384孔ELISA板在4℃下过夜或37℃下包被2h(本实施例优选在4℃下过夜)。NOTE：加完后瞬时离心。
(2)第二天：
(a1)配制PBST(0.05％Tween 20，Cat#TB220)：1L的PBS中加入0.5ml的Tween 20；
PBST机洗板子(Thermo Scientific wellwash versa)或者手洗(机洗完的板子依然要手动拍板/使用微孔板离心机(MPC-P25)离心1min，使板子看不见有水和气泡)；
(a2)封闭：80μl 5％BSA(BioFroxx,Cat.NO:4240GR100)(PBST配制)37℃下封闭1h；
(a3)加入实施实验三中合成的RBD抗原肽10μl/孔(20μg/ml)。室温1小时后洗板5次；
(a4)加入50ul亲和素Strepavidin-ALP抗体(3310-10)(1:1000)，室温30分钟；
(a5)100ul wash buffer清洗5次，加50ul反应底物PNPP；
(a6)检测吸光度值(OD405nm)。
结论：如图3所示，RBD抗原肽SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与RBD受体的ACRE2结合。
实验四：筛选新冠病毒RBD特异性单克隆抗体CQTS050、CQTS074和CQTS126
首先从新冠肺炎康复患者的外周血中分选得到单个RBD特异性记忆B细胞，然后获得RBD特异性记忆B细胞的mRNA，再通过RT-PCR和巢式PCR构建抗体可变区基因表达盒，再将抗体可变区基因表达盒转导入293T细胞表达抗体并收集上清，用ELISA法检测上清的RBD特异性，筛选得到RBD特异性单克隆抗体，具体包括以下步骤：
S1、采集若干名新冠肺炎康复患者外周血，分离得到PBMC，在-80℃的冰箱中冻存备用。
S2、首先采用去死细胞染料(Dead Dye)去除S1得到的PBMC的死细胞，然后采用CD19、mIg-G、mIg-D和S-RBD对PBMC中活的RBD特异性并且结合能力高的记忆B细胞染色标记，筛选出针对RBD特异性记忆B细胞；使用流式细胞分选仪将特异性记忆B细胞分选到96孔板上，每个孔内有一个特异性记忆B细胞，在-80℃的冰箱中冻存备用。
具体的，本实施例优选的Dead Dye染色时的浓度范围为1-2μg/mL，本实施例优选Dead Dye染色时的浓度为1.5μg/mL；CD19为Biolegend生产的B细胞标记物，染色时的浓度范围为1-2μg/mL，本实施例优选CD19染色时的浓度为1.5μg/mL。mIg-G为Biolegend生产的B细胞标表面受体，染色时的浓度范围为1-2μg/mL，本实施例优选mIg-G染色时的浓度为1.5μg/mL；mIg-D为Biolegend生产的B细胞表面受体，染色时的浓度范围为1-2μg/mL，本实施例优选mIg-D染色时的浓度为1.5μg/mL；S-RBD为sinobiological生产的新冠病毒是蛋白受体结构域，染色时的浓度范围为1-2μg/mL，本实施例优选S-RBD染色时的浓度为1.5μg/mL。
通过流式细胞仪分选RBD特异性记忆B细胞的，通过CD19、mIg-G、mIg-D和S-RBD对PBMC的细胞分选得到对S-RBD具有特异性记忆B细胞的细胞分选图如图4和图5所示，其中图5中的Batch ID 0428、0505、0522、0528是筛选批次。本实施例采用CD19、mIg-G、mIg-D和S-RBD筛选出针对RBD特异性记忆B细胞的原理在于：将PBMC用去死细胞染料(Dead Dye)、B细胞标记物CD19、记忆B细胞标记物mIg-G阳性和mIg-D阴性以及RBD特异性IgG表达的记忆B细胞进行染色，然后使用流式细胞分析仪将细胞群中CD19细胞群划分出来，再通过从CD19阳性细胞群中划分mIg-G+mIg-D-细胞群，再从mIg-G+mIg-D-细胞群划分RBD阳性的记忆B细胞，再通过流式细胞分选仪将RBD阳性的记忆B细胞进行分选。
S3、分选得到单个RBD特异性记忆B细胞的mRNA，采用RT-PCR扩增获得抗体可变区cDNA。具体的，使用RT-PCR扩增抗体可变区cDNA时，本实施例所设计的引物的引物前段设计有通用Leader(参见引物序列表一和引物序列表二)，有效提高了抗体基因的扩增率，实验结果如图6所示。
S4、采用巢式PCR扩增S1-S3得到的抗体可变区cDNA，构建抗体可变区基因表达盒。
S3和S4总共通过以下六部分进行：(1)提取RBD特异性记忆B细胞的mRNA；(2)单个细胞mRNA逆转录(RT)；(3)加G尾(TDT)；(4)第一轮PCR(1st PCR)；(5)第二轮PCR(2nd PCR)；(6)BCR-ORF PCR扩增构建基因表达盒；(7)CMV、WPRE-γ/κ/l片段扩增及CMV、BCR-Vγ/κ/l((6)的产物)、WPRE-γ/κ/l重叠PCR(Overlap PCR)预连接；(8)BCR-γORF、BCR-κORF、BCR-lPCR扩增。
各部分反应液配制及反应条件如下：
(1)采用DynabeadsTM mRNA DIRECTTM Purification Kit(ThermoFisherscientific)进行单细胞mRNA提取，具体包括以下步骤：
①离心：从-80℃冰箱中取出分选有单个RBD特异性记忆B细胞的96孔板后，600×g离心30s，使细胞离心于孔底部；
②清洗：将Dynabeads oligo(dT)25微球瓶取出后涡旋混匀，按照2μl/孔吸取足量微球，放置于磁铁块上，静置30s，弃上清，用500μl的Lysis Buffer重悬；
③配制：按照9μl/孔Lysis Buffer加入到50mL的离心管中，将上述500μl微球悬液加入其中，用枪吹匀；
④分装：用八连管分装微球，随后采用排枪将其按照9μl/孔加入到细胞板中；
⑤润洗：96孔板贴膜，随后润洗管壁四周，共2个循环；
⑥孵育：室温静置5min，使RBD特异性记忆B细胞的mRNA充分释放并结合到微球上，孵育结束后，600×g瞬时离心，使微球离心于孔底部。将96孔板放置于DynaMagTM-96sideMagnet磁板上，用排枪吸弃上清；
⑦Wash A清洗：按照8μl/孔加入Washing Buffer A，来回走板7-8次，使微球充分洗涤，弃上清；
⑧Wash B清洗：按照8μl/孔加入Washing Buffer B，来回走板7-8次，使微球充分洗涤，弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的逆转录(RT)反应液。试剂配制及反应条件如下述(2)描述。
(2)逆转录(RT)(10μl体系)：所需配制的试剂如下表1所示。
试剂名称 体积
DEPC-H<sub>2</sub>O 4.5μl
5×primerscript Buffer 2.0μl
2.5mM dNTP 2.0μl
RNase Inhibitor 1μl
Sample beads
PrimerScript Ⅱ RTase 0.5μl
总体积 10μl
反应条件：42℃ for 60min(每20min混合一次)；
反应结束后，600×g瞬时离心96孔板，然后将96孔板放置于DynaMagTM-96sideMagnet磁板上，用排枪吸弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的TDT反应液，试剂配制及反应条件如下述(3)描述。
(3)加G尾(TDT)(10μl体系)：所需配制的试剂如下表2所示。
试剂名称 体积
H<sub>2</sub>O 6.4μl
5×TdT buffer 2.0μl
10mM dGTP 0.5μl
0.1％BSA 1.0μl
Sample beads
TdT 0.1μl
总体积 10μl
反应条件：37℃ for 40min(每20min混合一次)。
反应结束，600×g瞬时离心96孔板，然后将其放置于DynaMagTM-96side Magnet磁板上，用排枪吸弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的第一轮PCR(1st PCR)反应液，试剂配制及反应条件如下述(4)描述。
(4)1st PCR(10μl体系)(引物序列参见引物序列表)：所需配制的试剂如下表3所示。
试剂名称 体积
H<sub>2</sub>O 1.9μl
2×GC Buffer 5μl
2.5mM dNTP 1μl
FP:AP3-dC(10μM) 0.5μl
RP1:Cg-1st(10μM) 0.5μl
RP2:Ck-1st(10μM) 0.5μl
RP3:CI-RT(10μM) 0.5μl
PrimesTAR 0.1μl
sample beads
总体积 10μl
基于PCR原理，1st PCR的实验反应条件为：①95℃预变性3min；②95℃变性15sec，60℃退火5sec，72℃延伸1min，30-35cycles，本实施例优选30cycles；③72℃循环外延伸5min，4℃保存。
(5)第二轮PCR(2nd PCR)(10μl体系)(引物序列参见引物序列表一和引物序列表二)：所需配制的试剂如下表4所示。
试剂名称 体积
H<sub>2O</sub> 1.5μl
2×GC Buffer 5μl
2.5mM dNTP 1μl
FP:MAC-AP3/AP3(10μM) 0.5μl
RP:Cg-nest/K20/CI-nest(10μM) 0.5μl
Primes TAR 0.5μl
sample 1μl
总体积 10μl
基于PCR原理，2nd PCR的实验反应条件为：①95℃预变性3min；②95℃变性15sec，60℃退火5s，72℃延伸1min，30-35cycles，本实施例优选35cycles；72℃循环外延伸5min，4℃保存。
PCR结束后：每孔取4μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。将Gamma链与Kappa链或Lamada链配对的细胞孔送测序。
(6)抗体表达盒(BCR-ORF)的扩增和构建：PCR扩增启动子区(CMV启动子)、WPRE-γ(抗体gamma链)和WPRE-κ(抗体kappa链)，PCR扩增体系如下表5所示。
Figure BDA0002641054490000091
PCR扩增条件为：①95℃预变性3min；②95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸1min，30cycles；③72℃循环外延伸5min，12℃保存。
(7)CMV、WPRE-γ/κ/l片段扩增及CMV、BCR-Vγ/κ/l、WPRE-γ/κ/l重叠PCR(Overlap PCR)预连接：实验体系如下表6所示。
Figure BDA0002641054490000092
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，50℃退火15sec，72℃延伸1.5min，10cycles；72℃循环外延伸5min，12℃保存。
(8)BCR-γORF、BCR-κORF、BCR-l PCR扩增：实验体系如下表7所示。
Figure BDA0002641054490000093
PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸1.5min，30cycles；72℃循环外延伸5min，12℃保存。
扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析得到的抗体可变区基因大小是否正确，实验结果如图7所示，Marker在中间位置，条带在5000bp处。
BCR-γORF和BCR-κ/ORF乙醇沉淀：BCR-γORF和BCR-κORF的PCR产物各取30μl置于8连管中，再加入120μl无水乙醇，6μl醋酸钠溶液，充分混匀，-80℃静置30min；10000rpm，离心20min，弃上清，依次用200μl的70％乙醇和无水乙醇各漂洗一次，于56℃乙醇充分挥发，加入40μl无菌水，振荡，使沉淀充分溶解，检测抗体可变区基因的浓度。
S3和S4所用到的Leader引物参见如下的引物序列表一：
Figure BDA0002641054490000101
Figure BDA0002641054490000111
S3和S4所用到的所用到J-region引物参见如下的引物序列表二：
primer ID sequence
IGHJ_01 GATGGGCCCTTGGTGGAGGGTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGT
IGHJ_02 GATGGGCCCTTGGTGGAGGGTGAGGAGACAGTGACCAGGGTGCCACGGCCCCAGA
IGHJ_03 GATGGGCCCTTGGTGGAGGGTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAGA
IGHJ_04 GATGGGCCCTTGGTGGAGGGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGCCCCCAGA
IGKJ_01 GATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTCC
IGKJ_02 GATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTCC
IGKJ_03 GATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGCCGAAAGTGA
IGKJ_04 GATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGCCGAAAGTGA
IGKJ_05 GATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGCCGAAGGTGA
IGLJ_01 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCCAGTTCCGAAGACAT
IGLJ_02 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAATACCA
IGLJ_03 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCCACCAAATACAA
IGLJ_04 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAGCTCGGTCCCCTCACCAAACACCC
IGLJ_05 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAGCTCCGTCCCCTCACCAAACACCC
IGLJ_06 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCGAGGACGGTCACCTTGGTGCCACTGCCGAACACAT
IGLJ_07 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCCTCCTCCGAACACAG
IGLJ_08 GGGGCAGCCTTGGGCTGACCGAGGGCGGTCAGCTGGGTGCCTCCTCCGAACACAG
S5、将S4得到的抗体可变区基因表达盒转导入293T细胞48小时内表达抗体并收集上清，用ELISA法检测上清的RBD特异性，筛选RBD特异性全人源单克隆抗体。
(A)使用PBS稀释抗原(终浓度2μg/mL)，10μl/孔，包被384孔ELISA板4℃过夜或37℃包被2h(本实施例优选4℃过夜)。NOTE：加完后瞬时离心保证液体在底部。
实验体系如下表8所示：
试剂名称 货号 原浓度 终浓度 稀释比
SARS-COV-2RBD Cat:40592-V08H 200μg/mL 2μg/mL 1:100
Goat pab to Hu IgG－ALP Cat:ab97221 1mg/mL 2μg/mL 1:500
(B)配制PBST(0.05％Tween 20，Cat#TB220)：1L的PBS加入0.5mL的Tween 20；
PBST机洗板子(Thermoscientific wellwash versa)或者手洗(机洗完的板子依然要手动拍板/使用微孔板离心机(MPC-P25)离心1min，使板子看不见有水和气泡)。
封闭：80μl的5％BSA(BioFroxx，Cat.NO:4240GR100)(PBST配制)加入上述洗好的板子里，放置于37℃的孵育箱孵育1h。PBST机洗板子或者手洗。
(C)加样及标准品。其中，标准品：10μl/well原浓度1μg/mL，梯度稀释为250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.9ng/mL和1.95ng/mL。(封闭液稀释)；样品：转染抗体基因的细胞上清液。阴性对照/空白孔：封闭液10μl/well。
在37℃孵育30min。PBST机洗板子或者手洗。
(D)加二抗，加入的浓度为10μl/well，然后在37℃下孵育30min，实验体系如下表9所示：
二抗名称 货号 原浓度 终浓度 稀释比
goat-anti-human IgG-ALP A18808 1.5mg/ml 0.3μg/ml 1:5000
Goat pab to Hu IgG-ALP Ab98532 0.5mg/ml 0.25μg/ml 1:2000
PBST机洗板子或者手洗。10μl/well的PNPP(对硝基苯磷酸二钠)，使用(Thermoscientific Muttiskan GO)检测5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min和60min的OD(450mm)值。50mg的PNPP粉末(Thermo，Prod#34045)+40mL的ddH2O+10mL的Diethanol aminesubstrate Buffer(5X)，PNPP避光4℃储存。
实验结果如图8-图9所示，如图8中的CQTS050和CQTS074，以及图9中的CQTS126为所需要的单克隆抗体，OD值为0.1以上为阳性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Figure IDA0002641054550000011

Claims (7)

1.一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，其特征在于，具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。
2.根据权利要求1所述的一种新冠病毒RBD特异性单克隆抗体的线性抗原表位，其特征在于，通过以下步骤得到：首先对新冠病毒的S蛋白或新冠病毒的RBD蛋白进行变性反应后，再用新冠病毒特异性单克隆抗体与变性反应后的S蛋白或RBD蛋白进行结合试验，再将S蛋白或RBD蛋白进行抗原线性表位段的合成而获得线性表位。
3.一种编码权利要求1所述的线性抗原表位的核酸。
4.一种包括权利要求2所述的核酸的重组载体。
5.一种包括权利要求2所述的核酸或导入了权利要求3所述的重组载体的宿主细胞。
6.一种疫苗，其特征在于，包括以下任一项：（1）包括权利要求1所述的线性抗原表位；（2）包括权利要求3所述的核酸；（3）包括权利要求4所述的重组载体。
7.一种检测试纸或者检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的线性抗原表位。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112920278A (zh) * 2021-02-18 2021-06-08 青岛硕景生物科技有限公司 一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
WO2022178591A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Biotome Pty Ltd Peptides and their use in diagnosis of sars-cov-2 infection
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111413495A (zh) * 2020-05-18 2020-07-14 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒
CN111426824A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 广东药科大学附属第一医院 一种胶体金试纸及其制备方法和应用
CN111474340A (zh) * 2020-05-18 2020-07-31 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用
CN111892648A (zh) * 2020-06-08 2020-11-06 中国科学院上海药物研究所 偶联tlr7激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用
CN111983236A (zh) * 2020-06-28 2020-11-24 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） 一种用于检测新型冠状病毒SARS-COV-2感染的γ干扰素释放方法
CN112384805A (zh) * 2020-05-31 2021-02-19 湖南珐驷特生物科技有限公司 一种检测新型冠状病毒的试剂盒和检测装置及其制备方法
US20220016235A1 (en) * 2020-06-10 2022-01-20 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111426824A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 广东药科大学附属第一医院 一种胶体金试纸及其制备方法和应用
CN111413495A (zh) * 2020-05-18 2020-07-14 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgM/IgG胶体金检测试剂盒
CN111474340A (zh) * 2020-05-18 2020-07-31 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用
CN112384805A (zh) * 2020-05-31 2021-02-19 湖南珐驷特生物科技有限公司 一种检测新型冠状病毒的试剂盒和检测装置及其制备方法
CN111892648A (zh) * 2020-06-08 2020-11-06 中国科学院上海药物研究所 偶联tlr7激动剂的新型冠状病毒多肽疫苗及其应用
US20220016235A1 (en) * 2020-06-10 2022-01-20 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof
CN111983236A (zh) * 2020-06-28 2020-11-24 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） 一种用于检测新型冠状病毒SARS-COV-2感染的γ干扰素释放方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YE FENG等: "Multi-Epitope Vaccine Design Using an Immunoinformatic Approach for SARS-CoV-2", 《PATHOGENS》 *
YE FENG等: "Multi-Epitope Vaccine Design Using an Immunoinformatic Approach for SARS-CoV-2", 《PATHOGENS》, vol. 10, no. 6, 11 June 2021 (2021-06-11) *
ZEZHONG LIU等: "The recombinant subunit vaccine RBD-Fc, consisting of SARS-CoV-2 RBD and human IgG Fc as an immunopotentiator, elicits robust neutralizing antibody responses against SARS-CoV-2 infection", 《RESEARCH SQUARE》 *
李文浩等: "新型冠状病毒疫苗设计原理与研究进展", 《大学化学》 *
李文浩等: "新型冠状病毒疫苗设计原理与研究进展", 《大学化学》, vol. 35, no. 12, 15 July 2020 (2020-07-15), pages 29 - 34 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies
CN112920278A (zh) * 2021-02-18 2021-06-08 青岛硕景生物科技有限公司 一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
WO2022178591A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Biotome Pty Ltd Peptides and their use in diagnosis of sars-cov-2 infection

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