FR2866025A1 - Utilisation des proteines et des peptides codes par le genome d'une nouvelle souche de coronavirus associe au sras - Google Patents

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Abstract

Utilisation des protéines et des peptides codés par le génome de la souche isolée ou purifiée de coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère, issue d'un prélèvement répertorié sous le n° 031589, et des anticorps dérivés comme réactifs de diagnostic et comme vaccin.

Description

UTILISATION DES PROTEINES ET DES PEPTIDES CODES PAR LE
GENOME D'UNE NOUVELLE SOUCHE DE CORONAVIRUS ASSOCIE AU
SRAS
La présente invention est relative à une nouvelle souche de corona- virus associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), issue d'un prélèvement répertorié sous le n 031589 et prélevé à Hanoi (Vietnam), à des molécules d'acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites molécules d'acide nucléique ainsi qu'à leurs applications, notamment en tant que réac-tifs de diagnostic et/ou comme vaccin.
Le coronavirus est un virus à ARN monocaténaire, de polarité positive, d'approximativement 30 kilobases qui se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes; l'extrémité 5' du génome a une structure en coiffe et l'extrémité 3' comporte une queue polyA. Ce virus est enveloppé et comprend, à sa surface, -des structures péplomériques- dénommées spicules.
Le génome comprend les cadres ouverts de lecture ou ORF suivants, de son extrémité 5' vers son extrémité 3' : ORF 1 a et ORF 1 b correspondant aux protéines du complexe de transcription-réplication, et ORF-S, ORF-E, ORFM et ORF-N correspondant aux protéines structurales S, E, M et N. I1 comprend également des ORFs correspondant à des protéines de fonction inconnue codées par: la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant cette dernière, la région située entre l'ORF-M et l'ORF-N, et la région incluse dans l'ORF-N.
La protéine S est une glycoprotéine membranaire (200-220 kDa) qui se présente sous la forme de spicules ou "Spike" émergeant de la surface de l'enveloppe virale. Elle est responsable de l'attachement du virus aux récepteurs de la cellule hôte et de l'induction de la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire.
La petite protéine d'enveloppe (E) également dénommée sM (small membrane) qui est une protéine trans-membranaire non glycosylée d'environ 10 kDa, est la protéine présente en plus faible quantité dans le virion. Elle joue un rôle moteur dans le processus de bourgeonnement des coronavirus qui se produit au niveau du compartiment intermédiaire dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi La protéine M ou protéine de matrice (25-30 kDa) est une glycoprotéine membranaire plus abondante qui est intégrée dans la particule virale par une interaction M/E, tandis que l'incorporation de S dans les particules est dirigée par une interaction S/M. Elle semble être importante pour la maturation virale des coronavirus et pour la détermination du site au niveau duquel les particules virales sont assemblées.
La protéine N ou protéine de nucléocapside (45-50 kDa) qui est la plus conservée parmi les protéines structurales des coronavirus, est nécessaire pour encapsider l'ARN génomique puis pour diriger son incorporation dans le virion. Cette protéine est vraisemblablement également impliquée dans la réplication de l'ARN.
Lorsqu'une cellule hôte est infectée, le cadre de lecture (ORF) situé en 5' du génome viral est traduit en une polyprotéine qui est clivée par les protéases virales et libère alors plusieurs protéines non-structurales telles que l'ARN-polymérase ARN dépendante (Rep) et l'ATPase hélicase (Hel). Ces deux protéines sont impliquées dans la réplication du génome viral ainsi que dans la génération de transcrits qui sont utilisés dans la synthèse des protéines virales. Les mécanismes par lesquels ces ARNms sub-génomiques sont produits, ne sont pas complètement compris; cependant des faits récents indiquent que les séquences de régulation de la transcription à l'extrémité 5' de chaque gène représentent des signaux qui régulent la transcription discontinue des ARNms sub-génomiques.
Les protéines de la membrane virale (protéines S, E et M) sont insérées dans le compartiment intermédiaire, alors que l'ARN répliqué (brin +) s'assemble avec la protéine N (nucléocapside). Ce complexe protéine-ARN s'associe ensuite avec la protéine M incluse dans les membranes du réticulum endoplasmique et les particules virales se forment lorsque le complexe de la nucléocapside bourgeonne dans le réticulum endoplasmique. Le virus migre ensuite à travers le complexe du Golgi et éventuellement sort de la cellule, par exemple par exocytose. Le site de l'attachement du virus à la cellule hôte se trouve au niveau de la protéine S. Les coronavirus sont responsables de 15 à 30 % des rhumes chez l'Homme et d'infections respiratoires ou digestives chez les animaux, notamment le chat (FIPV: Feline infectious peritonitis virus), la volaille (IBV: Avian Infectious bronchitis virus), la souris (MI-IV: Mouse Hepatitis virus), le porc (TGEV: Transmissible gastroenterititis virus, PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV: Porcine Respiratory Coronavirus, HEV: Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) et les bovins (BcoV: Bovine coronavirus).
En général, chaque coronavirus n'affecte qu'une seule espèce; chez les individus immunocompétents, l'infection induit des anticorps éventuellement neutralisants et une immunité cellulaire, capables de détruire les cellules infectées.
Une épidémie de pneumonie atypique, dénommée syndrome respiratoire aigu sévère (SARS ou Severe acute respiratory syndrome, SRAS en français) s'est propagée dans différents pays (Vietnam, Hong-Kong, Singapour, Thaïlande et Canada) au cours du premier trimestre 2003, à partir d'un foyer initial apparu en Chine dans le dernier trimestre de 2002. La sévérité de cette maladie est telle que son taux de mortalité est d'environ 3 à 6 %. La détermination de l'agent causatif de cette maladie a été entreprise par de nombreux laboratoires, à travers le monde.
En mars 2003, un nouveau coronavirus (SARS-CoV, SARS virus ou virus SRAS, en français) a été isolé, en association avec des cas de syndrome respiratoire aigu sévère (T.G.KSIAZEK et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330; C. DROSTEN et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976; Peiris et al., Lancet, 2003, 361, 1319-).
Des séquences génomiques de ce nouveau coronavirus ont ainsi été obtenues, notamment celles de l'isolat Urbani (Genbank n d'accès AY274119.3 et A. MARRA et al., Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404) et de l'isolat de Toronto (Tor2, Genbank n d'accès AY 278741 et A. ROTA et al., Science, 2003, 300, 1394-1399).
L'organisation du génome est comparable à celle des autres corona- virus connus permettant ainsi de confirmer l'appartenance du SARS-CoV à la famille des C'oronaviridae; les cadres ouverts de lecture ORF 1 a et 1 b et les cadres ouverts de lecture correspondant aux protéines S, E, M, et N, ainsi qu'à des protéines codées par: la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E (ORF3), la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant l'ORF-E (ORF4), la région située entre l'ORF-M et l'ORF-N (ORF7 à ORF 11) et la région correspondant à l'ORF-N (ORF 13 et ORF14), ont notamment été identifiées.
Sept différences ont été mises en évidence entre les séquences des isolats Tor2 et Urbani; 3 correspondent à des mutations silencieuses (c/t en position 16622 et alg en position 19064 de l'ORFIb, t/c en position 24872 de l'ORF-S) et 4 modifient la séquence en acides aminés de respectivement: les protéines codées par l'ORF 1 a (c/t en position 7919 correspondant à la mutation A/V), la protéine S (g/t en position 23220 correspondant à la mutation AIS), la protéine codée par l'ORF3 (a/g en position 25298 correspondant à la mutation R/G) et de la protéine M (t/c en position 26857 correspondant à la mutation S/P).
En outre, l'analyse phylogénétique montre que le SARS-CoV est éloigné des autres coronavirus et qu'il est apparu, ni par mutation de coronavirus respiratoires humains, ni par recombinaison entre des coronavirus connus (pour une revue, voir Holmes, J.C.I., 2003, 111, 1605- 1609).
La mise en évidence et la prise en compte de nouveaux variants sont importantes pour la mise au point de réactifs de détection et de diagnostic du SRAS suffisamment sensibles et spécifiques ainsi qu'à des compositions immunogènes aptes à protéger des populations contre des épidémies de SRAS.
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence une autre souche de coronavirus associé au SRAS, qui se distingue des isolats Tor2 et Urbani.
La présente invention a donc pour objet, une souche isolée ou puri- fiée de coronavirus humain associé au syndrome respiratoire aigu sévère, caractérisée en ce que son génome présente sous la forme d'ADN complémentaire un codon sérine en position 23220-23222 du gène de la protéine S ou un codon glycine en position 25298-25300 du gène de l'ORF3, et un codon alanine en position 7918-7920 de l'ORFIa ou un codon sérine en position 26857-26859 du gène de la protéine M, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite souche, l'équivalent ADN de son génome présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO: 1; cette souche de coronavirus est issue du prélèvement de lavage bronchoalvéolaire d'un patient atteint de SRAS, répertorié sous le n 031589 et effectué à l'hôpital français de Hanoi (Vietnam).
Conformément à l'invention, ladite séquence SEQ ID NO:1 est celle de l'acide désoxyribonucléique correspondant à la molécule d'acide ribonucléique du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus.
La séquence SEQ ID NO: 1 se distingue de la séquence Genbank AY274119.3 (isolat Tor2) en ce qu'elle possède les mutations suivantes: - g/t en position 23220; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct), - a/g en position 25298; le codon arginine (aga) en position 11 de la séquence en acide aminés de la protéine codée par l'ORF3 de Tor 2 est remplacé par 10 un codon glycine (gga).
En outre, la séquence SEQ ID NO: 1 se distingue de la séquence Genbank AY278741 (isolat Urbani) en ce qu'elle possède les mutations suivantes: t/c en position 7919; le codon valine (gtt) en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l' ORF 1 a est remplacé par un codon alanine (gct), - t/c en position 16622: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l'ORFIb (mutation silencieuse), - g/a en position 19064: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l'ORFIb (mutation silencieuse), - c/t en position 24872: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et - c/t en position 26857: le codon proline (ccc) en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M est remplacé par un codon sérine (tcc).
En l'absence de mention particulière, les positions des séquences nucléotidiques et peptidiques sont indiquées en référence à la séquence Genbank AY2741 19.3.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence est celle du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide il présente la séquence SEQ ID NO: 1.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence hybride dans des conditions de forte stringence avec la séquence du polynucléotide tel que défini cidessus.
Les termes isolé ou purifié signifient modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel; autrement dit si un objet existe dans la nature, il est dit isolé ou purifié s'il a été modifié ou extrait de son environnement naturel ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou une protéine/un peptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est ni isolé, ni purifié ; en revanche le même polynucléotide ou protéine /peptide séparé des molécules coexistantes dans son environnement naturel, obtenu par clonage, amplification et/ou synthèse chimique est isolé au sens de la présente invention. De plus, un polynucléotide ou une protéine/peptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par toute autre méthode, est isolé même s'il est présent dans ledit organisme. Le terme purifié tel qu'utilisé dans la présente invention, signifie que les protéines /peptides selon l'invention sont essentiellement libres d'association avec les autres protéines ou polypeptides, comme l'est par exemple le produit purifié de la culture de cellules hôtes recombinantes ou le produit purifié à partir d'une source non-recombinante.
Au sens de la présente invention, on entend par conditions d'hybridation de forte stringence, des conditions de température et de force ionique choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation spécifique et sélective entre polynucléotides complémentaires.
A titre d'illustration, des conditions de forte stringence aux fins de définir les polynucléotides ci-dessus, sont avantageusement les suivantes: l'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes: (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCI + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon; (2) hybridation pendant 20 heures à 42 C suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C.
La présente invention a également pour objet un fragment représen- tatif du polynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu, soit par l'utilisation d'enzymes de restriction dont les sites de reconnaissance et de coupure sont présents dans ledit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par amplification à l'aide d'amorces oligonucléotidiques spécifiques dudit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par transcription in vitro, soit par synthèse chimique.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il est sélectionné dans le groupe constitué par: l'ADNc correspondant à au moins un cadre ouvert de lecture (ORF) choisi parmi: ORF 1 a, ORF 1 b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 à ORF 11, ORF 13 et ORF 14, et l'ADNc correspondant aux extrémités 5' ou 3' non-codantes dudit polynucléotide.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit fragment présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par: - les séquences SEQ ID NO: 2 et 4 représentant l'ADNc corres-15 pondant à l'ORF-S qui code pour la protéine S, - les séquences SEQ ID NO: 13 et 15 représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-E qui code pour la protéine E, les séquences séquence SEQ ID NO: 16 et 18 représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-M qui code pour la protéine M, - les séquences SEQ ID NO: 36 et 38 représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-N qui code pour la protéine N, - les séquences représentant les ADNc correspondant respective-ment: aux ORF la et ORF 1 b (ORF 1 ab, SEQ ID NO: 31), aux ORF3 et ORF4 (SEQ ID NO: 7, 8), aux ORF 7 à 11 (SEQ ID NO: 19, 20), à l'ORF13 (SEQ ID NO: 32) et à l'ORF14 (SEQ ID NO: 34), et - les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement aux extrémités 5'(SEQ ID NO: 39 et 72) et 3' non-codantes (SEQ ID NO: 40, 73) dudit polynucléotide.
La présente invention a également pour objet un fragment de l'ADNc codant pour la protéine S, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 5 et 6 (fragments Sa et Sb).
La présente invention a également pour objet un fragment de l'ADNc correspondant aux ORF I a et ORF l b tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 41 à 54 (fragments LO à L12).
La présente invention a également pour objet un fragment du polynucléotide tel que défini ci dessus, caractérisé en ce qu'il présente au moins 15 bases ou paires de bases consécutives de la séquence du génome de ladite souche incluant au moins une de celles situées en position 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 et 26857. De préférence, il s'agit d'un fragment de 20 à 2500 bases ou paires de bases, de manière préférée de 20 à 400.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il inclut au moins un couple de bases ou de paires de bases correspondant aux positions suivantes: 7919 et 23220, 7919 et 25298, 16622 et 23220, 19064 et 23220, 16622 et 25298, 19064 et 25298, 23220 et 24872, 23220 et 26857, 24872 et 25298, 25298 et 26857.
La présente invention a également pour objet des amorces d'au moins 18 bases aptes à amplifier un fragment du génome d'un coronavirus associé au SRAS ou de l'équivalent ADN de celui-ci.
Selon un mode de réalisation desdites amorces, elles sont sélection-20 nées dans le groupe constitué par: - la paire d'amorces n 1 correspondant respectivement aux positions 28507 à 28522 (amorce sens, SEQ ID NO: 60) et 28774 à 28759 (amorce anti- sens, SEQ ID NO: 61) de la séquence du polynucléotide tel que défini ci- dessus, et - la paire d'amorces n 2 correspondant respectivement aux positions 28375 à 28390 (amorce sens, SEQ ID NO: 62) et 28702 à 28687 (amorce anti- sens, SEQ ID NO: 63) de la séquence du polynucléotide tel que défini ci- dessus.
La présente invention a également pour objet une sonde apte à détecter la présence du génome d'un coronavirus associé au SRAS ou d'un fragment de celui-ci, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par: les fragments tels que définis ci-dessus et les fragments correspondant aux positions suivantes de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus: 28561 à 28586, 28588 à 28608, 28541 à 28563 et 28565 à 28589 (SEQ ID NO: 64 à 67).
Les sondes et amorces selon l'Invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'Homme du Métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou 1,1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
L'invention englobe les sondes et les amorces marquées dérivées des 10 séquences précédentes.
De telles sondes et amorces sont utiles pour le diagnostic de l'infection par un coronavirus associé au SRAS.
La présente invention a également pour objet une méthode de détection d'un coronavirus associé au SRAS, à partir d'un échantillon biologique, laquelle 15 méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) l'extraction d'acides nucléiques présents dans ledit échantillon biologique, (b) l'amplification d'un fragment de l'ORF-N par RT-PCR à l'aide d'une paire d'amorces telle que définie ci-dessus, et (c) la détection par tout moyen approprié des produits d'amplifications obtenus en (b).
Les produits d'amplifications (amplicons) en (b) sont de 268 pb pour la paire d'amorces n 1 et de 328 pb pour la paire d'amorces n 2.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape (b) de détection est réalisée à l'aide d'au moins une sonde correspondant aux positions 28561 à 28586, 28588 à 28608, 28541 à 28563 et 28565 à 28589 de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus.
De préférence, le génome du coronavirus associé au SRAS est détecté et éventuellement quantifié par PCR en temps réel, à l'aide de la paire d'amorces n 2 et des sondes correspondant aux positions 28541 à 28563 et 28565 à 28589 marquées avec des composés différents, notamment des agents fluorescents différents.
La RT-PCR en temps réel qui met en oeuvre cette paire d'amorces et cette sonde est très sensible puisqu'elle permet de détecter 102 copies d'ARN et jusqu'à 5 10 copies d'ARN, elle est en outre fiable et reproductible.
L'invention englobe les polydésoxyribonucléotides et les polyribonucléotides simple-brin, double-brin et tripe-brin correspondant à la séquence du génome de la souche isolée de coronavirus et de ses fragments tels que définis ci-dessus, ainsi qu'à leurs séquences complémentaires, sens ou anti-sens, notamment les ARN et les ADNc correspondant à la séquence du génome et de ses fragments tels que définis ci-dessus.
La présente invention englobe également les fragments d'amplification obtenus à l'aide d'amorces spécifiques du génome de la souche purifiée ou isolée tel que défini ci-dessus, notamment à l'aide d'amorces et de paires d'amorces telles que définies ci-dessus, les fragments de restriction constitués par ou comprenant la séquence des fragments tels que définis ci-dessus, les fragments obtenus par transcription in vitro à partir d'un vecteur contenant la séquence SEQ ID NO: 1 ou un fragment tel que défini ci-dessus, ainsi que des fragments obtenus par synthèse chimique. Des exemples de fragments de restriction sont déduits de la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO: 1 illustrée par la figure 13. Conformément à l'invention lesdits fragments sont, soit sous forme de fragments isolés, soit sous forme de mélanges de fragments. L'invention englobe également les fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlèvement, ou addition de nucléotides dans une proportion d'environ 15 %, par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec les séquences d'ARN génomiques ou antigénomiques de l'isolat tel que défini ci-dessus.
Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M AUSUBEL,2000, Wiley and son hic, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RTPCR ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.
La présente invention a également pour objet une puce ou filtre à ADN ou à ARN, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide ou l'un 5 de ses fragments tels que définis ci-dessus.
Les puces ou filtres à ADN ou à ARN selon l'invention sont préparés par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comme par exemple greffage chimique ou électrochimique d'oligonucléotides sur support de verre ou de nylon.
La présente invention a également pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant, notamment un plasmide ou un phage comprenant un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit fragment d'acide nucléique est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur.
Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte, sont connus en eux-mêmes; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expres- sion de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
Conformément à l'invention, ledit plasmide est notamment sélectionné parmi les plasmides suivants: - le plasmide, dénommé SARS-S, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3059, le 20 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 25348 (SEQ ID NO: 4), en référence à la séquence Genbank AY274 119.3, - le plasmide, dénommé SARS-S1, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3020, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 5' de la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci- dessus, lequel fragment correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID NO:5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2, - le plasmide, dénommé SARS-S2, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3019, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 3'de la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348 (SEQ ID NO:6), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide, dénommé SARS-SE, compris dans la souche bacté- rienne déposée sous le n I-3126, le, 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant l'ORF-E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle région correspondant aux nucléotides des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO:8), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide, dénommé SARS-E, compris dans la souche bacté- rienne déposée sous le n I-3046, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO:15), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide, dénommé SARS-M; compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3047, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus; laquelle séquence correspondantaux nucléotides des positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO:18), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-MN, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n 1-3125, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF-M et l'ORF-N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci- dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO:20), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-N, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie cidessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à 29430 (SEQ ID NO:38), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-5'NC, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n 1- 3124, le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à l'extrémité 5'non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ ID NO:39), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-3'NC, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3123 le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. ; il contient la séquence d'ADNc correspondant à l'extrémité 3'non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant à celle située entre le nucléotide en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO:40), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, se termine par une série de nucléotides a., - le plasmide d'expression dénommé pIV2.3N, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion C-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression dénommé pIV2.3Sc, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion C-terminale du fragment correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression pIV2.3SL, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion C-terminale du fragment correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression dénommé pIV2.4N, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion N-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression dénommé pIV2.4Sc ou pIV2.4S1, contenant un insert codant pour une fusion N-terminale du fragment correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, et - le plasmide d'expression dénommé pIV2.4SL contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion N-terminale du fragment correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine.
Selon une disposition avantageuse du plasmide d'expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans une souche bactérienne qui a été déposée sous le n I- 3117, le 23 octobre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.
Selon une autre disposition avantageuse du plasmide d'expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans une souche bactérienne qui a été déposée sous le n I- 3118, le 23 octobre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.
La présente invention a également pour objet une banque d'ADNc caractérisée en ce qu'elle comprend des fragments tels que définis cidessus, en particulier des fragments d'amplification ou des fragments de restriction, clonés dans un vecteur recombinant, notamment un vecteur d'expression (banque d'expression).
La présente invention a également pour objet des cellules, notamment des cellules procaryotes, modifiées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Les vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus et les cellules transformées par lesdits vecteurs d'expression sont avantageusement utilisés pour la production des protéines et des peptides correspondants. Les banques d'expression dérivées desdits vecteurs, ainsi que les cellules transformées par lesdites banques d'expression sont avantageusement utilisées pour identifier les épitopes immunogènes (épitopes B et T) des protéines du coronavirus associé au SRAS.
La présente invention a également pour objet les protéines et les peptides purifiées ou isolées, caractérisés en ce qu'ils sont codés par le polynucléotide ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine est sélectionnée dans le groupe constitué par: - la protéine S de séquence SEQ ID NO:3 - la protéine E de séquence SEQ ID NO:14 - la protéine M de séquence SEQ ID NO:17 - la protéine N de séquence SEQ ID NO: 37 - les protéines codées par les ORFs: ORF 1 a, ORF 1 b, ORF3, ORF4 30 et ORF7 à ORF 11, ORF13 et ORF l 4 de séquence respectivement, SEQ ID NO:74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 et 35.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par: a) les peptides correspondant aux positions 14 à 1193 et 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S, b) les peptides correspondant aux positions 2 à 14 (SEQ ID NO: 69) et 100 à 221 de la séquence en acides aminés de la protéine M; ces peptides correspondent respectivement à l'ectodomaine et à l'endodomaine de la protéine M, et c) les peptides correspondant aux positions 1 à 12 (SEQ ID NO: 70) et 53 à 76 (SEQ ID NO: 71) de la séquence en acides aminés de la protéine E; ces peptides correspondent respectivement à l'ectodomaine et à l'extrémité C-terminale de la protéine E, et d) les peptides de 5 à 50 acides aminés consécutifs, de préférence de 10 à 30 acides aminés, inclus ou chevauchant partiellement ou totalement la séquence des peptides tels que définis en a), b) ou c).
La présente invention a également pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il présente une séquence de 7 à 50 acides aminés incluant un résidu d'acide aminé sélectionné dans le groupe constitué par: - l'alanine située en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ORFIa.
- la sérine située en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de la souche de SARS-CoV telle que définie ci-dessus, - la glycine en position 11 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ORF3 de la souche de SARS-CoV telle que définie ci- dessus, la sérine en position 154 de la séquence en acides aminés de la 25 protéine M de la souche de SARS-CoV telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un anticorps ou un fragment d'anticorps polyclonal ou monoclonal, susceptible d'être obtenu par immunisation d'un animal avec un vecteur recombinant tel que défini cidessus, une banque d'ADNc telle que définie ci-dessus ou bien une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il se lie avec l'une au moins des protéines codées par le SARS-CoV telles que définies ci-dessus.
L'invention englobe les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques tels que les anticorps humanisés, ainsi que leurs fragments (Fab, Fv, scFv).
Au sens de la présente invention, on entend par anticorps chimérique, relativement à un anticorps d'une espèce animale particulière ou d'une classe particulière d'anticorps, un anticorps comprenant tout ou partie d'une chaîne lourde et/ou d'une chaîne légère d'un anticorps d'une autre espèce animale ou d'une autre classe d'anticorps.
Au sens de la présente invention, on entend par anticorps humanisé une immmunoglobuline humaine dans laquelle les résidus des CDRs (Complementary-Determining Regions) qui forment le site de liaison à l'antigène sont remplacés par ceux d'un anticorps monoclonal non-humain possédant la spécificité, l'affinité ou l'activité recherchées. Par comparaison avec les anticorps non-humains, les anticorps humanisés sont moins immunogènes et possèdent une demi-vie prolon- gée chez l'Homme car ils ne possèdent qu'une faible proportion de séquences non-humaines étant donné que la quasi-totalité des résidus des régions FR (Framework) et de la région constante (Fc) de ces anticorps sont ceux d'une séquence consensus d'immunoglobulines humaines.
La présente invention a également pour objet une puce à protéine, 20 caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine, un peptide ou bien un anticorps tels que définis ci-dessus.
Les puces à protéine selon l'invention sont préparées par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Parmi les supports appropriés sur lesquels peuvent être immobilisés des protéines, on peut citer ceux en matière plastique ou en verre, notamment sous la forme de microplaques.
La présente invention a également pour objet des réactifs dérivés de la souche isolée de coronavirus associé au SRAS, issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, utiles pour l'étude et le diagnostic de l'infection provoquée par un coronavirus associé au SRAS, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe cons- titué par: (a) une paire d'amorces, une sonde ou une puce à ADN telles que définies ci-dessus, (b) un vecteur recombinant ou une cellule modifiée tels que définis cidessus, (c) une souche isolée de coronavirus ou un polynucléotide tels que définis ci-dessus, (d) une protéine ou un peptide tel que défini ci-dessus, (e) un anticorps ou fragment d'anticorps tels que définis ci-dessus, et (f) une puce à protéine telle que définie ci-dessus.
Ces différents réactifs sont préparés et utilisés selon les techniques classiques de biologie moléculaire et d'immunologie, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA), dans Current Protocols in Immunology (John E. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) et dans Antibodies: A Laboratory Manual (E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Les fragments d'acide nucléique selon l'invention sont préparés et utilisés selon les techniques classiques telles que définies ci-dessus. Les peptides et les protéines selon l'invention sont préparés par les techniques d'ADN recombinant, connues de l'Homme du métier, notamment à l'aide des vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus. Alternativement, les peptides selon l'invention peuvent être préparés par les techniques classiques de synthèse en phase solide ou liquide, connues de l'Homme du métier.
Les anticorps polyclonaux sont préparés par immunisation d'un animal approprié avec une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, éventuellement couplé à la KLH ou à l'albumine et/ou associé à un adjuvant approprié tel que l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet) ou l'hydroxyde d'alumine; après obtention d'un titre en anticorps satisfaisant, les anticorps sont récoltés par prélèvement du sérum des animaux immunisés et enrichis en IgG par précipitation, selon les techniques classiques, puis les IgG spécifiques des protéines du SARS-CoV sont éventuellement purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne appropriée sur laquelle sont fixés ledit peptide ou ladite protéine, tels que définis ci-dessus, de façon à obtenir une préparation d'IgG monospécifiques.
Les anticorps monoclonaux sont produits à partir d'hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d'un animal immunisé par une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus avec des myélomes, selon la technique de Kôhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; les hybridomes sont cultivés in vitro, notam- ment dans des fermenteurs ou produits in vivo, sous forme d'ascite; alternativement lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique comme décrit dans le brevet américain US 4,816,567.
Les anticorps humanisés sont produits par des méthodes générales comme celles décrites dans la Demande Internationale WO 98/45332.
Les fragments d'anticorps sont produits à partir des régions VH et VL clonées, à partir des ARNm d'hybridomes ou de lymphocytes spléniques d'une souris immunisée; par exemple, les fragments Fv, scFv ou Fab sont exprimés à la surface de phages filamenteux selon la technique de Winter et Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299) ; après plusieurs étapes de sélection, les fragments d'anticorps spécifiques de l'antigène sont isolés et exprimés dans un système d'expression appro- prié, par les techniques classiques de clonage et d'expression d'ADN recombinant.
Les anticorps ou leur fragments tels que définis ci-dessus, sont purifiés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que la chromatographie d'affinité.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par: une paire d'amorces, une sonde, une puce à ADN, un vecteur recombinant, une cellule modifiée, une souche isolée de coronavirus, un polynucléotide, une protéine ou un peptide, un anticorps ou un fragment d'anticorps, et une puce à protéine tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un réactif de détection et éventuellement de génotypage/sérotypage, d'un coronavirus associé au SRAS. i Les protéines et les peptides selon l'invention, qui sont aptes à être reconnus et/ou à induire la production d'anticorps spécifiques du coronavirus associé au SRAS, sont utiles pour le diagnostic de l'infection par un tel coronavirus; l'infection est détectée, par une technique appropriée- notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence-, à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté.
Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, lesdites protéines sont sélectionnées dans le groupe constitué par les protéines S, E, M et/ou N et les peptides tels que définis ci-dessus.
Les protéines S, E, M et/ou N et les peptides dérivés de ces protéines tels que définis ci-dessus, par exemple la protéine N, sont utilisées pour le diagnostic indirect d'une infection à coronavirus associé au SRAS (diagnostic sérologique; détection d'anticorps spécifiques du SARS-CoV), notamment par une méthode immunoenzymatique (ELISA).
Les anticorps et les fragments d'anticorps selon l'invention, notamment ceux dirigés contre les protéines S, E, M et/ou N et les peptides dérivés tels que définis ci-dessus, sont utiles pour le diagnostic direct d'une infection à coronavirus associé au SRAS; la détection de protéine(s) du SARS-CoV est réalisée par une technique appropriée, notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté.
La présente invention a également pour objet une méthode de détection d'un coronavirus associé au SRAS, à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps, une protéine, un peptide ou bien une puce ou un 20 filtre à protéine ou à peptide tels que définis ci- dessus, et (b) la révélation par tout moyen approprié des complexes antigène- anticorps formés en (a), par exemple par EIA, ELISA, RIA, ou par immunofluorescence.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé l'étape 25 (a) comprend: (al) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps ou un fragment d'anticorps qui est fixé sur un support approprié, notamment une microplaque, (a2) le lavage de la phase solide, et (a3) l'addition d'au moins un second anticorps ou un fragment d'anticorps, différent du premier, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant éventuellement marqué de façon appropriée.
Ce procédé qui permet de capturer les particules virales présentes dans l'échantillon biologique est également dénommé procédé d'immunocapture. Par exemple: - l'étape (al) est réalisée avec au moins un premier anticorps mono- clonai ou polyclonal ou un fragment de ceux-ci, dirigé contre la protéine S, M, et/ou E, et/ou un peptide correspondant à l'ectodomaine de l'une de ces protéines (peptides M2-14 ou E1-12) l'étape (a3) est réalisée avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre un autre épitope de la même protéine ou de préférence contre une autre protéine, de manière préférée contre une protéine interne telle que la nucléoprotéine N ou l'endodomaine de la protéine E ou M, de manière encore plus préférée il s'agit d'anticorps ou de fragments d'anticorps dirigés contre la protéine N qui est très abondante dans la particule virale; lorsqu'un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une protéine interne (N) ou contre l'endodomaine des protéines E ou M est utilisé, le dit anticorps est incubé en présence de détergent, comme le Tween 20 par exemple, à des concentrations de l'ordre de 0,1 %.
- l'étape (b) de révélation des complexes antigène-anticorps formés est réalisée, soit directement à l'aide d'un second anticorps marqué par exemple avec de la biotine ou une enzyme appropriée telle que la peroxydase ou la phosphatase alcaline, soit indirectement à l'aide d'un sérum anti-immunoglobulines marqué comme ci-dessus. Les complexes ainsi formés sont révélés à l'aide d'un substrat approprié.
La présente invention a en outre pour objet un kit de détection d'un coronavirus associé au SRAS, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par: une paire d'amorces, une sonde, une puce à ADN ou à ARN, un vecteur recombinant, une cellule modifiée, une souche isolée de coronavirus, un polynucléotide, une protéine ou un peptide, un anticorps, et une puce à protéine tels que définis ci-dessus.
La présente invention a en outre pour objet, une composition 30 immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit sélectionné dans le groupe constitué par: a) une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, b) un polynucléotide de type ADN ou ARN ou l'un de ses fragments représentatifs tels que définis ci-dessus, de séquence choisie parmi: (i) la séquence SEQ ID NO: 1 ou son équivalent ARN (ii) la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence 5 avec la séquence SEQ ID NO: 1, (iii) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1 ou de la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence SEQ ID NO: 1, (iv) la séquence nucléotidique d'un fragment représentatif du poly-10 nucléotide tel que défini en (i), (ii) ou (iii), (v) la séquence telle que définie en (i), (ii), (iii) ou (iv), modifiée, et c) un vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini en b), et d) une banque d'ADNc telle que définie ci-dessus, ladite composition immunogène étant capable d'induire une immunité humorale ou cellulaire protectrice spécifique du coronavirus associé au SRAS, notamment la production d'un anticorps dirigé contre un épitope spécifique du coronavirus associé au SRAS.
Les protéines et les peptides tels que définis ci-dessus, notamment les protéines S. M, E et/ou N et les peptides dérivés, ainsi que les molécules d'acide nucléique (ADN ou ARN) codant lesdites protéines ou lesdits peptides, sont de bons candidats vaccin et peuvent être utilisées dans des compositions immunogènes pour la production d'un vaccin contre le coronavirus associé au SRAS.
Selon un mode de réalisation avantageux des compositions selon l'invention, elles contiennent en outre, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des substances porteuses et/ou des adjuvants.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.
Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué 30 par des émulsions huileuses, de la saponine, des substances minérales, des extraits bactériens, de l'hydroxyde d'alumine et le squalène.
Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par des liposomes unilamellaires, des liposomes multilamellaires, des micelles de saponine ou des microsphères solides de nature saccharidique ou aurifère.
Les compositions selon l'invention, sont administrées par voie générale, notamment intramusculaire ou sous-cutanée ou bien par voie locale notamment nasale (aérosol).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75 pour former un complexe immun avec un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.
La présente invention a également pour objet un complexe immun formé d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75, et d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 7.5 pour induire la production d'un anticorps capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 et 38 pour induire la production d'un anticorps dirigé contre la protéine codée par ledit polynucléotide et capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du polynucléotide représentant le génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, et des fragments d'ADNc dérivés objets de la présente invention, ainsi qu'au Tableau I présentant la liste des séquences: Tableau I: Liste des séquences numéro Séquence Position de Numéro de d'identification IADNc en dépôt à la CNCM référence à du plasmide Genbank correspondant AY274119.3 SEQ ID NO: 1 génome de la - - souche issue du prélèvement SEQ ID NO: 2 ORF-S* 21406-25348 - SEQ ID NO: 3 Protéine S - SEQ ID NO: 4 ORF-S** 21406-25348 1-3059 SEQ ID NO: 5 fragment Sa 2140623454 1-3020 SEQ ID NO: 6 fragment Sb 23322-25348 I-3019 SEQ ID NO: 7 ORF-3+ORF-4* 25110-26244 - SEQ ID NO: 8 ORF-3+ORF-4** 25110-26244 I-3126 SEQ ID NO: 9 ORF3 - - _ Protéine ORF-3 - - SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 ORF4 - - SEQ ID NO: 12 Protéine ORF-4 - - SEQ ID NO: 13 ORF-E* 26082-26413 - _ SEQ ID NO: 14 Protéine E - - SEQ ID NO: 15 ORF-E** _ I-3046 26082-26413 SEQ ID NO: 16 ORF-M* 26330-27098 - SEQ ID NO: 17 Protéine M - SEQ ID NO: 18 ORF-M** 26330-27098 1-3047 _ ORF7 à 11* 26977-28218 - SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 ORF7 à 11** 26977-28218 1-3125 SEQ ID NO: 21 ORF7 - - SEQ ID NO: 22 Protéine ORF7 - - SEQ ID NO: 23 ORF8 - - SEQ ID NO: 24 Protéine ORF8 - - SEQ ID NO: 25 ORF9 - - SEQ ID NO: 26 Protéine ORF9 - SEQ ID NO: 27 ORF10 - - SEQ ID NO: 28 Protéine ORF10 - _
-
SEQ ID NO: 29 ORF11 - - SEQ ID NO: 30 Protéine ORF11 - - SEQ ID NO: 31 OrF1 ab 265-21485 - SEQ ID NO: 32 ORF13 28130-28426 -
_
SEQ ID NO: 33 Protéine ORF13 - - SEQ ID NO: 34 ORF14 - - SEQ ID NO: 35 Protéine ORF14 28583-28795 - SEQ ID NO: 36 ORF-N* 28054-29430 SEQ ID NO: 37 Protéine N..
SEQ ID NO: 38 ORF-N** 28054-29430 I-3048 SEQ ID NO: 39 5'non-codante** 1204 I-3124 SEQ ID NO: 40 3'non-codante** 28933-29727 I-3123 SEQ ID NO: 41 ORF1ab 30-500 - Fragment LO SEQ ID NO: 42 Fragment L1 211-2260 - SEQ ID NO: 43 Fragment L2 2136-4187 _ - SEQ ID NO: 44 Fragment L3 3892-5344 - SEQ ID NO: 45 Fragment L4b 4932-6043 - SEQ ID NO: 46 Fragment L4 5305-7318 SEQ ID NO: 47 _ Fragment L5 7275-9176 - SEQ ID NO: 48 Fragment L6 9032-11086 -
_
SEQ ID NO: 49 Fragment L7 10298-12982 - SEQ ID NO: 50 Fragment L8 12815-14854 - SEQ ID NO: 51 Fragment L9 14745-16646 - SEQ ID NO: 52 Fragment L10 16514-18590 _
-
SEQ ID NO: 53 Fragment L11 18500-20602 -
_
SEQ ID NO: 54 Fragment L12 20319-22224 - SEQ ID NO: 55 Amorce N sens - SEQ ID NO: 56 Amorce N - - antisens SEQ ID NO: 57 Amorce Sc sens _ -
-
SEQ ID NO: 58 Amorce SL sens - - SEQ ID NO: 59 _ - _ Amorce Sc e t SL antisens SEQ ID NO: 60 Amorce sens 28507-28522 - série 1 SEQ ID NO: 61 Amorce antisens 28774-28759 série 1 SEQ ID NO: 62 Amorce sens 28375-28390 - série 2 SEQ ID NO: 63 Amorce antisens 28702-28687 - série 2 SEQ ID NO: 64 Sonde 1/série 1 28561-28586 - SEQ ID NO: 65 Sonde 2/série 1 28588-28608 - SEQ ID NO: 66 Sonde 1/série 2 28541-28563 - SEQ ID NO: 67 Sonde 2/série 2 28565-28589 - SEQ ID NO: 68 Amorce ancre 14T SEQ ID NO: 69 Peptide M2-14.. - SEQ ID NO: 70 Peptide E1-12 - - SEQ ID NO: 71 Peptide E53-76 - SEQ ID NO: 72 5'non-codante* 1-204 - SEQ ID NO: 73 3'non-codante* 28933-29727 - SEQ ID NO: 74 Protéine ORF1a - - SEQ ID NO: 75 Protéine ORF1b - - SEQ ID NO:76-139 Amorces * produit d'amplification PCR (amplicon) ** insert cloné dans le plasmide déposé à la CNCM ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 illustre l'analyse par Western-blot de l'expression in vitro des protéines recombinantes N, Sc et SL à partir des vecteurs d'expression pIVEX. Piste 1: pIV2.3N. Piste 2: pIV2.3Sc. Piste 3: pIV2. 3SL. Piste 4: pIV2.4N. Piste 5: pIV2.4S1 ou pIV2.4Sc. Piste 6: pIV2.4SL. L'expression de la protéine GFP exprimée à partir du même vecteur est utilisée comme contrôle.
- la figure 2 illustre l'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et coloration au bleu de Coomassie, de l'expression in vivo de la protéine N à partir des vecteurs d'expression pIVEX. La souche d'E.coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants est cultivée à 30 C dans du milieu LB, en présence ou en l'absence d'inducteur (IPTG 1mM). Piste 1: pIV2.3N Piste 2: pIV2.4N.
- la figure 3 illustre l'analyse par électrophorèse en gel depolyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et coloration au bleu de Coomassie, de l'expression in vivo des polypeptides SL et Sc à partir des vecteurs d'expression pIVEX. La souche d'E.coli BL21(DE3) pDIAI7 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants est cultivée à 30 C dans du milieu LB, en présence ou en l'absence d'inducteur (IPTG 1mM) . Piste 1: pIV2.3Sc Piste 2: pIV2.3SL. Piste 3: pIV2.4S1 Piste 4: pIV2. 4SL.
- la figure 4 illustre l'activité antigénique des protéines N, SL et Sc recombinantes produites dans la souche E. coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants. A: électrophorèse (SDS- PAGE) des lysats bacté- riens.B et C: Western blot avec les sérums, provenant d'un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés respectivement 8 jours (B: sérum M12) et 29 jours-(C: sérum M13) après le début des symptômes du SRAS. Piste 1: pIV2.3N. Piste 2: pIV2.4N. Piste 3: pIV2.3Sc. Piste 4: pIV2.4 Si. Piste 5: pIV2.3SL. Piste 6: pIV2.4SL - la figure 5 illustre la purification sur colonne Ni-NTA agarose de la protéine N recombinante produite dans la souche E. coli BL2I(DE3)pDIA17 à partir du vecteur pIV2.3N. Piste 1: Extrait bactérien total. Piste 2: Extrait soluble. Piste 3: Extrait insoluble. Piste 4: Extrait déposé sur la colonne Ni-NTA. Piste 5: protéines non-retenues. Piste 6: Fractions du pic 1. Piste 7: Fractions du pic 2.
- la figure 6 illustre la purification de la protéine Sc recombinante à partir des corps d'inclusions produits dans la souche E. coli BL21(DE3) pDIA17 transformée par le pIV2.4S1.A. Traitement au Triton X-100 (2%) : Piste 1: Extrait bactérien total. Piste 2: Extrait soluble. Piste 3: Extrait insoluble. Piste 4: Surnageant après traitement au Triton X-100 (2 %). Pistes 5 et 6: Culot après traitement au Triton X-100 (2 %).B: Traitement à l'urée 4M, 5M, 6M et 7M des extraits solubles et insolubies.
- la figure 7 représente l'immunoempreinte réalisée à l'aide d'un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV et d'un sérum de patient atteint de pneumopathie atypique.
- la figure 8 représente des immunoempreintes réalisées à l'aide d'un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV et d'immunsérums de lapins spécifiques de la nucléoprotéine N (A) et de la protéine de spicule S (B). I.S. : sérum immun. p.i. : sérum pré-immun. L'immunsérum anti-N a été utilisé au 1/50000 et l'immunsérum anti-S au 1/10000.
- la figure 9 illustre la réactivité en ELISA des sérums polyclonaux monospécifiques de lapin dirigés contre la protéine N ou le fragment court de la protéine S (Sc), vis-à-vis des protéines recombinantes correspondantes utilisées pour l'immunisation. A: lapins P13097, P13081, et P13031 immunisés avec la protéine N recombinante purifié. B: lapins P11135, P13042, et P14001 immunisés avec une préparation de corps d'inclusions correspondants au fragment court de la protéine S (Sc). I.S. : sérum immun. p.i. : sérum pré-immun.
- la figure 10 illustre la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante purifiée, vis-à-vis de sérum de patients atteints de pneumonie atypique causée par le SARS-CoV. Figure 10a: plaques ELISA préparés avec la protéine N à la concentration de 4 pg/ml et 2 g/ml. Figure 10b: plaque ELISA préparée avec la protéine N à la concentration de 1 g/ml. Les sérums désignés A, B, D, E, F, G, H correspondent à ceux du Tableau IV.
- la figure 11 illustre l'amplification par RT-PCR de quantités décroissantes d'ARN synthétique du gène N du SARS-CoV (107 à 1 copie), à l'aide des couples d'amorces n 1 (N/+/28507,N/-/28774) (A) et n 2 (N/+ /28375,N/-/28702) (B). T: amplification réalisée en l'absence d'ARN. MW: marqueur d'ADN.
- la figure 12 illustre l'amplification par RT-PCR en temps réel d'ARN synthétique du gène N du SARS-CoV: des quantités décroissantes d'ARN synthétique en répliquat (repli. ; pistes 16 à 29) ainsi que de l'ARN viral dilué au 1/20x10-4 (piste 32) ont été amplifiés par RT-PCR en temps réel à l'aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes" et des couples d'amorces et de sondes de la série n 2, dans les conditions décrites à l'exemple 7.
- la figure 13 (figure 13.1 à 13.70) représente la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO: 1 correspondant à l'équivalent ADN du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1: Clonage et séquençage du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 L'ARN de la souche de SARS-CoV a été extrait à partir du prélè-20 vement de lavage bronchoalvéolaire répertorié sous le numéro 031589, effectué sur un patient de l'hôpital français de Hanoi (Vietnam) atteint de SRAS.
L'ARN isolé a été utilisé comme matrice pour amplifier les ADNc correspondant aux différents cadres ouverts de lecture du génome (ORF 1 a, ORF 1 b, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N (incluant les ORF-13 et ORF-14), ORF3, ORF4, ORF7 à ORF 11), et aux extrémités 5' et 3' non-codantes. Les séquences des amorces et des sondes utilisées pour l'amplification/détection ont été définies d'après la séquence nucléotidique disponible du SARS-CoV.
Dans ce qui suit les amorces et les sondes sont identifiées par: la lettre S, suivie d'une lettre qui indique la région correspondante du génome (L pour l'extrémité S'incluant ORF 1 a et ORF 1 b; S, M et N pour les ORF-S, ORF-M, ORF-N, SE et MN pour les régions intergéniques correspondantes), puis éventuellement de Fn, Rn, avec n inclus entre 1 et 6 correspondant aux amorces utilisées pour la PCR nichée ou imbriquée (paire F1 + Rl pour la première amplification, paire F2 + R2 pour la deuxième amplification, etc...), puis de /+/ ou / / correspondant à une amorce sens ou antisens et enfin des positions des amorces en référence à la séquence Genbank AY27411.3; pour les amorces S et N sens et antisens et les autres amorces sens uniquement, lorsqu'une seule position est indiquée elle correspond à celle de l'extrémité 5' d'une sonde ou d'une amorce d'environ 20 bases; pour les amorces antisens autres que les amorces S et N, lorsqu'une seule position est indiquée elle correspond à celle de l'extrémité 3' d'une sonde ou d'une amorce d'environ 20 bases.
Les produits d'amplifications ainsi générés ont été séquencés à l'aide d'amorces spécifiques afin de déterminer la séquence complète du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589. Ces produits d'amplification, à l'exception de ceux correspondant aux ORF 1 a et ORF 1 b, ont ensuite été clonés dans des vecteurs d'expression afin de produire les protéines virales correspondantes et les anticorps dirigés contre ces protéines, notamment par immunisation à base d'ADN.
1. Extraction des ARN Les ARN ont été extraits à l'aide du kit Qlamp viral RNA extraction mini (QIAGEN) en suivant les recommandations du fabricant. De manière plus précise: 140 l du prélèvement et 560 l de tampon AVL ont été mélangés vigoureusement pendant 15 secondes, incubés 10 min à température ambiante puis centrifugés brièvement à vitesse maximale. 560 l d'éthanol à 100% ont été ajoutés au surnageant et le mélange ainsi obtenu a été agité très vigoureusement pendant 15 sec. 630 l du mélange ont ensuite été déposés sur la colonne.
La colonne a été placée sur un tube de 2 ml, centrifugée 1 min à 8000 rpm, puis le reste du mélange précédent a été déposé sur la même colonne, centrifugé à nouveau, 1 min à 8000 rpm et la colonne a été transférée sur un tube de 2 ml propre. Ensuite, 500 l de tampon AW1 ont été ajoutés sur la colonne, puis la colonne a été centrifugée 1 min à 8000 rpm et l'éluat a été éliminé. 500 pl de tampon AW2 ont été ajoutés sur la colonne qui a ensuite été centrifugée 3 min à 14000 rpm et transférée sur un tube de 1, 5 ml. Enfin, 60 pi de tampon AVE ont été ajoutés sur la 2866025 30 colonne qui a été incubée 1 à 2 min à température ambiante puis centrifugée 1 min à 8000 rpm. L'éluat correspondant à l'ARN purifié a été récupéré et congelé à -20 C. 2. Amplification, séquençage et clonage des ADNc 2.1) ADNc codant pour la protéine S Les ARN extraits à partir du prélèvement ont été soumis à une transcription inverse à l'aide d'oligonucléotides hexamériques de séquence aléatoire (pdN6), afin de produire des fragments d'ADNc.
La séquence codant pour la glycoprotéine S du SARS-CoV a été amplifiée sous la forme de deux fragments d'ADN chevauchants: fragment 5' (SRAS-Sa, SEQ ID NO:5) et fragment 3'(SRAS-Sb, SEQ ID NO:6), en réalisant deux amplifications successives à l'aide d'amorces imbriquées. Les amplicons ainsi obtenus ont été séquencés, clonés dans le vecteur plasmidique PCR 2.1-TOPOTM (IN VITROGEN), puis la séquence des ADNc clonés a été déterminée.
a)clonage et séquençage des fragments Sa et Sb al) synthèse de l'ADNc Le mélange réactionnel contenant: ARN (5 pl) , H2O ppi (3,5 pl), tampon de transcriptase inverse5X (4 l,), dNTP 5 mM (2 pl), pdN6 100 ug/ml (4 pl), RNasin 40 UI/ul (0,5 pl) et transcriptase inverse AMV-RT, 10 UI/ul, PROMEGA (1 l) a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 45 min à 42 C, 15 min à 55 C, 5 min à 95 C, puis l'ADNc obtenu a été maintenu à + 4 C. a2) premiere_amplification PCR Les extrémités 5' et 3' du gène S ont été amplifiées respectivement avec les paires d'amorces S/Fl/+/ 21350- 21372 et S/Rl/-/ 23518-23498, S/F3/+/ 23258-23277 et S/R3/-125382-25363. Le mélange réactionnel de 50 pl contenant: ADNc (2 pl), amorces 50 pM (0, 5 pl), tampon 10 X (5 pl), dNTP 5 mM (2 pl), Taq Expand High Fidelity, Roche (0,75 pl) et H20 (39, 75 pl) a été amplifié dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 2 min 30 sec, avec 10 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. a3) deuxième amplification PCR Les produits de la première amplification PCR (amplicons 5' et 3') ont subi une seconde étape d'amplification PCR (PCR nichée) dans des conditions identiques à celles de la première amplification, avec les paires d'amorces S/F2/+/21406-21426 et S/R2/-/23454-23435, et S/F4/+ /23322-23341 et S/R4/-125348-25329, respectivement pour l'amplicon 5' et l'amplicon 3'.
a4)_ clonage_ et séquençage des fragments _Sa_et_Sb Les amplicons Sa (extrémité 5') et Sb (extrémité 3') ainsi obtenus ont été purifiés à l'aide du kit QlAquick PCR purification (QIAGEN), en suivant les recommandations du fabricant, puis ils ont été clonés dans le vecteur PCR2.1-TOPO (kit Invitrogen), pour donner les plasmides dénommés SRAS-S 1 et SRAS-S2.
L'ADN des clones Sa et Sb a été isolé puis l'insert correspondant a été séquencé à l'aide du Kit Big Dye, Applied Biosystem et des amorces universelles M13 forward et M13 reverse, ainsi que des amorces: S/S/+ /21867, S/S/+/22353, S/S/+/22811, S/S/+/23754, S/S/+/24207, S/S/+/24699, S/S/+/24348, S/S/-/24209, S/S/-/23630, S/S/-123038, S/S/-/22454, S/S//21815, S/S/-/24784, S/S/+/21556, S/S/+/23130 et S/S/+/24465, en suivant les instructions du fabricant; les séquences des fragments Sa et Sb ainsi obtenues correspondent aux séquences SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Le plasmide, dénommé SARS-S 1 a été déposé sous le n I-3020, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 5' de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sa correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID NO:5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2.
Le plasmide, dénommé TOPIOF'-SARS-S2 a été déposé sous le n I-3019, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 3'de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélève- ment répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sb correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348 (SEQ ID NO: 6), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.
b) clonage et séquençage de l'ADNc complet (clone SRAS-S de 4 kb) L'ADNc S complet a été obtenu à partir des clones SARS-SI et 5 SARS-S2 précités, de la façon suivante: 1) une réaction d'amplification PCR a été réalisée sur un clone SARS-S2 en présence de l'amorce S/R4/-/25348-25329 précitée et de l'amorce S/S/+ /24696-24715: un amplicon de 633 bp a été obtenu, 2) une autre réaction d'amplification PCR a été réalisée sur un autre 10 clone SARS-S2, en présence des amorces S/F4/+/23322-23341 précitée et S/S/-/24803-24784: un amplicon de 1481 pb a été obtenu, La réaction d'amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies cidessus pour l'amplification des fragments Sa et Sb, à l'exception que 30 cycles d'amplifications comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec et une étape d'élongation à 72 C pendant 2 min 30 sec ont été effectués.
3) les 2 amplicons (633 pb et 1481 pb) ont été purifiés dans les conditions telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb.
4) une autre réaction d'amplification PCR à l'aide des amorces S/F4/+ /23322-23341 et S/R4/-/25348-25329 précitées, a été réalisée sur les amplicons purifiés obtenus en 3). La réaction d'amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies ci-dessus pour l'amplification des fragments Sa et Sb, à l'exception que 30 cycles d'amplifications ont été effectués.
L'amplicon de 2026 pb ainsi obtenu a été purifié, cloné dans le vecteur PCR2.1-TOPO puis séquencé comme ci-dessus, à l'aide des amorces telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. Le clone ainsi obtenu a été dénommé clone 3'.
5) Le clone SARS-S1 précédemment obtenu et le clone 3'ont été digérés par EcoR 1, les bandes d'environ 2kb ainsi obtenues ont été purifiées sur gel puis amplifiées par PCR avec les amorces S/F2/+/21406-21426 et S/R4//25348- 25329 précitées. La réaction d'amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies ci-dessus pour l'amplification des fragments Sa et Sb, à l'exception que 30 cycles d'amplifications ont été effectués. L'amplicon d'environ 4 kb a été purifié et séquencé. Il a ensuite été cloné dans le vecteur PCR2.1-TOPO pour donner le plasmide, dénommé SARS-S, et l'insert contenu dans ce plasmide a été séquencé comme ci-dessus, à l'aide des amorces telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. Les séquences d'ADNc de l'insert et de l'amplicon codant pour la protéine S, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences jointe en annexe, elles codent pour la protéine S (SEQ ID NO: 3).
La séquence de l'amplicon correspondant à l'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 présente les deux mutations suivantes par rapport aux séquences correspondantes de respective-ment les isolats Tor2 et Urbani, les positions des mutations étant indiquées en référence à la séquence complète du génome de l'isolat Tor2 (Genbank AY274119.3) : - g/t en position 23220; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct), - c/t en position 24872: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et Le plasmide, dénommé SARS-S, a été déposé sous le n I-3059, le 20 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 25348 (SEQ ID NO:4), en référence à la séquence Genbank AY274119. 3.
2.2) ADNc codant pour les protéines M et E Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse, associée, lors de la même étape (kit Titan One Step RT-PCR , Roche), à une réaction d'amplification par PCR, à l'aide des couples d'amorces: - S/E/F1/+/26051-26070 et S/E/R1/-/26455-26436 pour amplifier l'ORF-E, et - S/M/F1/+/26225-26244 et S/M/Rl/-/27148-27129 pour amplifier l'ORF-M.
Un premier mélange réactionnel contenant: 8,6 l d'H2Oppi, 1 l de dNTP (5mM), 0,2 pl de chacune des amorces (50 M), 1,25 l de DTT (100mM) et 0,25 l de RNAsin (40UI/ l) a été combiné avec un deuxième mélange réactionnel contenant: 1 l d'ARN, 7 l d'H2Oppi, 5 l de tampon de RTPCR 5X et 0,5 l de mélange d'enzyme et les mélanges combinés ont été incubés dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 30 min à 42 C, 10 min à 55 C, 2 min à 94 C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 10 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 68 C pendant 45 sec, avec 3 sec d'incrément par cycle et enfin une étape d'élongation terminale à 68 C pendant 7 min. Les produits d'amplification ainsi obtenus (amplicons M et E) ont 10 subi une deuxième amplification PCR (PCR nichée) en utilisant le kit Expand High-Fi , Roche), à l'aide des couples d'amorces: S/E/F2/+/26082-26101 et S/E/R2/-/26413-26394 pour l'amplicon E, et S/M/F2/+/26330-26350 et S/M/R2/-/27098-27078 pour l'amplicon M. Le mélange réactionnel contenant: 2 l du produit de la première PCR, 39,25. il d'H2Oppi, 5 l de tampon 10X contenant du MgC12, 2 l de dNTP (5mM), 0, 5 l de chacune des amorces (50 M) et 0,75111 de mélange d'enzyme a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: une étape de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 60 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 72 C pendant 45 sec, avec 3 sec d'incrément par cycle, et enfin une étape d'élongation terminale à 72 C pendant 7 min. Les produits d'amplification obtenus correspondant aux ADNc codant pour les protéines E et M ont été séquencés comme ci-dessus, à l'aide des amorces: S/E/F2/+/26082 et S/E/R2/-/26394, S/M/F2/+/26330, S/M/R2/-/27078 précitées et des amorces S/M/+/26636-26655 et S/M/-/26567-26548. Ils ont ensuite été clonés, comme ci-dessus, pour donner les plasmides dénommés SARS-E et SARS-M. L'ADN de ces clones a ensuite été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 forward et M13 reverse ainsi que des amorces S/M/+/26636 et S/M/-/26548 précitées.
La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc codant pour la protéine E (SEQ ID NO: 13) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine E de la souche de SARS-CoV 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO: 14 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Le plasmide, dénommé SARS-E a été déposé sous le n I-3046, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO:15), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.
La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc codant pour la M (SEQ ID NO:16) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY274119.3-Tor2. En revanche, en position 26857, l'isolat AY278741-Urbani comporte un c et la séquence de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement réper- torié sous le n 031589 un t. Cette mutation aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante: en position 154, une proline (AY278741-Urbani) est changée en sérine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589. La séquence de la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO:17 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Le plasmide, dénommé SARS-M a été déposé sous le n I-3047, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus; laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO:18), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.
2.3) ADNc correspondant aux ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11 La même stratégie d'amplification, de clonage et de séquençage a été utilisée pour obtenir les fragments d'ADNc correspondant respectivement aux ORF suivantes: ORF 3, ORF4, ORF7, ORF8, ORF9, ORF 10 et ORF11. Les couples d'amorces utilisées pour la première amplification sont: - ORF3 et ORF4: S/SE/F1/+/25069-25088 et S/SE/RI/-/26300-26281 - ORF7 à ORF 11: S/MN/F 1 /+/26898-26917 et S/MN/R 1 /-/28287-28266 Les couples d'amorces utilisées pour la deuxième amplification sont: - ORF3 et ORF4: S/SE/F2/+/25 1 1 0-25 1 29 et S/SE/R2/-/26244-26225 - ORF7 à ORFI 1: S/MN/F2/+/26977-26996 et S/MN/R2/-/28218-28199 Les conditions de la première amplification (RT-PCR) sont les suivantes: 45 min à 42 C, 10 min à 55 C, 2 min à 94 C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 58 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 68 C pendant 1 min, avec 5 sec d'incré- ment par cycle et enfin une étape d'élongation terminale à 68 C pendant 7 min. Les conditions de la PCR nichée sont les suivantes: une étape de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 58 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 72 C pendant 50 sec, avec 4 sec d'incrément par cycle et enfin une étape d'élongation terminale à 72 C pendant 7 min. Les produits d'amplification obtenus correspondant aux ADNc contenant respectivement les ORF3 et 4 et les ORF7 à 11 ont été séquencés à l'aide des amorces: S/SE/+/25363, S/SE/+/25835, S/SE/-/25494, S/SE/-/25875, S/MN/+/27839, S/MN/+/27409, S/MN/-/27836 S/MN/-/27799 et clonés comme ci- dessus pour les autres ORF, pour donner les plasmides dénommés SARS-SE et SARS-MN. L'ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l'aide de ces mêmes amorces et des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens.
La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc de la région conte- nant les ORF 3 et 4 (SEQ ID NO:7) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 comporte une différence nucléotidique par rapport à la séquence corres- pondante de l'isolat AY274119-Tor2. Cette mutation en position 25298 aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante (ORF 3): en position 11, une arginine (AY274119-Tor2) est changée en glycine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589. En revanche, aucune mutation n'a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY278741-Urbani. Les séquences des ORF 3 et 4 la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO:10 et 12 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Le plasmide, dénommé SARS-SE a été déposé sous le n I-3126, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant l'ORF-E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle région correspondant aux nucléotides des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO:8), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF 11 (SEQ ID NO:19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à 11 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Le plasmide dénommé SARS-MN a été déposé sous le n I-3125, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF- M et l'ORF-N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO:20), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.
La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ ID NO:19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à 11 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.
2.4) ADNc codant pour la protéine N et incluant les ORF13 et ORF14 L'ADNc a été synthétisé et amplifié comme décrit ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. De manière plus précise, le mélange réactionnel contenant: 5 pl d'ARN, 5 pl d'H20 ppi 4 pl de tampon de reverse transcriptase 5X, 2 pl de dNTP (5 mM), 2 pl d'oligo 20T (5 M), 0,5 pl de RNasin (40 UI/ul) et 1, 5 l de AMV-RT (10 UI/ul Promega) a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 45 min à 42 C, 15 min à 55 C, 5 min à 95 C, puis il a été maintenu à +4 C.
Une première amplification PCR a été réalisée avec la paire d'amorces S/N/F3/+/28023 et S/N/R3/-/29480.
Le mélange réactionnel comme ci-dessus pour l'amplification des fragments S I et S2 a été incubé dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 1 min 30 sec avec 10 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. L'amplicon obtenu à la première amplification PCR a subi une seconde étape d'amplification PCR (PCR nichée) avec la paires d'amorceS/N/F4/+128054 et S/N/R4/-/29430 dans des conditions identiques à celles de la première amplification.
Le produit d'amplification obtenu correspondant à l'ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589a été séquencé à l'aide des amorces: S/N/F4/+/28054, S/N/R4/-/29430, S/N/+ /28468, S/N/+/28918 et S/N/-/28607 et cloné comme ci-dessus pour les autres ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-N. L'ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens, ainsi que des amorces S/N/+/28468, S/N/+/28918 et S/N/-/28607.
La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-N et incluant les ORF13 et ORF14 (SEQ ID NO:36) de la souche de SARS- CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La 2866025 39 séquence de la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO: 37 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Les séquences des ORF13 et 14 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 32 et 34 dans la liste de séquences jointe en annexe.
Le plasmide dénommé SARS-N a été déposé sous le n I-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à 29430 (SEQ ID NO:38), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.
2.5) extrémités 5' et 3' non-codantes a) extrémité 5'non-codante (5'NC) al) synthèse de l'ADNc Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse dans les conditions suivantes: L'ARN (15 pl) et l'amorce S/L/-/443 (3 pl à la concentration de 5 m, ont été incubés 10 min à 75 C.
Ensuite, du Tampon de transcriptase inverse 5X (6 pl, INVITROGEN), des dNTP 10 mM (1 pl), du DTT 0,1M (3 pl) ont été ajoutés et le mélange a été incubé à 50 C pendant 3 min. Enfin la transcriptase inverse (3 pl de Superscript , INVITROGEN) a été ajoutée au mélange précédent qui a été incubé à 50 C pendant 1h30 puis à 90 C 25 pendant 2 min. L'ADNc ainsi obtenu a été purifié à l'aide du kit QlAquick PCR purification (QIAGEN), selon les recommandations du fabricant.
b1) Réaction à laTerminal Transferase (TdT) L'ADNc (10 pl) est incubé 2 min à 100 C, conservé dans la glace, 30 puis sont ajoutés: H20 (2,5 pl), tampon TdT 5X (4 pl, AMERSHAM), dATP 5mM (2 pi) et TdT (1,5 pi, AMERSHAM). Le mélange ainsi obtenu est incubé 45 min à 37 C puis 2 min à 65 C.
Le produit obtenu est amplifié par une première réaction PCR à l'aide des amorces: S/L/-/225-206 et ancre 14T: 5'- AGATGAATTCGGTACCTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO:68). Les conditions de l'amplification sont les suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 10 sec, une étape d'hybridation à 45 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec puis de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 10 sec, une étape d'hybridation à 50 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d'amplification à l'aide des amorces: S/L/-/204-185 et ancre 14T précitée dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L'amplicon ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l'aide de l'amorce S/L/-/182-163 puis il a été cloné comme ci-dessus pour les différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-5'NC. L'ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l'amorce S/L/-/182163 précitée.
L'amplicon représentant l'ADNc correspondant à l'extrémité 5'NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO: 72 dans la liste de séquences jointe en annexe; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.
Le plasmide dénommé SARS-5'NC a été déposé sous le n I- 3124, le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à l'extrémité 5'non codante du génome de la souche de SARSCoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ ID NO:39), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY2741 19.3.
b) extrémité 3'non-codante (3'NC) al) synthèse de 1'ADNc Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse, selon le protocole suivant: le mélange réactionnel contenant: ARN (5 pl), H20 (5 pl), tampon de transcriptase inverse 5X (4 pl), dNTP 5 mM (2 pl), Oligo 20T 5 M (2 pl), RNasin 40 U/ pl (0,5 pl) et RT-AMV 10 UI/ pl (1,5 pl, PROMEGA) a été incubé dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes: 45 min à 42 C, 15 min à 55 C, 5 min à 95 C, puis il a été maintenu à +4 C.
L'ADNc obtenu a été amplifié par une première réaction PCR à l'aide des amorces S/N/+/28468-28487 et ancre 14T précitée. Les conditions de l'amplification sont les suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 45 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 50 sec puis de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 50 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 50 sec, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d'amplification à l'aide des amorces S/N/+/28933-28952 et ancre 14T précitée, dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L'amplicon ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l'aide de l'amorce S/N/+/29257-29278 et cloné comme ci-dessus pour les différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-3'NC. L'ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l'amorce S/N/+/29257-29278 précitée.
L'amplicon représentant l'ADNc correspondant à l'extrémité 3'NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO:73 dans la liste de séquences jointe en annexe; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.
Le plasmide dénommé SARS-3'NC a été déposé sous le n I-3123 le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. ; il contient la séquence d'ADNc correspondant à l'extrémité 3'non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant à celle située entre le nucléotide en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO:40), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, se termine par une série de nucléotides a.
2.6) ORF1a et ORF1b L'amplification de la région 5' contenant les ORF1a et ORFIb du génome du SARS-CoV issu du prélèvement 031589 a été réalisée en pratiquant des réactions de RT-PCR suivies de PCR nichées selon les mêmes principes que ceux précédemment décrits pour les autres ORF. Les fragments amplifiés sont chevauchants sur plusieurs dizaines de bases, permettant ainsi la reconstruction informatique de la séquence complète de cette partie du génome. En moyenne, les fragments ampli-fiés sont de deux kilobases.
14 fragments chevauchants dénommés LO à L12 ont ainsi été amplifiés à l'aide des amorces suivantes: Tableau II: Amorces utilisées pour l'amplification de la région 5'(ORFla et ORFlb) REGION Amorce sens Amorce antisens Amorce sens Amorce
AMPLIFIEE
ET RT-PCR RT-PCR PCR nichée antisens PCR SEQUENCEE nichée (ne tient pas compte des amorces) LO S/L0/F1/+30 S/LO/R1/-481 50480 _ L1 S/L1/F1/+147 S/L1/R1/-2336 S/L1/F2/+211 S/L1/R2/-2241 231-2240 L2 S/L2/F1/+2033 S/L2/R1/-4192 S/L2/F2/+2136 S/L2/R2/-4168 2156-4167 _ L3 S/L3bis/F1/+3850 S/L3bis/Ril-5365 S/L3bis/F2/+3892 _ S/L3bis/R21-5325 3913-5324 L4b S/L4b/F1/+4878 S/L4b/R1/-6061 S/L4b/F2/+ 4932 S/L4b/R21-6024 4952-6023 L4 S/L4/F1/+5272 S/L4/R1/-7392 S/L4/F2/+ 5305 S/L4/R2/-7323 5325-7318 L5 S/L5/F1/+7111 S/L5/R1/-9253 S/L5/F2/+ 7275 S/L5/R2/-9157 7296-9156 L6 S/L6/F1/+8975 S/L6/R1/-11151 S/L6/F2/+ 9032 S/L6/R2/-11067 9053-11066 L7 S/L7/F1/+10883 S/L7/R1/-13050 S/L71F21+ 10928 S/L7/R21-12963 10928-12962 L8 S/L8/F1/+12690 S/L8/R1/-14857 S/L8/F2/+12815 S/L8/R21- 14835 12835-14834 L9 S/L9/F1/+14688 S/L9/R1/-16678 S/L9/F2/+14745 S/L9/R2/16625 14765-16624 L10 S/L10/F1/+16451 S/L101R1/-18594 S/L10/F2/+16514 S/L10/R2/- 18571 16534-18570 L11 SIL 11/F11+18441 S/L11/R1/-20612 S/L11/F2/+ 18500 S/L11/R2/-20583 18521-20582 _ L12 S/L12/F1/+20279 S/L12/R1/-22229 S/L12/F2/+ 20319 S/L12/R2/-22206 20338-22205.
Tous les fragments ont été amplifiés dans les conditions suivantes, excepté le fragment LO qui a été amplifié comme décrit ci-dessus pour l'ORF-M: - RT-PCR: 30 min à 42 C, 15 min à 55 C, 2 min à 94 C, puis l'ADNc obtenu est amplifié dans les conditions suivantes: 40 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 58 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 68 C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale d'élongation à 68 C pendant 7 min. - PCR nichée: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 35 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 60 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant l min 30 sec, avec 5 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale d'élongation à 72 C pendant 7 min. Les produits d'amplifications ont été séquencés à l'aide des amorces définies dans le Tableau III ci-après: Tableau III: Amorces utilisées pour le séquençage de la région 5' (ORF1a et ORF1b) Noms Séquences (SEQ ID NO: 76 à 139) S/L3/+/4932 5'-CCACACACAGCTTGTGGATA- 3' S/L4/+/6401 5'-CCGAAGTTGTAGGCAATGTC-3' S/L4/+/6964 5'- TTTGGTGCTCCTTCTTATTG -3' S/L4/-/6817 5'-CCGGCATCCAAACATAATTT-3' S/ L5/47633 5'-TGGTCAGTAGGGTTGATTGG -3' S/L5/-/8127 5'-CATCCTTTGTGTCAACATCG - 3' S/L5/-/8633 5'-GTCACGAGTGACACCATCCT-3' S/L5/+/7839 5'- ATGCGACGAGTCTGCTTCTA -3' S/L5/+/8785 5'-TTCATAGTGCCTGGCTTACC-3' S/L5/+ /8255 5'-ATCTTGGCGCATGTATTGAC -3' S/L61-/9422 5'-TGCATTAGCAGCAACAACAT-3' S/L6/-/9966 5'-TCTGCAGAACAGCAGAAGTG-3' S/L6/-/10542 5'CCTGTGCAGTTTGTCTGTCA-3' S/L6/+/10677 5'-CCTTGTGGCAATGAAGTACA-3' S/L6/+ /10106 5'-ATGTCATTTGCACAGCAGAA-3' S/L6/+/9571 5'-CTTCAATGGTTTGCCATGTT -3' S/L7/-/11271 5'-TGCGAGCTGTCATGAGAATA-3' S/L7/-/11801 5'AACCGAGAGCAGTACCACAG-3' S/L7/-/12383 5'-TTTGGCTGCTGTAGTCAATG -3' S/L7/+ /12640 5'-CTACGACAGATGTCCTGTGC-3' S/L7/+/12088 5'-GAGCAGGCTGTAGCTAATGG-3' S/L7/+/ 11551 5'-TTAG G C TATTGTTG CTG CTG -3' S/L8/-13160 5'CAGACAACATGAAGCACCAC-3' S/L8/-/13704 5'-CGCTGACGTGATATATGTGG -3' S/L8/14284 5'-TGCACAATGAAGGATACACC-3' S/L8/+/14453 5'-ACATAGCTCGCGTCTCAGTT-3' S/L8/+/13968 5'-GGCATTGTAGGCGTACTGAC -3' S/L8/+/13401 5'GTTTGCGGTGTAAGTGCAG-3' S/L9/-15098 5'-TAGTGGCGGCTATTGACTTC -3' S/L9/15677 5'-CTAAACCTTGAGCCGCATAG-3' S/L9/-16247 5'-CATGGTCATAGCAGCACTTG-3' S/L9/+ 16323 5'-CCAGGTTGTGATGTCACTGAT-3' S/L9/+15858 5'CCTTACCCAGATCCATCAAG -3' S/L9/+ 15288 5'-CGCAAACATAACACTTGCTG-3' S/L 10/16914 5'-AGTGTTGGGTACAAGCCAGT-3' S/L 10/-17466 5'-GTTCCAAGGAACATGTCTGG-3' S/L10/-18022 5'-AGGTGCCTGTGTAGGATGAA-3' S/L10/+18245 5'GGGCTGTCATGCAACTAGAG -3' S/L10/+17663 5'-TCTTACACGCAATCCTGCTT-3' S/L 10/+ 17061 5'-TACCCATCTGCTCGCATAGT-3' S/L11 /-/18877 5'-GCAAGCAGAATTAACCCTCA3' S/L11/-19396 5'-AGCACCACCTAAATTGCATC-3' S/L11/-20002 5'TGGTCCCTTTGAAGGTGTTA-3' S/L11 /+20245 5'-TCGAACACATCGTTTATGGA-3' S/L 11/+ /19611 5'-GAAGCACCTGTTTCCATCAT-3' S/L111+11 9021 5'-ACGATGCTCAGCCATGTAGT3' SARS/L1/F3/+800 5'-GAGGTGCAGTCACTCGCTAT-3' SARS/L 1 /F41+1391 5'CAGAGATTGGACCTGAGCAT-3' 5'-CAGCAAACCACTCAATTCCT-3' 5'-AAATGATGGCAACCTCTTCA-3' 5'- CACGTGGTTGAATGACTTTG -3' 5'-ATTTCTGCAACCAGCTCAAC-3' 5'- CGCATTGTCTCCTGGTTTAC -3' 5'-GAGATTGAGCCAGAACCAGA-3' 5'- ATGAGCAGGTTGTCATGGAT-3' 5'-CTG C CTTAAGAAG CTG GATG -3' 5'- TTTCTTCACCAGCATCATCA-3' 5'-CACCGTTCTTGAGAACAAC C -3' 5'TCTTTGGCTGGCTCTTACAG -3' 5'-GCTGGTGATGCTGCTAACTT-3' 5'CCATCAAGCCTGTGTCGTAT-3' 5'-CAGGTGGTGCAGACATCATA-3' 5'-AACATCAG CAC CATC CAAG T-3' 5'-ATCGGACACCATAGTCAACG-3' Les séquences des fragments LO à L12 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO:41 à SEQ ID NO:54 dans la liste de séquences jointe en annexe. Parmi ces séquences, seule celle correspondant aux fragments L5 comporte une différence nucléotidique par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY278741-Urbani. Cette mutation tic en position 7919 aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante, codée par l'ORF 1a: en position 2552, une valine (codon gtt; AY278741) est changée en alanine (codon gct) dans la souche de SARSCoV 031589. En revanche, aucune mutation n'a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY274119.3-Urbani. Les autres fragments ne présentent pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats Tor2 et Urbani.
Exemple 2: Production et purification de protéines N et S recombinantes de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 La protéine entière et deux fragments polypeptidiques de la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 ont été produites chez E. coli, sous forme de protéines de fusion comprenant une étiquette polyhistidine N-ou C-terminale. Dans les deux polypeptides S, les séquences hydrophobes N et C-terminales de la protéine S (peptide signal: positions 1 à 13 et hélice transmembranaire: positions 1196 à 1218) ont été délétées alors que l'hélice (3 (positions 565 à 687) et les deux motifs de type coiled-coils (positions 895 à 980 et 1155 à 1186) de la protéine S ont été préservés. Ces deux polypeptides sont constitués SARS/L1/F5/+1925 SARS/L1 /R3/-1674 SARS/L1/R4/-1107 SARS/L 1 /R5/-520 SARS/L2/F3/+2664 SARS/L2/F4/+3232 SARS/L2/F5/+3746 SARS/L2/R3/-3579 SARS/L2/R4/-2991 SARS/L2/R5/-2529 SARS/L3/F3/+4708 SARS/L3/F4/+5305 SARS/L3/F5/+5822 SARS/L3/R3/-5610 SARS/L3/R4/-4988 SARS/L3/R5/-4437 par: un fragment long (SL) correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S et un fragment court (Sc) correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S. 1) Clonage des ADNc N, SL et Sc dans les vecteurs d'expression pIVEX2.3 et 5 pIVEX2.4 Les ADNc correspondant à la protéine N et aux fragments SL et Sc ont été amplifiés par PCR dans des conditions standard, à l'aide de l'ADN polymérase Platinium Pfx (INVITROGEN). Les plasmides SRAS-N et SRAS-S ont été utilisés comme matrice et les oligonucléotides suivants comme amorces: 5'-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3' (N sens, SEQ ID NO:55) 5'CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3' (N antisens, SEQ ID NO:56) 5'CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3' (Sc sens, SEQ ID NO:57) 5'CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3' (SL sens, SEQ ID NO:58) 5'CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC -3' (Sc et SL antisens, SEQ ID NO:59).
Les amorces sens introduisent un site Ndel (souligné) alors que les amorces antisens introduisent un site Xmal ou Smal (souligné). Les 3 produits d'amplification on été purifiés sur colonne (kit QlAquick PCR Purification, QIAGEN) et clonés dans un vecteur approprié. L'ADN plasmidique purifié des 3 constructions (kit QIAFilter Midi Plasmid, QIAGEN) a été vérifié par séquençage et digéré par les enzymes Ndel et Xmal. Les 3 fragments correspondants aux ADNc N, SL et Sc ont été purifiés sur gel d'agarose puis insérés dans les plasmides pIVEX2.3MCS (étiquette polyhistidine C-terminale) et pIVEX2.4d (étiquette polyhistidine N-terminale) préalablement digérés par les mêmes enzymes. Après vérification des constructions, les 6 vecteurs d'expressions ainsi obtenus (pIV2.3N, pIV2.3Sc, pIV2.3SL, pIV2.4N, pIV2. 4Sc également dénommé pIV2.4S1, pIV2.4SL) ont été ensuite utilisés, d'une part pour tester l'expression des protéines in-vitro, et d'autre part pour transformer la souche bactérienne BL2I(DE3)pDIA17 (NOVAGEN). Ces constructions codent pour des protéines dont la masse moléculaire attendue est la suivante: pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3Sc (82897 Da), pIV2. 3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4S1 (81076 Da) et pIV2. 4SL(133877 Da).
2) Analyse de l'expression des protéines recombinantes in-vitro et in vivo L'expression de protéines recombinantes à partir des 6 vecteurs recombinants a été testée, dans un premier temps, dans un système invitro (RTS 100, Roche). Les protéines produites in vitro, après une incubation des vecteurs recombi- nants pIVEX, 4h à 30 C, dans le système RTS100, ont été analysées par western-blot à l'aide d'un anticorps anti-(his)6 couplé à la péroxydase. Le résultat d'expression in-vitro (Figure 1) montre que seule la protéine N est exprimée en quantités importantes, cela quelle que soit la position, N- ou C-terminale, de l'étiquette polyhistidine. Dans une seconde étape, l'expression des protéines N et S a été testée in-vivo à 30 C dans du milieu LB, en présence ou en l'absence d'inducteur (IPTG 1mM). La protéine N est très bien produite dans ce système bactérien (Figure 2) et se retrouve principale-ment dans une fraction soluble après lyse des bactéries. En revanche, la version longue de S (SL) est très peu produite et complètement insoluble (Figure 3). La version courte (Sc) présente également une très faible solubilité, mais un taux d'expression beaucoup plus élevé que celui de la version longue. Par ailleurs, la construction Sc fusionnée à une étiquette polyhistidine en position C-terminale présente une taille plus faible que celle attendue. Une expérience d'immunodétection avec un anticorps anti-polyhistidine a montré que cette construction était incomplète. En conclusion, les deux constructions, pIV2.3N et pIV2.4S1, exprimant respectivement la protéine N entière fusionnée à l'étiquette polyhistidine en C-terminal et la protéine S courte fusionnée à l'étiquette polyhistidine en N-terminal, ont été retenues pour produire les deux protéines en grande quantité afin de les purifier.
3) Analyse de l'activité antigénique des protéines recombinantes L'activité antigénique des protéines N, SL et Sc a été testée par westernblot, à l'aide de deux échantillons de sérum, provenant d'un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés 8 jours (M12) et 29 jours-(M13) après le début des symptômes du SRAS. Le protocole expérimental est comme décrit à l'exemple 3. Les résultats illustrés par la figure 4 montrent (i) la séroconversion du patient, et (ii) que la protéine N possède une plus forte réactivité antigénique que la protéine S courte.
4) Purification de la protéine N à partir de pIV2.3N Plusieurs expériences de purification de la protéine N, produite à partir du vecteur pIV2.3N, ont été réalisées selon le protocole suivant. Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d'expression pIV2. 3N, ont été cultivées à 30 C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d'ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence d'inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, NaCl 0,3 M, 20 mM imidazole, pH 8 contenant le mélange d'inhibiteurs de protéases Complete , Roche), et lysées par la presse de French (12000 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le surnageant (50 ml) a été déposé à un débit de lml/min sur une colonne (15 ml) de chélation métallique (Ni-NTA superflow, Qiagen), équilibrée par le tampon de lyse. Après lavage de la colonne par 200 ml de tampon de lyse, la protéine N a été éluée par un gradient d'imidazole (20 *250 mM) en 10 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine N ont été rassemblées et analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes puis coloration au bleu de Coomassie. Les résultats illustrés par la figure 5 montrent que le protocole employé permet de purifier la protéine N avec une homogénéité très satisfaisante (95%) et un rendement moyen de 15 mg de protéine par litre de culture.
5) Purification de la protéine Sc à partir de pIV2.4Sc- (pIV2.4S1) Le protocole suivi pour purifier la protéine S courte est très différent de celui décrit ci-dessus car la protéine est fortement aggrégée dans le système bacté- rien (corps d'inclusion). Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d'expression pIV2.4S1 ont été cultivées à 30 C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d'ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence d'inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifu- gation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (0,1 M Tris-HC1, EDTA 1 mM, pH 7,5), et lysées par la presse de French (1200 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le culot a été remis en suspen- sion dans 25 ml de tampon de lyse contenant 2% Triton X100 et 10 mM P- mercaptoéthanol, puis centrifugé pendant 20 min à 12000 rpm. Le culot a été remis en suspension dans un tampon Tris-HC1 10 mM contenant 7 M urée, et mis en agitation douce pendant 30 min à température ambiante. Ce dernier lavage des corps d'inclusion avec 7 M urée est nécessaire pour éliminer la plupart des protéines membranaires d 'E. coli qui co- sédimentent avec la protéine Sc aggrégée. Après une dernière centrifugation pendant 20 min à 12000 rpm, le culot final est remis en suspension dans le tampon Tris-HC1 10 mM. L'analyse électrophorétique de cette préparation (Figure 6) montre que la protéine S courte peut être purifiée avec une homogénéité satisfaisante (environ 90%) à partir des corps d'inclusion (extrait insoluble).
Exemple 3: Immunodominance de la protéine N La réactivité des anticorps présents dans le sérum des patients atteints de pneumopathie atypique causée par le coronavirus associé au SRAS (SARSCoV), vis-à-vis des différentes protéines de ce virus, a été analysée par western-blot dans les conditions décrites ci-après.
1) Matériel a) lysat de cellules infectées par le SARS-CoV Des cellules Vero E6 (2x106) ont été infectées par le SARS-CoV (isolat répertorié sous le numéro FFMIMA104) à une multiplicité d'infection (M.O.I.) de 10"1 ou 10-2 puis incubées dans du milieu DMEM contenant 2% de SVF, à 35 C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 48 heures plus tard, le tapis cellulaire a été lavé avec du PBS puis lysé avec 500 l de tampon de dépôt préparé selon Laemmli et contenant du B-mercaptoéthanol. Les échantillons ont ensuite été bouillis 10 minutes puis soniqués 3 fois 20 secondes.
b) anticorps b1) sérum de_patient_attemt depneumopathi_e_atypigue Le sérum référencé au Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord) sous le N 20033168 est celui d'un patient français atteint d'une pneumopathie atypique causée par le SARS-CoV prélevé au jour 38 après le début des symptômes; le diagnostic d'infection par le SARS-CoV a été réalisé par RT-PCR nichée et PCR quantitative.
b2) sérums poly_clonaux de_lapm _onospéçif ques dirigés ontre la _protéine N ou la roté Les sérums sont ceux produits à partir des protéines recombinantes N et Sc (exemple 2), selon le protocole d'immunisation décrit à l'exemple 4; il s'agit du sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) et du sérum du lapin P11135 (sérum anti-S).
2) Méthode l de lysat de cellules infectées par le SARS-CoV à des M.O.I. de 10-1 et 10-2 et, à titre de contrôle, 20 l d'un lysat de cellules non infectées (mock) ont été séparés sur un gel SDS à 10% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage dans une solution de PBS/lait 5%/Tween 0,1% et lavage en PBS/Tween 0,1%, cette membrane a été hybridée pendant une nuit à 4 C avec: (i) l'immun-sérum N 20033168 dilué au 1/300, 1/1000 et 1/3000 dans le tampon PBS/BSA 1%/Tween 0,1%, (ii) le sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) dilué au 1/50000 dans le même tampon et (iii) le sérum du lapin P11135 (sérum anti- S) dilué au 1/10000 dans le même tampon. Après lavage en PBS/Tween, une hybridation secondaire a été réalisée à l'aide, soit d'anticorps polyclonaux de mouton dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G humaines et couplés à la peroxidase (NA933V, Amersham), soit d'anticorps polyclonaux d'âne dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés à l'aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d'autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham). Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.
3) Résultats La figure 7 montre que trois polypeptides de masse moléculaire appa-25 rente 35, 55 et 200 kDa sont détectés spécifiquement dans les extraits de cellules infectées par le SARS-CoV.
Afin d'identifier ces polypeptides, deux autres immunoempreintes (figure 8) ont été réalisées sur les mêmes échantillons et dans les mêmes conditions avec des anticorps polyclonaux de lapins spécifique de la nucléoprotéine N (lapin P13097, figure 8A) et de la protéine de spicule S (lapin P11135, figure 8B) Cette expérience montre que le polypeptide de 200 kDa correspond à la glycoprotéine de spicule S du SARS-CoV, que le polypeptide de 55 kDa correspond à la nucléoprotéine N tandis que le polypeptide de 35 kDa représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée de la N. Les données présentées dans la figure 7 montrent donc que le sérum 20033168 réagit fortement avec la N et beaucoup plus faiblement avec la S du SARS- CoV, puisque les polypeptides de 35 et 55 kDa sont révélés sous la forme de bandes intenses pour des dilutions de 1/300, 1/1000 et 1/3000 de l'immunsérum alors que le polypeptide de 200 kDa n'est que faiblement révélé pour une dilution de 1/300. On peut noter également qu'aucun autre polypeptide du SARS-CoV n'est détecté pour des dilutions supérieures au 1/300 du sérum 20033168.
* Cette expérience indique que la réponse en anticorps spécifique de la N du SARS-CoV domine les réponses en anticorps spécifiques des autres polypeptides du SARS-CoV et en particulier la réponse en anticorps dirigée contre la glycoprotéine S. Elle indique une immunodominance de la nucléoprotéine N lors des infections humaines par le SARS-CoV.
Exemple 4: Préparation d'anticorps polyclonaux monospécifiques dirigéscontre les protéines N et S du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) 1) Matériel et méthode Trois lapins (P13097, P13081, P13031) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant purifié correspondant à l'intégralité de la nucléoprotéine (N), préparé selon le protocole décrit à l'exemple 2. Après une première injection de 0,35 mg par lapin de protéine émulsionnée en adjuvant complet de Freund (voie intradermique), les animaux ont reçus 3 injections de rappel à 3 puis 4 semaines d'intervalle, de 0,35 mg de protéine recombinante émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund.
Trois lapins (P11135, P I3042, P14001) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant correspondant au fragment court de la protéine S (Sc), produit comme décrit à l'exemple 2. Comme ce polypeptide est retrouvé principale-ment sous la forme de corps d'inclusion dans le cytoplasme bactérien, les animaux ont reçus 4 injections intra-dermiques à 3-4 semaines d'intervalle d'une préparation de corps d'inclusion correspondant à 0,5 mg de protéine recombinante émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund. Les 3 premières injections ont été réalisées avec une préparation de corps d'inclusion préparés selon le protocole décrit à l'exemple 2, tandis que la quatrième injection a été réalisée avec une préparation de corps d'inclusion qui ont été préparés selon le protocole décrit à l'exemple 2 puis purifiés sur gradient de saccharose et lavés en 2 % Triton X100.
Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la 5 première immunisation et un immun-sérum (I.S.) 5 semaines après la quatrième immunisation.
Dans un premier temps, la réactivité des sérums a été analysée par test ELISA vis à vis de préparations de protéines recombinantes semblables à celles utilisées pour les immunisations; les tests ELISA ont été réalisés selon le protocole et avec les réactifs tels que décrits à l'exemple 6.
Dans un deuxième temps, la réactivité des sérums a été analysée en réalisant une immunoempreinte (western blot) d'un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV, en suivant le protocole tel que décrit à l'exemple 3.
2) Résultats Les tests ELISA (figure 9) démontrent que les préparations de protéine N recombinante et de corps d'inclusion du fragment court de la protéine S (Sc) sont immunogènes chez l'animal et que le titre des sérums immuns est élevé (plus de 1/25000).
L'immunoempreinte (figure 8) montre que le sérum immun du lapin P13097 reconnaît deux polypeptides présents dans les lysats de cellules infectées par le SARS-CoV: un polypeptide dont la masse moléculaire apparente (50-55 kDa selon les expériences) est compatible avec celle de la nucléoprotéine N (422 résidus, masse moléculaire prédite de 46 kDa) et un polypeptide de 35 kDa, qui représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée de la N. Cette expérience montre également que le sérum du lapin P11135 reconnaît principalement un polypeptide dont la masse moléculaire apparente (180-220 kDa selon les expériences) est compatible avec une forme glycosylée de la S (1255 résidus, chaîne polypeptidique non glycosylée de 139 kDa), ainsi que des polypeptides plus légers, qui représentent vraisemblablement des formes tronquées et/ou non glycosylées de la S. En conclusion, l'ensemble de ces expériences démontrent que des polypeptides recombinants exprimés chez E. coli et correspondant aux protéines N et S du SARS-CoV permettent d'induire chez l'animal des anticorps polyclonaux capables de reconnaître les formes natives de ces protéines.
Exemple 5: Préparation d'anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines M et E du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) 1) Analyse de la structure des protéines M et E a) Protéine E La structure de la protéine E du SARS-CoV (76 acides aminés) a été analysée in silico, à l'aide de différents logiciels comme signalP vl.l, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 et 2.0 (Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580) ou encore TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494). L'analyse montre que ce polypeptide non glycosylé est une protéine membranaire de type 1, contenant une seule hélice transmembranaire (aa 12-34 d'après THMM), et dont la plus grande partie du domaine hydrophile (42 résidus) est localisée à l'extrémité C-terminale et vraisemblablement à l'intérieur de la particule virale (endodomaine). On peut noter une inver- sion dans la topologie prédite par les versions 1.0 (N-ter est externe) et 2.0 (N-ter est interne) du logiciel THMM, mais que d'autres algorithmes, notamment TOPPRED et THUMBUP (Zhou et Zhou, 2003, Protein Science 12:1547-1555) confirment une localisation externe de l'extrémité N-terminale de E. b) Protéine M Une analyse similaire réalisée sur la protéine M du SARS-CoV (221 acides aminés) montre que ce polypeptide ne possède pas de peptide signal (d'après le logiciel signalP v1.1) mais trois domaines transmembranaires (résidus 15-37, 50-72, 77-99 d'après THMM2.0) et un grand domaine hydrophile (aa 100-221) localisé à l'intérieur de la particule virale (endodomaine). Elle est vraisemblablement glycosylée sur l'asparagine en position 4 (d'après NetNGlyc 1.0).
Ainsi, en accord avec les données expérimentales connues pour les autres coronavirus, il est remarquable que les deux protéines M et E présentent des endodomaines correspondant à la majeure partie des polypeptides et des ectodomaines de très petite taille.
- l'ectodomaine de E correspond vraisemblablement aux résidus 1 à 11 ou 1 à 12 de la protéine: MYSFVSEETGT(L), SEQ ID NO: 70. En effet, la probabilité associée à la localisation transmembranaire du résidu 12 est intermédiaire (0,56 d'après THMM 2.0).
- l'ectodomaine de M correspond vraisemblablement aux résidus 2 à 14 de la protéine: ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO: 69. En effet, la méthionine N-5 terminale de M est très probablement clivée du polypeptide mature car le résidu en position 2 est une Alanine (Varshavsky, 1996, 93:12142-12149) .
Par ailleurs, l'analyse de l'hydrophobicité (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) de la protéine E met en évidence que l'extrémité C-terminale de l'endodomaine de E est hydrophile et donc vraisemblablement exposée à la surface de ce domaine. Ainsi, un peptide synthétique correspondant à cette extrémité est un bon candidat immunogène pour induire chez l'animal des anticorps dirigés contre l'endodomaine de E. En conséquence, un peptide correspondant aux 24 résidus C-terminaux de E a été synthétisé.
2) Préparation d'anticorps dirigés contre l'ectodomaine des protéines M et E et 15 l'endodomaine de la protéine E Les peptides M2-14 (ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO: 69), El-12 (MYSFVSEETGTL, SEQ ID NO: 70) et E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEQ ID NO: 71) ont été synthétisés par Neosystem. Ils ont été couplés à la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) à l'aide du MBS (m-maleimido- benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) via une cystéine ajoutée au cours de la synthèse soit en N-terminal du peptide (cas de E53-76) soit en C- terminal (cas de M2-14 et El-12).
Deux lapins ont été immunisés avec chacun des conjugués, en suivant le protocole d'immunisation suivant: après une première injection de 0,5 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant complet de Freund (voie intradermique), les animaux reçoivent 2 à 4 injections de rappel à 3 ou 4 semaines d'intervalle de 0,25 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant incomplet de Freund.
Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la 30 première immunisation et un immun-sérum (I.S.) est préparé 3 à 5 semaines après les injections de rappel.
La réactivité des sérums est analysée dans un premier temps par test ELISA vis à vis du peptide utilisé pour l'immunisation, puis par immunoempreinte vis-à-vis de lysats de cellules infectées par le SARS-CoV, comme décrit pour les sérums anti-N et anti-S de l'exemple 4, selon des protocole similaires à ceux décrits aux exemples 3 et 6, respectivement pour l'immunoempreinte et le test ELISA.
Dans un second temps, la réactivité des immunsérums dirigés contre les peptides M2-14 et El-12 à reconnaître les ectodomaines de M et de E présents à la surface de la particule virale native est analysée par des tests d'immunocapture et/ou d'immunoprécipitation de virions natifs.
Exemple 6: Analyse de la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante, vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS 1) Matériel L'antigène utilisé pour préparer les phases solides est la nucléoprotéine N recombinante purifiée préparée selon le protocole décrit à l'exemple 2.
Les sérums à tester (Tableau IV) ont été choisis sur la base des résultats d'analyse de leur réactivité par immunofluorescence (titre IF- SRAS), vis-à-vis de lysats de cellules infectées par le SARS-CoV.
Tableau IV: Sérums testés en ELISA Référence N sérum Type Date du Titre IF-SRAS de sérum Sérum*** _ 3050 A Témoin na* nt** 3048 B Témoin na _ nt 033168 D Patient 1- SRAS 27/04/03 (J38) 320 033397 E Patient-1 SRAS 11/05/03 (J52) 320 032632 F Patient-2 SRAS 21/03/03 (J17) 2500 032791 G Patient-3 SRAS 04/04/03 (J3) <40 033258 H Patient-3 SRAS 28/04/03 (J27) 160 *na: non-applicable. ** nt: non-testé. *** les dates indiquées correspondent au nombre de jours après le début des symptômes de SRAS.
2) Méthode La protéine N (100 l) diluée à différentes concentrations dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9,6 (1, 2 ou 4 pg/ml) est distribuée dans les puits de plaques ELISA, puis les plaques sont incubées une nuit à température du laboratoire.
Les plaques sont lavées avec du tampon PBS-Tween, saturées avec du tampon PBS- lait écrémé-saccharose (5 %). Les sérums à tester (100 1.11) préalablement dilués (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 et 1/3200) sont ajoutés, puis les plaques sont incubées 1 h à 37 C. Après 3 lavages, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxydase (référence 209-035098, JACKSON) dilué au 1/18000 est ajouté puis les plaques sont incubées l h à 37 C. Après 4 lavages, le chromogène (TMB) et le substrat (H202) sont ajoutés et les plaques sont incubées 30min à température ambiante, à l'abri de la lumière. La réaction est ensuite arrêtée puis l'absorbance à 450 nm est mesurée à l'aide d'un lecteur automatique.
3) Résultats Les tests ELISA (figure 10) démontrent que la préparation de protéine N recombinante est reconnue spécifiquement par les anticorps de sérums de patients atteints de SRAS prélevés en phase tardive de l'infection (> 17 jours après le début des symptômes) alors qu'elle n'est pas reconnue de façon significative par les anticorps d'un sérum de patient prélevé en phase précoce de l'infection (3 jours après le début des symptômes) ni par des sérums témoins de sujets non atteints de SRAS. Exemple 7: Détection du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) par RTPCR en temps réel à l'aide d'amorces spécifiques du gène de la nucléoprotéine 1) Mise au point des conditions de la RT-PCR a) conception des amorces et des sondes La conception des amorces et sondes a été réalisée à partir de la séquence du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, à l'aide du programme "Light Cycler Probe Design (Roche)". Ainsi les deux séries d'amorces et de sondes suivantes ont été sélectionnées: - série 1 (SEQ ID NO: 60, 61, 64, 65): amorce sens: N/+/28507: 5'-GGC ATC GTA TGG GTT G-3' [28507-28522] - amorce antisens: N/-/28774: 5'-CAG TTT CAC CAC CTC C-3' [28774-28759] - sonde 1: 5'-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluorescéine 3' [28561- 28586] : 5' Red705 GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-phosphate [28588-28608] - sonde 2 série 2 (SEQ ID NO: 62, 63, 66, 67) - amorce sens: N/+/28375: 5'-GGC TAC TAC CGA AGA G-3' [28375-28390] - amorce antisens: N/-/28702: 5'-AAT TAC CGC GAC TAC G-3' [28702-28687] - sonde 1: SRAS/N/FL: 5'-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC - fluorescéine 3' [28541-28563] - sonde 2: SRAS/N/LC705: 5' Red705 -CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C- phosphate 3' [28565-28589] b) analyse de l'efficacité des deux couples amorces Afin de tester l'efficacité respective des deux couples d'amorces, une amplification par RT-PCR a été réalisée sur un ARN synthétique correspondant aux nucléotides 28054-29430 du génome de la souche de SARS- CoV issue du prélève- ment répertorié sous le numéro 031589et contenant la séquence du gène N. De manière plus précise: Cet ARN synthétique a été préparé par transcription in vitro à l'aide de l'ARN polymérase du phage T7, d'une matrice d'ADN obtenu par linéarisation du plasmide SRAS-N avec l'enzyme Bam HI. Après élimination de la matrice d'ADN par digestion à l'aide de DNAse 1, les ARN synthétiques sont purifiés par une extraction au phénol- chloroforme suivie de deux précipitations successives en acétate d'ammonium et isopropanol. Ils sont alors quantifiés par mesure de l'absorbance à 260 nm et leur qualité est contrôlée par le rapport des absorbantes à 260 et 280 nm ainsi que par une électrophorèse en gel d'agarose. Ainsi, la concentration de la préparation d'ARN synthétique utilisée pour ces études est de 1,6 mg/ml, ce qui correspond à 2,1.1015 copies/ml d'ARN.
Des quantités décroissantes d'ARN synthétique ont été amplifiés par RTPCR à l'aide du kit "SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum Taq" et les couples d'amorces n 1 (N/+/28507, N/-/28774) (figure 1A) et n 2 (N/+ /28375, N/- /28702) (figure 1B), en suivant les indications du fournisseur. Les conditions d'ampli- fication utilisées sont les suivantes: l'ADNc a été synthétisé par incubation 30 min à C, 15 min à 55 C puis 2 min à 94 C puis il a été amplifié par 5 cycles compre- nant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 45 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec, suivis de 35 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec, avec 2 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, et d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. Les produits d'amplification obtenus ont ensuite été maintenus à 10 C.
Les résultats présentés à la figure 11 montrent que le couple d'amorces n 2 (N/+/28375, N/-/28702) permet de détecter jusqu'à 10 copies d'ARN (bande de faible intensité) ou 102 copies (bande de bonne intensité) contre 104 copies pour le couple d'amorces n 1 (N/+/28507, N/-/28774). Les amplicons sont respectivement de 268 pb (couple 1) et de 328 pb (couple 2).
c) mise au point de la RT-PCR en temps réel Une RT-PCR en temps réel a été mise au point à l'aide du couple 10 d'amorces n 2 et du couple de sonde constitué par SRAS/N/FL et SRAS/N/LC705 (figure 2).
L'amplification a été réalisée sur un LightCyclerTM (Roche) à l'aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes " (référence 2 015 145, Roche) dans les conditions optimisées suivantes. Un Mélange réactionnel conte- nant: H2O (6,8 pl), MgCl2 25 mM (0,8 pl, 4 M final de Mg2+), mélange réactionnel 5X (4 pl), sonde SRAS/N/FL 3 M (0,5 pl, 0,075 pM final), sonde SRAS/N/LC705 3 pM (0,5 pl, 0,075 pM final), amorce N/+/28375 10 pM (1 pl, 0,5 pM final), amorce N/-/28702 10 pM (1 pl, 0,5 M final), mélange d'enzyme (0,4 pl) et échantillon (ARN viral, 5 pl) a été amplifié en suivant le programme suivant: -Transcription inverse: 50 C 10:O0min analysis mode: none - Dénaturation: 95 C 30sec xl analysis mode: none - Amplification: 95 C 2sec - 50 C 15sec analysis mode: quantification* x45 72 C 13sec rampe thermique 2,0 C/sec refroidissement: 40 C 30sec xl analysis mode: none *La mesure de fluorescence se fait à la fin de l'hybridation et à chaque cycle (en mode SINGLE).
Les résultats présentés à la figure 12 montrent que cette RT-PCR en temps réel est très sensible puisqu'elle permet de détecter 102 copies d'ARN synthétique dans 100% des 5 échantillons analysés (29/29 échantillons dans 8 expé- riences) et jusqu'à 10 copies d'ARN dans 100% des 5 échantillons analysés (40/45 échantillons dans 8 expériences). Elle montre également que cette RT-PCR permet de détecter la présence du génome du SARS-CoV dans un échantillon et de quantifier le nombre de génomes présents. A titre d'exemple, l'ARN viral d'un stock de SARSCoV cultivé sur cellules Vero E6 a été extrait à l'aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen), dilué à 0,05.10-4 et analysé par RT-PCR en temps réel selon le protocole décrit ci-dessus; l'analyse présentée à la figure 12 montre que ce stock de virus contient 6,5.109 génomes équivalents/ml (geq/ml), ce qui est tout à fait similaire à la valeur de 1,0.1010 geq/ml mesurée à l'aide du kit "RealArtTM HPACoronavirus LC RT PCR Reagents" commercialisé par Artus.
d) détection de l'ARN du SARS-CoV par PCR en temps réel à partir de prélèvements respiratoires Une étude comparative a été réalisée sur une série de prélèvements respiratoires reçus par le Centre National de Référence du Virus Influenzae (région nord) et susceptibles de contenir du SARS-CoV. Pour ce faire, l'ARN a été extrait des prélèvements à l'aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen) et analysé par RT-PCR en temps réel, d'une part à l'aide des couples d'amorces et de sondes de la série n 2 dans les conditions décrites ci-dessus d'une part, et d'autre part à l'aide du kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" commercialisé par Roche (référence 03 604 438). Les résultats sont résumés dans le Tableau ci-dessous. Ils montrent que 18 des 26 prélèvements sont négatifs et 5 des 26 prélèvements sont positifs pour les deux kits, tandis qu'un prélèvement est positif pour le seul kit Roche et deux pour les seuls réactifs N"série2". En outre, pour 3 prélèvements (20032701, 20032712, 20032714) les quantités d'ARN détectés sont nettement supérieures avec les réactifs (sondes et amorces) de la série n 2. Ces résultats indiquent que les amorces et sondes N"série2" sont plus sensibles pour la détection du génome du SARS-CoV dans des prélèvements biologiques que celles du kit actuellement disponible.
Tableau V: Analyse par RT-PCR en temps réel des ARN extraits d'une série de prélèvements de 5 patients à l'aide des couples d'amorces et de sondes de la série n 2 (N "série 2") ou du kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" (Roche). Le type de prélèvement est indiqué ainsi que le nombre de copies de génome viral mesurées dans chacun des deux tests. NEG: RT-PCR négative.
Prélèvements n Patient Type de prélèvement KIT ROCHE N "série2" 20033082 K nasal NEC NEC 20033083 K pharyngé NEG NEG 20033086 K nasal NEG NEG 20033087 K pharyngé NEG NEC 20032802 M nasal NEC NEG 20032803 M expectoration NEG NEC 20032806 M nasal ou pharyngé NEG NEG 20031746ARN2 C pharyngé NEC NEG 20032711 C nasal ou pharyngé 39 NEC 20032910 B nasal NEC NEC 20032911 B pharyngé NEG NEG 20033356 V expectoration NEC NEG 20033357 V expectoration NEC NEC 20031725 K asp. endotrachéale NEC 150 20032657 K asp. endotrachéale NEC NEC 20032698 K asp. endotrachéale NEC NEG 20032720 K asp. endotrachéale 3 5 20033074 K selles 115 257 20032701 M pharyngé 443 1676 20032702 M expectoration NEG 249 20031747ARN2 C pharyngé NEG NEG 20032712 C inconnu 634 6914 20032714 C pharyngé 17 223 20032800 B nasal NEC NEC 20033353 V nasal NEC NEG 20033384 V nasal NEC NEC

Claims (14)

REVENDICATIONS
1 ) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par: a) la protéine N isolée, de séquence SEQ ID NO: 37, b) un polypeptide correspondant à la fusion N-terminale ou C-5 terminale de la protéine N (SEQ II) NO: 37) avec une étiquette, c) un anticorps ou un fragment d'anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre ladite protéine en a), et d) une puce ou un filtre à protéine ou à polypeptide comprenant la protéine définie en a) ou le polypeptide défini en b) ou bien l'anticorps ou le fragment 10 d'anticorps défini en c), pour la préparation d'un réactif de détection d'une infection par un coronavirus associé au SRAS et éventuellement de sérotypage d'un coronavirus associé au SRAS.
2 ) Méthode de détection d'une infection par un coronavirus associé au SRAS, à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide ou bien une puce ou un filtre à protéine ou à polypeptide tels que définis à la revendication 1, et (b) la révélation par tout moyen approprié des complexes antigène-20 anticorps formés en (a).
3 ) Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'à l'étape (a), l'échantillon biologique est mis en contact avec la protéine N isolée, de séquence SEQ ID NO: 37, ou un polypeptide correspondant à la fusion Nterminale ou C-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette.
4 ) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'à l'étape (b), la révélation des complexes antigène-anticorps formés en (a) est effectuée à l'aide d'un anticorps dirigé contre les IgG humaines.
5 ) Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'étape (a) comprend: (al) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps ou fragment d'anticorps qui est fixé sur un support approprié, notamment une microplaque, 30 (a2) le lavage de la phase solide, et (a3) l'addition d'au moins un second anticorps ou fragment d'anticorps, différent du premier, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant éventuellement marqué de façon appropriée.
6 ) Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'étape (al) est réalisée avec au moins un premier anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment d'anticorps dirigé contre la protéine S, M, et/ou E, et/ou un peptide correspondant à l'ectodomaine de l'une de ces protéines (peptides M2-14 ou El-12), et en ce que l'étape (a3) est réalisée avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre la protéine N.
7 ) Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre la protéine N est incubé en présence de détergent, à une concentration de l'ordre de 0,1 %.
8 ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que l'étape (b) de révélation des complexes antigène-anticorps formés est réalisée, soit directement à l'aide d'un anticorps marqué, soit indirectement à l'aide d'un sérum anti-immunoglobulines.
9 ) Kit ou coffret de détection d'une infection par un coronavirus associé au SRAS, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par: une protéine ou un polypeptide, un anticorps ou un fragment d'anticorps et une puce ou un filtre à protéine ou à polypeptide tels que définis à la revendication 1.
10 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit sélectionné dans le groupe constitué par une protéine ou un poly- peptide tels que définis à la revendication 1 et par les molécules d'acide nucléique codant lesdites protéines ou lesdits polypeptides.
11 ) Utilisation d'une protéine isolée ou purifiée de séquence SEQ ID NO: 37, ou d'un polypeptide correspondant à la fusion N-terminale ou Cterminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette, pour former un complexe immun avec un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.
12 ) Complexe immun formé d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS, et d'une protéine isolée ou purifiée de séquence SEQ ID NO: 37 ou d'un polypeptide correspondant à la fusion N-terminale ou C-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette.
13 ) Utilisation d'une protéine isolée ou purifiée de séquence SEQ ID NO: 37, ou d'un polypeptide correspondant à la fusion N-terminale ou Cterminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette, pour induire la production d'un anticorps capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS.
14 ) Utilisation d'un polynucléotide isolé ou purifié de séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 36 et 38 et par un polynucléotide codant un polypeptide correspondant à la fusion N-terminale ou C-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette, pour induire la production d'un anticorps dirigé contre la protéine codée par ledit polynucléotide et capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS.
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