JPH11127858A - ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドと該ウイルス感染症の診断法 - Google Patents
ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドと該ウイルス感染症の診断法Info
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- JPH11127858A JPH11127858A JP9295873A JP29587397A JPH11127858A JP H11127858 A JPH11127858 A JP H11127858A JP 9295873 A JP9295873 A JP 9295873A JP 29587397 A JP29587397 A JP 29587397A JP H11127858 A JPH11127858 A JP H11127858A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＥＡＶのＧＬタンパク質以外の組換えタンパ
ク質を各種発現系で発現させ、ＥＡＶ感染症の診断に有
効なタンパク質を提供する。 【解決手段】 ウマ動脈炎ウイルスゲノムにコードされ
たポリぺプチドのＮ末端あるいは内部に、連続した６残
基のヒスチジンが付加されるように組換え核酸配列を構
築し、この組換え核酸配列をポリヘドリンプロモーター
の下流に組み込んだバキュロウイルスを宿主細胞に感染
させてウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリぺプチ
ドを産生させ、精製する。
ク質を各種発現系で発現させ、ＥＡＶ感染症の診断に有
効なタンパク質を提供する。 【解決手段】 ウマ動脈炎ウイルスゲノムにコードされ
たポリぺプチドのＮ末端あるいは内部に、連続した６残
基のヒスチジンが付加されるように組換え核酸配列を構
築し、この組換え核酸配列をポリヘドリンプロモーター
の下流に組み込んだバキュロウイルスを宿主細胞に感染
させてウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリぺプチ
ドを産生させ、精製する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はウマ動脈炎ウイルス
(Equine arteritis virus ：以下「ＥＡＶ」という) の
血清学的診断法に有用な方法、この方法に有効に用いる
ことができるポリペプチド等に関するものであり、詳し
くはＥＡＶのゲノムにコードされるタンパク質あるいは
その抗原性を有する部分（以下両者を合わせて「ポリぺ
プチド」と称する）を、バキュロウイルスと昆虫細胞の
系で発現させたポリぺプチドと、これを抗原とした血清
学的診断法に関するものである。
(Equine arteritis virus ：以下「ＥＡＶ」という) の
血清学的診断法に有用な方法、この方法に有効に用いる
ことができるポリペプチド等に関するものであり、詳し
くはＥＡＶのゲノムにコードされるタンパク質あるいは
その抗原性を有する部分（以下両者を合わせて「ポリぺ
プチド」と称する）を、バキュロウイルスと昆虫細胞の
系で発現させたポリぺプチドと、これを抗原とした血清
学的診断法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景と従来の技術】ウマウイルス性動脈炎 (Eq
uine viral arteritis) は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡ
Ｖ）を原因とする馬の伝染性疾病であり、本感染症は世
界的に広く分布し、その主な症状は発熱、眼瞼や四肢の
浮腫、結膜炎、鼻汁漏出などであるが、妊娠馬が感染し
た場合は流産をも引き起こすことが知られている (Chir
nside,1992,Br.Vet.J.,148:181-197)。
uine viral arteritis) は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡ
Ｖ）を原因とする馬の伝染性疾病であり、本感染症は世
界的に広く分布し、その主な症状は発熱、眼瞼や四肢の
浮腫、結膜炎、鼻汁漏出などであるが、妊娠馬が感染し
た場合は流産をも引き起こすことが知られている (Chir
nside,1992,Br.Vet.J.,148:181-197)。
【０００３】このウイルスの感染経路は主に呼吸器であ
るが、種雄馬が感染した場合にはその３５％程度の感染
馬で生殖器にウイルスが持続感染し、感染後１〜２年以
上に渡ってウイルスを排泄するという報告があり (Timo
ney et al.,1986,Res.Vet.Sci.,41:279-280)、交配や人
工授精によるウイルス感染拡大の原因となっている。
るが、種雄馬が感染した場合にはその３５％程度の感染
馬で生殖器にウイルスが持続感染し、感染後１〜２年以
上に渡ってウイルスを排泄するという報告があり (Timo
ney et al.,1986,Res.Vet.Sci.,41:279-280)、交配や人
工授精によるウイルス感染拡大の原因となっている。
【０００４】本感染症の原因ウイルスであるＥＡＶは、
その分離当初は、トガウイルス科の節足動物非媒介性の
ウイルス属としてアルテリウイルス属に分類されたが、
最近その全塩基配列が決定され (Den Boon et al.,199
1,J.Virol.,65:2910-2920) 、その遺伝子構造や遺伝子
発現様式がコロナウイルスおよびトロウイルスと類似し
ていることから、ＥＡＶおよび旧分類のアルテリウイル
ス属に属する乳酸脱水素酵素ウイルス、サル出血熱ウイ
ルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスを一つの属とし
てコロナウイルススーパーファミリーに分類しようとす
る提案がなされている（前出の「Den Boon et al.,1991,
J.Virol.,65:2910-2920」) 。
その分離当初は、トガウイルス科の節足動物非媒介性の
ウイルス属としてアルテリウイルス属に分類されたが、
最近その全塩基配列が決定され (Den Boon et al.,199
1,J.Virol.,65:2910-2920) 、その遺伝子構造や遺伝子
発現様式がコロナウイルスおよびトロウイルスと類似し
ていることから、ＥＡＶおよび旧分類のアルテリウイル
ス属に属する乳酸脱水素酵素ウイルス、サル出血熱ウイ
ルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスを一つの属とし
てコロナウイルススーパーファミリーに分類しようとす
る提案がなされている（前出の「Den Boon et al.,1991,
J.Virol.,65:2910-2920」) 。
【０００５】ところで、上記ＥＡＶは、その遺伝子構造
の解析から７個のオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の存在が確認されており、そのうちＯＲＦ１ａおよ
びＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ
７がそれぞれポリメラーゼタンパク質、膜タンパク質Ｇ
Ｓ、膜タンパク質ＧＬ、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質に
対応すると考えられている（前出の「Den Boon et al.,1
991,J.Virol.,65:2910-2920」) 。
の解析から７個のオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の存在が確認されており、そのうちＯＲＦ１ａおよ
びＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ
７がそれぞれポリメラーゼタンパク質、膜タンパク質Ｇ
Ｓ、膜タンパク質ＧＬ、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質に
対応すると考えられている（前出の「Den Boon et al.,1
991,J.Virol.,65:2910-2920」) 。
【０００６】このようにＥＡＶはその遺伝子構造が明ら
かになってきたため、遺伝子工学的手法を用いたワクチ
ンの開発あるいは血清学的診断用抗原の開発が可能な状
況になりつつある。
かになってきたため、遺伝子工学的手法を用いたワクチ
ンの開発あるいは血清学的診断用抗原の開発が可能な状
況になりつつある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】一般に感染症の診断は
血清学的に行われ、ウイルス中和試験、蛍光抗体法、補
体結合反応、エライサやラテックス凝集反応など各種試
験法が用いられる。ＥＡＶ感染症の血清学的診断にはも
っぱらウイルス中和試験が用いられておりこの診断法自
体は感度が良く特異性の高い優れた方法であるが、判定
までに日数を要し、手技に熟練を要するという問題が常
につきまとっている。
血清学的に行われ、ウイルス中和試験、蛍光抗体法、補
体結合反応、エライサやラテックス凝集反応など各種試
験法が用いられる。ＥＡＶ感染症の血清学的診断にはも
っぱらウイルス中和試験が用いられておりこの診断法自
体は感度が良く特異性の高い優れた方法であるが、判定
までに日数を要し、手技に熟練を要するという問題が常
につきまとっている。
【０００８】ウイルス感染症の血清診断の現場では、簡
易で、判定までの期間が短いところからエライサやラテ
ックス凝集反応が頻繁に使用されるようになってきてい
る。ＥＡＶ感染症の血清学的診断に対してもエライサを
応用したCookらの報告 (1989,Vet.Microbiol.,20:181-1
89) や近藤らの報告（馬の科学、1995,32:107-111)があ
るが、これらの報告では精製ウイルス粒子をエライサ用
抗原として用いているため、その調製に比較的大量の培
養規模を要すると考えられる。
易で、判定までの期間が短いところからエライサやラテ
ックス凝集反応が頻繁に使用されるようになってきてい
る。ＥＡＶ感染症の血清学的診断に対してもエライサを
応用したCookらの報告 (1989,Vet.Microbiol.,20:181-1
89) や近藤らの報告（馬の科学、1995,32:107-111)があ
るが、これらの報告では精製ウイルス粒子をエライサ用
抗原として用いているため、その調製に比較的大量の培
養規模を要すると考えられる。
【０００９】また、Chirnside ら (1995,J.Virol.Metho
ds,54:1-13) は、大腸菌で発現させたＧＬタンパク質を
抗原とした血清診断法を開発しているが、ＥＡＶ感染症
の診断においてこの抗原が最も有用であるか否か、ある
いは大腸菌の発現系が目的に最も合致しているか否かに
ついては不明である。
ds,54:1-13) は、大腸菌で発現させたＧＬタンパク質を
抗原とした血清診断法を開発しているが、ＥＡＶ感染症
の診断においてこの抗原が最も有用であるか否か、ある
いは大腸菌の発現系が目的に最も合致しているか否かに
ついては不明である。
【００１０】本発明は、以上のような従来技術の下で、
ＥＡＶのＧＬタンパク質以外のポリぺプチドを各種発現
系で発現させ、これらの血清診断用抗原としての有用性
を解明することにより、ＥＡＶ感染症の診断に有効なポ
リぺプチドを提供することができ、またこのポリぺプチ
ドを産生することができる遺伝子、この遺伝子を組み込
んだポリぺプチド産生体、かかるポリぺプチド産生体に
より産生されたポリぺプチドを精製する方法、並びにか
かるポリぺプチドを用いて馬動脈炎ウイルスの感染診断
を行う方法を提供し、該ウイルスに対する防疫に資する
ことに有効な方策を提供せんとするものである。
ＥＡＶのＧＬタンパク質以外のポリぺプチドを各種発現
系で発現させ、これらの血清診断用抗原としての有用性
を解明することにより、ＥＡＶ感染症の診断に有効なポ
リぺプチドを提供することができ、またこのポリぺプチ
ドを産生することができる遺伝子、この遺伝子を組み込
んだポリぺプチド産生体、かかるポリぺプチド産生体に
より産生されたポリぺプチドを精製する方法、並びにか
かるポリぺプチドを用いて馬動脈炎ウイルスの感染診断
を行う方法を提供し、該ウイルスに対する防疫に資する
ことに有効な方策を提供せんとするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本課題を解決するために
はその第一のステップとして、対象とする遺伝子断片の
クローニングが行われる。ＥＡＶゲノムの全塩基配列は
前述のようにDen Boonら（1991,1.Virol.,65:2910-292
0）により決定されているので、この塩基配列を参考に
してプライマーＤＮＡを合成し、逆転写反応とポリメラ
ーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により遺伝子断片を
増幅させ、クローニングすることができる。また、ＤＮ
Ａ合成機を用いて人工的に遺伝子断片を合成しクローニ
ングすることもできる。このクローニングされた遺伝子
断片を各種発現用ベクターへ挿入し、目的とするポリぺ
プチドを発現させる。各種発現系でのポリぺプチドの発
現がＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）や蛍光抗体法などで確認された場合、次のス
テップとして必要に応じてポリぺプチドの精製を行う。
そしてこの精製操作を容易にするために、本発明におい
ては連続した６残基のヒスチジンをあらかじめ発現用ベ
クターの構築の段階で目的とするポリペプチドの任意の
位置に挿入あるいは付加させておくという特徴的な構成
を有する。
はその第一のステップとして、対象とする遺伝子断片の
クローニングが行われる。ＥＡＶゲノムの全塩基配列は
前述のようにDen Boonら（1991,1.Virol.,65:2910-292
0）により決定されているので、この塩基配列を参考に
してプライマーＤＮＡを合成し、逆転写反応とポリメラ
ーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により遺伝子断片を
増幅させ、クローニングすることができる。また、ＤＮ
Ａ合成機を用いて人工的に遺伝子断片を合成しクローニ
ングすることもできる。このクローニングされた遺伝子
断片を各種発現用ベクターへ挿入し、目的とするポリぺ
プチドを発現させる。各種発現系でのポリぺプチドの発
現がＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）や蛍光抗体法などで確認された場合、次のス
テップとして必要に応じてポリぺプチドの精製を行う。
そしてこの精製操作を容易にするために、本発明におい
ては連続した６残基のヒスチジンをあらかじめ発現用ベ
クターの構築の段階で目的とするポリペプチドの任意の
位置に挿入あるいは付加させておくという特徴的な構成
を有する。
【００１２】このように構築した場合、例えば市販され
ているニッケルカラムで発現させたポリペプチドを容易
に精製することができる。あるいはグルタチオンＳトラ
ンスフェラーゼと目的のタンパク質が融合した形で発現
されるように発現ベクターを構築しグルタチオンカラム
で精製することもできる。
ているニッケルカラムで発現させたポリペプチドを容易
に精製することができる。あるいはグルタチオンＳトラ
ンスフェラーゼと目的のタンパク質が融合した形で発現
されるように発現ベクターを構築しグルタチオンカラム
で精製することもできる。
【００１３】このようにして精製したポリペプチドある
いは粗精製のポリペプチドを、市販されているエライサ
プレートあるいはラテックス粒子に吸着させ、常法によ
りＥＶＡ感染馬血清および非感染馬血清を用いてエライ
サあるいはラテックス凝集反応を行い、発現させた組換
えタンパク質が感染馬血清に特異的に反応するか否かを
試験して診断用抗原としての有用性を判定する。
いは粗精製のポリペプチドを、市販されているエライサ
プレートあるいはラテックス粒子に吸着させ、常法によ
りＥＶＡ感染馬血清および非感染馬血清を用いてエライ
サあるいはラテックス凝集反応を行い、発現させた組換
えタンパク質が感染馬血清に特異的に反応するか否かを
試験して診断用抗原としての有用性を判定する。
【００１４】本願請求項１の組換え核酸配列の発明は、
ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドの末
端あるいは内部に連続した６残基のヒスチジンが挿入あ
るいは付加されるように構築した核酸配列であることを
特徴とする。
ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドの末
端あるいは内部に連続した６残基のヒスチジンが挿入あ
るいは付加されるように構築した核酸配列であることを
特徴とする。
【００１５】上記において用いる核酸配列は、ウマ動脈
炎ウイルスゲノムにコードされた遺伝子であってもよい
し、ＤＮＡ合成機を用いて人工的に合成したウマ動脈炎
ウイルスの抗原性を有するポリペプチドをコードする核
酸配列であってもよいが、いずれの場合もポリぺプチド
の末端あるいは内部に、連続した６残基のヒスチジンが
挿入あるいは付加されるように構築されることが必須で
ある（以下これらを総称して「組換え核酸配列」とい
う）。
炎ウイルスゲノムにコードされた遺伝子であってもよい
し、ＤＮＡ合成機を用いて人工的に合成したウマ動脈炎
ウイルスの抗原性を有するポリペプチドをコードする核
酸配列であってもよいが、いずれの場合もポリぺプチド
の末端あるいは内部に、連続した６残基のヒスチジンが
挿入あるいは付加されるように構築されることが必須で
ある（以下これらを総称して「組換え核酸配列」とい
う）。
【００１６】このように構築された組換え核酸配列を用
いることにより、産生されたポリペプチドの精製を容易
に行うことができる。
いることにより、産生されたポリペプチドの精製を容易
に行うことができる。
【００１７】本発明の組換え核酸配列を構築するための
ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリぺプチドをコ
ードする核酸配列は、例えばＮタンパク質あるいはＭタ
ンパク質をコードする遺伝子とすることができる。更に
は、これらタンパク質の抗原性を有している部分のポリ
ぺプチド断片をコードする核酸配列とすることもでき
る。
ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリぺプチドをコ
ードする核酸配列は、例えばＮタンパク質あるいはＭタ
ンパク質をコードする遺伝子とすることができる。更に
は、これらタンパク質の抗原性を有している部分のポリ
ぺプチド断片をコードする核酸配列とすることもでき
る。
【００１８】また本発明の組換え核酸配列は、ポリぺプ
チドを産生するためにバキュロウイルスに、そのポリヘ
ドリンプロモーターの下流に組み込んで組換えバキュロ
ウイルスとすることができる。また組換え核酸配列は、
大腸菌内で作動するプロモーターの下流に組み込むこと
もでき、診断抗原として用いられるポリぺプチドは、該
組換えバキュロウイルスを、その宿主細胞に感染させて
産生させて得ることができる他、大腸菌内でこれに組み
込んだプラスミド上のプロモーターを作動させることに
より大腸菌内で発現させて得ることができる。
チドを産生するためにバキュロウイルスに、そのポリヘ
ドリンプロモーターの下流に組み込んで組換えバキュロ
ウイルスとすることができる。また組換え核酸配列は、
大腸菌内で作動するプロモーターの下流に組み込むこと
もでき、診断抗原として用いられるポリぺプチドは、該
組換えバキュロウイルスを、その宿主細胞に感染させて
産生させて得ることができる他、大腸菌内でこれに組み
込んだプラスミド上のプロモーターを作動させることに
より大腸菌内で発現させて得ることができる。
【００１９】そして以上のようにして得たポリぺプチド
は、連続した６残基のヒスチジンに特異的なカラムを用
いて容易に精製することができる。
は、連続した６残基のヒスチジンに特異的なカラムを用
いて容易に精製することができる。
【００２０】また精製されたポリぺプチドは、ウマ動脈
炎ウイルス感染症の診断用抗原として用いることがで
き、このような診断法としては、エライザ反応が特に有
用性が高い。
炎ウイルス感染症の診断用抗原として用いることがで
き、このような診断法としては、エライザ反応が特に有
用性が高い。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明は、遺伝子工学的技術と血
清学的診断法の技術を用いて行われる。前者の技術はSa
mbrookら（1989,Molecular Cloning:A laboratory manu
al,2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, New York ）により、また後者の技術はHaarlow ら
（1998，Antibodies : A laboratory manual ,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press , New York）により集大
成されている。
清学的診断法の技術を用いて行われる。前者の技術はSa
mbrookら（1989,Molecular Cloning:A laboratory manu
al,2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, New York ）により、また後者の技術はHaarlow ら
（1998，Antibodies : A laboratory manual ,Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press , New York）により集大
成されている。
【００２２】本発明を遂行する第一段階ではＥＡＶゲノ
ムに相補的なｃＤＮＡ断片のクローニングを行う。本発
明で用いるＥＡＶにはいかなるＥＡＶ株を用いることも
でき、例えばBucyrus 株（ＡＴＣＣ ＶＲ−７９６）で
もよい。この過程はすでに、Den Boonら（1991 , J.Vir
ol., 65:2910-2920 ）が確立しており、彼らの報告して
いる方法により行うことができる。
ムに相補的なｃＤＮＡ断片のクローニングを行う。本発
明で用いるＥＡＶにはいかなるＥＡＶ株を用いることも
でき、例えばBucyrus 株（ＡＴＣＣ ＶＲ−７９６）で
もよい。この過程はすでに、Den Boonら（1991 , J.Vir
ol., 65:2910-2920 ）が確立しており、彼らの報告して
いる方法により行うことができる。
【００２３】あるいは、現在までに公知となっている塩
基配列 (Den Boon et al.,1991,J.Virol.,65:2910-2920
; Chirnside et al.,1994,J.Gen.Virol.,75:1491-1497
; Sugita et al.,1994,in Proceedings of Equine Inf
ectious Disease VII,pp39-43)を参考にして任意に合成
ＤＮＡプライマーを作成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により目的
の断片を増幅することも可能であり、さらにはＤＮＡ合
成機を用いて人工合成することも可能である。このよう
にして得られた断片は、適当なプラスミドＤＮＡ、例え
ばｐＵＣ１９上にクローニングする。目的の核酸配列が
クローニングされたなら、これを各種発現用ベクターに
挿入する。発現に用いられるベクターは数多く開発され
ており、例えば Sambrook ら (1989,Molecular Clonin
g:A laboratory manual,2nd edition,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,New York)の成書にもまとめられ
ている。これらの発現系の中で一般によく用いられてい
るものに大腸菌の発現系、例えばＱｉａｇｅｎ社のｐＱ
Ｅシリーズの発現系とバキュロウイルスの発現系があ
り、本発明の発明者らも以下の実施例で示すようにこれ
らの発現系を使用した。
基配列 (Den Boon et al.,1991,J.Virol.,65:2910-2920
; Chirnside et al.,1994,J.Gen.Virol.,75:1491-1497
; Sugita et al.,1994,in Proceedings of Equine Inf
ectious Disease VII,pp39-43)を参考にして任意に合成
ＤＮＡプライマーを作成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により目的
の断片を増幅することも可能であり、さらにはＤＮＡ合
成機を用いて人工合成することも可能である。このよう
にして得られた断片は、適当なプラスミドＤＮＡ、例え
ばｐＵＣ１９上にクローニングする。目的の核酸配列が
クローニングされたなら、これを各種発現用ベクターに
挿入する。発現に用いられるベクターは数多く開発され
ており、例えば Sambrook ら (1989,Molecular Clonin
g:A laboratory manual,2nd edition,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,New York)の成書にもまとめられ
ている。これらの発現系の中で一般によく用いられてい
るものに大腸菌の発現系、例えばＱｉａｇｅｎ社のｐＱ
Ｅシリーズの発現系とバキュロウイルスの発現系があ
り、本発明の発明者らも以下の実施例で示すようにこれ
らの発現系を使用した。
【００２４】これらの発現系で発現ベクターを構築する
際に、発現させるポリペプチドの末端あるいは内部に読
みとり枠が合致するように連続した６残基のヒスチジン
が付加するように構築すると、発現ポリぺプチドをニッ
ケルカラムを用いて一段階で精製することが可能にな
る。この目的のための発現ベクターは例えば上に述べた
大腸菌発現用にＱｉａｇｅｎ社からｐＱＥシリーズのベ
クター、あるいはバキュロウイルス発現用にＣｌｏｎｔ
ｅｃｈ社からｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ１などのベクター
が市販されている。また、グルタチオンＳトランスフェ
ラーゼとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオ
ンカラムを用いて精製を容易にするシステムも市販され
ている。以上のような発現系で組換えポリぺプチドが発
現するか否かはＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはウェスタンブ
ロッティング法を用いて解析することができる。
際に、発現させるポリペプチドの末端あるいは内部に読
みとり枠が合致するように連続した６残基のヒスチジン
が付加するように構築すると、発現ポリぺプチドをニッ
ケルカラムを用いて一段階で精製することが可能にな
る。この目的のための発現ベクターは例えば上に述べた
大腸菌発現用にＱｉａｇｅｎ社からｐＱＥシリーズのベ
クター、あるいはバキュロウイルス発現用にＣｌｏｎｔ
ｅｃｈ社からｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ１などのベクター
が市販されている。また、グルタチオンＳトランスフェ
ラーゼとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオ
ンカラムを用いて精製を容易にするシステムも市販され
ている。以上のような発現系で組換えポリぺプチドが発
現するか否かはＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはウェスタンブ
ロッティング法を用いて解析することができる。
【００２５】組換えポリぺプチドの発現が確認できた場
合、次の段階では必要に応じ、適当な方法で精製する。
精製の方法にはゲルろ過法、イオン交換ゲルを用いる方
法、ハイドロキシアパタイトゲルを用いる方法などの従
来の方法に加え、上述の様に組換えタンパク質を構築し
た場合にはニッケルカラムあるいはグルタチオンカラム
を用いることが可能である。精製あるいは粗精製の組換
えポリぺプチドを得たならば、これらのポリぺプチドを
常法に従いエライサ用マイクロタイタープレートへ吸着
させる。吸着後、適当なブロッキング剤、例えばゼラチ
ンあるいは牛血清アルブミンなどでプレートの各ウェル
をブロッキングし、これらのウェルに適当に希釈した被
検血清すなわち、既知の抗体陽性馬血清あるいは抗体陰
性馬血清を反応させ、これらのウェルの洗浄後さらにペ
ルオキシダーゼなどで標識した抗馬ＩｇＧ抗体あるいは
プロテインＧを添加し反応させる。さらにウェルを洗浄
した後、標識化合物に見合った発色基質液、例えばペル
オキシダーゼに対してはＡＢＴＳあるいはｏ−フェニレ
ンジアミンと過酸化水素水を含む溶液を添加し一定時間
反応させた後、エライサリーダーにて発色量を定量し、
用いた抗原が抗体と特異的に反応しているか否かを判定
し、作出した組換え抗原の有用性を検討する。組換え抗
原の有用性の検討の仕方には以上のエライサの他に例え
ばラテックス凝集反応など従来の血清学的診断法を用い
てもよい。
合、次の段階では必要に応じ、適当な方法で精製する。
精製の方法にはゲルろ過法、イオン交換ゲルを用いる方
法、ハイドロキシアパタイトゲルを用いる方法などの従
来の方法に加え、上述の様に組換えタンパク質を構築し
た場合にはニッケルカラムあるいはグルタチオンカラム
を用いることが可能である。精製あるいは粗精製の組換
えポリぺプチドを得たならば、これらのポリぺプチドを
常法に従いエライサ用マイクロタイタープレートへ吸着
させる。吸着後、適当なブロッキング剤、例えばゼラチ
ンあるいは牛血清アルブミンなどでプレートの各ウェル
をブロッキングし、これらのウェルに適当に希釈した被
検血清すなわち、既知の抗体陽性馬血清あるいは抗体陰
性馬血清を反応させ、これらのウェルの洗浄後さらにペ
ルオキシダーゼなどで標識した抗馬ＩｇＧ抗体あるいは
プロテインＧを添加し反応させる。さらにウェルを洗浄
した後、標識化合物に見合った発色基質液、例えばペル
オキシダーゼに対してはＡＢＴＳあるいはｏ−フェニレ
ンジアミンと過酸化水素水を含む溶液を添加し一定時間
反応させた後、エライサリーダーにて発色量を定量し、
用いた抗原が抗体と特異的に反応しているか否かを判定
し、作出した組換え抗原の有用性を検討する。組換え抗
原の有用性の検討の仕方には以上のエライサの他に例え
ばラテックス凝集反応など従来の血清学的診断法を用い
てもよい。
【００２６】以上のようにしてその有用性が確認された
組換えポリぺプチド抗原は各種血清学的診断法、例え
ば、ここで述べたエライサやラテックス凝集反応の抗原
として用いることができ、ＥＡＶ感染症の有益な診断法
を提供することができる。
組換えポリぺプチド抗原は各種血清学的診断法、例え
ば、ここで述べたエライサやラテックス凝集反応の抗原
として用いることができ、ＥＡＶ感染症の有益な診断法
を提供することができる。
【００２７】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２８】（１）ＯＲＦ６遺伝子およびＯＲＦ７遺伝
子のクローニングおよび組換えバキュロウイルスの作成 ＥＡＶ増殖用細胞としてＥｑｕｉｎｅ ｆｅｔａｌ ｄ
ｅｒｍａｌ（ＥＦＤ）細胞を用い、ＥＡＶはＥＦＤ細胞
順化Ｂｕｃｙｒｕｓ株を用いた。バキュロウイルスの宿
主細胞としては昆虫細胞であるＳｆ２１ＡＥ細胞を用い
た。プラスミドの構築および大腸菌での組換えタンパク
質の発現には大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を用いた。
子のクローニングおよび組換えバキュロウイルスの作成 ＥＡＶ増殖用細胞としてＥｑｕｉｎｅ ｆｅｔａｌ ｄ
ｅｒｍａｌ（ＥＦＤ）細胞を用い、ＥＡＶはＥＦＤ細胞
順化Ｂｕｃｙｒｕｓ株を用いた。バキュロウイルスの宿
主細胞としては昆虫細胞であるＳｆ２１ＡＥ細胞を用い
た。プラスミドの構築および大腸菌での組換えタンパク
質の発現には大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を用いた。
【００２９】ＥＡＶウイルス培養上清より超遠心法によ
りウイルス粒子を沈殿として回収し、ＲＴ−ＰＣＲ法に
より目的の遺伝子断片を増幅させた。
りウイルス粒子を沈殿として回収し、ＲＴ−ＰＣＲ法に
より目的の遺伝子断片を増幅させた。
【００３０】ＥＡＶゲノムＲＮＡを回収するために、２
５０μｌの精製ウイルス液に、１．５μｌの１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８）６μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶
液、３μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液およ
び３７．５μｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加え、３７℃で
３０分間反応させた。これをフェノール：クロロフォル
ム溶液（１：１）で２回抽出操作を行い、水層の部分を
回収してこれに３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ５．２）と１ｍｌのエタノールを加え、−８０℃で２
０分間静置した後、１５０００回転で１０分間遠心して
沈殿を回収し、１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８）に溶
かした。ＲＮＡの濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより求めた。
５０μｌの精製ウイルス液に、１．５μｌの１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８）６μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶
液、３μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液およ
び３７．５μｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加え、３７℃で
３０分間反応させた。これをフェノール：クロロフォル
ム溶液（１：１）で２回抽出操作を行い、水層の部分を
回収してこれに３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ５．２）と１ｍｌのエタノールを加え、−８０℃で２
０分間静置した後、１５０００回転で１０分間遠心して
沈殿を回収し、１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８）に溶
かした。ＲＮＡの濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより求めた。
【００３１】ゲノムＲＮＡよりｃＤＮＡを合成する逆転
写反応（ＲＴ反応）は以下のように行った。すなわち、
ＲＮＡに対して、５μｌの１０Ｘ逆転写反応用緩衝液
（０．５Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．３、０．５Ｍ
ＫＣｌ，８０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍジチオス
レイトール）、２μｌの１０μＭランダムプライマー、
１μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（３８ ｕｎｉｔｓ／
μｌ、和光純薬工業株式会社）を加えて総量４３μｌと
し、９０℃で５分間静置した後、氷水中で急冷し、さら
に、１μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤、５μｌのデオキ
シヌクレオチド混合液（各１０ｍＭ）、１μｌの逆転写
酵素（２９ ｕｎｉｔｓ／μｌ、生化学工業株式会社）
を加え、４２℃で９０分間反応させた。反応終了後、ウ
ルトラフリーＣ３ＴＫ（ミリポア社）を用いてランダム
プライマーを除去し、最終溶液量２０μｌとした。
写反応（ＲＴ反応）は以下のように行った。すなわち、
ＲＮＡに対して、５μｌの１０Ｘ逆転写反応用緩衝液
（０．５Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．３、０．５Ｍ
ＫＣｌ，８０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍジチオス
レイトール）、２μｌの１０μＭランダムプライマー、
１μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（３８ ｕｎｉｔｓ／
μｌ、和光純薬工業株式会社）を加えて総量４３μｌと
し、９０℃で５分間静置した後、氷水中で急冷し、さら
に、１μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤、５μｌのデオキ
シヌクレオチド混合液（各１０ｍＭ）、１μｌの逆転写
酵素（２９ ｕｎｉｔｓ／μｌ、生化学工業株式会社）
を加え、４２℃で９０分間反応させた。反応終了後、ウ
ルトラフリーＣ３ＴＫ（ミリポア社）を用いてランダム
プライマーを除去し、最終溶液量２０μｌとした。
【００３２】各遺伝子を増幅させるＰＣＲ反応のために
作成したプライマーの塩基配列はすでに報告されている
Ｂｕｃｙｒｕｓ株の塩基配列 (Den Boon et al.,1991,
J.Virol.,65:2910-2920) を参考にした。ＯＲＦ６遺伝
子を増幅させるために合成したプライマーは （ORF6-F） 5’-ATGGGAGCCATAGAATCATT- 3’ と （ORF6-R） 5’-TCATTGTAGCTTGATGGCTG- 3’ であり、ＯＲＦ７遺伝子を増幅させるために合成したプ
ライマーは （ORF7-F） 5’-ATGGCGTCAAGACGATCACG- 3’ と （ORF7-R） 5’-TTACGGCCCTGCTGGAGGCG- 3’ である。
作成したプライマーの塩基配列はすでに報告されている
Ｂｕｃｙｒｕｓ株の塩基配列 (Den Boon et al.,1991,
J.Virol.,65:2910-2920) を参考にした。ＯＲＦ６遺伝
子を増幅させるために合成したプライマーは （ORF6-F） 5’-ATGGGAGCCATAGAATCATT- 3’ と （ORF6-R） 5’-TCATTGTAGCTTGATGGCTG- 3’ であり、ＯＲＦ７遺伝子を増幅させるために合成したプ
ライマーは （ORF7-F） 5’-ATGGCGTCAAGACGATCACG- 3’ と （ORF7-R） 5’-TTACGGCCCTGCTGGAGGCG- 3’ である。
【００３３】上記で合成した２μｌのｃＤＮＡに対して
２μｌの１０ＸＰｆｕポリメラーゼ用バッファ（ポリメ
ラーゼに添付のもの）、各０．５μｌの１０μＭ合成プ
ライマー、５μｌのデオキシリボヌクレオチド混合液
（各２ｍＭ）、１４μｌの蒸留水、０．５μｌのＰｆｕ
ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、２．５ ｕｎ
ｉｔ／μｌ）を加え、流動パラフィンを重層した後、９
４℃ ９０秒、５６℃３０秒、７２℃ ２分を１サイク
ルとしたＰＣＲを３０サイクル行い、予想される長さの
ＤＮＡ断片をＰＣＲ産物として得た。この反応液をフェ
ノール：クロロフォルム（１：１）で抽出操作を施し、
ウルトラフリーＣ３ＴＫでプライマーおよびデオキシリ
ボヌクレオチドを除去した後、これを３０μｌの１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、６ｍ
Ｍ ＡＴＰを含む７０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．
６に溶かし、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドカイネー
スを加えて、３７℃で１時間反応させＤＮＡ断片の５’
末端をリン酸化した。ＰＣＲ法により増幅した各ＤＮＡ
断片を大腸菌用発現ベクターｐＱＥ３２（Ｑｉａｇｅｎ
社）のＳｍａ Ｉサイトにそれぞれクローニングした。
これにより、ラクトースプロモーターの下流に、６残基
のヒスチジン（ヒスチジンヘキサマー）とそれぞれのＯ
ＲＦ遺伝子が同一読みとり枠内で連結された融合遺伝子
として配置されるように設計した。
２μｌの１０ＸＰｆｕポリメラーゼ用バッファ（ポリメ
ラーゼに添付のもの）、各０．５μｌの１０μＭ合成プ
ライマー、５μｌのデオキシリボヌクレオチド混合液
（各２ｍＭ）、１４μｌの蒸留水、０．５μｌのＰｆｕ
ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、２．５ ｕｎ
ｉｔ／μｌ）を加え、流動パラフィンを重層した後、９
４℃ ９０秒、５６℃３０秒、７２℃ ２分を１サイク
ルとしたＰＣＲを３０サイクル行い、予想される長さの
ＤＮＡ断片をＰＣＲ産物として得た。この反応液をフェ
ノール：クロロフォルム（１：１）で抽出操作を施し、
ウルトラフリーＣ３ＴＫでプライマーおよびデオキシリ
ボヌクレオチドを除去した後、これを３０μｌの１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、６ｍ
Ｍ ＡＴＰを含む７０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．
６に溶かし、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドカイネー
スを加えて、３７℃で１時間反応させＤＮＡ断片の５’
末端をリン酸化した。ＰＣＲ法により増幅した各ＤＮＡ
断片を大腸菌用発現ベクターｐＱＥ３２（Ｑｉａｇｅｎ
社）のＳｍａ Ｉサイトにそれぞれクローニングした。
これにより、ラクトースプロモーターの下流に、６残基
のヒスチジン（ヒスチジンヘキサマー）とそれぞれのＯ
ＲＦ遺伝子が同一読みとり枠内で連結された融合遺伝子
として配置されるように設計した。
【００３４】以上のＲＴ−ＰＣＲ法によりＯＲＦ６遺伝
子に対応する４８９ｂｐおよびＯＲＦ７遺伝子に対応す
る３２４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これらをｐＱ
Ｅ３２ベクターのプロモーターに対して同方向に挿入さ
れたクローンを選び出し、目的とするプラスミドｐＱＥ
−ＯＲＦ６およびｐＱＥ−ＯＲＦ７と名付けた。更に、
これらのプラスミドより融合遺伝子全体を含むＥｃｏＲ
Ｉ−Ｓａｌ Ｉ断片をアガロース電気泳動法により回
収し、クレノー酵素を用いてＤＮＡ末端を平滑化し、バ
キュロウイルストランスファーベクターｐＢａｃＰＡＫ
１のクローニングサイトへポリヘドリンプロモーターに
対して同方向に挿入されたクローンを選び出し、トラン
スファーベクターを構築した。
子に対応する４８９ｂｐおよびＯＲＦ７遺伝子に対応す
る３２４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これらをｐＱ
Ｅ３２ベクターのプロモーターに対して同方向に挿入さ
れたクローンを選び出し、目的とするプラスミドｐＱＥ
−ＯＲＦ６およびｐＱＥ−ＯＲＦ７と名付けた。更に、
これらのプラスミドより融合遺伝子全体を含むＥｃｏＲ
Ｉ−Ｓａｌ Ｉ断片をアガロース電気泳動法により回
収し、クレノー酵素を用いてＤＮＡ末端を平滑化し、バ
キュロウイルストランスファーベクターｐＢａｃＰＡＫ
１のクローニングサイトへポリヘドリンプロモーターに
対して同方向に挿入されたクローンを選び出し、トラン
スファーベクターを構築した。
【００３５】これらのトランスファーベクターとバキュ
ロウイルスゲノムＤＮＡを宿主細胞であるＳｆ２１ＡＥ
細胞へリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を用い
て導入し、培養上清に出現したウイルスより組換えウイ
ルスをプラック法によりクローニングした。得られたウ
イルスはそれぞれＡｃＥＡＶ−Ｈ６（ＯＲＦ６との融合
遺伝子）ＡｃＥＡＶ−Ｈ７．１ａ（ＯＲＦ７との融合遺
伝子）と名付けた。以下の記載ではＯＲＦ６との融合遺
伝子に由来する発現タンパク質を「６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ
６タンパク質」、ＯＲＦ７との融合遺伝子に由来する発
現タンパク質を「６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ７．１タンパク
質」と称する。
ロウイルスゲノムＤＮＡを宿主細胞であるＳｆ２１ＡＥ
細胞へリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を用い
て導入し、培養上清に出現したウイルスより組換えウイ
ルスをプラック法によりクローニングした。得られたウ
イルスはそれぞれＡｃＥＡＶ−Ｈ６（ＯＲＦ６との融合
遺伝子）ＡｃＥＡＶ−Ｈ７．１ａ（ＯＲＦ７との融合遺
伝子）と名付けた。以下の記載ではＯＲＦ６との融合遺
伝子に由来する発現タンパク質を「６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ
６タンパク質」、ＯＲＦ７との融合遺伝子に由来する発
現タンパク質を「６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ７．１タンパク
質」と称する。
【００３６】（２）各タンパク質の大腸菌での発現 プラスミドｐＱＥ−ＯＲＦ６あるいはｐＱＥ−ＯＲＦ７
を保有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを培養し、ＩＰＴＧ
の添加により組換えタンパク質の発現の誘導を試みた。
それぞれの大腸菌をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン
ブロッティングにより解析したところ６ｘＨｉｓ−ＯＲ
Ｆ６タンパク質の発現は確認されたものの６ｘＨｉｓ−
ＯＲＦ７．１タンパク質の発現は確認できなかった。
を保有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを培養し、ＩＰＴＧ
の添加により組換えタンパク質の発現の誘導を試みた。
それぞれの大腸菌をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン
ブロッティングにより解析したところ６ｘＨｉｓ−ＯＲ
Ｆ６タンパク質の発現は確認されたものの６ｘＨｉｓ−
ＯＲＦ７．１タンパク質の発現は確認できなかった。
【００３７】（３）各融合タンパク質の昆虫細胞での発
現 組換えバキュロウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞にＭＯＩ
（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ）約１で感染させ、３日後に感染細胞を回収した。回
収した感染細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３
回洗浄した後、−３０℃に保存した。これをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで解析したところ、タンパク質染色では６ｘＨｉ
ｓ−ＯＲＦ７．１タンパク質は比較的大量に発現してい
たが、６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ６タンパク質の発現量は比較
的低かった。これらの遺伝子産物をウェスタンブロッテ
ィング法で感染馬血清と反応させたところ、いずれの組
換えタンパク質も陽性反応を示した。
現 組換えバキュロウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞にＭＯＩ
（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ）約１で感染させ、３日後に感染細胞を回収した。回
収した感染細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３
回洗浄した後、−３０℃に保存した。これをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで解析したところ、タンパク質染色では６ｘＨｉ
ｓ−ＯＲＦ７．１タンパク質は比較的大量に発現してい
たが、６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ６タンパク質の発現量は比較
的低かった。これらの遺伝子産物をウェスタンブロッテ
ィング法で感染馬血清と反応させたところ、いずれの組
換えタンパク質も陽性反応を示した。
【００３８】（４）発現タンパク質の精製 以上の発現タンパク質の中から発現量が高く、診断用抗
原として有望と考えられる大腸菌由来６ｘＨｉｓ−ＯＲ
Ｆ６タンパク質と昆虫細胞由来６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ７．
１タンパク質の２種類を精製した。すなわち、タンパク
質を発現した細胞を超音波で処理しその沈殿の分画を精
製の出発材料とした。精製はヒスチジンヘキサマーを付
加させたタンパク質を特異的に吸着させるニッケルカラ
ム（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｐｉｎ ｋｉ
ｔ）を用い、キットのマニュアルに従い変性条件下で精
製した。すなわち、出発材料を３．５Ｍの塩酸グアニジ
ンを含む緩衝液で可溶化した後スピンカラムに添加し、
そのカラムを洗浄した後に８Ｍ尿素を含む緩衝液で目的
とする組換えタンパク質を溶出した。得られたタンパク
質は−８０℃に保存した。
原として有望と考えられる大腸菌由来６ｘＨｉｓ−ＯＲ
Ｆ６タンパク質と昆虫細胞由来６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ７．
１タンパク質の２種類を精製した。すなわち、タンパク
質を発現した細胞を超音波で処理しその沈殿の分画を精
製の出発材料とした。精製はヒスチジンヘキサマーを付
加させたタンパク質を特異的に吸着させるニッケルカラ
ム（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｐｉｎ ｋｉ
ｔ）を用い、キットのマニュアルに従い変性条件下で精
製した。すなわち、出発材料を３．５Ｍの塩酸グアニジ
ンを含む緩衝液で可溶化した後スピンカラムに添加し、
そのカラムを洗浄した後に８Ｍ尿素を含む緩衝液で目的
とする組換えタンパク質を溶出した。得られたタンパク
質は−８０℃に保存した。
【００３９】（５）発現タンパク質のエライサへの応用 エライサは以下のように実施した。すなわち、精製抗原
を４Ｍ尿素溶液で希釈し、エライサプレート（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ社、Ｎｏ．３９１２）の各ウェ
ルに５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置することによ
り抗原を各ウェルに吸着させた（抗原吸着ウェル）。ま
た、抗原吸着ウェル１穴に対応して１穴の抗原を分注し
ないウェル（抗原非吸着ウェル）を設け、陰性対象ウェ
ルとした。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２
０を含む生理食塩水（プレート洗浄液）で２回洗浄した
後、ウェル当たり５０μｌの１％ゼラチン水溶液を分注
し３７℃に１時間静置することによりブロッキング操作
を行った。このプレートをプレート洗浄液で１回洗浄し
た後、１％ゼラチンと０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含む
ＰＢＳで１００倍に希釈した被検血清５０μｌを抗原吸
着ウェルおよび抗原非吸着ウェルに分注し、３７℃で３
０分間反応させた。反応終了後プレートを４回洗浄し、
０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含むＰＢＳで１０００倍に
希釈したペルオキシダーゼ標識リコンビナントＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｇ（Ｚｙｍｅｄ社）を各ウェルに５０μｌずつ
分注し３７℃で１５分間反応させた。更にプレートを４
回洗浄し、５０μｌの基質発色剤を各ウェルに分注し３
０℃で２０分間静置した後、７．２Ｎ硫酸溶液を５０μ
ｌ添加して酵素反応を停止させエライサリーダーにより
吸光度ＯＤ４９２−ＯＤ６００を測定した。基質発色剤
には０．１Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ ５）２５
ｍｌに対し１０ｍｇのｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍ
ｉｎｅと５μｌの３０％過酸化水素水を溶解した溶液を
用いた。
を４Ｍ尿素溶液で希釈し、エライサプレート（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ社、Ｎｏ．３９１２）の各ウェ
ルに５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置することによ
り抗原を各ウェルに吸着させた（抗原吸着ウェル）。ま
た、抗原吸着ウェル１穴に対応して１穴の抗原を分注し
ないウェル（抗原非吸着ウェル）を設け、陰性対象ウェ
ルとした。このプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ ２
０を含む生理食塩水（プレート洗浄液）で２回洗浄した
後、ウェル当たり５０μｌの１％ゼラチン水溶液を分注
し３７℃に１時間静置することによりブロッキング操作
を行った。このプレートをプレート洗浄液で１回洗浄し
た後、１％ゼラチンと０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含む
ＰＢＳで１００倍に希釈した被検血清５０μｌを抗原吸
着ウェルおよび抗原非吸着ウェルに分注し、３７℃で３
０分間反応させた。反応終了後プレートを４回洗浄し、
０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を含むＰＢＳで１０００倍に
希釈したペルオキシダーゼ標識リコンビナントＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｇ（Ｚｙｍｅｄ社）を各ウェルに５０μｌずつ
分注し３７℃で１５分間反応させた。更にプレートを４
回洗浄し、５０μｌの基質発色剤を各ウェルに分注し３
０℃で２０分間静置した後、７．２Ｎ硫酸溶液を５０μ
ｌ添加して酵素反応を停止させエライサリーダーにより
吸光度ＯＤ４９２−ＯＤ６００を測定した。基質発色剤
には０．１Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ ５）２５
ｍｌに対し１０ｍｇのｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍ
ｉｎｅと５μｌの３０％過酸化水素水を溶解した溶液を
用いた。
【００４０】表１に示すように６３検体の抗体陰性血清
を用いた試験を行った結果、昆虫細胞由来６ｘＨｉｓ−
ＯＲＦ７．１タンパク質の方が大腸菌由来６ｘＨｉｓ−
ＯＲＦ６タンパク質よりも抗体陰性血清に対する非特異
反応が少なかった。
を用いた試験を行った結果、昆虫細胞由来６ｘＨｉｓ−
ＯＲＦ７．１タンパク質の方が大腸菌由来６ｘＨｉｓ−
ＯＲＦ６タンパク質よりも抗体陰性血清に対する非特異
反応が少なかった。
【００４１】
【表１】
【００４２】さらに、３頭の実験感染馬の経過血清につ
いて精製６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ７タンパク質を用いたエラ
イサでのＯＤ値を測定しその中和抗体価と比較して表２
に示した。表２に示すようにＥＡＶ感染馬の中和抗体価
は感染後１週目より上昇し、その後一定の中和抗体価が
維持されるという推移を示した。これに対し、エライサ
抗体は中和抗体の出現より１週間遅れるものの、感染後
２週目から上昇し始め、その後、エライサ抗体陽性に転
じた。
いて精製６ｘＨｉｓ−ＯＲＦ７タンパク質を用いたエラ
イサでのＯＤ値を測定しその中和抗体価と比較して表２
に示した。表２に示すようにＥＡＶ感染馬の中和抗体価
は感染後１週目より上昇し、その後一定の中和抗体価が
維持されるという推移を示した。これに対し、エライサ
抗体は中和抗体の出現より１週間遅れるものの、感染後
２週目から上昇し始め、その後、エライサ抗体陽性に転
じた。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、組換えＥＡＶタンパク
質を用いることによりＥＡＶ感染症の血清学的診断のた
めの有用な抗原を提供し、本感染症の防疫に貢献すると
いう効果が得られる。
質を用いることによりＥＡＶ感染症の血清学的診断のた
めの有用な抗原を提供し、本感染症の防疫に貢献すると
いう効果が得られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ // Ａ６１Ｋ 39/215 ＡＦＥ Ａ６１Ｋ 39/215 ＡＦＥ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 長井 伸也 東京都羽村市神明台２−２−14−306 (72)発明者 上田 進 埼玉県所沢市中新井３−12−19 (72)発明者 今川 浩 栃木県下都賀郡国分寺町駅東６−10−21 (72)発明者 福永 昌夫 栃木県下都賀郡国分寺町駅東５−12−19 (72)発明者 杉田 繁夫 茨城県古河市古河141−６ フレッシュコ ーポ301 (72)発明者 近藤 高志 栃木県河内郡南河内町祇園５−16−10 サ ンアメニティハウス105号 (72)発明者 明石 博臣 茨城県つくば市竹園１丁目803−405
Claims (12)
- 【請求項１】 ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポ
リぺプチドをコードする核酸配列の内部あるいは末端
に、連続した６残基のヒスチジンをコードする核酸配列
を該ポリぺプチドの読み取り枠と一致するように挿入あ
るいは付加することにより構築されたことを特徴とする
組換え遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１のウマ動脈炎ウイルスの抗原性
を有するポリぺプチドをコードする核酸配列がＮタンパ
ク質をコードする核酸配列断片であることを特徴とする
組換え遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１のウマ動脈炎ウイルスの抗原性
を有するポリぺプチドをコードする核酸配列がＭタンパ
ク質をコードする核酸配列断片であることを特徴とする
組換え遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの組換え核
酸配列が組み込まれたことを特徴とする組換えバキュロ
ウイルス。 - 【請求項５】 請求項４における組換え核酸配列がバキ
ュロウイルスのポリヘドリンプロモーターの下流に組み
込まれたことを特徴とする組換えバキュロウイルス。 - 【請求項６】 請求項４又は５の組換えバキュロウイル
スを、その宿主細胞に感染させて産生させて得たことを
特徴とするウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリぺ
プチド。 - 【請求項７】 請求項１ないし３の組換え遺伝子が、大
腸菌内で作動するプロモーターの下流に組み込まれたこ
とを特徴とするプラスミド。 - 【請求項８】 請求項７のプラスミド上のプロモーター
を作動させることにより大腸菌内で発現させて得たこと
を特徴とするウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリ
ぺプチド。 - 【請求項９】 請求項６又は８のポリぺプチドを、連続
した６残基のヒスチジンに特異的なカラムを用いて精製
することを特徴とするウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有
するポリぺプチドの精製方法。 - 【請求項１０】 請求項９の方法により精製したことを
特徴とするウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリぺ
プチド。 - 【請求項１１】 請求項６、８又は１０の組換えポリぺ
プチドを抗原として用いることを特徴とするウマ動脈炎
ウイルス感染症の診断法。 - 【請求項１２】 請求項１１において、診断法がエライ
ザ反応であることを特徴とするウマ動脈炎ウイルス感染
症の診断法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9295873A JPH11127858A (ja) | 1997-10-28 | 1997-10-28 | ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドと該ウイルス感染症の診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9295873A JPH11127858A (ja) | 1997-10-28 | 1997-10-28 | ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドと該ウイルス感染症の診断法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11127858A true JPH11127858A (ja) | 1999-05-18 |
Family
ID=17826290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9295873A Withdrawn JPH11127858A (ja) | 1997-10-28 | 1997-10-28 | ウマ動脈炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドと該ウイルス感染症の診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11127858A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001068683A2 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Universite Du Quebec A Montreal | Peptide fragments of the equine arteritis virus m protein and their use in diagnostic tests |
-
1997
- 1997-10-28 JP JP9295873A patent/JPH11127858A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001068683A2 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Universite Du Quebec A Montreal | Peptide fragments of the equine arteritis virus m protein and their use in diagnostic tests |
| WO2001068683A3 (en) * | 2000-03-17 | 2002-02-07 | Univ Quebec Montreal | Peptide fragments of the equine arteritis virus m protein and their use in diagnostic tests |
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