CN1116654A - 血液测试鉴别疾病使用的保藏非传染性对照细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明描述从正常的、非传染的、非病变的血液中，通过减少或扩增一种或多种发现于正常血中反映特定疾病状态的细胞类型，制备非传染性对照细胞。将由此生产的对照细胞保藏并在此之后重建用于免疫检测。

Description

血液测试鉴别疾病使用的保藏非 传染性对照细胞
本申请与1991年10月22日申请的美国专利US5,059,518相关。本申请和US,5,059,518归共同的受让人，Coulter Corporation，Hialeah，Florida所有。
本发明涉及对照细胞和生产用于免疫检测的该细胞的方法。尤其是，本发明涉及具有至少一种特定细胞类型的种群或数量的保藏非传染性对照细胞，所述特定细胞类型种群或数量是患病哺乳动物血液或组织样品中所述细胞种群或数量的指示特征，与正常血液或组织样品的其数量相比，所述疾病可导致上述细胞数量改变。具体地说，非传染性对照细胞通过减少或扩增在正常血液中发现的反映特定的疾病状态的一种或多种细胞类型，从正常、非传染性、非疾病变化的血液中产生的。然后将这种减少或扩增的正常血液样品保藏，例如，冻干，以便延长其保存期，随后将其用于临床和免疫分析方法中。
对照细胞是准确无误的临床和免疫检测中所必需的。需要对照细胞来确保测试设备和测试方法的可靠性和准确性，并保证在不同的时间和不同的实验室的可重复性。管理这些检测的美国州和联邦法规通常要求使用多级对照以证实设备在一定值内性能运行正常。免疫检测中，新鲜的正常细胞为这种设备检测的标准对照细胞。为了免除获得和保持新鲜细胞所需的费用和开支，已评估了各种保藏新鲜细胞的方法。例如，US,5,059,518(’518专利)描述了使用冻干的正常哺乳动物细胞作对照细胞。
也曾经采用异常血细胞样品作为对照细胞来证实疾病的存在并确定其阶段，但是已将它们的使用限制在从患者抽取的新鲜或鲜冻样品。因此这些样品的供应受到内在的限制。再者，由于许多这样的血样与传染性疾病有关，由于健康和社会以及有时技术上的原因，这些血样不能大规范生产和销售，并且这些血样需要特别的处理方法。
本发明描述通过使用经修饰的正常对照细胞样品作为上述异常对照细胞的替代物而反映人血中存在于表现出特定疾病的人血液中的一种或多种特定细胞类型的种群或数量。
本发明提供反映表现出疾病的，以及血液中存在的细胞类型、数量或生理化学性质上有改变的哺乳动物血样中特定细胞种群的对照细胞，以及生产与保藏这些对照细胞的方法。对照细胞反映以下两个方面的血细胞种群的异常现状；(1)由于疾病的存在而使特定类型细胞在数量上的增加或减少，增加或减少的量与正常血样中这些细胞的数量有关；或(2)存在在正常血样中不应发现的细胞，这些细胞在大小、形状或其它物理特性上有差异，或具有未在正常细胞发现的分子和/或抗原位点。第一种类型的对照细胞通过减少正常存在于血液中的特定细胞的血样至正常水平以下或通过添加这些细胞至存在于血液中的正常水平之上来制备，且随后保藏该样品。第二种类型的对照细胞通过将不是正常存在于血液中的细胞加到正常血样中并随后保藏该样品。
图1(a)-(d)表示正常血样的流动血细胞计数分析，其中白细胞已与标记的抗CD-19单克隆抗体的PE(藻红蛋白)和标记了抗CD-10单克隆抗体的FITC(异硫氰酸荧光素)结合。
图2(a)-(d)表示含有添加了CD10阳性细胞的正常血样的流动血细胞计数分析。
图3(a)-(d)表示患有普通急性淋巴白血病患者血样的流动血细胞计数分析。
图4(a)-(d)表示正常白样的淋巴细胞流动血细胞计数分析。
图5(a)-(d)表示AIDS患者血样淋巴细胞的细胞计数分析。
图6(a)-(d)表示按本发明已减少了CD4的淋巴细胞的细胞计数分析。
图7图示当正常细胞样品用增加体积减少了CD4的样中品稀释时，CD4细胞百分率的降低。
图8图示当正常细胞样品用增加体积的减少了CD4的样品稀释时，每毫立升样品体积中CD4细胞数量上的变化。
本文中采用的术语“异常对照细胞样品”是指细胞的种群或数量或是总数或是特定类型不同于正常血样的细胞样品；或存在的不存在于正常血样中的异常血样细胞。例如，全部白细胞(白血细胞或WBC)总数的正常值为4,300至10,800每立方毫米。有差异的白细胞数量中各种细胞类型的正常值为：分裂中性白细胞(segmented neutrophil)＝34-75％，带状中性白细胞(band neutrophis)＝0-8％，淋巴细胞＝12-50％；单核细胞＝3-15％。嗜曙红细胞＝0-5％和嗜碱性粒细胞＝0-3％(The Merck Manual，14th Ed.R.Berkow，ed(Merck Sharp&Dohme，Rahway，New Jersey 1982)，p2182)。异常血样中，这些值有所不同。例如，(1)慢性粒细胞自血病患者的样品中，WBC数量可升至15,000至500,000或更高(文献同上，p1142)；(2)血友病者会患有轻微至严重的VIII因子缺陷，该因子鉴别为一种抗原(文献同上，p1127-1129)；和(3)普通急性淋巴母细胞白血病(CALL)患者的样品中，细胞会含有不正常出现的CD10抗原，该抗原可由抗CD10单克隆抗体如J5(Coulter Corporation，Hialeah，Florida)特殊地鉴别。
术语“生理化学性质”包括细胞的抗原特性，不论这些特性是正常存在的还是由于疾病导致未存在的。
本发明可由许多不同形式和与不同哺乳动物种类有关的实施方案来实现。虽然本文描述的详细实施例涉及人及与AIDS和CALL有关的分析，这些实施例将被看作本发明原理的举证，而并非旨在将本发明的范围限定至这些特定的实施方案。再者，虽然用来鉴别细胞类型的分子结构是人独有的且在其它哺乳动物中一般是没有的，但本发明的实施不限于人对照细胞样品和制备该样品的方法。例如可制备用于诊断猫白血病病毒或猿猴T细胞亲淋巴病毒1(STLV-1)，以及其它对照细胞样品。
异常对照细胞通常与两种情况之一有关。首先，特定类型细胞种群或数量的增加或降低。例如，从HIV(AIDS)感染的病人定期抽取的血样将显示CD4阳性淋巴细胞随疾病发晨而降低。其次，出现正常血样中未发现的细胞。例如，普通急性淋巴母细胞白血病患者的外周血样中出现CD10阳性细胞[CALL；K.A.Foon et al.，“Immunologic Classification of Leukemia and Lymphoma”，Blood 68：1-31(1986)]。通常用仪器，加上将特异的单克隆抗体与特定细胞类型其上或其中的特异分子结构结合，完成有关各种细胞种群血样的免疫分析。例如，通过将抗CD4单克隆抗体结合到CD4分子的抗原位点上，鉴别CD4阳性淋巴细胞。可以在单一的细胞上鉴别几种不同分子结构，以便鉴别特定的细胞类型或是与特定疾病有关的特定细胞类型。可以将大类的(broad class)细胞增分成更小和更具体的亚型。为了从几大类中区分一大类细胞并从选出的大类中进一步区分所选大类亚型，可将不同的标记结合到不同的单克隆抗体上。例如，可以使用单独或组合的、含有分子、酶和染料(特别是荧光染料)的放射成分作为这样的标记物。优选的是荧光染料，且此染料的例子包括荧光素，异硫氰酸荧光素(FITC)，异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)，藻红蛋白(PE或RD)，藻红蛋白-得克萨其红结合物和别藻蓝蛋白，等等。
降低特异细胞的数量对于对照细胞来说是重要的，通常，制备此对照细胞的方法包括：采集正常的、白血球富集的、抗凝固的血样；将其中的红血球(RBCs)溶胞并洗涤样品以去除溶胞碎片或由任何其它适宜的方法，例如US4,752,863中描述的方法，使用与可剥离底物诸如玻璃、陶瓷或聚合物珠，优选磁珠结合的单克隆抗体，从样品中去除特异细胞类型；去除RBC，并将去除的细胞重新加至可以表示疾病发展的不同阶段的特定水平。然后将样品长期保藏，例如，根据US5,059,518中描述的方法冻干样品(其方法引入本文中作为参考)，或通过其它适合的细胞保藏技术。除了那些特异的与疾病相关的其数目已增加或降低的细胞，或已加入那些特异的与疾病有关的细胞之外，由此生产的对照细胞显示正常的白血球细胞谱。
给出以下实施例是作说明之用，而不应看作限定本发明。
HIV患者的血液中表现出CD4(T4)细胞的含量降低。由于CD4细胞在抵抗许多直接导致AIDS患者死亡的继发性疾病中起着重要作用，进行CD4数量测定可以指示HIV感染的程度和患者避免继发性感染的能力。由于患者的血样分析是绝对必要的，因此人们希望用于分析的对照细胞是非传染性的，这样便可将任何疾病的偶然传播降至最低限度。实施例1  制备用作AIDS对照细胞的CD4减少的
              正常血细胞
将若干ACD(柠檬酸葡萄糖)或CPD(柠檬酸，磷酸葡萄糖)抗凝固的、自细胞富体的、正常血集合物在容器中合并，得到大量白细胞富集的血样。用0.83％(重量比)的氯化铵溶液将样品中的红血球溶胞。溶胞后，用Hepes-盐水-牛血清白蛋白溶液(HSB)将白血细胞洗涤几次。然后将白血细胞从最终洗涤液中分离出来并置于含有等渗10％海藻糖溶液容器中作为保藏介质。保留部分白血细胞备用。另外，通过例如由US4,752,563描述的那些方法，以及其它方法，将抗CD4单克隆抗体如T4(Coulter Corporation，Hialeah)结合到磁珠上。将抗CD4结合的磁珠加到洗涤的白细胞样品中并混合30分钟。采用磁性装置例如手持磁分离器或市售磁分离器将珠和结合于其上的细胞从容器中除去。将留在容器中的细胞离心分离，去除上层的清液并将细胞重悬浮于等渗海藻糖溶液中，最好是等渗10％海藻糖溶液作为保藏介质。然后将CD4减少的样品与来自其它带已知数量CD4细胞的样品中的不同数量保留白细胞或正常、无白细胞红血球混合，制备含不同数量CD4细胞的样品。例如：
1级CD4细胞：等体积的保留白细胞和CD4减少的白细胞混合，得到在原正常采集的血样中有50％CD4细胞的样品。
2级CD4细胞：三个体积的保留自细胞和一个体积CD4减少的白细胞混合，得到在原采集的血样中有25％CD4细胞的样品。
3级CD4细胞：九个体积的保留白细胞和一个体积CD4减少的白细胞混合，得到在原采集的血样中有10％CD4细胞的样品。
图7和8以图表示按所述方法制备的CD4对照细胞。图7描述当含正常CD4的样品用增加量的CD4减少的血稀释时，阳性细胞百分率的变化。图8描述当稀释度增加时，每立方毫米CD4阳性细胞绝对数量的变化。
此外，采集其它的正常的ACD或CPD抗凝固的、富集白细胞血集合物，将红血细胞溶胞且如本文前面所述的方法洗涤白细胞。采集样品中存在的CD4细胞数量可由使用荧光标记的T4单克隆抗体的流动血白细胞计数法确定。然后将该采集含CD4的样品的等分物与各种量的CD4减少的白细胞混合而制备具有不同浓度的CD4细胞的对照细胞样品。实施例2  制备CD10(CALLA)扩增的对照细胞
采集大量的正常ACD或PCD抗凝固的、富集白细胞的红血细胞集合物，并用0.83％(重量比)的氯化铵溶液将红血细胞溶胞。溶胞后，用HSB洗涤白细胞几次。然后将白细胞从最终洗涤液分离并置于含有等渗10％海藻糖溶液的容器中作为保藏介质。另外使用市售CALLA阳性，一种美国典型培养物保藏中心(ATCC)的CALLA样品、或其它来源的细胞，制备培养的CALLA(CD10阳性，普通急性淋巴母细胞白血病抗原)阳性细胞。在这里使用的细胞来自ATCC，保藏号CRL1596。然后将培养的CD10+细胞以不同的量加入到各等份保藏溶液中的正常白细胞中。实施例3  冻干用作非传染疾病细胞对照的稳定正常细胞
将由实施例1和2所示描述的方法制备的对照细胞根据US5,059,518(其方法入本文作为参考)冻干。具体地，将悬浮在等渗10％海藻糖溶液中的1、2或3级CD4对照细胞或CALLA对照细胞悬浮于300μl冻干的管形瓶中等渗的10％海藻糖溶液中，盖上管形瓶并冷却至4℃，然后搅拌以保证将管形瓶置于约-70℃的冷冻器中至少一小时使细胞分布均匀。冷冻完之后，立刻将管形瓶置于冻干器中约15小时。15小时结束后将冻干的管形瓶从冻干器中移出并贮藏在温度为2-8℃的冰箱中。此对照细胞可贮藏6个月或更长。向冻干管形瓶中加入去离子水或蒸馏水至300μl体积可重建冻干细胞。为在流动血细胞计数器口进行对照检测，将再悬浮的重建细胞染色，或作标记成记号，然后用标准流动血细胞计数方法分析。也可在其它类型的测定或其它适合的诊断方法中使用再悬浮细胞。
图1、2和3(a)-(d)将正常细胞(图1)与患者细胞(图3)以及根据本发明方法制备的对照细胞(图2)相比。这些数字表明，使用对照细胞，该检测手段能检测出可能存在于得病的患者血样中的异常CD10+和CD19+细胞。
图4、5和6(a)-(d)，表示该检测手段能检测出在AIDS患者中能见到的少量的CD4+细胞。图4中四边形1表示正常血样中出现的CD4+细胞。图5中，四边形1表示AIDS患者中见到的减少的CD4+细胞数量。图6中四边形1表示该仪器能检测由本发明减少的对照细胞表示的减少的CD4+。
图4中的(b)、(c)、(d)分析数据分别如表I、表II、表III所示：
                        表I
  最小  最大    计数    百分率   平均    SD  HPCV1 x    0     2      1562     44.6    0.0     0.2y    7     63                      23.9    3.7 11.62 x    3     63     124      3.5     24.0    9.0 10.6y    7     63                      14.7    8.1 9.713 x    0     2      689      19.7    0.0     0.2y    0     6                       1.0     1.84 x    3     63     1126     32.2    26.6    6.4  8.26y    0     6                       0.8     1.6
                        表II
最小    最大    计数    百分率    平均    SD   HPCV1   20      255     1231    35.2      108.3   24.6 4.44
                            表III
最小    最大    计数    百分率    平均    SD   HPCV
31      255     1654     47.3     95.5    17.1 9.66
图5中的(a)-(d)分析数据分别如表IV-表VII所示：
                         表IV
 最小    最大    计数    百分率    平均    SD  HPCV1 x   1       1       0       0.0y   7       72 x   0       0       1       0.0y   0       03 x   13      13      3       0.0y   16      164 x   3       3       4       0.0y   16      16
                        表V
最小    最大    计数    百分率    平均    SD    HPCV1 x 0.102   2.426   -245     4.9      0.192   0.140y 2.103   1023.                     20.99   9.44  24.42 x 2.428   1023.   2        0.0      5.359   0.386 12.2y 2.103   1023.                     7.146   1.546 6.113 x 0.102   2.426   1109     22.2     0.193   0.164y 0.102   2.101                     0.149   0.0854 x 2.428   1023.   3643     72.9     21.07   10.48 24.9y 0.102   2.101                     0.108   0.023
                        表VI
最小    最大    计数    百分率    平均     SD   HPCV1 x 575.8   1023.   3553     23.5     814.0    58.9y 29      57                        42.8     1.8  3.742 x 8.367   76.72   387      2.6      20.97    8.34 30.5y 18      41                        28.1     5.51 9.23 x 13.66   15.75   0        0.0y 0       04 x 0.102   0.118   1        0.0y 0       0
                        表VII
最小    最大     计数    百分率    平均    SD    HPCV1 x 0.102   2.101    -259    77.3     0.197   0.140y 7.679   1023.                     22.39   6.72   28.02 x 2.103   1023.    76      22.7     18.73   13.96  32.2y 7.679   1023.                     18.73   6.01   29.13 x 0.102   2.101    0       0.0y 0.102   7.6724 x 2.103   1023.    0.      0.0y 0.102   7.672
图6中的(b)-(d)分析数据如表VIII-表X所示：
                        表VIII
最小    最大    计数    百分率     平均    SD    HPCV1 x  0       3      175      5.0       0.1     0.5y  8       63                        24.9    7.5   3.492 x  4       63     78       2.2       28.49   8.9   3.83y  8       63                        12.1    6.8   7.333 x  0       3      1150     33.0      0.1     0.5y  0       7                         1.1     1.94 x  4       63     2090     59.7      28.2    7.1   7.54y  0       7                         1.1     2.0
                        表IX
最小    最大    计数    百分率    平均    SD   HPCV1   26      255     2130    60.9      115.9   26.1 5.41
                      表X最小    最大    计数    百分率    平均    SD   HPCV1 34      249     231     6.6       90.3    35.3

Claims (11)

1、一种反映患病的哺乳动物血样中特定细胞种群的对照细胞，所述疾病在发作时，与正常血样相比，存在于所述血样中的细胞在类型、数量或生理化学性质上有所变化，所述的对照细胞包含从正常血样中获得的正常白细胞种群，除了：
(a)至少一种已减少至低于正常白细胞样品中存在的数量的特定类型的细胞，或
(b)至少一种已增加至高于正常白细胞样品中存在的数量的特定类型细胞，或
(c)至少有一种不存在于正常白细胞样品中的特定类型细胞。
2、根据权利要求1的对照细胞，其中能将所述细胞重组成用于免疫测定的生物对照物。
3、根据权利要求1的对照细胞，其中所述细胞适合于替代在细胞流动细胞计数分析中作为标准物的新鲜异常细胞。
4、根据权利要求1的对照细胞，其中所述的细胞是从正常哺乳动物外周血细胞中得到的。
5、一种制备反映患病的哺乳动物血样中特定细胞种群保藏的对照细胞的方法，所述疾病在发作时，与正常血样相比，存在于所述血样中的细胞在类型、数量或生理化学性质上有所变化，所述的方法包括：
(a)去除正常血样中的红血细胞；
(b)将余下的细胞悬浮于保藏溶液中；
(c)保留步骤(b)的部分细胞；
(d)(ⅰ)通过将单克降抗体结合到可剥离的底物上，从步骤(b)的非保留细胞中减少反映疾病的特定细胞类型，并且
(ⅱ)步骤(d)(ⅰ)的减少的样品与
(1)步骤(c)中保留的不同量的细胞混合，得到不同程度地减少了所述特定细胞类型的样品；或
(2)根据步骤(a)和(b)处理的不同的正常血样，得到不同程度地减少了所述特定细胞类型的样品；或
(e)将正常存在于血液中的特定类型其他细胞加到步骤(b)的细胞中，以便增加所述特定细胞的数量，使其高于反映疾病的正常数量；
(f)将特定类型的其他细胞加到步骤(b)的细胞中，所述特定类型的其它细胞正常不存在于血液中但存在于患病而产生所述细胞的哺乳动物血液中；和
(g)保藏步骤(d)(e)和(f)中制备的细胞。
6、一种制备保藏的对照细胞的方法，所述的对照细胞反映患病哺乳动物血样中特定的细胞种群，所述疾病在发作时，与正常血样相比，存在于所述的血样中的细胞在类型、数量或生理化学性质上有所变化，所述的方法包括：
(a)将正常血样中的红血细胞溶胞、并洗涤所述样品中余下的细胞以去除溶胞碎片；
(b)余下的细胞悬浮于保藏溶液中；
(c)保留步骤(b)部分的细胞；
(d)(ⅰ)通过单克隆抗体与可剥离的底物连接，将反映疾病的特定细胞类型从步骤(b)的非保留细胞中减少；
(ⅱ)将步骤(d)(ⅰ)的减少的样品与
(1)步骤(C)中保留不同量的细胞混合，得到不同程度减少所述细胞类型的样品；或
(2)根据步骤(a)和(b)处理的不同的正常血样，得到不同程度减少所述细胞类型的样品；或
(e)向步骤(b)的细胞加入正常存在于血液中的特定类型其他细胞，使所述特定细胞的数量增至高于反映疾病的正常数量；
(f)将特定类型的其他细胞加到步骤(b)的细胞中，所述特定类型的其他细胞正常不存在于血液中但存在于患病而产生所述细胞的哺乳动物血中；和
(g)保藏步骤(d)(e)和(f)中制备的细胞。
7、一种反映患病的哺乳动物血样中特定细胞种群的对照细胞，所述疾病在发作时，与正常血样相比，存在于所述血样的细胞在类型、数量或生理化学性质上有所变化，所述的对照细胞包含从正常血样中获得的正常白细胞种群，除了；
(a)至少一种已减少至低于正常细胞样品中的数量，的特定类型的细胞，或
(b)至少一种已增至高于正常白细胞样品中的数量的特定类型的细胞，或
(c)至少一种不存在于正常白细胞样品中的特定类型细胞；和(d)用等渗海藻糖溶液通过冻干保藏(a)、(b)和(c)的所述对照细胞。
8、根据权利要求7的对照细胞，其中能够将所述细胞重建用作为免疫检测的生物对照物。
9、根据权利要求7的对照细胞，其中所述的细胞适宜代替细胞流动细胞计数分析作为标准物的新鲜不正常的细胞。
10、根据权利要求7的对照细胞，其中所述细胞是从正常哺乳动物的外周血细胞得到的。
11、一种制备保藏的对照细胞的方法，所述对照细胞可反映患病哺乳动物血样中特定细胞种群，所述疾病发作时，与正常血样相比，存在于所述血样中的细胞在类型、数量或生理化学性质上有所改变，所述方法包括：
(a)将正常血样中的红血细胞溶胞，并洗涤样品中剩余的细胞以除去溶胞碎片；
(b)将剩余的细胞悬浮于等渗海藻糖溶液中；
(c)保留步骤(b)的部分细胞；
(d)(ⅰ)通过将单克隆抗体与剥离的底物结合，将反映疾病的特定类型细胞从步骤(b)的非保留细胞中减少；
(ⅱ)将步骤(d)(ⅰ)的减少的样品与
(1)步骤(c)中保留不同量的细胞混合，得到不同程度减少所述细胞类型的样品；或
(2)根据步骤(a)和(b)处理的不同的正常血样，得到不同程度减少所述细胞类型的样品，或
(e)向步骤(b)的细胞加入正常存在于血液中的特定类型的其他细胞，使所述特定细胞的数量增至高于反映疾病的正常数量，或
(f)将特定类型的其它细胞加到步骤(b)的细胞中，所述特定类型的其他细胞正常不存在于血液中但存在于患病而产生所述细胞的哺乳动物血液中；和
(g)通过冻干在等渗海藻糖溶液中的所述细胞而保藏步骤(d)(e)和(f)中制备的细胞。
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