JPH0627017A - 多元的細胞識別分析法 - Google Patents
多元的細胞識別分析法Info
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- JPH0627017A JPH0627017A JP5008492A JP849293A JPH0627017A JP H0627017 A JPH0627017 A JP H0627017A JP 5008492 A JP5008492 A JP 5008492A JP 849293 A JP849293 A JP 849293A JP H0627017 A JPH0627017 A JP H0627017A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、末梢血液または骨髄からの細胞の
マルチパラメーター分析の改良法を提供することを目的
とする。 【構成】 本法は、血液または骨髄中の異なる細胞を区
別し識別するために、核酸染色剤、少なくとも２種類の
蛍光標識されたモノクローナル抗体および少なくとも２
種類の光散乱パラメーターを使用している。
マルチパラメーター分析の改良法を提供することを目的
とする。 【構成】 本法は、血液または骨髄中の異なる細胞を区
別し識別するために、核酸染色剤、少なくとも２種類の
蛍光標識されたモノクローナル抗体および少なくとも２
種類の光散乱パラメーターを使用している。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はフローサイトメトリーの
分野、特に血液および骨髄からの造血細胞の分析に関す
る。本発明はマルチパラメーターフローサイトメトリー
による血液および骨髄の計数を可能にする。
分野、特に血液および骨髄からの造血細胞の分析に関す
る。本発明はマルチパラメーターフローサイトメトリー
による血液および骨髄の計数を可能にする。
【０００２】
【従来の技術】米国特許第５，０４７，３２１号におい
て、ローケン（Ｌｏｋｅｎ）とテルスタッペン（Ｔｅｒ
ｓｔａｐｐｅｎ）は体液中の細胞成分のマルチパラメー
ター分析を記載している。記載された体液には血液と骨
髄が含まれていた。２つの核酸染色剤、蛍光標識された
抗体および２つの光散乱パラメーターを用いて、ローケ
ンとテルスタッペンは、血液および骨髄の種々の成分を
区別し、各成分内の細胞数を計測し、そして各々の識別
分析法を提供することを可能にした。
て、ローケン（Ｌｏｋｅｎ）とテルスタッペン（Ｔｅｒ
ｓｔａｐｐｅｎ）は体液中の細胞成分のマルチパラメー
ター分析を記載している。記載された体液には血液と骨
髄が含まれていた。２つの核酸染色剤、蛍光標識された
抗体および２つの光散乱パラメーターを用いて、ローケ
ンとテルスタッペンは、血液および骨髄の種々の成分を
区別し、各成分内の細胞数を計測し、そして各々の識別
分析法を提供することを可能にした。
【０００３】ローケンとテルスタッペンはＤＮＡの染色
剤としてＬＤＳ−７５１（エキサイトン（Ｅｘｃｉｔｏ
ｎ））を、ＲＮＡの染色剤としてチアゾールオレンジ
（Ｔｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ）（”ＴＯ”，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を、そして
蛍光標識された抗ＣＤ４５モノクローナル抗体、並びに
血液または骨髄の吸引物全体に対して前方および直角方
向の光散乱を使用した。これら５つのパラメーターを用
いて、彼等は赤血球、網赤血球、有核赤血球、血小板、
リンパ球、単球、好中性顆粒球、好塩基性顆粒球、エオ
シン好性顆粒球およびすべての有核細胞の前駆体を検出
および区別できた。
剤としてＬＤＳ−７５１（エキサイトン（Ｅｘｃｉｔｏ
ｎ））を、ＲＮＡの染色剤としてチアゾールオレンジ
（Ｔｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ）（”ＴＯ”，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を、そして
蛍光標識された抗ＣＤ４５モノクローナル抗体、並びに
血液または骨髄の吸引物全体に対して前方および直角方
向の光散乱を使用した。これら５つのパラメーターを用
いて、彼等は赤血球、網赤血球、有核赤血球、血小板、
リンパ球、単球、好中性顆粒球、好塩基性顆粒球、エオ
シン好性顆粒球およびすべての有核細胞の前駆体を検出
および区別できた。
【０００４】特に、赤血球は光散乱および蛍光の喪失に
より特徴付けられた。網赤血球は赤血球と同様に、光散
乱により特徴付けられたが、チアゾールオレンジによる
染色から赤血球と区別することができた。血小板はそれ
らの低い光散乱とＬＤＳ−７５１による染色により特徴
付けられた。白血球はそれらの大きな光散乱、ＬＤＳ−
７５１およびチアゾールオレンジ蛍光および抗ＣＤ４５
蛍光により特徴付けられた。白血球のなかで、リンパ球
は抗ＣＤ４５染色の高い蛍光強度により特徴付けられ；
単球は、より大きな光散乱と共に、同様の抗体蛍光強度
を有しており；好中性顆粒球は大きな光散乱とともに不
明確な抗体蛍光強度を有しており；エオシン好性顆粒球
は単球と同様の抗体蛍光強度を有していたが、単球に比
べ直角方向の光散乱が大きく前方光散乱が低かった。
より特徴付けられた。網赤血球は赤血球と同様に、光散
乱により特徴付けられたが、チアゾールオレンジによる
染色から赤血球と区別することができた。血小板はそれ
らの低い光散乱とＬＤＳ−７５１による染色により特徴
付けられた。白血球はそれらの大きな光散乱、ＬＤＳ−
７５１およびチアゾールオレンジ蛍光および抗ＣＤ４５
蛍光により特徴付けられた。白血球のなかで、リンパ球
は抗ＣＤ４５染色の高い蛍光強度により特徴付けられ；
単球は、より大きな光散乱と共に、同様の抗体蛍光強度
を有しており；好中性顆粒球は大きな光散乱とともに不
明確な抗体蛍光強度を有しており；エオシン好性顆粒球
は単球と同様の抗体蛍光強度を有していたが、単球に比
べ直角方向の光散乱が大きく前方光散乱が低かった。
【０００５】本方法は大部分の分析に有用であるが、本
法には限界がある。チアゾールオレンジおよび抗ＣＤ４
５蛍光とＬＤＳ−７５１の組み合わせでは赤血球系の十
分な区別ができず（即ち、正染性正赤芽球、正赤芽球お
よび赤芽球の同定ができず網赤血球の成熟型と未熟型の
区別ができない）、増殖中の骨髄細胞と非造血細胞（即
ち、基質細胞と上皮細胞）の同定ができない。
法には限界がある。チアゾールオレンジおよび抗ＣＤ４
５蛍光とＬＤＳ−７５１の組み合わせでは赤血球系の十
分な区別ができず（即ち、正染性正赤芽球、正赤芽球お
よび赤芽球の同定ができず網赤血球の成熟型と未熟型の
区別ができない）、増殖中の骨髄細胞と非造血細胞（即
ち、基質細胞と上皮細胞）の同定ができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】これらの限界をふまえ
て、血液および骨髄の細胞成分の同定および識別の改良
法の必要性がある。
て、血液および骨髄の細胞成分の同定および識別の改良
法の必要性がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、血液および骨
髄などの体液中の細胞を同時にマルチパラメーター分析
する方法からなる。血液または骨髄から採取された細胞
試料中の個々の細胞に対して、少なくとも２種類の光散
乱計測と少なくとも３種類の蛍光計測が行なわれる。３
種の蛍光成分にはＲＮＡに好適な核酸染色剤、造血系の
異なる系統の細胞上に特異な量だけ発現している抗原を
認識する、第１蛍光により標識された細胞表面マーカ
ー、および赤血球の前駆体と増殖中の細胞を認識する、
第２蛍光により標識された細胞表面マーカーが含まれ
る。３種の染色法の蛍光放射は区別され得るものでなけ
ればならない。
髄などの体液中の細胞を同時にマルチパラメーター分析
する方法からなる。血液または骨髄から採取された細胞
試料中の個々の細胞に対して、少なくとも２種類の光散
乱計測と少なくとも３種類の蛍光計測が行なわれる。３
種の蛍光成分にはＲＮＡに好適な核酸染色剤、造血系の
異なる系統の細胞上に特異な量だけ発現している抗原を
認識する、第１蛍光により標識された細胞表面マーカ
ー、および赤血球の前駆体と増殖中の細胞を認識する、
第２蛍光により標識された細胞表面マーカーが含まれ
る。３種の染色法の蛍光放射は区別され得るものでなけ
ればならない。
【０００８】本法においては、細胞を個別に、または核
酸染色剤および細胞表面マーカーとともに混合する。染
色した細胞を次にフローサイトメトリーによって分析す
るが、その際、細胞は一つまたは複数の識別領域（ここ
で個々の細胞を単一波長の光源に個別に暴露し、少なく
とも２種類の光散乱パラメーターの計測と少なくとも３
種類の蛍光放射の計測が各細胞に対して独立に記録され
る）を、実質的にひとまとめにされて一度に通され、そ
して各細胞に対して記録されたデータはリアルタイムで
分析されるかまたはデータ貯蔵庫やコンピューターなど
の解析装置に保存される。米国特許第４，２８４，４１
２号において、単一光源を備えた典型的フローサイトメ
ーターの構成および使用法が記載され、また、米国特許
第４，７２７，０２０号において、２つの光源が設置さ
れたフローサイトメーターの構成および使用法が記載さ
れている。
酸染色剤および細胞表面マーカーとともに混合する。染
色した細胞を次にフローサイトメトリーによって分析す
るが、その際、細胞は一つまたは複数の識別領域（ここ
で個々の細胞を単一波長の光源に個別に暴露し、少なく
とも２種類の光散乱パラメーターの計測と少なくとも３
種類の蛍光放射の計測が各細胞に対して独立に記録され
る）を、実質的にひとまとめにされて一度に通され、そ
して各細胞に対して記録されたデータはリアルタイムで
分析されるかまたはデータ貯蔵庫やコンピューターなど
の解析装置に保存される。米国特許第４，２８４，４１
２号において、単一光源を備えた典型的フローサイトメ
ーターの構成および使用法が記載され、また、米国特許
第４，７２７，０２０号において、２つの光源が設置さ
れたフローサイトメーターの構成および使用法が記載さ
れている。
【０００９】本発明の好適な実施態様においては、細胞
表面マーカーはモノクローナル抗体からなる。第１細胞
表面マーカーは抗ＨＬｅ−１などの抗ＣＤ４５モノクロ
ーナル抗体（ベクトンディキンソンイムノサイトメトリ
ーシステム（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ），”ＢＤＩ
Ｓ”）である。第２細胞表面マーカーは、増殖中の細胞
および赤血球前駆体を認識する一つまたは複数のモノク
ローナル抗体である。好適な実施態様では、本抗体は抗
トランスフェリン受容体などの抗ＣＤ７１モノクローナ
ル抗体（ＢＤＩＳ）である。
表面マーカーはモノクローナル抗体からなる。第１細胞
表面マーカーは抗ＨＬｅ−１などの抗ＣＤ４５モノクロ
ーナル抗体（ベクトンディキンソンイムノサイトメトリ
ーシステム（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ），”ＢＤＩ
Ｓ”）である。第２細胞表面マーカーは、増殖中の細胞
および赤血球前駆体を認識する一つまたは複数のモノク
ローナル抗体である。好適な実施態様では、本抗体は抗
トランスフェリン受容体などの抗ＣＤ７１モノクローナ
ル抗体（ＢＤＩＳ）である。
【００１０】別の実施態様においては、第３細胞表面マ
ーカーは、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４１または抗ＣＤ４２、
および汎血小板モノクローナル抗体からなるグループか
ら選択することができる。汎血小板抗体の添加は血小板
の分離を助け、血小板前駆体（即ち、巨核球）の同定を
助けることができる。
ーカーは、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４１または抗ＣＤ４２、
および汎血小板モノクローナル抗体からなるグループか
ら選択することができる。汎血小板抗体の添加は血小板
の分離を助け、血小板前駆体（即ち、巨核球）の同定を
助けることができる。
【００１１】本明細書に記載されるこれらの抗体の各々
は”クラスター名称（ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｅｓｉｇｎａ
ｔｉｏｎ）”ナンバー（または”ＣＤ”ナンバー）を、
ヒト白血球分化抗原に関する国際ワークショップおよび
会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ
ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＨｕｍａｎＬ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ａｎｔｉｇｅｎｓ）により与えられており、各抗体の多
くの実施例が独立にそしてそれと同様に商業的にもクラ
スター化のワークショップに提出されている。
は”クラスター名称（ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｅｓｉｇｎａ
ｔｉｏｎ）”ナンバー（または”ＣＤ”ナンバー）を、
ヒト白血球分化抗原に関する国際ワークショップおよび
会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ
ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＨｕｍａｎＬ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ａｎｔｉｇｅｎｓ）により与えられており、各抗体の多
くの実施例が独立にそしてそれと同様に商業的にもクラ
スター化のワークショップに提出されている。
【００１２】本抗体は蛍光ラベルに直接結合させること
ができ、あるいは例えば蛍光ラベルに直接結合されたヤ
ギ抗マウス抗体で間接的に標識することが可能である。
しかしながら、直接結合のほうが好適である。本発明の
実施において利用可能な蛍光ラベルはフィコエリスリン
（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；”ＰＥ”）、蛍光イソ
チオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅ；”ＦＩＴＣ”）、アロフィコシア
ニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ；”ＡＰ
Ｃ”）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ；”Ｔ
Ｒ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）、ペリジニンクロロフィルコンプレックス（ｐｅ
ｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｍｐｌ
ｅｘ；”ＰｅｒＣｐ”）、ＣＹ５（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）およびそのＰ
Ｅ結合体（例、ＰＥ／ＣＹ５、ＰＥ／ＡＰＣおよびＰＥ
／ＴＲ）を含む。好適な標識の組み合わせはＰＥとＰＥ
／ＣＹ５である。チアゾールオレンジ（Ｔｈｉａｚｏｌ
ｅ Ｏｒａｎｇｅ）は好適な核酸染色剤である。米国特
許第４，５２０，１１０号には、モノクローナル抗体に
結合されたＰＥ組成物および使用法が記載されており、
米国特許第４，４５２，１０４号にはペア結合体型のＰ
Ｅ組成物および使用法が記載されている。米国特許第
４，８７６，１９０号にはＰｅｒＣｐ組成物および使用
法が記載されている。
ができ、あるいは例えば蛍光ラベルに直接結合されたヤ
ギ抗マウス抗体で間接的に標識することが可能である。
しかしながら、直接結合のほうが好適である。本発明の
実施において利用可能な蛍光ラベルはフィコエリスリン
（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；”ＰＥ”）、蛍光イソ
チオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅ；”ＦＩＴＣ”）、アロフィコシア
ニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ；”ＡＰ
Ｃ”）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ；”Ｔ
Ｒ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）、ペリジニンクロロフィルコンプレックス（ｐｅ
ｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｍｐｌ
ｅｘ；”ＰｅｒＣｐ”）、ＣＹ５（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）およびそのＰ
Ｅ結合体（例、ＰＥ／ＣＹ５、ＰＥ／ＡＰＣおよびＰＥ
／ＴＲ）を含む。好適な標識の組み合わせはＰＥとＰＥ
／ＣＹ５である。チアゾールオレンジ（Ｔｈｉａｚｏｌ
ｅ Ｏｒａｎｇｅ）は好適な核酸染色剤である。米国特
許第４，５２０，１１０号には、モノクローナル抗体に
結合されたＰＥ組成物および使用法が記載されており、
米国特許第４，４５２，１０４号にはペア結合体型のＰ
Ｅ組成物および使用法が記載されている。米国特許第
４，８７６，１９０号にはＰｅｒＣｐ組成物および使用
法が記載されている。
【００１３】好適な方法においては、血液または骨髄の
試料を採取し、ＲＮＡ染色剤、蛍光標識した抗ＣＤ４５
モノクローナル抗体および蛍光標識した抗ＣＤ７１モノ
クローナル抗体と混合する。混合後、本試料をレーザー
光源が設置されたＦＡＣＳｃａｎ（商標名）ブランドフ
ローサイトメーター（ＢＤＩＳ）などのフローサイトメ
ーターで分析する。細胞は実質的に一度に分析され、直
角方向の光散乱、前方光散乱および３つの蛍光放射が個
別に各細胞に対して記録される。各細胞に対して記録さ
れた５種類のパラメーターは、一つまたは複数の組み合
わせによって各細胞の同定および特定に使用される。
試料を採取し、ＲＮＡ染色剤、蛍光標識した抗ＣＤ４５
モノクローナル抗体および蛍光標識した抗ＣＤ７１モノ
クローナル抗体と混合する。混合後、本試料をレーザー
光源が設置されたＦＡＣＳｃａｎ（商標名）ブランドフ
ローサイトメーター（ＢＤＩＳ）などのフローサイトメ
ーターで分析する。細胞は実質的に一度に分析され、直
角方向の光散乱、前方光散乱および３つの蛍光放射が個
別に各細胞に対して記録される。各細胞に対して記録さ
れた５種類のパラメーターは、一つまたは複数の組み合
わせによって各細胞の同定および特定に使用される。
【００１４】本発明の方法は、各細胞集団および各発生
ステージにある細胞数の計数と同様に、細胞集団および
発生ステージの同定と区別の両方に使用することが可能
である。
ステージにある細胞数の計数と同様に、細胞集団および
発生ステージの同定と区別の両方に使用することが可能
である。
【００１５】
【実施例】以下において、本発明の特定の態様を例示す
るが、当業者には明らかなとおり、さまざまな変更およ
び修飾は、記載された本発明の目的の範囲内であると考
えられる。
るが、当業者には明らかなとおり、さまざまな変更およ
び修飾は、記載された本発明の目的の範囲内であると考
えられる。
【００１６】正常な全血または正常な骨髄吸引物は、米
国特許第５，０４７，３２１に記載されたように健康な
志願者から得られた。胎児骨髄は妊娠１７−２５週目の
胎児から吸収された。骨髄細胞は大腿骨の髄内空洞をＲ
ＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０％胎児ウシ
血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ；”ＦＣ
Ｓ”）で洗い、ＮＨ4Ｃｌ溶解することにより分離し
た。
国特許第５，０４７，３２１に記載されたように健康な
志願者から得られた。胎児骨髄は妊娠１７−２５週目の
胎児から吸収された。骨髄細胞は大腿骨の髄内空洞をＲ
ＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０％胎児ウシ
血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ；”ＦＣ
Ｓ”）で洗い、ＮＨ4Ｃｌ溶解することにより分離し
た。
【００１７】各試験に対して、１０マイクロリットルの
全血または骨髄を使用した。各試験に対し、１０マクロ
リットルのＴＯ（１マイクログラム／ミリリットルのリ
ン酸緩衝溶液（”ＰＢＳ”）、０．５％ウシ血清アルブ
ミン（”ＢＳＡ”）および０．１％ＮａＮ3を含む）、
０．２５マイクログラム／試験の抗ＣＤ７１ ＰＥ（Ｐ
ＢＳ溶液、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ3を含
む）、および０．２５マイクログラム／試験の抗ＣＤ４
５ ＰＥ／ＣＹ５（ＰＢＳ溶液、０．５％ＢＳＡおよび
０．１％ＮａＮ3を含む）を加えた。本試薬を体液とと
もに室温、暗所で約１５分インキュベートした。パラホ
ルムアルデヒドの０．５％ＰＢＳ溶液１ミリリットルを
次に加えた。次に本試料を、アルゴンレーザー４８８ｎ
ｍを備えたＦＡＣＳｃａｎ（商標名）ブランドフローサ
イトメーターで分析した。データを記録しＬＹＳＩＳ
ＩＩ（商標名）ソフトウェア（ＢＤＩＳ）およびＰａｉ
ｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ（商標名）ソフトウェア（ＢＤＩ
Ｓ）を装備したＨＰ３１０コンピューターで解析した。
（Ｐａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ（商標名）ソフトウェアお
よび使用法は米国特許第４，８４５，６５３号に記載さ
れている。）図１について述べると、６ドットプロット
（またはスキャッタグラム）は正常な末梢全血試料に対
して示されている。赤血球は赤で、血小板は薄い青で、
網赤血球は黄色で、未成熟網赤血球は紫で、そして白血
球は緑で示されている。図２では、６ドットプロットは
正常な胎児骨髄試料に対して示されている。色分けは図
１と同じであるが、しかし、有核赤血球が薄い青で、血
小板は灰色で、そして増殖中の細胞は黒で示されてい
る。
全血または骨髄を使用した。各試験に対し、１０マクロ
リットルのＴＯ（１マイクログラム／ミリリットルのリ
ン酸緩衝溶液（”ＰＢＳ”）、０．５％ウシ血清アルブ
ミン（”ＢＳＡ”）および０．１％ＮａＮ3を含む）、
０．２５マイクログラム／試験の抗ＣＤ７１ ＰＥ（Ｐ
ＢＳ溶液、０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ3を含
む）、および０．２５マイクログラム／試験の抗ＣＤ４
５ ＰＥ／ＣＹ５（ＰＢＳ溶液、０．５％ＢＳＡおよび
０．１％ＮａＮ3を含む）を加えた。本試薬を体液とと
もに室温、暗所で約１５分インキュベートした。パラホ
ルムアルデヒドの０．５％ＰＢＳ溶液１ミリリットルを
次に加えた。次に本試料を、アルゴンレーザー４８８ｎ
ｍを備えたＦＡＣＳｃａｎ（商標名）ブランドフローサ
イトメーターで分析した。データを記録しＬＹＳＩＳ
ＩＩ（商標名）ソフトウェア（ＢＤＩＳ）およびＰａｉ
ｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ（商標名）ソフトウェア（ＢＤＩ
Ｓ）を装備したＨＰ３１０コンピューターで解析した。
（Ｐａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅ（商標名）ソフトウェアお
よび使用法は米国特許第４，８４５，６５３号に記載さ
れている。）図１について述べると、６ドットプロット
（またはスキャッタグラム）は正常な末梢全血試料に対
して示されている。赤血球は赤で、血小板は薄い青で、
網赤血球は黄色で、未成熟網赤血球は紫で、そして白血
球は緑で示されている。図２では、６ドットプロットは
正常な胎児骨髄試料に対して示されている。色分けは図
１と同じであるが、しかし、有核赤血球が薄い青で、血
小板は灰色で、そして増殖中の細胞は黒で示されてい
る。
【００１８】これらの図は米国特許第５，０４７，３２
１号の図１−４と比較されるべきものである。見て分か
るように、本発明は、米国特許第５，０４７，３２１号
にはないさらなる情報および詳細な記述を提供してい
る。
１号の図１−４と比較されるべきものである。見て分か
るように、本発明は、米国特許第５，０４７，３２１号
にはないさらなる情報および詳細な記述を提供してい
る。
【００１９】赤血球系統の未成熟細胞と白血球との区別
を明確にするために、ＴＯ染色に域値（または”ゲー
ト”）を適用した。白血球集団内の細胞の分解度を更に
増すために、フローサイトメーターの光散乱増幅を（通
常の対数処理の代わりに）線形にして行ない、直角方向
の光散乱を、同時係属中かつ本願と同一出願人である出
願Ｓ／Ｎ５１７，０９６に記載されているように変換し
た。
を明確にするために、ＴＯ染色に域値（または”ゲー
ト”）を適用した。白血球集団内の細胞の分解度を更に
増すために、フローサイトメーターの光散乱増幅を（通
常の対数処理の代わりに）線形にして行ない、直角方向
の光散乱を、同時係属中かつ本願と同一出願人である出
願Ｓ／Ｎ５１７，０９６に記載されているように変換し
た。
【００２０】図３について述べると、６ドットプロット
は、図１における末梢全体血液に関して、ＴＯ域値およ
び直角方向光変換を用いて示されている。しかし、図３
では、血小板および成熟網赤血球は灰色で、未成熟網赤
血球は濃い青で、好中球は緑で、リンパ球は赤で、そし
て単球は薄い青で示されている。図４においては、６ド
ットプロットは図２の胎児骨髄試料に対して、図３での
ＴＯおよび直角光散乱変換を用いて示してある。図４で
は、色分けは図３と同じだが、しかし、祖先細胞は黄色
で、基質細胞および上皮細胞は黒で、そして有核赤血球
は紫で示されている。
は、図１における末梢全体血液に関して、ＴＯ域値およ
び直角方向光変換を用いて示されている。しかし、図３
では、血小板および成熟網赤血球は灰色で、未成熟網赤
血球は濃い青で、好中球は緑で、リンパ球は赤で、そし
て単球は薄い青で示されている。図４においては、６ド
ットプロットは図２の胎児骨髄試料に対して、図３での
ＴＯおよび直角光散乱変換を用いて示してある。図４で
は、色分けは図３と同じだが、しかし、祖先細胞は黄色
で、基質細胞および上皮細胞は黒で、そして有核赤血球
は紫で示されている。
【００２１】図３および４について述べると、網赤血球
の２つの集団がＣＤ７１による染色の強度から明らかで
ある。未成熟網赤血球（濃い青）および成熟網赤血球
（灰色）はＣＤ７１について異なる発現を示した。この
ことは赤血球前駆体のより詳細な分割を可能にするもの
である。更に、有核赤血球（紫）は、ＴＯによる染色強
度が強いことから未成熟網赤血球と区別することがで
き、ＣＤ４５およびＣＤ７１蛍光の欠如から白血球およ
び基質細胞および上皮細胞と区別することが可能であ
る。有核赤血球（紫）の中で、２種類の細胞集団が同定
可能である。未成熟細胞は、成熟細胞がＣＤ４５を発現
していないのに対し、ＣＤ４５をわずかに発現してい
る。
の２つの集団がＣＤ７１による染色の強度から明らかで
ある。未成熟網赤血球（濃い青）および成熟網赤血球
（灰色）はＣＤ７１について異なる発現を示した。この
ことは赤血球前駆体のより詳細な分割を可能にするもの
である。更に、有核赤血球（紫）は、ＴＯによる染色強
度が強いことから未成熟網赤血球と区別することがで
き、ＣＤ４５およびＣＤ７１蛍光の欠如から白血球およ
び基質細胞および上皮細胞と区別することが可能であ
る。有核赤血球（紫）の中で、２種類の細胞集団が同定
可能である。未成熟細胞は、成熟細胞がＣＤ４５を発現
していないのに対し、ＣＤ４５をわずかに発現してい
る。
【００２２】図４について述べると、非造血細胞の位置
が示されている。これらの細胞は黒で表示されている。
こうした黒で色付けされた細胞はＴＯに関して高い強度
の発現を示す（即ち、有核である）が、ＣＤ７１を発現
せず、ＣＤ４５をわずかに発現する。これらの細胞に対
する様々な光散乱パラメーターはその不均一性を示すも
のである（即ち、本細胞には顕微鏡検定で決定されるよ
うに繊維芽細胞、上皮細胞および破骨細胞が含まれてい
る）。
が示されている。これらの細胞は黒で表示されている。
こうした黒で色付けされた細胞はＴＯに関して高い強度
の発現を示す（即ち、有核である）が、ＣＤ７１を発現
せず、ＣＤ４５をわずかに発現する。これらの細胞に対
する様々な光散乱パラメーターはその不均一性を示すも
のである（即ち、本細胞には顕微鏡検定で決定されるよ
うに繊維芽細胞、上皮細胞および破骨細胞が含まれてい
る）。
【００２３】本明細書にて言及されたすべての出版物お
よび特許出願は、本発明に関係する当業者の水準を示す
ものである。すべての出版物および特許出願は、個人的
出版物または特許出願の各々が特異的かつ個別に参考文
献として取り入れられて示されるのとまったく同様にし
て、本発明において参考文献として取り入れられてい
る。
よび特許出願は、本発明に関係する当業者の水準を示す
ものである。すべての出版物および特許出願は、個人的
出版物または特許出願の各々が特異的かつ個別に参考文
献として取り入れられて示されるのとまったく同様にし
て、本発明において参考文献として取り入れられてい
る。
【００２４】当業者の者にとっては、特許請求の範囲の
精神または範囲を逸脱することなく、多くの変更および
改変が本発明においてなされるのは明らかであろう。
精神または範囲を逸脱することなく、多くの変更および
改変が本発明においてなされるのは明らかであろう。
【図１】図１はＴＯで標識された末梢全血の細胞の６ド
ットプロットのシリーズからなる。（Ａ）は直角方向の
光散乱対前方光散乱のプロット、（Ｂ）はＴＯ蛍光の対
数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、（Ｃ）は直角
方向の光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、
（Ｄ）はＰＥ蛍光の対数対ＴＯ蛍光の対数のプロット、
（Ｅ）はＰＥ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプ
ロット、そして（Ｆ）は前方光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光
の対数のプロットである。
ットプロットのシリーズからなる。（Ａ）は直角方向の
光散乱対前方光散乱のプロット、（Ｂ）はＴＯ蛍光の対
数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、（Ｃ）は直角
方向の光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、
（Ｄ）はＰＥ蛍光の対数対ＴＯ蛍光の対数のプロット、
（Ｅ）はＰＥ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプ
ロット、そして（Ｆ）は前方光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光
の対数のプロットである。
【図２】図２はＴＯ、抗ＣＤ４５ ＰＥ／ＣＹ５、抗Ｃ
Ｄ７１ ＰＥで標識された胎児骨髄細胞の６ドットプロ
ットのシリーズからなる。（Ａ）−（Ｆ）の各軸は図１
と同様である。
Ｄ７１ ＰＥで標識された胎児骨髄細胞の６ドットプロ
ットのシリーズからなる。（Ａ）−（Ｆ）の各軸は図１
と同様である。
【図３】図３は、図１の末梢全血の細胞の６ドットプロ
ットで、ＴＯ蛍光に対する域値設定を付けたものであ
る。（Ａ）は変換された直角方向の光散乱対前方光散乱
のプロット、（Ｂ）はＴＯ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍
光の対数のプロット、（Ｃ）は変換された直角方向の光
散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、（Ｄ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＴＯ蛍光の対数のプロット、（Ｅ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、そ
して（Ｆ）は前方光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプ
ロットである。
ットで、ＴＯ蛍光に対する域値設定を付けたものであ
る。（Ａ）は変換された直角方向の光散乱対前方光散乱
のプロット、（Ｂ）はＴＯ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍
光の対数のプロット、（Ｃ）は変換された直角方向の光
散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、（Ｄ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＴＯ蛍光の対数のプロット、（Ｅ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、そ
して（Ｆ）は前方光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプ
ロットである。
【図４】図４は、図２の末梢全血の細胞の６ドットプロ
ットで、ＴＯ蛍光に対する域値設定を付けたものであ
る。（Ａ）は変換された直角方向の光散乱対前方光散乱
のプロット、（Ｂ）はＴＯ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍
光の対数のプロット、（Ｃ）は変換された直角方向の光
散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、（Ｄ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＴＯ蛍光の対数のプロット、（Ｅ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、そ
して（Ｆ）は前方光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプ
ロットである。
ットで、ＴＯ蛍光に対する域値設定を付けたものであ
る。（Ａ）は変換された直角方向の光散乱対前方光散乱
のプロット、（Ｂ）はＴＯ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍
光の対数のプロット、（Ｃ）は変換された直角方向の光
散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、（Ｄ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＴＯ蛍光の対数のプロット、（Ｅ）はＰ
Ｅ蛍光の対数対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプロット、そ
して（Ｆ）は前方光散乱対ＰＥ／ＣＹ５蛍光の対数のプ
ロットである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャ−ヒュエイ・チェン アメリカ合衆国カリフォルニア州95120, サン・ノゼ，ウィルヘルミナ・ウェイ 1155
Claims (6)
- 【請求項１】 １）試料にチアゾールオレンジ（Ｔｈｉ
ａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ）を添加し； ２）試料に、蛍光ラベルした抗ＣＤ４５モノクローナル
抗体および蛍光ラベルした抗ＣＤ７１モノクローナル抗
体を添加するが、その際、上記抗体への蛍光ラベルは互
いに且つチアゾールオレンジとは異なるピーク放射スペ
クトルを有し； ３）上記試料中の各細胞に関して、少なくとも３種の蛍
光チャンネル、および少なくとも２種の光散乱チャンネ
ルを検出、かつ記録することができるフローサイトメー
ターにより上記細胞を分析するが、その際、赤血球、成
熟網赤血球、未成熟網赤血球、成熟有核赤血球、未成熟
網赤血球、成熟有核赤血球、未成熟有核赤血球、芽細
胞、プラズマ細胞、巨核球、好中球、エオシン好球、好
塩基球、単球、リンパ球、基質および上皮細胞を同定す
る工程からなる、体液中の細胞のマルチパラメーター分
析法。 - 【請求項２】 体液試料が末梢全血からなる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 体液試料が骨髄からなる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項４】 第３蛍光で標識されたモノクローナル抗
体を上記工程２の試料に加えるが、その際、上記抗体は
血小板上に特異な抗原を認識する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項５】 上記ラベルがフィコエリスリン（ｐｈｙ
ｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、蛍光イソチオシアネート（ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａ
ｎｉｎ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｃ
Ｙ５、ペリジニンクロロフィルコンプレックス（ｐｅｒ
ｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ）およびそれらのフィコエリスリン結合体からなるグ
ループから選択される、請求項１または４に記載の方
法。 - 【請求項６】 上記第３抗体が抗ＣＤ６１、抗ＣＤ４１
または抗ＣＤ４２、および汎血小板抗体からなる、請求
項４に記載の方法。
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