JP4831915B2 - 血小板由来微小粒子分析用のモノリージェント - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、二重色素標識により血小板由来微小粒子（ＰＭＰ）を検出し、定量するためのモノ試薬(monoreagent)に関し、またそれを含む診断キットに関する。
【０００２】
活性化された血小板は、血小板由来微小粒子(ＰＭＰ)と呼ばれる小胞を放出することが知られている。直径の小さな（とは言っても、おそらく0.1〜0.8μｍの範囲であるが）これらの粒子は、ある種の刺激（トロンビン、コラーゲン、Ｃ５ｂ９等）の後に、血小板原形質膜の小胞化の結果として生ずる。それらにはプロトロンビン活性及びプロ凝血素活性によって、ＰＭＰは生体内で重要な役割を演じているように見える。
ＰＭＰは数種類の血小板レセプタ（GpIb、GpIIb/IIIa等）を発現し、数種類の血小板リガンド（フィブリノゲン、フィブロネクチン、コラーゲン、ｖＷＦ、ビトロネクチン等）を結合させる能力があり、血管の開口部における内皮下基質に固着させる能力がある。高い血行中ＰＭＰレベルは、多くの病理、例えば不安定狭心症(unstable angina)、心筋梗塞(myocardial infarction)、冠動脈造影(coronary angiography)、真性糖尿病(diabetes mellitus)、心肺シャント(cardiopulmonary shunt)、発作性夜間血色素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinurea)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、ＨＩＴ（ヘパリンに誘発された血小板減少症）、特発性血小板減少性紫斑病(idiopathic thrombocytopenic purpura) 等で観察されている。逆に、ある種の病変、例えばスコット症候集団のようなものは、血行中ＰＭＰレベルの欠乏と関連している可能性がある。
それ故、これらＰＭＰの検出とカウントは、種々の病理過程における血栓性前駆状態の重篤度の検出及び評価における重要な尺度であるように見える。
【０００３】
血小板由来微小粒子の形成に関連する現象と、該微小粒子を検出することの価値は、文献に広く記述されている（文献１−５参照）。
【０００４】
それ故に、血小板由来微小粒子の分離及び／又は定量のために、例えば濾過（文献６参照）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）（文献７参照）、また、特に流動細胞光度測定法（フローサイトメトリー）（文献８−１１参照）のような技術に基づく種々のアプローチが提案されている。
【０００５】
フローサイトメトリーの原理、及び細胞や細胞粒子の部分集団を識別し定量する方法としてのその利点は、今日では当該技術に精通する者にはよく知られている。
この方法は、血液中の活性化された血小板を検出したり、機能検定法（文献１２参照）を用いて血小板由来のプロ凝血素性微小粒子を検出するために、既に使用されている。
しかしながら、実施された研究の大部分は単色の蛍光ラベリング、及び／又は計数ビーズを使用しており、これらの手法の有効性は、完全に標準化された態様でＰＭＰの検出と定量のための試験を実施するための工業化可能な方法を予見するには、基準合わせ（キャリブレーション）の点で不十分なものであった。
【０００６】
本発明は、ワンステップで、かつ標準化された態様で、前処理なしに血液サンプル中の血小板由来微小粒子を特異的に検出しカウントすることを可能ならしめる新規な解決法を提供することにより、以前から存在している複数の方法に改良を導入するものである。
この目的に添って、特別なモノ試薬と、複数集団の基準化されたビーズならびにＰＭＰの二重標識法の組み合わせが開発された。そして、この試薬は、１）ある粒径規準に従って、ＰＭＰの最適な分離を行うこと、２）特異的なラベリングによるＰＭＰの特性付け、及び３）計数ビーズを用いたＰＭＰの計数を、同時に可能ならしめる。従って、これらＰＭＰがきわめて少量しか存在しない場合でも、サンプル中のＰＭＰを特異的に検出し、高い信頼性で計数する手段が提供される。
【０００７】
本発明の主題は、それ故、血液サンプル中の血小板由来微小粒子（ＰＭＰ）をフローサイトメトリーによって検出及び定量するためのモノ試薬であり、該試薬は下記の構成要素を含むものである：
【０００８】
ａ）二重標識のための下記成分を含む試薬１：
− アネキシンＶ、又は生体膜リン脂質に特異的な他のマーカーの何れか一つと、蛍光色素１を組み合わせたもの、
− 又は血小板膜構造に指向する集団１のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を蛍光色素１で標識したもの（試薬１ａ）、及び
【０００９】
血小板膜構造に指向する集団２のＭＡＢを蛍光色素２で標識したもの（試薬１ｂ）（前記蛍光色素２は、蛍光色素１とは異なったものである）、及び
【００１０】
ｂ）下記成分を含むミクロスフェア混合物から成る試薬２：
− 蛍光色素１又は２の何れか一方、或いはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されており、粒径（光散乱のパラメータ）に関するＰＭＰの分析範囲を規定するために使用され、且つＰＭＰの区別を可能にするミクロスフェアＡの一集団（セッティングビーズ）、
− 標識されていないか、蛍光色素１又は２の何れか一方、或いはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されており、その濃度が既知であって、微小粒子を計数するために使用されるミクロスフェアＢの一集団（計数ビーズ）、
− 蛍光色素１のみで標識されており、蛍光色素１の蛍光パラメータに関して、蛍光色素１で標識されたＭＡＢ１又はアネキシンＶ、又は生体膜のリン脂質に特異的な他のマーカーが結合している微小粒子の分析範囲の限界を定める最小強度閾値を定義するために使用されるミクロスフェアＣの一集団（閾値ビーズ）、及び
− 粒径がＣと等しく、かつ蛍光色素２のみで標識されており、蛍光色素２の蛍光パラメータに関して、蛍光色素２で標識されたＭＡＢ２が結合している微小粒子の分析範囲の限界を定める最小強度閾値を定義するために使用されるミクロスフェアＤの一集団（閾値ビーズ）。
【００１１】
それ故、本発明によるモノ試薬は、下記のような複数の機能を持つ：
− 微小粒子を色素で二重標識し、血小板由来微小粒子と、起源を異にする等価物の最適な区別ができるようにすること、
− 分析対象たる微小粒子と、可能な背景ノイズに起因する他の粒子や断片とを識別するための閾値を標準化すること、
− 内部標準ビーズの参照計数によって、識別された標識付き血小板由来微小粒子の計数を標準化すること。
【００１２】
好ましくは、閾値ビーズのＣ集団及びＤ集団のそれぞれは、閾値の設定と補償値の調整により分析の最適標準化を行うために、蛍光レベルが１と２との２水準である２つの部分集団から成っている。
【００１３】
種々の集団のビーズは、この種の粒子の製造に一般に使用されている多種多様な材料から得られる。それらは、例えば、多糖類、スチレン重合物、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ビニルポリマー類、ポリスチレン及び芳香族原子団を含む重合物のような、有機重合物である。好ましく用いられる材料は、ポリスチレンである。しかしながら、使用されるビーズの種々の集団の間で、材料に差異があっても差し支えない。
【００１４】
数種類の蛍光色素は、市販品として入手可能である。フィコエリトリン(ＰＥ)又はフルオレッセイン塩類、例えばフルオレッセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を用いるのが好ましい。
【００１５】
ＰＭＰをカウントする役割の計数ビーズは、粒径５μｍ以上であり、計数（サイトメトリー）の際に、計数ビーズのクラウドが、細胞から、また他のビーズ集団（閾値ビーズ等）から明瞭に区別されることが有利である。好ましくは、計数ビーズの粒径は５〜１０μｍである。
【００１６】
これらの計数ビーズは、標識されていなくても良く、塊の内部か又は表面が標識されていても良い。好ましくは、塊の内部が、閾値ビーズの標識に用いられる蛍光色素１又は２の何れか一方、若しくはその一方に近似したスペクトルを有する他の蛍光色素で標識されている。
【００１７】
セッティングビーズは、粒径に応じてＰＭＰのための分析ウィンドウの設定を可能にする。粒径は 0.5〜１μｍであることが好都合である。セッティングビーズは、塊の内部もしくは表面が、蛍光色素１又は２の何れか一方、もしくはその一方に近似したスペクトルを有する他の蛍光色素で標識されている。
【００１８】
閾値ビーズの役割は、ＰＭＰのための分析ウィンドウを設定することによって分析を標準化することと、補償の調節を可能にすることである。粒径は１〜５μｍ、好ましくは３μｍである。
【００１９】
閾値ビーズにおけるＣ及びＤの２集団は、蛍光色素１又は２の何れか一方で標識された２集団から成っており、何れも同じ性質を持ったビーズであるが蛍光のレベルが異なる二つのカテゴリーから成っていることが好都合である。
これらの標準液(calibrant)は、ＭＥＳＦ（可溶性蛍光色素のモル当量−文献１３）として、標準物質（Quantum 24 フルオレッセイン−コードRF 824；Quantum PER-フィコエリトリン−コードRF 827、FCSC Europe）を用いて標定すると良い。
【００２０】
閾値ビーズの強度は、このようにして、ＰＭＰの強度最小値と、他の起源に由来する微小粒子や粒径が近似した混入異物（塵埃、細胞の断片、等々）の強度最大値の間の限界値であるように設定される。
蛍光色素１及び蛍光色素２、好ましくはＦＩＴＣ及びＰＥの閾値は、他の混入異物と比較してＰＭＰの最適な識別ができるように、正常な個人と病的な個人の集団について、市販の標準キャリブラントを使用して決定される。
こうして定義される閾値が、モノ試薬の共同閾値ビーズ（Ｃ，Ｄ）の数値を与える。
【００２１】
集団１及び集団２のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）は、下記の特異性から選ばれる血小板膜構造に指向しているのが好ましい：抗原ＣＤ６１、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、プロテインＳ、及びプロトロンビン。
これら集団１及び２は、単一種のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）、特異性は同一であるが異なったエピトープ（抗原決定基）を指向する複数種のＭＡＢ、あるいは血小板特異性を異にする複数種のＭＡＢの何れによっても代表され得る。
【００２２】
好ましい変法の一つでは、本発明のモノ試薬の試薬１は、蛍光色素１で標識されたアネキシンＶ（又は膜のリン脂質に特異的な他のマーカー）（試薬１ａ）、及び蛍光色素２で標識された集団２のＭＡＢ（試薬１ｂ）から成る。
【００２３】
好ましくは、特異性を異にする複数種のＭＡＢを含む集団２のＭＡＢ、更に好ましくは、抗ＣＤ６１ ＭＡＢ及び抗ＣＤ４２ｂ ＭＡＢが用いられる。好ましい試薬の一例は、ＰＥで標識した抗ＣＤ６１並びに抗ＣＤ４２ｂ ＭＡＢ、及びＦＩＴＣで標識したアネキシンＶから成る。
【００２４】
有利な形態の一つによれば、抗ＣＤ６１抗体は、Ｐ１８及び４Ｆ８ハイブリドーマによって産生されるものであり、これらのハイブリドーマは、ブダペスト協定に従って、それぞれ０６．２６．９７及び０６．０２．９８付で、ＬＭＢＰ１６２ＣＢ（Ｐ１８）及びＬＭＢＰ１６６７ＣＢ（４Ｆ８）の番号の下にＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（ベルギー微生物保存機関）に寄託されている。
これら２種のＭＡＢの組み合わせが特に有利であるのは、それらの間に立体遺伝子(steric gene)がなく、それらとＰＭＰとの結合が、市販のGPIIb/IIIa抗凝集剤、例えばReopro（Centocor社のAbciximab）、Integrilin（Shering-Plough社のCeptifibatide）、あるいはAgrastat（Merck社のTirofiban）などの存在によって妨げられない故である。
【００２５】
抗ＣＤ４２ｂ ＭＡＢ は、例えば抗体ＳＺ２によって代表される。この抗体は、Beckman Coul-ter/Immunotech社から入手することができる（参照：IMO 409）。
アネキシンＶは、市販品として入手できる。例えば、Bender社が販売している（参照：BMS 306 FI）。
その他の物質で生体膜リン脂質に特異的なマーカーとして使用できるものは、例えば、抗ホスファチジルセリン抗体（文献１４）に記載されているＢＡ３Ｂ５Ｃ４抗体や３ＳＢ９ｂ抗体など）、あるいはFrance Biochemが頒布しているＡｂ−１抗体（参照：Oncogene Research Product のAM31）等である。
サンプルは、採取された全血にCTAD（クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール）、クエン酸ナトリウム又はEDTAを加えたものが良い。血漿を用いることもできるが、この種のサンプルは調製のための前処理を必要とするために、好んで使用されることはない。
【００２６】
第２の要件によれば、本発明は前述のモノ試薬を含み、血液サンプル中のＰＭＰを検出し定量するために使用すべく意図された診断キットに関する。
【００２７】
それ故、該診断キットは、下記の成分を含むのが良い：
− 血小板膜構造に特異的な集団１のＭＡＢ、又はアネキシンＶ、又は膜のリン脂質に特異的なその他のマーカーを、蛍光色素１で標識したものを含む試薬１ａ、
− 血小板膜構造に特異的な集団２のＭＡＢを蛍光色素２（この蛍光色素２は、蛍光色素１とは異なるものである）で標識したものを含む試薬１ｂ、
− 下記の成分を含む試薬２：
・ ＰＭＰのための分析ウィンドウを設定するための、蛍光色素１又は２、もしくはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されているビーズの一集団、
・ 標識されていなくても良く、あるいは蛍光色素１又は２、もしくはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されていても良い計数ビーズの一集団、
・ 好ましくは蛍光色素１で標識された、２レベルの２つの部分集団ビーズを含む閾値ビーズの一集団、
・ 好ましくは蛍光色素２で標識された、２レベルの２つの部分集団ビーズを含む閾値ビーズの一集団、及び、好ましくは、
− 希釈用の緩衝液から成る試薬３。
試薬１、２及び３は混合されていることが好ましい。
【００２８】
有利な一形態では、試薬１ａはアネキシンＶを含む。この場合には、希釈用の緩衝液３は、例えばＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ／ＣａＣｌ２ 混合物を含むカルシウム緩衝液である。その理由は、アネキシンＶとリン脂質との結合は、カルシウムに依存する故である（文献１５）。この場合、サンプルをＥＤＴＡで処理することは、無論避けねばならない。
【００２９】
試薬１ｂは特異性の異なる複数ＭＡＢの混合物を構成することが有利であり、好ましくは抗ＣＤ６１と抗ＣＤ４２ｂの混合物が良い。
更に具体的には、試薬１ｂは、Ｐ１８と、４Ｆ８（抗ＣＤ６１）と、ＳＺ２（抗ＣＤ４２ｂ）とを含むＭＡＢ混合物であることが好ましい。
【００３０】
蛍光色素１としてはＦＩＴＣが、また蛍光色素２としてはＰＥが、好ましく使用される。
【００３１】
良好な保存性を確保するために、キットの成分をなすすべての試薬は、0.09％（0.09 g/l）のアジ化ナトリウムを含んでいても良い。
【００３２】
もう一つの付加的要件によれば、本発明の主題の一つは、ＰＭＰの検出と定量のための、下記のステップを含むことを特徴とする方法である：
ａ）血液サンプルを上に定義したモノ試薬に接触せしめ、これらをインキュベートして、該ＰＭＰの二重色素標識を行う操作、及び
ｂ）二重標識された微小粒子(events)を、サイトメトリーによってに分析する操作。
【００３３】
最後に、本発明は、血栓症前駆状態(prothrombotic condision) を検出し、監視するための方法に上述のモノ試薬、もしくは該モノ試薬を含む診断キットを使用することを案内するものである。
【００３４】
本発明の関連で使用されるサイトメトリー分析法の原理を、以下に説明する。
【００３５】
サイトメトリー分析：
【００３６】
機器の製造元が提供する操作説明書を参照し、細胞計測値の読み取り方に関する指示を得ること。分析前に、ボルテックスミキサを使用してチューブ［の内容物］を均一に混合する。
プロトコルを実行するためには、下記のものが必要である：
− ＦＳ×ＳＳサイトグラムが一つ
− ＦＬ１ ＬＯＧ ヒストグラムが二つ。一つはＦＳ×ＳＳサイトグラム（セッティングビーズＡについての）によってゲーティングされたもの、もう一つはＦＳ×ＳＳサイトグラム（計数ビーズＢについての）によってゲーティングされたもの
− ＦＬ１ ＬＯＧ／ＦＬ２ ＬＯＧサイトグラムが二つ。一方のサイトグラムは閾値ビーズ（Ｃ及びＤ）にゲーティングされ、他方はビーズＡ＋ＰＭＰにゲーティングされたものである。
【００３７】
ＦＳ ＬＯＧ×ＳＳ ＬＯＧサイトグラムを作成する。異物混入の可能性（機器の背景ノイズ）を消去するために、識別のための閾値(discriminating threshold)を設定する。種々のビーズ集団の周囲に下記の３個の分析ウィンドウを描く：
− 0.8μｍセッティングビーズのためのウィンドウＲ１
− ５〜１０μｍ計数ビーズのためのウィンドウＲ２
− ３μｍ閾値ビーズのためのウィンドウＲ３。
【００３８】
ＦＬ１ ＬＯＧ ヒストグラムを二つ作成する。一つはセッティングビーズに関するもの（ウィンドウＲ１でゲーティングする）、もう一つは計数ビーズに関するもの（ウィンドウＲ２でゲーティングする）である。
【００３９】
ＦＬ１ ＬＯＧ／ＦＬ２ ＬＯＧサイトグラムを二つ作成する。一方のサイトグラムは閾値ビーズＣ及び／又はＤに関するもの（ウィンドウＲ３でゲーティングする）、もう一方はＰＭＰに関するもの（ウィンドウＲ１でゲーティングする）である。
【００４０】
分析条件を最適とするために、光電子増倍管ＦＬ１及びＦＬ２の電圧を、高い方の閾値ビーズ（Ｃ又はＤ）が、それに対応するＦＬ１又はＦＬ２の４番目の１０進目盛の始めに設定されるように調節する。
閾値ビーズ（Ｃ及びＤ）の補償をセットアップする。
【００４１】
ＦＬ２ 補償のセットアップ
“Ｒ３”分析ウィンドウでゲーティングされたビーズＤのＦＬ１ ＬＯＧ/ＦＬ２ ＬＯＧ サイトグラム上の、上方ビーズと下方ビーズのそれぞれに対応するクラウド上に、２個のウィンドウ（Ｒ４及びＲ５）を設ける。ＦＬ２ ＬＯＧ 平均蛍光強度がＲ４及びＲ５ウィンドウで等しい値となるまでＦＬ２の蛍光を補償（ＦＬ２ −ｘ％ ＦＬ１）する。
【００４２】
ＦＬ１ 補償のセットアップ
以後のプロトコル実行においては、これまでに設定されているＦＬ１ ＬＯＧ 及びＦＬ２ ＬＯＧ の蛍光セッティング（ＦＬ１ならびにＦＬ２光電子倍増管、ＰＭＴ、電圧）は変更しない。
手順は上に述べたものと同一である。ビーズＣの”Ｒ３”分析ウィンドウでゲーティングされたＦＬ１ ＬＯＧ／ＦＬ２ ＬＯＧサイトグラム上の、上方ビーズと下方ビーズのそれぞれに対応するクラウド上に、２個のウィンドウ（Ｒ６及びＲ７）を設ける。Ｒ６及びＲ７ウィンドウのＦＬ１ ＬＯＧ ＭＦＩが等しい値となるまでＦＬ１の蛍光を補償（ＦＬ１ −ｘ％ ＦＬ２）する。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
【００４４】
実施例 Ｎｏ．１： 本発明におけるモノ試薬の閾値ビーズの検討
【００４５】
以下に例示するモノ試薬は、ＰＭＰの、アネキシンＶ−ＦＩＴＣならびにＣＤ４１−ＰＥによる二重標識に基づくものである。
【００４６】
１．１ 閾値ビーズの調製
【００４７】
閾値ビーズを、言及された血液要素とは反応しないネズミの免疫グロブリンＧ（murine ＩｇＧ ）の種々異なる量でコーティングされた粒径３μｍのポリスチレンビーズから調製した。ネズミＩｇＧの負荷量は、この閾値ビーズに求められる蛍光強度のレベルに応じて選定される。ビーズを、下記の何れかに相当する抗ネズミＩｇＧ試薬に接触させることにより、蛍光標識する。
− ＦＩＴＣで標識したヒツジ F(ab')2 抗マウスＩｇＧ(H＋L)、human absorbed
− ＦＩＴＣで標識したヤギ Fab 抗マウスＩｇＧ(H＋L)、human absorbed
− ＰＥで標識したヒツジ F(ab')2 抗マウスＩｇＧ(H＋L)，human absorbed
− ＰＥで標識したヤギ Fab 抗マウスＩｇＧ(H＋L)、human absorbed
【００４８】
ａ．ＩｇＧでコーティングされたビーズの調製
【００４９】
ビーズのバッチを選択し、標識されていない血小板の集団に比べてシフトされた（例えばビーズの平均蛍光［強度］が血小板の平均蛍光［強度］の１０倍の大きさになるように）平均蛍光強度が得られるようにする。
【００５０】
原 料
− ＭＡＢ Sendo-3（抗−ＣＤ１４６、クローンＦ４３９−Ｅ１０）、言及されている血液要素と反応しないもの（岸本、菊谷等による白血球型別VI）
− Ｌ３００ ビーズ（Estapor）
【００５１】
【表１】
【００５２】
方 法
緩衝液の調製
１リットルのＰＢＳ［溶液］を調製し、500 mlの濾過システムを用い、0.22μｍのメンブランフィルタを通して濾過する。
１リットルのＰＢＳ、１％ＰＦＡ、0.09％アジ化ナトリウム［溶液］を調製する。
１リットルのＰＢＳ ＢＡ［溶液］を調製し、500 mlの濾過システムを用い、0.22μｍのメンブランフィルタを通して濾過する。
注意：緩衝液はすべて、使用前に0.22μｍのメンブランフィルタを通して濾過すること。
【００５３】
カップリング試薬の調製
ａ）ＩｇＧ1s の希釈
ビーズへの負荷の種々レベルは、コーティング溶液の ＩｇＧ1 濃度を変えることによって得られる。
１．５ｍｇ／ｍｌのSendo-3原液の容器１個分(aliquot)を解凍する。
２．Sendo-3 の500μg/ml溶液（原液の10倍希釈）を、次のようにして調製する：
− ＣＭＦ用試験管に、５mg/mlのSendo-3原液100μｌを取る。
− 同じ試験管に、ＰＢＳ溶液 900μｌ を加えて希釈する。
３．Sendo-3 の100μg/ml溶液（500μg/ml溶液の５倍希釈）を、次のようにして調製する：
− Sendo-3 の500μg/ml溶液200μｌを、ＣＭＦ用試験管に取る。
− この同じ試験管に、ＰＢＳ溶液800μｌを加えて希釈する。
４．表２に示すように、２種類のコーティング溶液を調製する。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ｂ）カップリング前のミクロスフェアの調製
一般的なミクロスフェア洗浄プロトコル
洗浄と緩衝液の交換は、すべて下記のように行われる：
１．ビーズを3000回転で８分間（重力の1890倍、8160ロータ使用）遠心分離し、ブレーキをかける。
２．水流ポンプ (liquid jet vacuum pump) を用いて、上澄み液を除去する。
３．ピペットで緩衝液を加え、再懸濁させる。
４．ペレット状の沈殿物を再懸濁させるために、充分に振り混ぜる。
【００５６】
カップリング前のビーズの洗浄
１．ビーズの10％懸濁液（ミクロスフェア約4,106個／μlであることが確認されている）を6 ml取る。
２．懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去する。
３．ペレット状の沈殿物を7.5mlのＰＢＳ溶液で再懸濁させる。
４．懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去する。
５．ペレット状の沈殿物を６mlのＰＢＳ溶液で再懸濁させる。
【００５７】
カップリングのプロトコル
ａ．洗浄済みのミクロスフェアが入っている試験管を振り混ぜる。
ｂ．コーティング溶液が入っている試験管を振り混ぜる。
ｃ．コーティング溶液が入っている試験管をボルテックスミキサ上で連続的に振り混ぜる。洗浄済みのミクロスフェア１mlを、１ml「ジルソン(Gilson)」を用いて手早く、一度に、［コーティング］溶液の中心部に垂直に加える。
ｄ．［コーティング溶液、ミクロスフェア混合物の］試験管に栓を施す。
ｅ．［栓を施した］試験管を＋２−８℃のロータリーミキサに装着する。
ｆ．操作段階ｂからｅまでを、他の複数のコーティング溶液で繰り返す。
ｇ．溶液を、混合しながら１晩インキュベートする。
ｈ．飽和用緩衝液（２ｇのＢＳＡ A7030を50mlのＰＢＳ溶液と混合）を調製し、0.22μｍのフィルタを通して濾過する。
ｉ．100mlの固定用緩衝液を、シリンジフィルタを用い、0.22μmのメンブランフィルタを通して濾過する。
ｊ．遠心分離した後、上澄み液を除去する（一般的なミクロスフェア洗浄のプロトコルを参照）。
ｋ．ペレット状の沈殿物に飽和用緩衝液５mlを加え、振り混ぜる。
ｌ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｍ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ溶液10mlを加え、振り混ぜる。
ｎ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｏ．ペレット状の沈殿物に固定用緩衝液10 mlを加え、振り混ぜる。
ｐ．混合物を、室温で混合しながら、10分間インキュベートする。
ｑ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｒ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ−ＢＡ溶液10mlを加え、振り混ぜる。
ｓ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｔ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ−ＢＡ溶液10mlを加え、振り混ぜる。
ｕ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｖ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ−ＢＡ溶液7.5mlを加え、振り混ぜる。
【００５８】
処理を終えた個々の懸濁液（ミクロスフェア約500,000個／μlを含む）を、＋２−８℃で保存する。
【００５９】
ｂ．ＦＩＴＣ又はＰＥと結合した F(ab')2s の使用による蛍光閾値ビーズの調製
【００６０】
原 料
− ＦＩＴＣ（Silenus、参照記号DDAF）とカップリングせしめた抗マウス・ヒツジ免疫グロブリン F(ab')2
− ＰＥ（Silenus、参照記号DDAPE）とカップリングせしめた抗マウス・ヒツジ免疫グロブリン F(ab')2
【００６１】
方 法
１．Sendo-3 でコーティングしたL300ビーズ (Estapor)（300,000個／μｌのミクロスフェアを含む）［懸濁液］2.5 ml をピペットで取る。
ＦＩＴＣ標識ビーズの場合、Sendo-3 濃度は 15μg/ml
ＰＥ標識ビーズの場合、Sendo-3 濃度は 5μg/ml
２．ビーズ［懸濁液］を 3,000rpmで８分間遠心分離し、上澄み液を除去する。
３．［ペレット状に沈殿した］ビーズに、1× PBS BA緩衝液 500 μlを加える。
４．それぞれ1×ＰＢＳ ＢＡ緩衝液で100倍に希釈したＤＤＡ又はＤＤＡＰＥ 12.5mlを上記のビーズ調製液に加え、混合物を均一に混合する。
５．混合物をロータリーミキサで混合しながら、室温で１時間インキュベートする。
６．次のようにして2回の洗浄を行う：
１×ＰＢＳ ＢＡ緩衝液２５mlを加える。
混合物を、3,000 rpmで８分間遠心分離する。
上澄み液を除去する。
７．沈殿したビーズのペレットに濃度100μg/ml のマウス γ-グロブリン溶液（Jackson、#015-000-002）を加え、ＤＤＡＦ及びＤＤＡＰＥ試薬の未結合抗マウスＩｇＧサイトを中和する。
８．混合物をロータリーミキサで混合しながら、室温で１時間インキュベートする。
９．上記６項の手順で１回の洗浄を行う。
１０．沈殿したビーズのペレットに、1×ＰＢＳ ＢＡ緩衝液2.5mlを加える。
【００６２】
ｃ．ＦＩＴＣ又はＰＥと結合した Fabs の使用による閾値ビーズの調製
【００６３】
原 料
− ＦＩＴＦとカップリングせしめた抗マウス・ヤギ免疫グロブリン Fab（Protos、参照番号#341）
− ＰＥとカップリングせしめた抗マウス・ヤギ免疫グロブリン Fab（Protos、参照記号 #441）
【００６４】
方 法
上記と同じであるが、操作段階７、８及び９は除く。
【００６５】
１．２ サイトメトリー分析
【００６６】
調製した２種のＦＩＴＣ標識閾値ビーズ及びＰＥ標識閾値ビーズを、単独でＰＢＳ−ＢＡ緩衝液中で、もしくは本発明のモノ試薬を構成する他のすべての試薬（ＦＩＴＣ又はＰＥとカップリングせしめたＭＡＢ、及び粒径0.85μｍのセッティングビーズＡ）の存在下で試験した。散乱パラメータ（本明細書中では、前方角散乱 forward-angle scatter をＦＳ、側方角散乱side-angle scatter をＳＳと称する）は、弁別回路をＳＳにセットして対数スケールで分析した。
【００６７】
結果を図１に示す。図中：
− 図１ａ）は、ＰＢＳ ＢＡ緩衝液中の閾値ビーズの分析を示し；
− 図１ｂ）は、モノ試薬中にビーズＡを用いた閾値ビーズの分析を示す。
これらの図において、Ｒ１ウィンドウは、３μｍのＦＩＴＣ標識閾値ビーズならびにＰＥ標識閾値ビーズに対応し、Ｒ３ウィンドウは二重散乱ＰＭＰ分析ウィンドウに対応し、ビーズＤはＦＩＴＣ標識閾値ウィンドウに対応し、ビーズＣはＰＥ標識閾値ウィンドウに対応する。
【００６８】
１．３ 結 論
【００６９】
上述のように、ＦＩＴＣ及びＰＥで標識された３μｍビーズの混合物を使用して二重標識された要素のための分析ウィンドウ（本明細書中ではＱ２と称する）を設定することが可能である。この例では、FL2 Log の閾値（垂直閾値）をビーズＤの平均値のレベルに選定し、FL1 Log の閾値（水平閾値）を、ビーズＣの平均値の1/3.5に等しくなるように選定した。
【００７０】
試験を実施するためのモノ試薬として求められる種々のカテゴリーのビーズ（測定領域Ｑ２を設定するための３μｍＦＩＴＣ標識閾値ビーズとＰＥ標識閾値ビーズ、及びＰＭＰのためのＲ３分析ウィンドウを設定するための 0.85μｍ ＦＩＴＣ標識閾値ビーズ）を必要に応じて組み合わせた場合の機能性を例示する。
【００７１】
実施例 Ｎｏ．２： 本発明のモノ試薬の試験
【００７２】
２．１ 原 料
【００７３】
−ＣＤ６１ ： ＦＩＴＣ標識Ｐ１８（当該技術に通暁する者には周知の標準的な手順によって精製され、標識されたもの。試薬は、0.1μmフィルタを通して濾過）。P18（McGregor JL、Thromb. Haemost。1987、58、507）。
−ＣＤ４１ａ： ＰＥ標識Ｐ２（参照番号 IM1416、Immunotech）
Ｐ２（参照番号 IM0145、Immunotech）
【００７４】
− ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（参照番号 BMS306FI/a、Bender Medsystems） − 0.85μｍセッティングビーズ(Ａ)（カタログ番号 VFP 08525、アビジンでコーティングされた黄色品、Spherotec）
【００７５】
− ＦＩＴＣ標識F(ab')2 及び ＰＥ標識F(ab')2と結合した閾値ビーズ（Ｃ及びＤ）、上に述べたもの
【００７６】
− 1×塩化カルシウム緩衝液（10mMのＨＥＰＥＳ、140mMのＮａＣｌ、2.5mMのＣａＣｌ２ を含むもの）
【００７７】
− 塩化カルシウム／ＥＤＴＡ緩衝液（10mMのＨＥＰＥＳ、140mMのＮａＣｌ、2.5mMのＣａＣｌ２、6.2mMのＥＤＴＡを含むもの。pH7.4）
【００７８】
２．２ プロトコル
【００７９】
１．クエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡを加え、1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液で10倍に希釈した全血30μｌをピペットで取る。
２．カップリングしていないＭＡＢ又は緩衝液（1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液、又は塩化カルシウム緩衝液、又は塩化カルシウム／ＥＤＴＡ緩衝液）10μlをピペットで取る。
３．室温で10分間、インキュベーションを行う。
４．ＦＩＴＣとカップリングせしめたＭＡＢ、もしくはＦＩＴＣとカップリングせしめたアネキシンＶを10μl加える。
５．ＰＥとカップリングせしめたＭａｂ 10μlをピペットで取る。
６．ＦＩＴＣ標識閾値ビーズ（ミクロスフェア濃度200,000／μｌ）５μlをピペットで取る。
７．ＰＥ標識閾値ビーズ（ミクロスフェア濃度200,000／μｌ）５μlをピペットで取る。
８．粒径0.85μｍの Spherotec ビーズ［原液］を1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液で20倍に希釈した懸濁液５μｌをピペットで取る。
９．室温で20分間、インキュベーションを行う。
１０．緩衝液（1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液、塩化カルシウム緩衝液、又は塩化カルシウム／ＥＤＴＡ緩衝液）１mlを加える。
１１．サイトメトリー分析を行う：分析時間は２分間、流速はスローとする。
【００８０】
補 注：
１．モノ試薬を使用するこれらの試験の関連において、閾値ビーズはＰＭＰをカウントするためのビーズとして働く。
２．蛍光色素にカップリングせしめたＭＡＢの定着が阻害される場合には、血液サンプルをカップリングされていないＭＡＢと共に常温で10分間プレインキュベートする前処理を行う。
【００８１】
２．３ 操作条件
【００８２】
【表３】
【００８３】
試験Ａ
粒径が0.85μｍ以下であり、ＣＤ６１＋／ＣＤ４１ａ＋の事象に対応するＰＭＰならびに血小板をカウントすることが可能な条件。
【００８４】
試験Ｂ
粒径が0.85μｍ以下であり、アネキシンＶ＋／ＣＤ４１ａ＋の事象に対応する活性化されたＰＭＰ及び／又は活性化された血小板をカウントすることが可能な条件。血液中の血小板由来要素であって、粒径が0.85μｍ以下であり、活性化された（血小板及びＰＭＰの外部細胞膜上にアネキシンＶによって明らかにされるホスファチジルセリン残基が存在するために）表現型を有するものをカウントすることが可能なのは、この試験のみである。
【００８５】
試験Ｃ、試験Ｄ及び試験Ｅ
それぞれＣＤ４１ａ、ＣＤ６１及びアネキシンＶ試薬の特異性を確立することが可能な条件。
【００８６】
２．４ 全血中のモノ試薬の試験
【００８７】
ａ）全血中ＰＭＰの二重散乱分析を行うためのＲ３ウィンドウ設定の原理
【００８８】
以下で説明する例は、全血中のＰＭＰの二重散乱分析について説明するものであり、血液サンプルは、試験Ａ（ＣＤ６１−ＦＩＴＣ／ＣＤ４１−ＰＥ）に相当する。
【００８９】
サイトメトリー分析の種々の操作段階は、図２ａ、図２ｂに示してある。
【００９０】
ＰＭＰ分析ウィンドウＲ３は、塊中にＦＩＴＣの蛍光を持つ0.85μｍセッティングビーズ（ビーズＡ）の一重状態(singlets)を用いてゲーティングする。まず最初に、大きな二重散乱ウィンドウＲ３を、これらのビーズの周囲にゲーティングする（段階＃１）。Ｒ３でゲーティングされたＦＬ１−ＬＯＧ／ＦＬ２−ＬＯＧサイトグラムによって、ウィンドウＲ２を持つＦＬ１中にこれらのセッティングビーズを確認することが可能になる（段階＃２）。次いでウィンドウＲ３を二重散乱に定義し直し、このビーズＡの一重状態集団についてＦＳ−ＬＯＧパラメータを測定する（段階＃３）。
【００９１】
かくして、血小板由来微小粒子分析用のウィンドウＲ３が、下記の基準に従って二重散乱に定義され得る（段階＃４）：
− ＦＳ−ＬＯＧの上限：先の段階で測定されたビーズＡの一重状態集団のＦＳ−ＬＯＧパラメータの平均値に等しい。
− ＦＳ−ＬＯＧの下限：ＦＳ−ＬＯＧパラメータの最初のチャネルをとらない。
− ＳＳ−ＬＯＧの上限：ビーズＡの一重状態クラウドに対して設定。
− ＳＳ−ＬＯＧの下限：ＳＳ−ＬＯＧパラメータの弁別回路を最小値に設定する。
【００９２】
最後に、サンプル（全血＋モノ試薬）の二重散乱分析を、種々異なったサイトメトリー分析ウィンドウを用いて実行することができる（段階＃５）。
【００９３】
ｂ） サンプルの分析
【００９４】
本発明のモノ試薬の機能性と、該試薬の成分の特異性についての試験を、19点の全血サンプルについて実施した。サンプルの11点にはＥＤＴＡを、7点にはクエン酸ナトリウムを加えた。
上に記述したプロトコルに従い、10倍に希釈した血液サンプルを用いて、試験Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを実施した。
【００９５】
サイトメトリー分析の結果を、図３ａ，図３ｂに示す。
【００９６】
定量的な結果は、全血μl当りのＰＭＰ数(number of events)で表す。
【００９７】
分析は、ウィンドウＱ２内にカウントされるエレメントを用いて行う。
【００９８】
− 抗血液凝固剤がＥＤＴＡの場合：
【００９９】
【表４】
【０１００】
− 抗血液凝固剤がクエン酸ナトリウムの場合：
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
− 阻害試験（抗血液凝固剤はＥＤＴＡ）
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
参考文献
１． プロトロンビナーゼ複合体の形成 (assembly) は、血小板原形質膜の小胞形成に関連している。スコット症候集団における研究：血小板のプロ凝血素活性の孤立欠損。 P.J. Sims, T. Wiedmer, C.T. Esmon, H.J. Weiss and J.J. Shattil. J. Biol. Chem., vol. 264, No. 29, 17049-17057, 1989.
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【図面の簡単な説明】
【図１】 調製した２種のＦＩＴＣ標識閾値ビーズ及びＰＥ標識閾値ビーズの試験結果を示す説明図である。ａ図はＰＢＳ−ＢＡ緩衝液中の閾値ビーズの分析を示し、ｂ図はモノ試薬中にビーズＡを用いた閾値ビーズの分析を示す。
【図２ａ】 サイトメトリー分析の種々の操作段階を示す説明図である。
【図２ｂ】 サイトメトリー分析の種々の操作段階を示す説明図である。
【図３ａ】 サイトメトリー分析の結果を示す説明図である。
【図３ｂ】 サイトメトリー分析の結果を示す説明図である。
本発明は、二重色素標識により血小板由来微小粒子（ＰＭＰ）を検出し、定量するためのモノ試薬(monoreagent)に関し、またそれを含む診断キットに関する。
【０００２】
活性化された血小板は、血小板由来微小粒子(ＰＭＰ)と呼ばれる小胞を放出することが知られている。直径の小さな（とは言っても、おそらく0.1〜0.8μｍの範囲であるが）これらの粒子は、ある種の刺激（トロンビン、コラーゲン、Ｃ５ｂ９等）の後に、血小板原形質膜の小胞化の結果として生ずる。それらにはプロトロンビン活性及びプロ凝血素活性によって、ＰＭＰは生体内で重要な役割を演じているように見える。
ＰＭＰは数種類の血小板レセプタ（GpIb、GpIIb/IIIa等）を発現し、数種類の血小板リガンド（フィブリノゲン、フィブロネクチン、コラーゲン、ｖＷＦ、ビトロネクチン等）を結合させる能力があり、血管の開口部における内皮下基質に固着させる能力がある。高い血行中ＰＭＰレベルは、多くの病理、例えば不安定狭心症(unstable angina)、心筋梗塞(myocardial infarction)、冠動脈造影(coronary angiography)、真性糖尿病(diabetes mellitus)、心肺シャント(cardiopulmonary shunt)、発作性夜間血色素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinurea)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、ＨＩＴ（ヘパリンに誘発された血小板減少症）、特発性血小板減少性紫斑病(idiopathic thrombocytopenic purpura) 等で観察されている。逆に、ある種の病変、例えばスコット症候集団のようなものは、血行中ＰＭＰレベルの欠乏と関連している可能性がある。
それ故、これらＰＭＰの検出とカウントは、種々の病理過程における血栓性前駆状態の重篤度の検出及び評価における重要な尺度であるように見える。
【０００３】
血小板由来微小粒子の形成に関連する現象と、該微小粒子を検出することの価値は、文献に広く記述されている（文献１−５参照）。
【０００４】
それ故に、血小板由来微小粒子の分離及び／又は定量のために、例えば濾過（文献６参照）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）（文献７参照）、また、特に流動細胞光度測定法（フローサイトメトリー）（文献８−１１参照）のような技術に基づく種々のアプローチが提案されている。
【０００５】
フローサイトメトリーの原理、及び細胞や細胞粒子の部分集団を識別し定量する方法としてのその利点は、今日では当該技術に精通する者にはよく知られている。
この方法は、血液中の活性化された血小板を検出したり、機能検定法（文献１２参照）を用いて血小板由来のプロ凝血素性微小粒子を検出するために、既に使用されている。
しかしながら、実施された研究の大部分は単色の蛍光ラベリング、及び／又は計数ビーズを使用しており、これらの手法の有効性は、完全に標準化された態様でＰＭＰの検出と定量のための試験を実施するための工業化可能な方法を予見するには、基準合わせ（キャリブレーション）の点で不十分なものであった。
【０００６】
本発明は、ワンステップで、かつ標準化された態様で、前処理なしに血液サンプル中の血小板由来微小粒子を特異的に検出しカウントすることを可能ならしめる新規な解決法を提供することにより、以前から存在している複数の方法に改良を導入するものである。
この目的に添って、特別なモノ試薬と、複数集団の基準化されたビーズならびにＰＭＰの二重標識法の組み合わせが開発された。そして、この試薬は、１）ある粒径規準に従って、ＰＭＰの最適な分離を行うこと、２）特異的なラベリングによるＰＭＰの特性付け、及び３）計数ビーズを用いたＰＭＰの計数を、同時に可能ならしめる。従って、これらＰＭＰがきわめて少量しか存在しない場合でも、サンプル中のＰＭＰを特異的に検出し、高い信頼性で計数する手段が提供される。
【０００７】
本発明の主題は、それ故、血液サンプル中の血小板由来微小粒子（ＰＭＰ）をフローサイトメトリーによって検出及び定量するためのモノ試薬であり、該試薬は下記の構成要素を含むものである：
【０００８】
ａ）二重標識のための下記成分を含む試薬１：
− アネキシンＶ、又は生体膜リン脂質に特異的な他のマーカーの何れか一つと、蛍光色素１を組み合わせたもの、
− 又は血小板膜構造に指向する集団１のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を蛍光色素１で標識したもの（試薬１ａ）、及び
【０００９】
血小板膜構造に指向する集団２のＭＡＢを蛍光色素２で標識したもの（試薬１ｂ）（前記蛍光色素２は、蛍光色素１とは異なったものである）、及び
【００１０】
ｂ）下記成分を含むミクロスフェア混合物から成る試薬２：
− 蛍光色素１又は２の何れか一方、或いはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されており、粒径（光散乱のパラメータ）に関するＰＭＰの分析範囲を規定するために使用され、且つＰＭＰの区別を可能にするミクロスフェアＡの一集団（セッティングビーズ）、
− 標識されていないか、蛍光色素１又は２の何れか一方、或いはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されており、その濃度が既知であって、微小粒子を計数するために使用されるミクロスフェアＢの一集団（計数ビーズ）、
− 蛍光色素１のみで標識されており、蛍光色素１の蛍光パラメータに関して、蛍光色素１で標識されたＭＡＢ１又はアネキシンＶ、又は生体膜のリン脂質に特異的な他のマーカーが結合している微小粒子の分析範囲の限界を定める最小強度閾値を定義するために使用されるミクロスフェアＣの一集団（閾値ビーズ）、及び
− 粒径がＣと等しく、かつ蛍光色素２のみで標識されており、蛍光色素２の蛍光パラメータに関して、蛍光色素２で標識されたＭＡＢ２が結合している微小粒子の分析範囲の限界を定める最小強度閾値を定義するために使用されるミクロスフェアＤの一集団（閾値ビーズ）。
【００１１】
それ故、本発明によるモノ試薬は、下記のような複数の機能を持つ：
− 微小粒子を色素で二重標識し、血小板由来微小粒子と、起源を異にする等価物の最適な区別ができるようにすること、
− 分析対象たる微小粒子と、可能な背景ノイズに起因する他の粒子や断片とを識別するための閾値を標準化すること、
− 内部標準ビーズの参照計数によって、識別された標識付き血小板由来微小粒子の計数を標準化すること。
【００１２】
好ましくは、閾値ビーズのＣ集団及びＤ集団のそれぞれは、閾値の設定と補償値の調整により分析の最適標準化を行うために、蛍光レベルが１と２との２水準である２つの部分集団から成っている。
【００１３】
種々の集団のビーズは、この種の粒子の製造に一般に使用されている多種多様な材料から得られる。それらは、例えば、多糖類、スチレン重合物、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ビニルポリマー類、ポリスチレン及び芳香族原子団を含む重合物のような、有機重合物である。好ましく用いられる材料は、ポリスチレンである。しかしながら、使用されるビーズの種々の集団の間で、材料に差異があっても差し支えない。
【００１４】
数種類の蛍光色素は、市販品として入手可能である。フィコエリトリン(ＰＥ)又はフルオレッセイン塩類、例えばフルオレッセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を用いるのが好ましい。
【００１５】
ＰＭＰをカウントする役割の計数ビーズは、粒径５μｍ以上であり、計数（サイトメトリー）の際に、計数ビーズのクラウドが、細胞から、また他のビーズ集団（閾値ビーズ等）から明瞭に区別されることが有利である。好ましくは、計数ビーズの粒径は５〜１０μｍである。
【００１６】
これらの計数ビーズは、標識されていなくても良く、塊の内部か又は表面が標識されていても良い。好ましくは、塊の内部が、閾値ビーズの標識に用いられる蛍光色素１又は２の何れか一方、若しくはその一方に近似したスペクトルを有する他の蛍光色素で標識されている。
【００１７】
セッティングビーズは、粒径に応じてＰＭＰのための分析ウィンドウの設定を可能にする。粒径は 0.5〜１μｍであることが好都合である。セッティングビーズは、塊の内部もしくは表面が、蛍光色素１又は２の何れか一方、もしくはその一方に近似したスペクトルを有する他の蛍光色素で標識されている。
【００１８】
閾値ビーズの役割は、ＰＭＰのための分析ウィンドウを設定することによって分析を標準化することと、補償の調節を可能にすることである。粒径は１〜５μｍ、好ましくは３μｍである。
【００１９】
閾値ビーズにおけるＣ及びＤの２集団は、蛍光色素１又は２の何れか一方で標識された２集団から成っており、何れも同じ性質を持ったビーズであるが蛍光のレベルが異なる二つのカテゴリーから成っていることが好都合である。
これらの標準液(calibrant)は、ＭＥＳＦ（可溶性蛍光色素のモル当量−文献１３）として、標準物質（Quantum 24 フルオレッセイン−コードRF 824；Quantum PER-フィコエリトリン−コードRF 827、FCSC Europe）を用いて標定すると良い。
【００２０】
閾値ビーズの強度は、このようにして、ＰＭＰの強度最小値と、他の起源に由来する微小粒子や粒径が近似した混入異物（塵埃、細胞の断片、等々）の強度最大値の間の限界値であるように設定される。
蛍光色素１及び蛍光色素２、好ましくはＦＩＴＣ及びＰＥの閾値は、他の混入異物と比較してＰＭＰの最適な識別ができるように、正常な個人と病的な個人の集団について、市販の標準キャリブラントを使用して決定される。
こうして定義される閾値が、モノ試薬の共同閾値ビーズ（Ｃ，Ｄ）の数値を与える。
【００２１】
集団１及び集団２のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）は、下記の特異性から選ばれる血小板膜構造に指向しているのが好ましい：抗原ＣＤ６１、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、プロテインＳ、及びプロトロンビン。
これら集団１及び２は、単一種のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）、特異性は同一であるが異なったエピトープ（抗原決定基）を指向する複数種のＭＡＢ、あるいは血小板特異性を異にする複数種のＭＡＢの何れによっても代表され得る。
【００２２】
好ましい変法の一つでは、本発明のモノ試薬の試薬１は、蛍光色素１で標識されたアネキシンＶ（又は膜のリン脂質に特異的な他のマーカー）（試薬１ａ）、及び蛍光色素２で標識された集団２のＭＡＢ（試薬１ｂ）から成る。
【００２３】
好ましくは、特異性を異にする複数種のＭＡＢを含む集団２のＭＡＢ、更に好ましくは、抗ＣＤ６１ ＭＡＢ及び抗ＣＤ４２ｂ ＭＡＢが用いられる。好ましい試薬の一例は、ＰＥで標識した抗ＣＤ６１並びに抗ＣＤ４２ｂ ＭＡＢ、及びＦＩＴＣで標識したアネキシンＶから成る。
【００２４】
有利な形態の一つによれば、抗ＣＤ６１抗体は、Ｐ１８及び４Ｆ８ハイブリドーマによって産生されるものであり、これらのハイブリドーマは、ブダペスト協定に従って、それぞれ０６．２６．９７及び０６．０２．９８付で、ＬＭＢＰ１６２ＣＢ（Ｐ１８）及びＬＭＢＰ１６６７ＣＢ（４Ｆ８）の番号の下にＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（ベルギー微生物保存機関）に寄託されている。
これら２種のＭＡＢの組み合わせが特に有利であるのは、それらの間に立体遺伝子(steric gene)がなく、それらとＰＭＰとの結合が、市販のGPIIb/IIIa抗凝集剤、例えばReopro（Centocor社のAbciximab）、Integrilin（Shering-Plough社のCeptifibatide）、あるいはAgrastat（Merck社のTirofiban）などの存在によって妨げられない故である。
【００２５】
抗ＣＤ４２ｂ ＭＡＢ は、例えば抗体ＳＺ２によって代表される。この抗体は、Beckman Coul-ter/Immunotech社から入手することができる（参照：IMO 409）。
アネキシンＶは、市販品として入手できる。例えば、Bender社が販売している（参照：BMS 306 FI）。
その他の物質で生体膜リン脂質に特異的なマーカーとして使用できるものは、例えば、抗ホスファチジルセリン抗体（文献１４）に記載されているＢＡ３Ｂ５Ｃ４抗体や３ＳＢ９ｂ抗体など）、あるいはFrance Biochemが頒布しているＡｂ−１抗体（参照：Oncogene Research Product のAM31）等である。
サンプルは、採取された全血にCTAD（クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール）、クエン酸ナトリウム又はEDTAを加えたものが良い。血漿を用いることもできるが、この種のサンプルは調製のための前処理を必要とするために、好んで使用されることはない。
【００２６】
第２の要件によれば、本発明は前述のモノ試薬を含み、血液サンプル中のＰＭＰを検出し定量するために使用すべく意図された診断キットに関する。
【００２７】
それ故、該診断キットは、下記の成分を含むのが良い：
− 血小板膜構造に特異的な集団１のＭＡＢ、又はアネキシンＶ、又は膜のリン脂質に特異的なその他のマーカーを、蛍光色素１で標識したものを含む試薬１ａ、
− 血小板膜構造に特異的な集団２のＭＡＢを蛍光色素２（この蛍光色素２は、蛍光色素１とは異なるものである）で標識したものを含む試薬１ｂ、
− 下記の成分を含む試薬２：
・ ＰＭＰのための分析ウィンドウを設定するための、蛍光色素１又は２、もしくはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されているビーズの一集団、
・ 標識されていなくても良く、あるいは蛍光色素１又は２、もしくはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されていても良い計数ビーズの一集団、
・ 好ましくは蛍光色素１で標識された、２レベルの２つの部分集団ビーズを含む閾値ビーズの一集団、
・ 好ましくは蛍光色素２で標識された、２レベルの２つの部分集団ビーズを含む閾値ビーズの一集団、及び、好ましくは、
− 希釈用の緩衝液から成る試薬３。
試薬１、２及び３は混合されていることが好ましい。
【００２８】
有利な一形態では、試薬１ａはアネキシンＶを含む。この場合には、希釈用の緩衝液３は、例えばＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ／ＣａＣｌ２ 混合物を含むカルシウム緩衝液である。その理由は、アネキシンＶとリン脂質との結合は、カルシウムに依存する故である（文献１５）。この場合、サンプルをＥＤＴＡで処理することは、無論避けねばならない。
【００２９】
試薬１ｂは特異性の異なる複数ＭＡＢの混合物を構成することが有利であり、好ましくは抗ＣＤ６１と抗ＣＤ４２ｂの混合物が良い。
更に具体的には、試薬１ｂは、Ｐ１８と、４Ｆ８（抗ＣＤ６１）と、ＳＺ２（抗ＣＤ４２ｂ）とを含むＭＡＢ混合物であることが好ましい。
【００３０】
蛍光色素１としてはＦＩＴＣが、また蛍光色素２としてはＰＥが、好ましく使用される。
【００３１】
良好な保存性を確保するために、キットの成分をなすすべての試薬は、0.09％（0.09 g/l）のアジ化ナトリウムを含んでいても良い。
【００３２】
もう一つの付加的要件によれば、本発明の主題の一つは、ＰＭＰの検出と定量のための、下記のステップを含むことを特徴とする方法である：
ａ）血液サンプルを上に定義したモノ試薬に接触せしめ、これらをインキュベートして、該ＰＭＰの二重色素標識を行う操作、及び
ｂ）二重標識された微小粒子(events)を、サイトメトリーによってに分析する操作。
【００３３】
最後に、本発明は、血栓症前駆状態(prothrombotic condision) を検出し、監視するための方法に上述のモノ試薬、もしくは該モノ試薬を含む診断キットを使用することを案内するものである。
【００３４】
本発明の関連で使用されるサイトメトリー分析法の原理を、以下に説明する。
【００３５】
サイトメトリー分析：
【００３６】
機器の製造元が提供する操作説明書を参照し、細胞計測値の読み取り方に関する指示を得ること。分析前に、ボルテックスミキサを使用してチューブ［の内容物］を均一に混合する。
プロトコルを実行するためには、下記のものが必要である：
− ＦＳ×ＳＳサイトグラムが一つ
− ＦＬ１ ＬＯＧ ヒストグラムが二つ。一つはＦＳ×ＳＳサイトグラム（セッティングビーズＡについての）によってゲーティングされたもの、もう一つはＦＳ×ＳＳサイトグラム（計数ビーズＢについての）によってゲーティングされたもの
− ＦＬ１ ＬＯＧ／ＦＬ２ ＬＯＧサイトグラムが二つ。一方のサイトグラムは閾値ビーズ（Ｃ及びＤ）にゲーティングされ、他方はビーズＡ＋ＰＭＰにゲーティングされたものである。
【００３７】
ＦＳ ＬＯＧ×ＳＳ ＬＯＧサイトグラムを作成する。異物混入の可能性（機器の背景ノイズ）を消去するために、識別のための閾値(discriminating threshold)を設定する。種々のビーズ集団の周囲に下記の３個の分析ウィンドウを描く：
− 0.8μｍセッティングビーズのためのウィンドウＲ１
− ５〜１０μｍ計数ビーズのためのウィンドウＲ２
− ３μｍ閾値ビーズのためのウィンドウＲ３。
【００３８】
ＦＬ１ ＬＯＧ ヒストグラムを二つ作成する。一つはセッティングビーズに関するもの（ウィンドウＲ１でゲーティングする）、もう一つは計数ビーズに関するもの（ウィンドウＲ２でゲーティングする）である。
【００３９】
ＦＬ１ ＬＯＧ／ＦＬ２ ＬＯＧサイトグラムを二つ作成する。一方のサイトグラムは閾値ビーズＣ及び／又はＤに関するもの（ウィンドウＲ３でゲーティングする）、もう一方はＰＭＰに関するもの（ウィンドウＲ１でゲーティングする）である。
【００４０】
分析条件を最適とするために、光電子増倍管ＦＬ１及びＦＬ２の電圧を、高い方の閾値ビーズ（Ｃ又はＤ）が、それに対応するＦＬ１又はＦＬ２の４番目の１０進目盛の始めに設定されるように調節する。
閾値ビーズ（Ｃ及びＤ）の補償をセットアップする。
【００４１】
ＦＬ２ 補償のセットアップ
“Ｒ３”分析ウィンドウでゲーティングされたビーズＤのＦＬ１ ＬＯＧ/ＦＬ２ ＬＯＧ サイトグラム上の、上方ビーズと下方ビーズのそれぞれに対応するクラウド上に、２個のウィンドウ（Ｒ４及びＲ５）を設ける。ＦＬ２ ＬＯＧ 平均蛍光強度がＲ４及びＲ５ウィンドウで等しい値となるまでＦＬ２の蛍光を補償（ＦＬ２ −ｘ％ ＦＬ１）する。
【００４２】
ＦＬ１ 補償のセットアップ
以後のプロトコル実行においては、これまでに設定されているＦＬ１ ＬＯＧ 及びＦＬ２ ＬＯＧ の蛍光セッティング（ＦＬ１ならびにＦＬ２光電子倍増管、ＰＭＴ、電圧）は変更しない。
手順は上に述べたものと同一である。ビーズＣの”Ｒ３”分析ウィンドウでゲーティングされたＦＬ１ ＬＯＧ／ＦＬ２ ＬＯＧサイトグラム上の、上方ビーズと下方ビーズのそれぞれに対応するクラウド上に、２個のウィンドウ（Ｒ６及びＲ７）を設ける。Ｒ６及びＲ７ウィンドウのＦＬ１ ＬＯＧ ＭＦＩが等しい値となるまでＦＬ１の蛍光を補償（ＦＬ１ −ｘ％ ＦＬ２）する。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
【００４４】
実施例 Ｎｏ．１： 本発明におけるモノ試薬の閾値ビーズの検討
【００４５】
以下に例示するモノ試薬は、ＰＭＰの、アネキシンＶ−ＦＩＴＣならびにＣＤ４１−ＰＥによる二重標識に基づくものである。
【００４６】
１．１ 閾値ビーズの調製
【００４７】
閾値ビーズを、言及された血液要素とは反応しないネズミの免疫グロブリンＧ（murine ＩｇＧ ）の種々異なる量でコーティングされた粒径３μｍのポリスチレンビーズから調製した。ネズミＩｇＧの負荷量は、この閾値ビーズに求められる蛍光強度のレベルに応じて選定される。ビーズを、下記の何れかに相当する抗ネズミＩｇＧ試薬に接触させることにより、蛍光標識する。
− ＦＩＴＣで標識したヒツジ F(ab')2 抗マウスＩｇＧ(H＋L)、human absorbed
− ＦＩＴＣで標識したヤギ Fab 抗マウスＩｇＧ(H＋L)、human absorbed
− ＰＥで標識したヒツジ F(ab')2 抗マウスＩｇＧ(H＋L)，human absorbed
− ＰＥで標識したヤギ Fab 抗マウスＩｇＧ(H＋L)、human absorbed
【００４８】
ａ．ＩｇＧでコーティングされたビーズの調製
【００４９】
ビーズのバッチを選択し、標識されていない血小板の集団に比べてシフトされた（例えばビーズの平均蛍光［強度］が血小板の平均蛍光［強度］の１０倍の大きさになるように）平均蛍光強度が得られるようにする。
【００５０】
原 料
− ＭＡＢ Sendo-3（抗−ＣＤ１４６、クローンＦ４３９−Ｅ１０）、言及されている血液要素と反応しないもの（岸本、菊谷等による白血球型別VI）
− Ｌ３００ ビーズ（Estapor）
【００５１】
【表１】
方 法
緩衝液の調製
１リットルのＰＢＳ［溶液］を調製し、500 mlの濾過システムを用い、0.22μｍのメンブランフィルタを通して濾過する。
１リットルのＰＢＳ、１％ＰＦＡ、0.09％アジ化ナトリウム［溶液］を調製する。
１リットルのＰＢＳ ＢＡ［溶液］を調製し、500 mlの濾過システムを用い、0.22μｍのメンブランフィルタを通して濾過する。
注意：緩衝液はすべて、使用前に0.22μｍのメンブランフィルタを通して濾過すること。
【００５３】
カップリング試薬の調製
ａ）ＩｇＧ1s の希釈
ビーズへの負荷の種々レベルは、コーティング溶液の ＩｇＧ1 濃度を変えることによって得られる。
１．５ｍｇ／ｍｌのSendo-3原液の容器１個分(aliquot)を解凍する。
２．Sendo-3 の500μg/ml溶液（原液の10倍希釈）を、次のようにして調製する：
− ＣＭＦ用試験管に、５mg/mlのSendo-3原液100μｌを取る。
− 同じ試験管に、ＰＢＳ溶液 900μｌ を加えて希釈する。
３．Sendo-3 の100μg/ml溶液（500μg/ml溶液の５倍希釈）を、次のようにして調製する：
− Sendo-3 の500μg/ml溶液200μｌを、ＣＭＦ用試験管に取る。
− この同じ試験管に、ＰＢＳ溶液800μｌを加えて希釈する。
４．表２に示すように、２種類のコーティング溶液を調製する。
【００５４】
【表２】
ｂ）カップリング前のミクロスフェアの調製
一般的なミクロスフェア洗浄プロトコル
洗浄と緩衝液の交換は、すべて下記のように行われる：
１．ビーズを3000回転で８分間（重力の1890倍、8160ロータ使用）遠心分離し、ブレーキをかける。
２．水流ポンプ (liquid jet vacuum pump) を用いて、上澄み液を除去する。
３．ピペットで緩衝液を加え、再懸濁させる。
４．ペレット状の沈殿物を再懸濁させるために、充分に振り混ぜる。
【００５６】
カップリング前のビーズの洗浄
１．ビーズの10％懸濁液（ミクロスフェア約4,106個／μlであることが確認されている）を6 ml取る。
２．懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去する。
３．ペレット状の沈殿物を7.5mlのＰＢＳ溶液で再懸濁させる。
４．懸濁液を遠心分離し、上澄み液を除去する。
５．ペレット状の沈殿物を６mlのＰＢＳ溶液で再懸濁させる。
【００５７】
カップリングのプロトコル
ａ．洗浄済みのミクロスフェアが入っている試験管を振り混ぜる。
ｂ．コーティング溶液が入っている試験管を振り混ぜる。
ｃ．コーティング溶液が入っている試験管をボルテックスミキサ上で連続的に振り混ぜる。洗浄済みのミクロスフェア１mlを、１ml「ジルソン(Gilson)」を用いて手早く、一度に、［コーティング］溶液の中心部に垂直に加える。
ｄ．［コーティング溶液、ミクロスフェア混合物の］試験管に栓を施す。
ｅ．［栓を施した］試験管を＋２−８℃のロータリーミキサに装着する。
ｆ．操作段階ｂからｅまでを、他の複数のコーティング溶液で繰り返す。
ｇ．溶液を、混合しながら１晩インキュベートする。
ｈ．飽和用緩衝液（２ｇのＢＳＡ A7030を50mlのＰＢＳ溶液と混合）を調製し、0.22μｍのフィルタを通して濾過する。
ｉ．100mlの固定用緩衝液を、シリンジフィルタを用い、0.22μmのメンブランフィルタを通して濾過する。
ｊ．遠心分離した後、上澄み液を除去する（一般的なミクロスフェア洗浄のプロトコルを参照）。
ｋ．ペレット状の沈殿物に飽和用緩衝液５mlを加え、振り混ぜる。
ｌ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｍ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ溶液10mlを加え、振り混ぜる。
ｎ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｏ．ペレット状の沈殿物に固定用緩衝液10 mlを加え、振り混ぜる。
ｐ．混合物を、室温で混合しながら、10分間インキュベートする。
ｑ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｒ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ−ＢＡ溶液10mlを加え、振り混ぜる。
ｓ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｔ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ−ＢＡ溶液10mlを加え、振り混ぜる。
ｕ．遠心分離した後、上澄み液を除去する。
ｖ．ペレット状の沈殿物にＰＢＳ−ＢＡ溶液7.5mlを加え、振り混ぜる。
【００５８】
処理を終えた個々の懸濁液（ミクロスフェア約500,000個／μlを含む）を、＋２−８℃で保存する。
【００５９】
ｂ．ＦＩＴＣ又はＰＥと結合した F(ab')2s の使用による蛍光閾値ビーズの調製
【００６０】
原 料
− ＦＩＴＣ（Silenus、参照記号DDAF）とカップリングせしめた抗マウス・ヒツジ免疫グロブリン F(ab')2
− ＰＥ（Silenus、参照記号DDAPE）とカップリングせしめた抗マウス・ヒツジ免疫グロブリン F(ab')2
【００６１】
方 法
１．Sendo-3 でコーティングしたL300ビーズ (Estapor)（300,000個／μｌのミクロスフェアを含む）［懸濁液］2.5 ml をピペットで取る。
ＦＩＴＣ標識ビーズの場合、Sendo-3 濃度は 15μg/ml
ＰＥ標識ビーズの場合、Sendo-3 濃度は 5μg/ml
２．ビーズ［懸濁液］を 3,000rpmで８分間遠心分離し、上澄み液を除去する。
３．［ペレット状に沈殿した］ビーズに、1× PBS BA緩衝液 500 μlを加える。
４．それぞれ1×ＰＢＳ ＢＡ緩衝液で100倍に希釈したＤＤＡ又はＤＤＡＰＥ 12.5mlを上記のビーズ調製液に加え、混合物を均一に混合する。
５．混合物をロータリーミキサで混合しながら、室温で１時間インキュベートする。
６．次のようにして2回の洗浄を行う：
１×ＰＢＳ ＢＡ緩衝液２５mlを加える。
混合物を、3,000 rpmで８分間遠心分離する。
上澄み液を除去する。
７．沈殿したビーズのペレットに濃度100μg/ml のマウス γ-グロブリン溶液（Jackson、#015-000-002）を加え、ＤＤＡＦ及びＤＤＡＰＥ試薬の未結合抗マウスＩｇＧサイトを中和する。
８．混合物をロータリーミキサで混合しながら、室温で１時間インキュベートする。
９．上記６項の手順で１回の洗浄を行う。
１０．沈殿したビーズのペレットに、1×ＰＢＳ ＢＡ緩衝液2.5mlを加える。
【００６２】
ｃ．ＦＩＴＣ又はＰＥと結合した Fabs の使用による閾値ビーズの調製
【００６３】
原 料
− ＦＩＴＦとカップリングせしめた抗マウス・ヤギ免疫グロブリン Fab（Protos、参照番号#341）
− ＰＥとカップリングせしめた抗マウス・ヤギ免疫グロブリン Fab（Protos、参照記号 #441）
【００６４】
方 法
上記と同じであるが、操作段階７、８及び９は除く。
【００６５】
１．２ サイトメトリー分析
【００６６】
調製した２種のＦＩＴＣ標識閾値ビーズ及びＰＥ標識閾値ビーズを、単独でＰＢＳ−ＢＡ緩衝液中で、もしくは本発明のモノ試薬を構成する他のすべての試薬（ＦＩＴＣ又はＰＥとカップリングせしめたＭＡＢ、及び粒径0.85μｍのセッティングビーズＡ）の存在下で試験した。散乱パラメータ（本明細書中では、前方角散乱 forward-angle scatter をＦＳ、側方角散乱side-angle scatter をＳＳと称する）は、弁別回路をＳＳにセットして対数スケールで分析した。
【００６７】
結果を図１に示す。図中：
− 図１ａ）は、ＰＢＳ ＢＡ緩衝液中の閾値ビーズの分析を示し；
− 図１ｂ）は、モノ試薬中にビーズＡを用いた閾値ビーズの分析を示す。
これらの図において、Ｒ１ウィンドウは、３μｍのＦＩＴＣ標識閾値ビーズならびにＰＥ標識閾値ビーズに対応し、Ｒ３ウィンドウは二重散乱ＰＭＰ分析ウィンドウに対応し、ビーズＤはＦＩＴＣ標識閾値ウィンドウに対応し、ビーズＣはＰＥ標識閾値ウィンドウに対応する。
【００６８】
１．３ 結 論
【００６９】
上述のように、ＦＩＴＣ及びＰＥで標識された３μｍビーズの混合物を使用して二重標識された要素のための分析ウィンドウ（本明細書中ではＱ２と称する）を設定することが可能である。この例では、FL2 Log の閾値（垂直閾値）をビーズＤの平均値のレベルに選定し、FL1 Log の閾値（水平閾値）を、ビーズＣの平均値の1/3.5に等しくなるように選定した。
【００７０】
試験を実施するためのモノ試薬として求められる種々のカテゴリーのビーズ（測定領域Ｑ２を設定するための３μｍＦＩＴＣ標識閾値ビーズとＰＥ標識閾値ビーズ、及びＰＭＰのためのＲ３分析ウィンドウを設定するための 0.85μｍ ＦＩＴＣ標識閾値ビーズ）を必要に応じて組み合わせた場合の機能性を例示する。
【００７１】
実施例 Ｎｏ．２： 本発明のモノ試薬の試験
【００７２】
２．１ 原 料
【００７３】
−ＣＤ６１ ： ＦＩＴＣ標識Ｐ１８（当該技術に通暁する者には周知の標準的な手順によって精製され、標識されたもの。試薬は、0.1μmフィルタを通して濾過）。P18（McGregor JL、Thromb. Haemost。1987、58、507）。
−ＣＤ４１ａ： ＰＥ標識Ｐ２（参照番号 IM1416、Immunotech）
Ｐ２（参照番号 IM0145、Immunotech）
【００７４】
− ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（参照番号 BMS306FI/a、Bender Medsystems） − 0.85μｍセッティングビーズ(Ａ)（カタログ番号 VFP 08525、アビジンでコーティングされた黄色品、Spherotec）
【００７５】
− ＦＩＴＣ標識F(ab')2 及び ＰＥ標識F(ab')2と結合した閾値ビーズ（Ｃ及びＤ）、上に述べたもの
【００７６】
− 1×塩化カルシウム緩衝液（10mMのＨＥＰＥＳ、140mMのＮａＣｌ、2.5mMのＣａＣｌ２ を含むもの）
【００７７】
− 塩化カルシウム／ＥＤＴＡ緩衝液（10mMのＨＥＰＥＳ、140mMのＮａＣｌ、2.5mMのＣａＣｌ２、6.2mMのＥＤＴＡを含むもの。pH7.4）
【００７８】
２．２ プロトコル
【００７９】
１．クエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡを加え、1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液で10倍に希釈した全血30μｌをピペットで取る。
２．カップリングしていないＭＡＢ又は緩衝液（1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液、又は塩化カルシウム緩衝液、又は塩化カルシウム／ＥＤＴＡ緩衝液）10μlをピペットで取る。
３．室温で10分間、インキュベーションを行う。
４．ＦＩＴＣとカップリングせしめたＭＡＢ、もしくはＦＩＴＣとカップリングせしめたアネキシンＶを10μl加える。
５．ＰＥとカップリングせしめたＭａｂ 10μlをピペットで取る。
６．ＦＩＴＣ標識閾値ビーズ（ミクロスフェア濃度200,000／μｌ）５μlをピペットで取る。
７．ＰＥ標識閾値ビーズ（ミクロスフェア濃度200,000／μｌ）５μlをピペットで取る。
８．粒径0.85μｍの Spherotec ビーズ［原液］を1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液で20倍に希釈した懸濁液５μｌをピペットで取る。
９．室温で20分間、インキュベーションを行う。
１０．緩衝液（1×ＰＢＳ−ＢＡ溶液、塩化カルシウム緩衝液、又は塩化カルシウム／ＥＤＴＡ緩衝液）１mlを加える。
１１．サイトメトリー分析を行う：分析時間は２分間、流速はスローとする。
【００８０】
補 注：
１．モノ試薬を使用するこれらの試験の関連において、閾値ビーズはＰＭＰをカウントするためのビーズとして働く。
２．蛍光色素にカップリングせしめたＭＡＢの定着が阻害される場合には、血液サンプルをカップリングされていないＭＡＢと共に常温で10分間プレインキュベートする前処理を行う。
【００８１】
２．３ 操作条件
【００８２】
【表３】
試験Ａ
粒径が0.85μｍ以下であり、ＣＤ６１＋／ＣＤ４１ａ＋の事象に対応するＰＭＰならびに血小板をカウントすることが可能な条件。
【００８４】
試験Ｂ
粒径が0.85μｍ以下であり、アネキシンＶ＋／ＣＤ４１ａ＋の事象に対応する活性化されたＰＭＰ及び／又は活性化された血小板をカウントすることが可能な条件。血液中の血小板由来要素であって、粒径が0.85μｍ以下であり、活性化された（血小板及びＰＭＰの外部細胞膜上にアネキシンＶによって明らかにされるホスファチジルセリン残基が存在するために）表現型を有するものをカウントすることが可能なのは、この試験のみである。
【００８５】
試験Ｃ、試験Ｄ及び試験Ｅ
それぞれＣＤ４１ａ、ＣＤ６１及びアネキシンＶ試薬の特異性を確立することが可能な条件。
【００８６】
２．４ 全血中のモノ試薬の試験
【００８７】
ａ）全血中ＰＭＰの二重散乱分析を行うためのＲ３ウィンドウ設定の原理
【００８８】
以下で説明する例は、全血中のＰＭＰの二重散乱分析について説明するものであり、血液サンプルは、試験Ａ（ＣＤ６１−ＦＩＴＣ／ＣＤ４１−ＰＥ）に相当する。
【００８９】
サイトメトリー分析の種々の操作段階は、図２ａ、図２ｂに示してある。
【００９０】
ＰＭＰ分析ウィンドウＲ３は、塊中にＦＩＴＣの蛍光を持つ0.85μｍセッティングビーズ（ビーズＡ）の一重状態(singlets)を用いてゲーティングする。まず最初に、大きな二重散乱ウィンドウＲ３を、これらのビーズの周囲にゲーティングする（段階＃１）。Ｒ３でゲーティングされたＦＬ１−ＬＯＧ／ＦＬ２−ＬＯＧサイトグラムによって、ウィンドウＲ２を持つＦＬ１中にこれらのセッティングビーズを確認することが可能になる（段階＃２）。次いでウィンドウＲ３を二重散乱に定義し直し、このビーズＡの一重状態集団についてＦＳ−ＬＯＧパラメータを測定する（段階＃３）。
【００９１】
かくして、血小板由来微小粒子分析用のウィンドウＲ３が、下記の基準に従って二重散乱に定義され得る（段階＃４）：
− ＦＳ−ＬＯＧの上限：先の段階で測定されたビーズＡの一重状態集団のＦＳ−ＬＯＧパラメータの平均値に等しい。
− ＦＳ−ＬＯＧの下限：ＦＳ−ＬＯＧパラメータの最初のチャネルをとらない。
− ＳＳ−ＬＯＧの上限：ビーズＡの一重状態クラウドに対して設定。
− ＳＳ−ＬＯＧの下限：ＳＳ−ＬＯＧパラメータの弁別回路を最小値に設定する。
【００９２】
最後に、サンプル（全血＋モノ試薬）の二重散乱分析を、種々異なったサイトメトリー分析ウィンドウを用いて実行することができる（段階＃５）。
【００９３】
ｂ） サンプルの分析
【００９４】
本発明のモノ試薬の機能性と、該試薬の成分の特異性についての試験を、19点の全血サンプルについて実施した。サンプルの11点にはＥＤＴＡを、7点にはクエン酸ナトリウムを加えた。
上に記述したプロトコルに従い、10倍に希釈した血液サンプルを用いて、試験Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを実施した。
【００９５】
サイトメトリー分析の結果を、図３ａ，図３ｂに示す。
【００９６】
定量的な結果は、全血μl当りのＰＭＰ数(number of events)で表す。
【００９７】
分析は、ウィンドウＱ２内にカウントされるエレメントを用いて行う。
【００９８】
− 抗血液凝固剤がＥＤＴＡの場合：
【００９９】
【表４】
− 抗血液凝固剤がクエン酸ナトリウムの場合：
【０１０１】
【表５】
− 阻害試験（抗血液凝固剤はＥＤＴＡ）
【０１０３】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 調製した２種のＦＩＴＣ標識閾値ビーズ及びＰＥ標識閾値ビーズの試験結果を示す説明図である。ａ図はＰＢＳ−ＢＡ緩衝液中の閾値ビーズの分析を示し、ｂ図はモノ試薬中にビーズＡを用いた閾値ビーズの分析を示す。
【図２ａ】 サイトメトリー分析の種々の操作段階を示す説明図である。
【図２ｂ】 サイトメトリー分析の種々の操作段階を示す説明図である。
【図３ａ】 サイトメトリー分析の結果を示す説明図である。
【図３ｂ】 サイトメトリー分析の結果を示す説明図である。
Claims (22)
- 血液サンプル中の血小板由来微小粒子(ＰＭＰ)をフローサイトメトリーによって検出・定量するためのモノリージェントにおいて、下記の成分を含むことを特徴とするモノリージェント：
ａ）ＰＭＰの二重標識のための下記成分を含む試薬１：
− アネキシンＶ、又は生体膜リン脂質に特異的な他のマーカーの何れか一つを、蛍光色素１に結合せしめたものか、
− 又は血小板の膜構造に指向する集団１のモノクローナル抗体(ＭＡＢ)を蛍光色素１で標識したもの（試薬１ａ）、及び
− 血小板の膜構造に指向する集団２のモノクローナル抗体(ＭＡＢ)を蛍光色素２で標識したもの（試薬１ｂ）；及び
ｂ）下記成分を含むミクロスフェア混合物から成る試薬２：
− 蛍光色素１又は２の何れか一方、或いはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されており、粒径（光散乱のパラメータ）に関するＰＭＰの分析範囲を規定するために使用され、且つＰＭＰの区別を可能にするミクロスフェアＡの一集団（セッティングビーズ）、
− 標識されていないか、蛍光色素１又は２の何れか一方、或いはこれら２種の一方に近似したスペクトルを持つ他の蛍光色素で標識されており、その濃度が既知であって、ＰＭＰを計数するために使用されるミクロスフェアＢの一集団（計数ビーズ）、
− 蛍光色素１のみで標識されており、蛍光色素１の蛍光パラメータに関して、蛍光色素１で標識されたＭＡＢ１又はアネキシンＶ、又は生体膜のリン脂質に特異的な他のマーカーが結合しているＰＭＰの分析範囲の限界を定める最小強度閾値を定義するために使用されるミクロスフェアＣの一集団（閾値ビーズ）、及び
− 粒径がＣと等しく、かつ蛍光色素２のみで標識されており、蛍光色素２の蛍光パラメータに関して、蛍光色素２で標識されたＭＡＢ２が結合しているＰＭＰの分析範囲の限界を定める最小強度閾値を定義するために使用されるミクロスフェアＤの一集団（閾値ビーズ）。 - 閾値ビーズのＣ集団及びＤ集団のそれぞれが、２つの蛍光基準となる２つの部分集団ビーズから成ることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 計数ビーズの粒径が５μｍ以上であることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 計数ビーズの粒径が５〜１０μｍであることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- セッティングビーズの粒径が０．５〜１μｍであることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 閾値ビーズの粒径が３μｍであることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 集団１及び集団２のモノクローナル抗体(ＭＡＢ)が、次の特異性から選ばれる血小板膜構造に対して指向されているものであることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント：
ＣＤ６１、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、プロテインＳ（血液凝固調節因子）及びプロトロンビン（血液凝固第II因子）。 - 集団１及び集団２のＭＡＢが、単一のＭＡＢ、特異性は同一であるが種々異なったエピトープ（抗原決定基）に指向されている複数種のＭＡＢ、又は血小板特異性の異なる複数種のＭＡＢを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 本発明の試薬１が、アネキシンＶ又は生体膜リン脂質に特異的な別のマーカーを蛍光色素１で標識したもの（試薬１ａ）と、蛍光色素２で標識された集団２のＭＡＢ（試薬１ｂ）とを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 試薬１が蛍光色素１で標識されたアネキシンＶと、蛍光色素２で標識された集団２のＭＡＢとを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のモノリージェント。
- 集団２のＭＡＢが特異性の異なる複数種のＭＡＢを含んでいることを特徴とする請求項１０に記載のモノリージェント。
- 集団２のＭＡＢが抗ＣＤ６１ＭＡＢと抗ＣＤ４２ｂＭＡＢとを含んでいることを特徴とする請求項１０に記載のモノリージェント。
- 前記集団２が、Ｐ１８と、４Ｆ８（抗ＣＤ６１）ＭＡＢと、ＳＺ２（抗ＣＤ４２ｂ）とのＭＡＢから成ることを特徴とする請求項１０に記載のモノリージェント。
- 蛍光色素１がＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）であり、蛍光色素２がＰＥ（フィコエリトリン）であることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載のモノリージェント。
- サンプルが全血であることを特徴とする請求項１〜１４の何れか１項に記載のモノリージェント。
- ＰＭＰを検出し定量するための診断キットにおいて、請求項１〜１５の何れか１項に記載のモノリージェントを含むことを特徴とする診断キット。
- 希釈用の緩衝液を更に含むことを特徴とする請求項１６に記載の診断キット。
- 請求項１６に記載の診断キットにおいて、請求項２に記載のモノリージェントと、希釈用の緩衝液を含む試薬３を含むことを特徴とする診断キット。
- 試薬１ａがアネキシンＶを含み、試薬１ｂが異なる特異性を持つＭＡＢの混合物を含んでいることを特徴とする請求項１６〜１８の何れか１項に記載の診断キット。
- 試薬１ｂが抗ＣＤ６１ＭＡＢと抗ＣＤ４２ｂＭＡＢとの混合物を含んでいることを特徴とする請求項１６〜１８の何れか１項に記載の診断キット。
- ＰＭＰを検出し、定量するための試験方法において、次のステップを含むことを特徴とする方法：
ａ）血液サンプルを請求項１〜１５の何れか１項に記載のモノリージェントに接触せしめ、該ＰＭＰの二重色素標識を得る段階、及び
ｂ）二重標識されたＰＭＰ(events)をサイトメトリーによって分析する段階。 - 血栓症前駆状態(prothrombotic condition)の検出及び監視方法への請求項１〜１５の何れか１項に記載のモノリージェント又は請求項１６〜２０の何れか１項に記載の診断キットの使用。
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