DE60110407T2

DE60110407T2 - Reagenz zur bestimmung von blutplättchen-mikroteilchen

Info

Publication number: DE60110407T2
Application number: DE60110407T
Authority: DE
Inventors: Michel Canton; Isabelle Botosezzy
Original assignee: Biocytex SRL
Current assignee: Biocytex SRL
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-15
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2021-05-16
Also published as: CA2410008A1; EP1282817A1; DE60110407D1; ATE294392T1; FR2809181A1; JP2003533698A; EP1282817B1; US20030175831A1; ES2238442T3; WO2001088539A1; JP4831915B2; FR2809181B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Monoreagenz und ein dieses umfassendes Diagnosekit für den Nachweis und die Quantifizierung von Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs (BMP) durch Markierung mit doppelter Farbe.
Es ist bekannt, dass aktivierte Blutplättchen Vesikel freisetzen, die als Blutplättchen-Mikropartikel (BMP) bezeichnet werden. Diese Partikel mit geringem Durchmesser (der jedoch von 0,1 bis 0,8 μm reichen kann) resultieren aus einer Vesikulation der Blutplättchen-Plasmamembran nach gewissen Stimuli (Thrombin, Kollagen, C5b9 ...). Wegen ihrer prothrombotischen und koagulationsfördernden Wirkung scheinen die BMP in vivo eine wichtige Rolle zu spielen.
Da sie mehrere Blutplättchen-Rezeptoren exprimieren (GpIb, GpIIb/IIIa ...), sind die BMP in der Lage, mehrere Arten von Blutplättchen-Liganden zu fixieren (Fibrinogen, Fibronectin, Kollagen, vWF, Vitronectin ...) und bei einer Gefäßöffnung an der subendothelialen Matrix anzuhaften. Bei zahlreichen pathologischen Zuständen wurden erhöhte Spiegel an zirkulierenden BMP beobachtet, wie bei: instabiler Herzbräune, Myokardinfarkt, Koronarangiographie, Diabetes mellitus, kardiopulmonalem Bypass, paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie, aplastischer Anämie, HIT (Thrombozytopenien, die durch Heparin induziert sind), idiopathischer thrombozytopenischer Purpura .... Umgekehrt können gewisse Krankheiten, wie das Scott-Syndrom, mit einem Mangel des Gehalts an zirkulierenden BMP verbunden sein.
So scheint der Nachweis und die Zählung dieser BMP ein wichtiges Kriterium beim Nachweis und der Bewertung der Schwere eines prothrombotischen Zustands im Verlauf verschiedener Krankheiten zu sein.
Die Phänomene, die mit der Bildung von Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs verbunden sind, und die Bedeutung ihres Nachweises für die Diagnose sind in großem Umfang in der Literatur beschrieben worden (1–5).
Verschiedene Ansätze auf der Basis von Techniken wie Filtration (6), ELISA (7) oder spezieller Durchflusszytometrie (8–11) sind so für ihre Isolierung und/oder ihre Quantifizierung vorgeschlagen worden.
Combes V. et al., J. Clin. Invest., 1999, Bd. 104, S. 43–102, offenbaren ein Monoreagenz für den Nachweis und die Quantifizierung von BMP für eine doppelte Markierung der BMP.
Das Prinzip der Durchflusszytometrie und ihre Vorteile, um Subpopulationen von Zellen und zellulären Partikeln zu unterscheiden und zu quantifizieren, sind heute dem Fachmann wohlbekannt.
Dieses Verfahren ist bereits für den Nachweis von aktivierten Blutplättchen in Blutproben und die Bestimmung von koagulationsfördernden Mikropartikeln Blutplättchen-Ursprungs durch funktionelle Tests verwendet worden (12).
Jedoch verwenden die durchgeführten Studien meistens eine Fluoreszenzmarkierung in einer einzigen Farbe und/oder setzen Zählungskügelchen ein, deren Leistung bezüglich der Kalibrierung nicht ausreichend sind, um ein industrialisierbares Verfahren zu entwerfen, welches es ermöglicht, Nachweis- und Quantifizierungstests für BMP auf vollständig standardisierte Weise durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung führt zu einer Verbesserung der vorbestehenden Verfahren, indem sie eine neue Lösung vorschlägt, die es gleichzeitig und auf standardisierte Weise ermöglicht, spezifisch Mikropartikel Blutplättchen-Ursprungs in einer Blutprobe ohne vorherige Behandlung nachzuweisen und zu zählen.
Zu diesem Zweck wird ein spezielles Monoreagenz eingesetzt, das mehrere Populationen von kalibrierten Kügelchen und eine doppelte Markierung der BMP vereinigt. So ermöglicht ein derartiges Reagenz gleichzeitig 1) eine optimale Isolierung der BMP auf einem Kriterium der Größe, 2) ihre Charakterisierung durch spezifische Markierungen und 3) ihre Zählung mittels Zählungskügelchen. Es bietet also ein Mittel, spezifisch auf sehr verlässliche Weise die Zahl von BMP in einer Probe nachzuweisen und zu zählen, selbst wenn diese in sehr geringer Menge vorliegen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Monoreagenz für den Nachweis und die Quantifizierung von Blutplättchen-Mirkopartikeln (BMP) in einer Blutprobe durch Durchflusszytometrie, umfassend:

a) ein Reagenz für eine doppelte Markierung der BMP, umfassend: – entweder Annexin V oder jeden anderen Marker, der für Membran-Phospholipide spezifisch ist, gekuppelt an ein Fluorochrom 1, – oder eine Population 1 von MAK, die gegen Blutplättchen-Membranstrukturen gerichtet sind, markiert mit einem Fluorochrom 1 (Reagenz 1a), und eine Population 2 von MAK, die gegen Blutplättchen-Membranstrukturen gerichtet sind, markiert mit einem Fluorochrom 2 (Reagenz 1b), wobei das Fluorochrom 2 vom Fluorochrom 1 verschieden ist, und
b) ein Reagenz 2, das aus einer Mischung von Mikrokügelchen zusammengesetzt ist, welche umfassen: – eine Population von Mikrokügelchen A, die mit einem der beiden Fluorochrome 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem dieser beiden ähnlich ist, markiert ist und dazu dient, den Analysebereich der BMP bezüglich der Größe (Lichtdiffusionsparameter) zu definieren, und deren Differenzierung ermöglicht (Positionierungskügelchen), – eine Population von Mikrokügelchen B, die nicht markiert oder mit einem der beiden Fluorochrome 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem der beiden ähnlich ist, markiert ist, deren Konzentration bekannt ist und die als innerer Standard zur Zählung der Mikropartikel dient (Zählungskügelchen), – eine Population von Mikrokügelchen C, die allein mit dem Fluorochrom 1 markiert ist und dazu dient, bei dem Fluoreszenzparameter des Fluorochroms 1 die minimale Intensitätsschwelle zu definieren, welche den Analysebereich der Mikropartikel beschränkt, an denen die mit dem Fluorochrom 1 markierten MAK 1 oder Annexin V oder jeder andere, für Membran-Phospholipide spezifische Marker, markiert mit dem Fluorochrom 1, befestigt sind (Schwellenkügelchen), – eine Population von Mikrokügelchen D mit einem mit C identischen Durchmesser und allein mit dem Fluorochrom 2 markiert, die dazu dient, bei dem Fluoreszenzparameter des Fluorochroms 2 die minimale Intensitätsschwelle zu definieren, die den Analysebereich der Mikropartikel beschränkt, an denen die mit dem Fluorochrom 2 markierten MAK 2 befestigt sind (Schwellenkügelchen).

Das Monoreagenz gemäß der Erfindung besitzt demgemäß mehrere Funktionen, welche sind:

– Markierung der Mikropartikel mit doppelter Farbe, was eine optimale Unterscheidung der Blutplättchen-Mikropartikel von Äquivalenten anderen Ursprungs ermöglicht;
– Standardisierung der Unterscheidungsschwellen der interessierenden Mikropartikel von anderen Partikeln und Trümmern, die für ein eventuelles Grundlinienrauschen verantwortlich sind;
– Standardisierung der Zählung der Blutplättchen-Mikropartikel, die markiert und durch die Bezugszählung des internen Kügelchen-Standards unterschieden sind.

Vorteilhaft ist jede Population C und D von Schwellenkügelchen aus zwei Subpopulationen von Kügelchen mit zwei Fluoreszenzniveaus 1 oder 2 zusammengesetzt, um die Standardisierung der Analyse durch eine Positionierung der Schwellen und eine Regulierung der Kompensationen zu optimieren.
Die verschiedenen Populationen von Kügelchen können aus verschiedenen Materialien erhalten werden, die klassisch für die Herstellung dieser Art von Teilchen verwendet werden. Dies sind beispielsweise organische Polymere, wie Polysaccharide, Styrol-Polymere, Polyacrylate, Polyacrylamid, Hydroxyethylpolymetharcylat, Polyvinyle, Polystyrole und Polymere, die aromatische Gruppen enthalten. Ein bevorzugt verwendetes Material ist Polystyrol. Das Material kann jedoch zwischen den verschiedenen Populationen der verwendeten Kügelchen verschieden sein.
Mehrere Fluorochrome sind im Handel verfügbar. Man verwendet vorteilhaft Phycoerythrin (PE) oder Fluorescein, zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
Die Zählungskügelchen, deren Rolle es ist, die BMP zu zählen, weisen vorteilhaft einen Durchmesser oberhalb von oder gleich 5 μm auf, damit in der Zytometrie die Wolke der Zählungskügelchen gut von Zellen und Kügelchen einer anderen Population (Schwellenkügelchen) verschieden ist. Bevorzugt liegt der Durchmesser zwischen 5 und 10 μm einschließlich.
Diese Zählungskügelchen können unmarkiert oder im Volumen oder auf der Oberfläche markiert sein. Sie sind bevorzugt im Volumen mit einem der Fluorochrome 1 oder 2, welche für die Markierung der Schwellenkügelchen verwendet werden, oder mit einem anderen Fluorochrom mit einem ähnlichen Spektrum wie einer der beiden markiert.
Die Positionierungskügelchen ermöglichen es, das Analysefenster der BMP gemäß der Größe zu positionieren. Ihr Durchmesser liegt vorteilhaft zwischen 1 und 0,5 μm einschließlich. Sie sind mit einem der beiden Fluorochrome 1 und 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem ähnlichen Spektrum wie einer der beiden im Volumen oder auf der Oberfläche markiert.
Die Rolle der Schwellenkügelchen besteht darin, die Analyse zu standardisieren, indem das Analysefenster der BMP positioniert wird, um die Regulierung der Kompensationen zu ermöglichen. Ihr Durchmesser liegt zwischen 1 und 5 μm einschließlich und beträgt bevorzugt 3 μm.
Die beiden Populationen C und D der Schwellenkügelchen bestehen aus zwei Populationen, die mit einem der Fluorochrome 1 oder 2 markiert sind, und bestehen vorteilhaft alle beide aus zwei Kategorien von Kügelchen gleicher Natur, die aber verschiedene Fluoreszenzniveaus aufweisen.
Diese Kalibrierungsmittel sind vorteilhaft dank eines Standards (Quantum 24 Fluorescein – Code: RF 824; Quantum PE R-Phycoerythrin – Code RF 827, FCSC Europa) in MESF (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome-13) standardisiert.
Die Intensität der Schwellenkügelchen wird so reguliert, damit sie an der Grenze zwischen der minimalen Intensität der BMP und der maximalen Intensität der Mikropartikel anderen Ursprungs und der Verunreinigungen ähnlicher Größe (Staub, Zelltrümmer ...) liegt.
Der Wert der Schwellen von Fluorochrom 1 und Fluorochrom 2, bevorzugt FITC und PE, wird für eine optimale Unterscheidung der BMP bezüglich anderer Verunreinigungen über einer Kohorte von normalen und pathologischen Individuen mit Hilfe von kommerziellen Standard-Kalibrierungsmitteln bestimmt.
Der Wert der so definierten Schwellen ergibt den Wert der assoziierten Schwellenkügelchen (C, D) des Monoreagenz.
Die monoklonalen Antikörper (MAK) der Populationen 1 und 2 sind vorteilhaft gegen Blutplättchen-Membranstrukturen gerichtet, die aus den folgenden Spezifitäten ausgewählt sind: CD61, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD49b, CD29, CD62P, CD63, Protein S und Prothrombin.
Diese Populationen 1 und 2 können durch einen einzigen MAK, durch mehrere MAK der gleichen Spezifität, aber gegen verschiedene Epitope gerichtet, oder durch mehrere MAK von unterschiedlicher Blutplättchen-Spezifität repräsentiert sein.
Gemäß einer bevorzugten Variante besteht das Reagenz 1 des Monoreagenz der Erfindung aus Annexin V oder einem anderen spezifischen Marker von Membran-Phospholipiden, markiert mit einem Fluorochrom 1 (Reagenz 1a), und einer Population 2 von mit einem Fluorochrom 2 markierten MAK (Reagenz 1b).
Man verwendet bevorzugt eine Population 2 von MAK, die mehrere MAK verschiedener Spezifitäten umfasst, und bevorzugter Anti-CD61-MAK und Anti-CD42b-MAK. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Reagenz besteht aus Anti-CD61-MAK und Anti-CD42b-MAK, die mit PE markiert sind, und aus Annexin V, das mit FITC markiert ist.
Gemäß einer vorteilhaften Variante werden die Anti-CD61-Antikörper von den Hybridomen P18 und 4F8 produziert, die bei der BCCM/LMBP Collection (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) gemäß dem Budapester Vertrag am 26.06.97 bzw. am 02.06.98, unter den Nummern LMBP162CB (P18) und LMBP1667CB (4F8) hinterlegt worden sind.
Die Assoziation dieser beiden MAK ist besonders vorteilhaft, da es zwischen ihnen keine sterische Hinderung gibt und ihre Fixierung auf den BMP nicht durch die eventuelle Anwesenheit von kommerziellen Anti-GPIIb/IIIa-Antiaggregationsmitteln, wie Reopro (Abciximab, Centocor), Integrilin (Ceptifibatid, Shering-Plough) oder Agrastat (Tirofiban, Merck), verändert wird.
Die Anti-CD42b-MAK werden beispielsweise durch den Antikörper SZ2 repräsentiert. Dieser kann bei der Firma Beckman Coulter/Immunotech (Bez. IM0409) erhalten werden.
Annexin V ist im Handel erhältlich. Es kann beispielsweise von Bender (Bez. BMS306 FI) abstammen.
Andere Verbindungen, die als spezifische Marker von Membran-Phospholipiden nützlich sind, sind beispielsweise Anti-Phosphatidylserin-Antikörper, wie die Antikörper BA3B5C4 und 3SB9b, die in der Literatur beschrieben sind (14), oder die Antikörper Ab-1, die von France Biochem (Bez. AM31, Oncogene Research Product) im Handel sind.
Vorteilhaft besteht die Probe aus Vollblut, das auf CTAD (Citrat – Theophyllin – Adenosin – Dipyridamol), Natriumcitrat oder EDTA entnommen ist. Sie kann auch aus Plasma bestehen, obwohl diese Probenart aufgrund des vorangehenden Präparationsschrittes, den sie erfordert, nicht bevorzugt verwendet wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Diagnosekit, das ein wie vorstehend erwähntes Monoreagenz umfasst und für den Nachweis und die Quantifizierung von BMP in einer Blutprobe bestimmt ist.
Ein derartiges Diagnosekit umfasst so vorteilhaft:

– ein Reagenz 1a, das aus einer Population 1 von für Blutplättchen-Membranstrukturen spezifischen MAK oder aus Annexin V oder aus jedem anderen, für Membran-Phospholipide spezifischen Marker, markiert mit einem Fluorochrom 1, zusammengesetzt ist,
– ein Reagenz 1b, das aus einer Population 2 von für Blutplättchen-Membranstrukturen spezifischen MAK, die mit einem Fluorochrom 2 markiert sind, zusammengesetzt ist,
– ein Reagenz 2, das zusammengesetzt ist aus: • einer Population von Kügelchen zur Positionierung des Analysefensters von BMP, die mit dem Fluorochrom 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem der beiden ähnlich ist, markiert ist, • einer Population von Zählungskügelchen, die nicht markiert oder mit dem Fluorochrom 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem der beiden ähnlich ist, markiert ist, • einer Population von Schwellenkügelchen, die vorzugsweise aus zwei Subpopulationen von Kügelchen mit zwei Niveaus zusammengesetzt ist, welche mit dem Fluorochrom 1 markiert sind, • einer Population von Schwellenkügelchen, die vorzugsweise aus zwei Subpopulationen von Kügelchen mit zwei Niveaus zusammengesetzt ist, welche mit dem Fluorochrom 2 markiert sind,
– ein Reagenz 3, das aus einem Verdünnungspuffer besteht.

Vorzugsweise sind die Reagenzien 1, 2 und 3 gemischt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besteht das Reagenz 1a aus Annexin V. In diesem Fall ist der Verdünnungspuffer des Reagenz 3 ein calciumhaltiger Puffer, der beispielsweise aus einer Mischung Hepes/NaCl/CaCl2 besteht, denn die Fixierung des Annexin an den Phospholipiden hängt von der Anwesenheit von Calcium ab (15). Man wird es in diesem Fall offensichtlich vermeiden, eine Probe zu verwenden, die mit EDTA behandelt worden ist.
Das Reagenz 1b ist vorteilhaft aus einer Mischung von MAK mit verschiedenen Spezifitäten und bevorzugt aus Anti-CD61-MAK und Anti-CD42b-MAK zusammengesetzt. Spezieller ist das Reagenz 1b aus einer Mischung der MAK P18 und 4F8 (Anti-CD61) und SZ2 (Anti-CD42b) zusammengesetzt.
Man verwendet bevorzugt FITC als Fluorochrom 1 und PE als Fluorochrom 2.
Um eine gute Konservierung sicherzustellen, können alle Reagenzien des Kits der Erfindung Natriumazid zu 0,09% (0,09 g/l) enthalten.
Gemäß einem weiteren komplementären Aspekt ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von BMP, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Vereinigen und Inkubieren einer Blutprobe mit einem wie vorstehend definierten Monoreagenz auf solche Weise, dass man eine Markierung der BMP mit doppelter Farbe erhält, und
b) zytometrische Analyse der doppelt markierten Ereignisse.

Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung eines wie vorstehend definierten Monoreagenz oder eines Diagnosekits, welches das Monoreagenz umfasst, in einem Verfahren zum Nachweis und zur Verfolgung eines prothrombotischen Zustands.
Das Prinzip des Verfahrens der zytometrischen Analyse, das im Rahmen der Erfindung verwendet wird, wird nachstehend noch einmal angeführt:
Zytometrische Analyse:
Um die zytometrische Messung durchzuführen, beziehe man sich auf die Gebrauchsanleitung der Apparatur, die vom Hersteller geliefert wird.
Vor der Analyse homogenisiere man die Röhrchen mit einem Rührer vom Vortex-Typ.
Für die Durchführung des Protokolls sind erforderlich:

– 1 Zytogramm FSXSS;
– 2 Histogramme FL1 LOG, eines konditioniert durch das Zytogramm FSXSS (für die Positionierungskügelchen A) und das andere konditioniert durch das Zytogramm FSXSS (für die Zählungskügelchen B);
– 2 Zytogramme FL1 LOG/FL2 LOG, ein Zytogramm konditioniert über den Schwellenkügelchen (C und D) und das andere konditioniert über den Kügelchen A+BMPs.

Man konstruiere ein Zytogramm FS LOG × SS LOG. Man positioniere eine diskriiminierende Schwelle, um die eventuellen Verunreinigungen (Hintergrundrauschen der Apparatur) zu eliminieren. Man entwerte drei Analysefenster um die verschiedenen Populationen von Kügelchen herum:

– Fenster R1 für die Positionierungskügelchen mit 0,8 μm;
– Fenster R2 für die Zählungskügelchen mit 5 bis 10 μm;
– Fenster R3 für die Schwellenkügelchen mit 3 μm.

Man erzeuge 2 Histogramme FL1 LOG, eines für die Positonierungskügelchen (konditioniert durch das Fenster R1), das andere für die Zählungskügelchen (konditioniert durch das Fenster R2).
Man schaffe zwei Zytogramme FL1 LOG/FL2 LOG, ein Zytogramm für die Schwellenkügelchen C und/oder D (konditioniert durch das Fenster R3), und das andere für die BMPs (konditioniert durch das Fenster R1).
Man stelle für optimale Analysebedingungen die Spannung des Sekundärelektronenvervielfachers FL1 und FL2 derart ein, dass das Kügelchen mit hoher Schwelle (C oder D) zu Beginn der vierten Dekade in FL1 bzw. FL2 positioniert ist.
Die Regulierung der Kompensationen wird mit dem Schwellenkügelchen (C und D) bewirkt.
Regulierung der Kompensation FL2
Über dem Zytogramm FL1 LOG/FL2 LOG, das über dem Analysefenster „R3" der Kügelchen D konditioniert wurde, positioniere man 2 Fenster (R4 und R5) über den entsprechenden Wolken mit hohem Kügelchen und niedrigem Kügelchen. Man kompensiere die Fluoreszenz FL2 (FL2 – x% FL1) bis zur Äquivalenz der Mittelwerte der Fluoreszenz (MFI) FL2 LOG der Fenster R4 und R5.
Regulierung der Kompensation FL1
Man ändere die Regulierungen der Fluoreszenz FL1 LOG und FL2 LOG (Spannungen der Sekundärelektronenvervielfacher PMT FL1 und FL2), die zuvor festgelegt wurden, für den Rest des Protokolls nicht.
Man verfahre auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben. Über dem Zytogramm FL1 LOG/FL2 LOG, das über dem Analysefenster „R3" der Kügelchen C gebildet wurde, positioniere man 2 Fenster (R6 und R7) über den entsprechenden Wolken mit hohem Kügelchen bzw. niedrigem Kügelchen. Man kompensiere die Fluoreszenz FL1 (FL1 – x% FL2) bis zur Äquivalenz der MFI FL1 LOG der Fenster R6 und R7.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung
Beispiel Nr. 1: Studie der Schwellenkügelchen eines Monoreagenz gemäß der Erfindung
Das nachstehend erläuterte Monoreagenz beruht auf einer doppelten Markierung der BMP durch Annexin V-FITC und CD 41-PE.
1.1 Herstellung der Schwellenkügelchen
Die Schwellenkügelchen wurden aus 3 μm-Polystyrol-Kügelchen hergestellt, die mit verschiedenen Mengen eines Mäuse-IgG beschichtet waren, das mit den vorkommenden Blutelementen nicht reagiert. Die Beladung mit Mäuse-IgG wird gemäß dem Fluoreszenz-Intensitätsgrad gewählt, der für dieses Schwellenkügelchen gewünscht wird. Die Kügelchen werden durch Kontakt mit einem entsprechenden Anti-Mäuse-IgG-Reagenz fluoreszenzmarkiert, d.h. mit:

– FITC-markiertem Schaf-F(ab')2-Anti-Maus-IgG (H+L), human-absorbiert,
– FITC-markiertem Ziegen-Fab-Anti-Maus-IgG (H+L), human-absorbiert,
– PE-markiertem Schaf-F(ab')2-Anti-Maus-IgG (H+L), human-absorbiert,
– PE-markiertem Ziegen-Fab-Anti-Maus-IgG (H+L), human-absorbiert.

a) Herstellung der IgG-beschichteten Kügelchen
Die Menge an Kügelchen wird so gewählt, dass diese eine mittlere Fluoreszenzaktivität ergibt, die bezüglich einer Population von nicht-markierten Blutplättchen abgesetzt ist (z.B. mittlere Fluoreszenz der Kügelchen zehnmal stärker als die mittlere Fluoreszenz der Blutplättchen).
Material

– MAK Sendo-3, Anti-CD146, Klon F439-E10, nicht reaktiv mit den vorkommenden Blutelementen (Leukocyte Typing VI, Kishimoto, Kikutani et al.)
– Kügelchen L300 (Estapor) Puffer (Tabelle 1):

Verfahren
Herstellung der Puffer
Man stelle 1 Liter PBS her. Man filtriere über eine 0,22 μm-Membran mit einem 500 ml-Filtrationssystem.
Man stelle 1 Liter PBS, 1% PFA, 0,09% Natriumazid her.
Man stelle 1 Liter PBS BA her, man filtriere über eine 0,22 μm-Membran mit einem 500 ml-Filtrationssystem.
Bemerkung: Alle Puffer werden vor der Verwendung über eine 0,22 μm-Membran filtriert.
Herstellung der Kupplungsreagenzien
a) Verdünnung der IgG1
Die verschiedenen Beladungsniveaus der Kügelchen werden erhalten, indem man die IgG1-Konzentration der Beschichtungslösungen variiert.

1. Man taue eine Aliquote von Sendo3 zu 5 mg/ml auf.
2. Man stelle eine Lösung von Sendo3 zu 500 μg/ml (Verdünnung auf 1/10) wie folgt her: – man gebe in ein CMF-Röhrchen 100 μl Sendo3 zu 5 mg/ml – man gebe in dasselbe Röhrchen 900 μl PBS dazu.
3. Man stelle eine Lösung von Sendo3 zu 100 μg/ml (Verdünnung auf 1/5) wie folgt her: – man gebe in ein CMF-Röhrchen 200 μl Sendo3 zu 500 μg/ml – man gebe in dasselbe Röhrchen 800 μl PBS dazu.
4. Man stelle zwei Beschichtungslösungen her, wie in Tabelle 2 angegeben:

b) Präparierung der Mikrokügelchen vor der Kupplung
Allgemeines Protokoll zum Waschen der Mikrokügelchen
Die Waschschritte und die Puffer-Auswechslungen werden wie folgt durchgeführt:

1. Man zentrifugiere die Kügelchen 8 min lang bei 3000 U/min (1890 g, Rotor 8160) mit der Bremse.
2. Man beseitige den Überstand mit Hilfe der Vakuumpumpe.
3. Man gebe mit einer Pipette den Wiederaufnahmepuffer dazu.
4. Man vortexe gut, um das Pellet wieder in Suspension zu bringen.

Waschen der Kügelchen vor der Kupplung

1. Man verwende 6 ml 10%-ige Kügelchen-Suspension (geprüft auf etwa 4,106 Mikrokügelchen/μl).
2. Man zentrifugiere, beseitige den Überstand.
3. Man resuspendiere das Pellet mit 7,5 ml PBS.
4. Man zentrifugiere, beseitige den Überstand.
5. Man resuspendiere das Pellet mit 6 ml PBS.

Kupplungsprotokoll

a. Man vortexe das Röhrchen, das die gewaschenen Mikrokügelchen enthält.
b. Man vortexe das Röhrchen, das die Beschichtungslösung enthält.
c. Man halte das Röhrchen, das die Beschichtungslösung enthält, unter Rühren auf dem Vortexer. Man gebe rasch 1 ml gewaschene Mikro kügelchen mit einer 1 ml-Gilson-Pipette auf einmal vertikal ins Zentrum der Lösung.
d. Man verschließe das Röhrchen.
e. Man gebe das Röhrchen bei +2 – 8°C auf den Rotationsrührer.
f. Man wiederhole die Schritte b bis e mit den anderen Beschichtungen.
g. Man inkubiere eine Nacht unter Rühren.
h. Man stelle den Sättigungspuffer her (2 g BSA A7030, PBS ad 50 ml), und filtriere mit einem 0,22 μm-Filter.
i. Man filtriere 100 ml Fixierungspuffer über eine 0,22 μm-Membran mit einem Spritzenfilter.
j. Man zentrifugiere, beseitige die Überstände (siehe allgemeines Protokoll für das Waschen der Mikrokügelchen).
k. Man nehme das Pellet mit 5 ml Sättigungspuffer auf, man vortexe.
l. Man zentrifugiere, beseitige die Überstände.
m. Man nehme das Pellet mit 10 ml PBS auf, man vortexe.
n. Man zentrifugiere, beseitige die Überstände.
o. Man nehme das Pellet mit 10 ml Fixierungspuffer auf, man vortexe.
p. Man inkubiere 10 min bei Umgebungstemperatur unter Rühren.
q. Man zentrifugiere, beseitige die Überstände.
r. Man nehme die Pellets mit 10 ml PBS-BA auf, man vortexe.
s. Man zentrifugiere, beseitige die Überstände.
t. Man nehme die Pellets mit 10 ml PBS-BA auf, man vortexe.
u. Man zentrifugiere, beseitige die Überstände.
v. Man nehme die Pellets mit 7,5 ml PBS-BA auf, man vortexe.

Die einzelnen Suspensionen (Lösung mit etwa 500 000 Mikrokügelchen/μl) sind fertig und werden bei + 2 – 8°C aufbewahrt.
b. Herstellung von fluoreszierenden Schwellenkügelchen mit Hilfe von F(ab')2, die an FITC oder an PE konjugiert sind
Material

– F(ab')2 von Schaf-Anti-Maus-Immunglobulinen, die an FITC gekuppelt sind (Silenus, Bez. DDAF)
– F(ab')2 von Schaf-Anti-Maus-Immunglobulinen, die an PE gekuppelt sind (Silenus, Bez. DDAPE)

Verfahren

1. Man pipettiere 2,5 ml beschichtete L300-Kügelchen (Estapor) in Sendo-3 (300 000 Mikrokügelchen/μl) Sendo-3 zu 15 μg/ml für das FITC-Kügelchen Sendo-3 zu 5 μg/ml für das PE-Kügelchen.
2. Man zentrifugiere 8 Minuten lang bei 3000 U/min. Man beseitige den Überstand.
3. Man nehme wieder in 500 μl Puffer PBS BA 1X auf.
4. Man gebe 12,5 ml DDAF oder DDAPE zu 1/100 in PBS BA 1X zu dem Kügelchen-Präparat. Man homogenisiere.
5. Man inkubiere 1 Stunde bei Umgebungstemperatur unter Rotationsrühren.
6. Man führe wie folgt zwei Waschungen durch: Man gebe 25 ml PBS BA 1X dazu. Man zentrifugiere 8 Minuten lang bei 3000 U/min. Man beseitige den Überstand.
7. Man gebe 2,5 ml einer Maus-gamma-Globulin-Lösung (Jackson, #015-000-002) zu 100 μg/ml auf das Kügelchen-Pellet, um die freien Anti-Maus-IgG-Stellen der Reagenzien DDAF und DDAPE zu neutralisieren.
8. Man inkubiere 1 Stunde bei Umgebungstemperatur unter Rotationsrühren.
9. Man führe eine Waschung wie oben beschrieben durch.
10. Man nehme das Kügelchen-Pellet wieder in 2,5 ml PBS BA auf.

c) Herstellung von Schwellenkügelchen mit Hilfe von Fab die an FITC oder an PE konjugiert sind
Material

– Fab von Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinen, die an FITC gekuppelt sind (Protos, Bez. #341)
– Fab von Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinen, die an PE gekuppelt sind (Protos, Bez. #441).

Verfahren
Wie vorstehend, ohne die Schritte 7, 8 und 9.
1.2. Zytometrische Analyse
Die zwei hergestellten Arten von Schwellenkügelchen, FITC und PE, wurden einzeln in PBS BA-Puffer oder in Anwesenheit aller anderer Reagenzien getestet, aus denen das Monoreagenz besteht (MAKs, gekuppelt an FITC oder PE, und 0,85 μm-Positionierungskügelchen A). Die Streuparameter (axiale Streuung hier als FS notiert, senkrechte Streuung hier als SS notiert) werden in logarithmischer Skala mit einem über SS regulierten Diskriminator analysiert.
Die Ergebnisse sind in der 1 mitgeteilt, in der:
1a) eine Analyse der Schwellenkügelchen in PBS BA-Puffer darstellt;
1b) die Analyse von Schwellenkügelchen mit den Kügelchen A in dem Monoreagenz darstellt.
In diesen Figuren entspricht das Fenster R1 den FITC- und PE-Schwellenkügelchen von 3 μm, das Fenster R3 dem Analysefenster der BMP in Doppel streuung, die Kügelchen D den FITC-Schwellenkügelchen und die Kügelchen C den PE-Schwellenkügelchen.
1.3 Schlussfolgerung
Es ist möglich, die Mischung von 3 Kügelchen zu verwenden, die mit FITC und PE markiert sind, um ein Analysefenster (hier als Q2 notiert) von doppelt markierten Elementen zu positionieren. In diesem Beispiel wurde die Schwelle bei FL2 log (vertikale Schwelle) auf dem Niveau des Mittelwerts der Kügelchen D gewählt, die Schwelle bei FL1 log (horizontale Schwelle) wurde gleich 1/3,5 des Mittelwertes der Kügelchen C gewählt.
Die Funktionalität einer extemporanen Assoziation von verschiedenen Kategorien von Kügelchen (3 μm-FITC- und -PE-Schwellenkügelchen, welche es ermöglichen, eine Messzone Q2 zu positionieren, und 0,8 μm-FITC-Kügelchen, welche es ermöglichen, das Analysefenster R3 der BMP zu positionieren), die für die Durchführung des Tests in einem Monoreagenz notwendig sind, wird demonstriert.
Beispiel Nr. 2: Test des Monoreagenz gemäß der Erfindung
2.1 Material

– CD61: P18-FITC (gereinigt und markiert gemäß den dem Fachmann bekannten Standardverfahren) (Reagenz durch 0,1 μm filtriert) P18 (McGregor J. L., Thromb. Haemost. 1987, 58, 507)
– CD41a: P2-PE (Bez. IM1416, Immunotech) P2 (Bez. IM0145, Immunotech)
– Annexin V FITC (Bez. BMS306F1/a, Bender Medsystems)
– 0,85 μm-Positionierungskügelchen A (Kat. VFP 08525 Avidin coated Yellow, Spherotec)
– Schwellenkügelchen (C und D), F(ab')2 FITC- und PE-konjugiert, vorstehend beschrieben
– Puffer CaCl2 1X (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2)
– Puffer CaCl2/EDTA (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 6,2 mM EDTA, pH 7,4)

2.2 Protokoll

1. Man pipettiere 30 μl Vollblut, das auf Natriumcitrat oder EDTA entnommen wurde, und verdünne in PBS BA 1X auf 1/10.
2. Man pipettiere 10 ml MAKs, nicht gekuppelt, oder Puffer (PBS BA 1X oder CaCl2 oder CaCl2/EDTA) dazu.
3. Man inkubiere 10 Minuten bei Umgebungstemperatur.
4. Man gebe 10 μl MAK, gekuppelt an FITC, oder Annexin V, gekuppelt an FITC, dazu.
5. Man pipettiere 10 ml MAKs, gekuppelt an PE, dazu.
6. Man pipettiere 5 μl FITC-Schwellenkügelchen (200 000 Mikrokügelchen/☐l) dazu.
7. Man pipettiere 5 μl PE-Schwellenkügelchen (200 000 Mikrokügelchen/☐l) dazu.
8. Man pipettiere 5 μl 0,85 μm-Spherotec-Kügelchen, verdünnt auf 1/20 in PBS BA 1X, dazu.
9. Man inkubiere 20 Minuten bei Umgebungstemperatur.
10. Man gebe 10 ml Puffer (PBS BA 1X oder CaCl2 oder CaCl2 EDTA) dazu.
11. Zytometrische Analyse: Analysenzeit von 2 Minuten, langsame Fließgeschwindigkeit.

Bemerkung:

1. Im Rahmen dieser Monoreagenz-Assays spielen die Schwellenkügelchen die Rolle der Zählungskügelchen für die BMP.
2. Im Fall der Fixierungsinhibierungen der MAKs, die an Fluorochrome gekuppelt sind, wird eine 10-minütige Vorinkubation der Blutprobe mit den nicht-gekuppelten MAKs durchgeführt.

2.3 Verfahrensbedingungen
Der Test A ermöglicht es, die BMP und die Blutplättchen mit einer Größe unterhalb von oder gleich 0,85 μm und entsprechend den Ereignissen CD61+/CD41a+ zu zählen.
Der Test B ermöglicht es, die BMP und/oder die aktivierten Blutplättchen mit einer Größe unterhalb von oder gleich 0,85 μm entsprechend den Ereignissen Annexin V+/CD41a+ zu zählen. Allein dieser Test ermöglicht es, die Elemente Blutplättchen-Ursprungs, die aus dem Blut abstammen, mit einer Größe unterhalb von oder gleich 0,85 μm und die einen aktivierten Phänotyp darstellen (wegen der Anwesenheit von Phosphatidylserin-Resten an der äußeren Zellmembran von Blutplättchen und von BMP, aufgezeigt durch Annexin V) nachzuweisen.
Die Tests C, D und E ermöglichen es, die Spezifität der Reagenzien CD41a, CD61 bzw. Annexin V festzustellen.
2.4 Test des Monoreagenz in Vollblut
a) Prinzip der Positionierung des Fensters R3 zur Analyse der BMP in Doppelstreuung in Vollblut
Das nachstehende Beispiel erläutert das Prinzip der Analyse von BMP in Doppelstreuung in Vollblut. Die Blutprobe entspricht dem Test A (CD61-FITC/CD41-PE).
Die verschiedenen Schritte der zytometrischen Analyse sind in 2 dargestellt.
Das Fenster R3 zur Analyse der BMP wird mit Hilfe von Singletten von Positionierungskügelchen konditioniert, die im Volumen FITC-fluoreszierend sind (Kügelchen A). Ein breites Fenster R3 in Doppelstreuung wird zuerst um diese Kügelchen herum konditioniert (SCHRITT Nr. 1). Ein Zytogramm FL1-LOG/FL2-LOG, das über R3 konditioniert ist, ermöglicht es, diese Positionierungskügelchen durch ein Fenster R2 in FL1 zu markieren (SCHRITT Nr. 2). Ein Fenster R3 wird dann in Doppelstreuung erneut definiert, und ein Messung des Mittelwerts des Parameters FS log wird über dieser Singletten-Population von Kügelchen A vorgenommen (SCHRITT Nr. 3).
Das Fenster R3 zur Analyse der Blutplättchen-Mikropartikel kann dann gemäß den folgenden Kriterien in Doppelstreuung positioniert werden (SCHRITT Nr. 4):

– Obere Grenze FS-LOG: gleich dem Mittelwert des Parameters FS LOG für die Singletten-Population von Kügelchen A, gemessen im vorangehenden Schritt.
– Untere Grenze FS-LOG: nicht den ersten Kanal des Parameters FS LOG nehmen.
– Obere Grenze SS-LOG: gegen die Singletten-Wolke der Kügelchen A.
– Untere Grenze SS-LOG: Diskriminator über dem Parameter SS LOG, am Minimum reguliert.

Schließlich kann die Analyse in Doppelstreuung der Proben (Vollblut + Monoreagenz) mit den verschiedenen Fenstern der zytometrischen Analysen gemacht werden (SCHRITT Nr. 5).
b. Analyse der Proben
Der Test der Funktionalität des Monoreagenz und der Spezifität seiner Komponenten wurde bei 19 Vollblutproben durchgeführt: 11 Blutproben, die über EDTA entnommen wurden, und 7 Blutproben, die über Natriumcitrat entnommen wurden.
Die Tests A, B, C, D und E wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll ausgehend von auf 1/10 verdünntem Blut durchgeführt.
Die zytometrischen Ergebnisse sind in 3 aufgeführt.
Die quantitativen Ergebnisse sind als Zahl der Ereignisse pro μl Vollblut ausgedrückt.
Die Analyse wird ausgehend von den Elementen ausgedrückt, die im Fenster Q2 gezählt wurden.
– Antikoagulans EDTA
– Antikoagulans Na-Citrat:
– Inhibierungstests (Antikoagulans EDTA):
LITERATURVERZEICHNIS

1. Assembly of the Platelet Prothrombinase Complex Is Linked to Vesiculation of the Platelet Plasma Membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity. P. J. Sims, T. Wiedmer, C. T. Esmon, H. J. Weiss and S. J. Shattil. J. Biol. Chem., Bd. 264, Nr. 29, 17049-17057, 1989.
2. Microparticle generation during in vitro platelet activation by anti-CD9 murine monoclonal antibodies. S. Nomura, H. Nagata, M. Suzuki, K. Kondo, S. Ohga, T. Kawakatsu, H. Kido, T. Fukuroi, K. Yamaguchi, K. Twata, M. Yanabu, T. Soga, T. Kokawa and K. Yasunaga. Thrombosis Research, 62, 429-439, 1991.
3. Platelet microparticles Bind, Activate and Aggregate Neutrophils In Vitro. W. Jy, W. -W. Mao, L. L. Horstman, J. Tao, Y. S. Ahn. Blood Cells, Molecules and Diseases. 21, 217-231, 1995.
4. A new lupus anticoagulant neutralization test based on platelet-derived vesicles. J. Arnout, E. Huybrechts, M. Vanrusselt and J. Vermylen. British Journal of Haematology. 80, 341-346, 1992.
5. Platelet procoagulant activity and microvesicle formation. Its putative role in hemostasis and thrombosis. R. F. A. Zwaal, P. Comfurius and E. M. Bevers. Biochimica et Biophysica Acta. 1180, 1-8, 1992.
6. Demonstration of Platelet-Derived Microvesicles in Blood from Patients with Activated Coagulation and Fibrinolysis Using a Filtration Technique and Western Blotting. P. A. Holme, N. O. Solum, F. Brosstad, M. Roger. Thrombosis and Hemostasis. 72 (5), 666-71, 1994.
7. WO 96/03655 (8. Februar 1996) – Erfinder: J. M. Freyssinet, B. Antoni, F. Donie, H. Lill.
8. Direct Detection of Activated Platelets and Platelet-Derived Microparticles in Humans. C. S. Abrams, N. Ellison, A. Z. Budzyndki and S. J. Shattil. Blood, Bd. 75, Nr. 1, 128-138, 1990.
9. Annexin V as a Probe of Aminophospholipid Exposure and Platelet Membrane Vesiculation: A flow Cytometry Study Showing a Role for Free Sulfhydryl Groups. J. Dachary-Prigent, J. -M. Freyssinet, J. -M. Pasquet, J. -C. Carron and A. T. Nurden. Blood, Bd. 81, Nr. 10, 2554-2565, 1993.
10. Platelet-derived Microvesicles in Thrombotic Thrombocytopenic Purpura and Hemolytic Uremic Syndrome. M. Galli, A. Grassi, T. Barbui. Thrombosis and Hemostasis. 75 (3), 427-31, 1996.
11. A New Flow Cytometry Method of Platelet-derived Microvesicle Quantification in Plasma. V. Combes, F. Dignat-George, M. Mutin, J. Sampol. Thrombosis and Hemostasis. 77, 1, 212-24, 1997.
12. WO 96/15449 (23. Mai 1996) – Erfinder A. D. Michelson, M. R. Barnard.
13. Terminology and Nomenclature for Standardization in Quantitative Fluorescence Cytometry. L. O. Henderson, G. E. Marti, A. Gaigalas, W. H. Hannon, R. F. Vogt Jr., Cytometry, 33: 97-105, 1998.
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LEGENDE DER FIGUREN
14

NON conditionne – NICHT konditioniert:
Double scatter – Doppelstreuung
Fenêtre R1 = Billes C + D – Fenster R1 = Kügelchen C + D
Conditionné sur R1 – Konditioniert über R1
Fluorescence FL1/FL2- Fluoreszenz FL1/FL2
Billes seuils (C + D) conjugées F(ab')₂ FITC et PE-Schwellenkügelchen (C + D), F(ab')₂ FITC- und PE-konjugiert
Conditionné sur R1-Konditioniert über R1
Fluorescence FL1/FL2 – Fluoreszenz FL1/FL2
Billes seuils (C + D) conjugées Fab FITC et PE – Schwellenkügelchen (C + D), F(ab)-, FITC- und PE-konjugiert

1B

NON conditionné – NICHT konditioniert:
Double scatter – Doppelstreuung
Fenêtre R1 = Billes C + D – Fenster R1 = Kügelchen C + D
Fenêtre R3 = Billes A – Fenster R3 = Kügelchen A
Conditionné sur R1 – Konditioniert über R1
Fluorescence FL1/FL2- Fluoreszenz FL1/FL2
Billes seuils (C + D) conjugées F(ab')₂ FITC et PE-Schwellenkügelchen (C + D), F(ab')₂ FITC- und PE-konjugiert
Conditionné sur R1- Konditioniert über R1
Fluorescence FL1/FL2 – Fluoreszenz FL1/FL2
Billes seuils (C + D) conjugées Fab FITC et PE – Schwellenkügelchen (C + D), F(ab)-, FITC- und PE-konjugiert

2

ETAPE #1- SCHRITT Nr. 1
NON conditionné – NICHT konditioniert
Double scatter – Doppelstreuung:
Fenêtre R1 = Billes C + D – Fenster R1 = Kügelchen C + D
Fenêtre R3 = Billes A + Plaquettes – Fenster R3 = Kügelchen A + Blutplättchen
Cellules sanguines – Blutzellen
ETAPE #2 – SCHRITT Nr. 2
Conditionné sur R3 – Konditioniert über R3:
Fenêtre FL1 +/FL2+ = Plaquettes – Fenster FL1 + /FL2 + = Blutplättchen
Fenêtre R2 = Billes A – Fenster R2 = Kügelchen A
ETAPE #3 – SCHRITT Nr. 3
Conditionné sur R2 – Konditioniert über R2:
Double scatter – Doppelstreuung:
Fenêtre R3 = Singlets de billes A – Fenster R3 = Singletten von Kügelchen A

2 (Fortsetzung)

ETAPE #4 – SCHRITT Nr. 4
Conditionné sur R2 – Konditioniert über R2:
Double scatter – Doppelstreuung
Positionnement de Ia fenêtre R3 pour l'alalyse des microparticules – Positionierung des Fensters R3 für die Analyse der Mikropartikel
ETAPE #5 – SCHRITT Nr. 5
NON conditionne – NICHT konditioniert:
Double scatter – Doppelstreuung:
Fenêtre R1 = Billes C + D- Fenster R1 = Kügelchen C + D
Fenêtre R3 = MPP + Plaquettes – Fenster R3 = BMP plus Blutplättchen
Cellules sanguines – Blutzellen

3

NON conditionne – NICHT konditioniert:
Double scatter – Doppelstreuung:
Fenêtre R1 = Billes C + D – Fenster R1 = Kügelchen C + D
Fenêtre R3 = MPP + Plaquettes – Fenster R3 = BMP plus Blutplättchen
Cellules sanguines – Blutzellen
Conditionné sur R1 – Konditioniert über R1:
Fluorescence FL1/FL2: Billes C + Billes D – Fluoreszenz FL1/FL2: Kügelchen C + Kügelchen D
Positionnement des regions – Positionierung der Bereiche

3 (Fortsetzung)

Conditionné sur R3 – Konditioniert über R3:

Claims

Monoreagenz für den Nachweis und die Quantifizierung von Blutplättchen-Mikropartikeln (BMP) in einer Blutprobe mittels Durchflusszytometrie, umfassend: a) ein Reagenz für eine doppelte Markierung der BMP, umfassend: – entweder Annexin V oder jeden anderen Marker, der für Membran-Phospholipide spezifisch ist, gekuppelt an ein Fluorochrom 1, – oder eine Population 1 von MAK, die gegen Blutplättchen-Membranstrukturen gerichtet sind, markiert mit einem Fluorochrom 1 (Reagenz 1a), und eine Population 2 von monoklonalen Antikörpern (MAK), die gegen Blutplättchen-Membranstrukturen gerichtet sind, markiert mit einem Fluorochrom 2 (Reagenz 1 b), und b) ein Reagenz 2, das aus einer Mischung von Mikrokügelchen zusammengesetzt ist, welche umfassen: – eine Population von Mikrokügelchen A, die mit einem der beiden Fluorochrome 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem dieser beiden ähnlich ist, markiert ist und dazu dient, den Analysebereich der BMP bezüglich der Größe (Lichtdiffusionsparameter) zu definieren, und deren Differenzierung ermöglicht (Positionierungskügelchen), – eine Population von Mikrokügelchen B, die nicht markiert oder mit einem der beiden Fluorochrome 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem der beiden ähnlich ist, markiert ist, deren Konzentration bekannt ist und die als innerer Standard zur Zählung der Mikropartikel dient (Zählungskügelchen), – eine Population von Mikrokügelchen C, die allein mit dem Fluorochrom 1 markiert ist und dazu dient, bei dem Fluoreszenzparameter des Fluorochroms 1 die minimale Intensitätsschwelle zu definieren, welche den Analysebereich der Mikropartikel beschränkt, an denen die mit dem Fluorochrom 1 markierten MAK 1 oder Annexin V oder ein anderer, für Membran-Phospholipide spezifischer Marker, markiert mit dem Fluorochrom 1, befestigt sind (Schwellenkügelchen), – eine Population von Mikrokügelchen D mit einem mit C identischen Durchmesser und allein mit dem Fluorochrom 2 markiert, die dazu dient, bei dem Fluoreszenzparameter des Fluorochroms 2 die minimale Intensitätsschwelle zu definieren, die den Analysebereich der Mikropartikel beschränkt, an denen die MAK 2 befestigt sind (Schwellenkügelchen).
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jede Population C und D von Schwellenkügelchen aus zwei Unterpopulationen von Kügelchen mit zwei Niveaus zusammengesetzt ist.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zählungskügelchen einen Durchmesser von größer oder gleich 5 μm aufweisen.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zählungskügelchen einen Durchmesser zwischen 5 und 10 μm einschließlich aufweisen.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionierungskügelchen einen Durchmesser zwischen 1 und 0,5 μm einschließlich aufweisen.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schwellenkügelchen einen Durchmesser von 3 μm aufweisen.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die monoklonalen Antikörper (MAK) der Populationen 1 und 2 gegen Blutplättchen- Membranstrukturen gerichtet sind, die aus den folgenden Spezifitäten ausgewählt sind: CD61, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD49b, CD29, CD62P, CD63, Protein S und Prothrombin.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die MAK-Populationen 1 und 2 aus einem einzigen MAK, aus mehreren MAK der gleichen Spezifität, aber gegen unterschiedliche Epitope gerichtet, oder aus mehreren MAK mit unterschiedlicher Blutplättchen-Spezifität zusammengesetzt sind.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 1 des Monoreagenz der Erfindung aus Annexin V oder einem anderen, für Membran-Phospholipide spezifischen, mit einem Fluorochrom 1 markierten Marker (Reagenz 1a) und einer Population 2 von mit einem Fluorochrom 2 markierten MAK (Reagenz 1b) zusammengesetzt ist.
Monoreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 1 aus mit einem Fluorochrom 1 markiertem Annexin V und einer Population 2 von mit einem Fluorochrom 2 markierten MAK zusammengesetzt ist.
Monoreagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die MAK-Population 2 aus mehreren MAK mit unterschiedlichen Spezifitäten zusammengesetzt ist.
Monoreagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die MAK-Population 2 aus Anti-CD61-MAK und Anti-CD42b-MAK zusammengesetzt ist.
Monoreagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Population 2 aus MAK P18 und 4F8 (Anti-CD61) und SZ2 (Anti-CD42b) zusammengesetzt ist.
Monoreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorochrom 1 FITC ist und das Fluorochrom 2 PE ist.
Monoreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Vollblut ist.
Diagnosekit zum Nachweis und zur Quantifizierung von BMP, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Monoreagenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 umfasst.
Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es darüber hinaus einen Verdünnungspuffer umfasst.
Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – ein Reagenz 1a, das aus einer Population 1 von für Blutplättchen-Membranstrukturen spezifischen MAK oder aus Annexin V oder aus einem anderen, für Membran-Phospholipide spezifischen Marker, die mit einem Fluorochrom 1 markiert sind, zusammengesetzt ist, – ein Reagenz 1b, das aus einer Population 2 von für Blutplättchen-Membranstrukturen spezifischen MAK, die mit einem Fluorochrom 2 markiert sind, zusammengesetzt ist, – ein Reagenz 2, das zusammengesetzt ist aus: • einer Population von Kügelchen zur Positionierung des Analysefensters von BMP, die mit dem Fluorochrom 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem der beiden ähnlich ist, markiert ist, • einer Population von Zählungskügelchen, die nicht markiert oder mit dem Fluorochrom 1 oder 2 oder einem anderen Fluorochrom mit einem Spektrum, das einem der beiden ähnlich ist, markiert ist, • einer Population von Schwellenkügelchen, die vorzugsweise aus zwei Unterpopulationen von Kügelchen mit zwei Niveaus zusammengesetzt ist, welche mit dem Fluorochrom 1 markiert sind, • einer Population von Schwellenkügelchen, die vorzugsweise aus zwei Unterpopulationen von Kügelchen mit zwei Niveaus zusammengesetzt ist, welche mit dem Fluorochrom 2 markiert sind, – ein Reagenz 3, das aus einem Verdünnungspuffer zusammengesetzt ist.
Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 1a aus Annexin V und das Reagenz 1b aus einer Mischung von MAK mit unterschiedlichen Spezifitäten zusammengesetzt ist.
Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 1b aus einer Mischung von Anti-CD61- und Anti-CD42b-MAK zusammengesetzt ist.
Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von BMP, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Vereinigen und Inkubieren einer Blutprobe mit einem Monoreagenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 auf solche Weise, dass man eine Markierung der BMP mit doppelter Farbe erhält, und b) zytometrische Analyse der doppelt markierten Ereignisse.
Verwendung eines Monoreagenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Diagnosekits nach irgendeinem der Ansprüche 16 bis 20 in einem Verfahren zum Nachweis und zur Verfolgung eines prothrombotischen Zustands.