DE69513027T2

DE69513027T2 - Verfahren zur bestimmung des präthrombotischen status

Info

Publication number: DE69513027T2
Application number: DE69513027T
Authority: DE
Inventors: Benedicte Antoni; Frederic Donie; Jean-Marie Freyssinet; Helmut Lill
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Freyssinet SAS
Priority date: 1994-07-23
Filing date: 1995-07-19
Publication date: 2000-03-16
Anticipated expiration: 2015-07-20
Also published as: EP0772778A1; EP0772778B1; JP3574659B2; ATE186121T1; US7005271B1; DE69513027D1; WO1996003655A1; ES2139957T3; JPH10503023A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des präthrombotischen Zustands eines Individuums. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen, ein Verfahren zur Bestimmung einer speziellen Kategorie zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Phospholipid-bindenden Antikörper, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, welche mit einem erhöhten Thromboserisiko verbunden sind.
Thrombose tritt als akutes Ereignis auf, das sich nicht leicht und schnell vorhersagen läßt. Es sind verschiedene vage Bedingungen für die Entwicklung thrombotischer Komplikationen beschrieben, wobei Entzündung die häufigste ist. Veränderungen in den Blut- und/oder Gefäßzellfunktionen stehen wahrscheinlich am Anfang präthrombotischer Zustände und könnten daher unter der Voraussetzung einer eindeutigen Bewertung Hinweise für das damit verbundene Thromboserisiko liefern.
Anionische Phospholipide, vorwiegend Phosphatidylserin, sind für die normale Hämostase essentiell, doch sind sie nahezu vollständig im Innenblatt der Plasmamembran ruhender Blut- und Gefäßzellen sequestriert (Devaux P.F., Static and dynamic lipid asymmetry in cell membranes; Biochemistry 30 (1991), 1163-1173; Zwaal R.F.A. et al., Mechanism and function of changes in membrane-phospholipid asymmetry in platelets and erythrocytes; Biochem. Soc. Trans. 21 (1993), 248-253). Ihr katalytisches Potential beruht auf der Fähigkeit, die charakteristischen Enzymkomplexe der Blutkoagulationskaskade (Fig. 1) am Ort einer Wunde zusammenzusetzen. Bis jetzt wurden fast alle verfügbaren kinetischen Daten von Koagulationsreaktionen bei Phospholipid-Sättigungskonzentrationen gewonnen (Mann K.G. et al., Surface-dependent hemostasis; Semin. Hematol. 29 (1992), 213-226). Dies ist wahrscheinlich nicht das, was man unter physiologischen Bedingungen versteht, und es ist vernünftigerweise zu erwarten, an der Expositionsgrad anionischer Phospholipide ein geschwindigkeitsbeschränkender Faktor sein sollte. An der asymmetrischen Verteilung der verschiedenen Phospholipid- Spezies innerhalb der Plasmamembran könnte ein ATP-abhängiger Aminophospholipid-Transporter beteiligt sein, der als "innere" Aminophospholipid-Translocase bezeichnet wird (Devaux P.F., Static and dynamic lipid asymmetry in cell membranes; Biochemistry, 30 (1991), 1163-1173). Nach geeigneter Stimulierung kann die Exposition anionischer Phospholipide hin zum Außenblatt der Membran stattfinden. Thrombin, Collagen und vor allem die Thrombin+Collagen-Kombination sind die physiologischen Hauptagonisten der Exposition anionischer Phospholipide in Plättchen. Diese erfolgt als Umverteilungsprozeß, der für die Membranumbildung und die Ausschüttung von Mikropartikeln verantwortlich ist (Zwaal R.F.A. et al., Mechanism and function of changes in membranephospholipid asymmetry in platelets and erythrocytes; Biochem. Soc. Trans. 21 (1993), 248-253). Die Phospholipid-Umverteilung und Vesikelbildung könnten die Folge eines vorübergehendem Anstiegs von intrazellulärem Calcium sein. Zudem stimuliert der unlängst beschriebene Thrombin-Rezeptor der Plättchen, der auch in Endothelzellen vorhanden ist, den Calcium-Zustrom (Coughlin S.R. et al., Characterization of a functional thrombin receptor. J. Clin. Invest. 89 (1992), 351-355) und könnte somit an einem solchen Prozeß beteiligt sein. Unter pathologischen Bedingungen könnte der die Grenzmembran angreifende Komplementkomplex C5b-9 ebenfalls das Ausschütten von Mikropartikeln hervorrufen, die einen Teil der anionischen Phospholipide aus Plättchen und Endothel tragen (Zwaal R.F.A. et al., Mechanism and function of changes in membrane-phospholipid asymmetry in platelets and erythrocytes; Biochem. Soc. Trans. 21 (1993), 248-253; Hamilton K. et al., Complement proteins C5b-9 induce vesiculation of the endothelial plasma membrane and expose catalytic surface for assembly of the prothrombinase complex; J. Biol. Chem. 265 (1990), 3809-3814). Weiterhin könnte Endotoxin ein ähn liches Verhalten der Monozyten auslösen (Robinson R.A. et al., Endotoxin enhances the expression of monocyte prothrombinase activity; Blood, 79 (1992), 406-416; Satta N. et al., Monocyte vesiculation, J. Immunol. 153 (1994), 3245-3255: A mechanism for dissemination of membrane-associated procoagulant activities following stimulation by lipopolysaccaride (1994)). Drastischere Bedingungen wie etwa Apoptose und/oder Zell-Lyse führen zu Membranfragmentierung, aus der zirkulierende Partikel mit Phospholipid-abhängiger Prokoagulationswirkung herrühren.
Man nimmt an, daß Phosphatidylserin eine Determinante bei der retikuloendothelialen Erkennung ist und zur Beseitigung zirkulierender Membranbruchstücke führt (Allen T. et al., Phosphatidyl-serine as a determinant of reticuloendothelial recognition of liposome models of the erythrocyte surface; Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 (1988), 8067-8071). Es ist jedoch vorstellbar, daß das retikuloendotheliale System bei fortwährender Zellmembranschädigung überfordert sein könnte und daß überschüssiges anionisches Phospholipid in zunehmendem Maße Koagulationsreaktionen auslösen könnte. Unter diesen Umständen könnte die Freisetzung sequestrierter Phospholipide am Anfang des Thrombose-assoziierten Antiphospholipid-Syndroms stehen (McNeil et al., Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies; Adv. Immunol. 49 (1991), 193-280). Zudem exprimieren einige tumorbildende Zellen größere Mengen an Phosphatidylserin in ihrem äußeren Membranblatt als ihre differenzierten, nicht tumorbildenden Gegenstücke (Connor J. et al., Differentiation-dependent expression of phosphadityl serine in mammalian plasma membranes: Quantitative assessment of outer leaflet lipid by prothrombinase complex formation; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3184-3188). Es wurden bereits mehrere Studien an (zirkulierenden) Mikropartikeln oder Prokoagulationszellen veröffentlicht (Abrams C. und Shattil S.J., Immunological detection of activated platelets in clinical disorders; Thromb. Haemostats. 65 (1991), 67-473; Nomura S. et al., Antiplatelet autoantibody-related microparticles in patients with idiopathic (autoimmune) thrombocytopenic purpura; Ann. Hematol. 62 (1991), 103-107; Nomura S. et al., Microparticle generation during in vitro platelet activation by anti-CD9 murine monoclonal antibodies; Thrombos. Res. 62 (1991), 429- 439; Tans G. et al., Comparison of anticoagulant and procoagulant activities of stimulated platelets and platelet-derived microparticles; Blood 77 (1991), 2641-2648; Gilbert G.E. et al., Platelet-derived microparticles express high affinity receptors for factor VIII; J. Biol. Chem. 266 (1991), 17261- 17268; Bode A.P. et al. Vesiculation of platelets during in vitro aging; Blood 77 (1991), 887-895; Owens M.R. et al., Platelet microvesicles adhere to subendothelium and promote adhesion of platelets; Thrombos. Res. 66 (1992), 247-258; Hoffmann M. et al., Coagulation factor IXa binding to activated platelets and platelet-derived microparticles: a flow cytometric study; Thromb. Haemostas. 68 (1992), 74-78; Jy W. et al., Clinical significance of platelet microparticles in autoimmune thrombocytopenias; J. Lab. Clin. Med. 119 (1992) 334-345; Borenstain-Ben Yashar V. et al., Phosphatidyl serine in the outer leaflet of red blood cells from β-thalassemia patients may explain the chronic hypercoagulable state and thrombotic episodes; Am. J. Hematol. 44 (1993), 63-65; Wiedmer T. et al., Complement-induced vesiculation and exposure of membrane prothrombinase sites in platelets of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; Blood 82 (1993) 1192-1196; Lee Y. et al., Elevated microparticles in transient ischemic attacks, lacunar infarcts, and multiinfarct dementias; Thrombosis Res. 72 (1993) 295-304; Galli M. et al., Effect of antiphospholipid antibodies on procoagulant activity of activated platelets and platelet-derived microparticles; Br. J. Haemotol. 83 (1993), 466-472; Rajesekhar D. et al., Procoagulant activity of platelet-derived microparticles in whole blood: Differences between adults and neonates; Blood 82 (1983), 163a; Jy W. et al., Platelet microparticles adhere to polymorphonuclear leukocytes: Possible mode of clearance; Blood 82 (1993), 281a; Jy W, et al., Procoagulant activity of platelet microparticles (PAPM) correlates with thrombotic risks; Blood 82 (1993), 281a) und ihre klinische Bedeutung wurde diskutiert (Zucker-Franklin D., Clinical significance of platelet microparticles; J. Lab. Clin. Med. 119 (1992), 321-322). In einer der obigen Studien (Lee Y. et al., Elevated microparticles in transient ischemic attacks, lacunar infarcts, and multiinfarct dementias; Thrombosis Res. 72 (1993) 295-304) erschien die pharmakologische Kontrolle des Ausmaßes der Plättchen-Vesikelbildung durchführbar. Im Gegensatz zur Neigung zur Membran-Vesikelbildung und Phosphatidylserin-Exposition ist das Scott-Syndrom, eine seltene Blutungsstörung, durch eine verminderte Fähigkeit von Plättchen, Erythrozyten und Lymphozyten gekennzeichnet, eine angemessene membranassoziierte Prokoagulationswirkung zu präsentieren (Bevers E.M. et al., Defective Ca²&spplus;-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant acitivity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: A study of the red blood cells of Scott syndrome; Blood 79 (1992), 380-388).
Die Bildung von Thrombin ist der Kulminationspunkt der Koagulationskaskade, hauptsächlich aufgrund eines hohen Selbstverstärkungspotentials, das sich in mehreren Rückkopplungschleifen ausdrückt (Mann K.G., Krishnaswamy S. und Lawson J.H., Surface-dependent hemostasis; Semin. Hematol., 12 (1992), 213-226), von denen eine zur Exposition von Prokoagulationsphospholipiden durch und aus Plättchen führt (Zwaal R.F.A., Comfurius P. und Bevers E.M., Mechanism and function of changes in membrane-phospholipid asymmetry in platelets and erythrocytes; Biochem. Soc. Trans. 21 (1993), 248-253). Übermäßige Thrombin-Bildung läßt sich mit Hilfe zweier unterschiedlicher Mechanismen kontrollieren, entweder durch direkte Neutralisierung durch Antithrombine oder durch das Antikoagulationsprotein C, das die Fähigkeit zum Abbau der Prokoagulationscofaktoren Villa und Va nach Aktivierung durch Thrombin selbst annimmt (Fig. 1) (Mann K.G., Krishnaswamy S. und Lawson J.H., Surface-dependent hemostasis; Semin. Hema tol. 29 (1992), 213-226; Esmon C.T., The roles of protein C and thrombomodulin in the regulation of blood coagulation; J. Biol. Chem. 264 (1989), 4743-4746). Eine Zunahme aktivierter/stimulierter Zellen und zirkulierender Prokoagulationszellfragmente könnte zu übermäßiger Thrombin-Bildung im frühen Stadium nach der Zellschädigung oder Aktivierung führen. Eine zusätzliche Exposition von Prokoagulationsphospholipiden könnte dann zu einer Folge der verstärkten Thrombin-Produktion werden. Dies sollte bei der Erklärung förderlich sein, wie sequestrierte Phospholipide nach der Exposition ein antigenes Potential annehmen können, besonders mit dem Hinweis, daß die resultierenden Phospholipid-bindenden Antikörper mit Thrombose in Zusammenhang stehen (McNeil et al., Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies; Adv. Immunol. 49 (1991), 193-280). Eine mögliche Erklärung könnte in der Störung von Antiphospholipid-Antikörpern auf dem Weg von Antikoagulationsprotein C liegen (Freyssinet J.-M. et al., An IgM lupus anticoagulant that neutralizes the enhancing effect of phospholipids on purified endothelial thrombomodulin. A mechanism for thrombosis; Thromb. Haemostats. 55 (1986), 309-313), wie mehrere Forschergruppen bestätigen, doch sollten andere Mechanismen nicht ausgeschlossen werden (McNeil et al., Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies; Adv. Immunol. 49 (1991), 193-280). Nach der Exposition könnte Phosphatidylserin bestimmte Plasmaproteine binden, unter Bildung komplexer Antigene. Die Vielfalt dieser möglichen Komplexe könnte die Vielfalt der zugehörigen klinischen Manifestationen mit der Gegenwart gebildeter Antikörper erklären (Freyssinet J.-M. et al., Phospholipid-binding antibodies and thrombosis; Blood Coagulat. Fibrinol. 4 (1993), 645-648).
Die bisherigen Verfahren zur Analyse von Koagulationsreaktionen bestehen überwiegend in der Bestimmung einer Gerinnungszeit wie z. B. der Prothrombinzeit. Diese Bestimmungen liefern keine Informationen über die Prokoagulationswirkung oder den präthrombotischen Zustand eines Individuums, da - wie vor stehend erwähnt - die Daten bei Sättigungsphospholipid-Konzentrationen gewonnen wurden.
Die WO 93/24840 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Prokoagulationswirkung ruhender Plättchen auf der Grundlage der Verfügbarkeit negativ geladener Phospholipide in der äußeren Membran von Plättchen. Die Menge an Prokoagulationsphospholipiden in Vollblut ist gering, da ruhende Plättchen über einen Mechanismus verfügen, der das Phosphatidylserin vom äußeren zum inneren Blatt der Membran transportiert. Eine kleinere Menge Phosphatidylserin ist wahrscheinlich noch im Außenblatt vorhanden und bewirkt eine Restprokoagulationswirkung der Plättchen. Aus dieser Rest- oder Ruhewirkung ergibt sich eine Schwelle, oberhalb derer aktivierte Gerinnungsfaktoren zu Thrombose führen können. Somit kann die Anfälligkeit einer Person, eine Thrombose zu erleiden, mit der Stärke der Prokoagulationswirkung der Plättchen in Zusammenhang stehen.
Es gibt allerdings keinen absoluten Beweis dafür, daß bei dieser Methode über die Bestimmung der Aktivität ruhender Plättchen eine direkte Beziehung zum präthrombotischen Zustand einer Person vorliegt. Es besteht daher noch immer ein Bedarf an einer einfachen und direkteren Methode zur Bestimmung des präthrombotischen Zustands einer Person. Da nicht nur die Plättchen bei der Koagulationsreaktion aktiviert werden und Phospholipid-reiche Mikropartikel oder Fragmente freisetzen, besteht auch noch immer ein Bedarf an einer Methode zur Bestimmung der Herkunft der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen oder den Fragmenten derselben im Blut eines Individuums.
Dachray-Prigent et al., Blood 81(10) (1993), 2554-2565, beschreiben die Verwendung von markiertem Annexin V oder eines monoklonalen Antikörpers VH10 zur Bindung von Plättchen oder daraus stammenden Mikropartikeln. Annexin V oder der monoklonale Antikörper VH10 wurde mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, und die Bindung dieser Rezeptoren wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie bestimmt. Dieses Verfahren ermöglicht eine qualitative Analyse der Exposition von Phosphatidylserin an der Oberfläche von Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen mit Hilfe der Durchflußzytometrie.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein einfaches und schnelles Verfahren zur Bestimmung des präthrombotischen Zustands einer Person, zur Diagnose verschiedener Gefäßkrankheiten wie z. B. Verschluß peripherer Arterien, Arteriosklerose, diabetische Angiopathie, Vaskulitis, Präeklampsie, Lupus erythematodes oder Angina pectoris, sowie zur Diagnose und Überwachung des Zustands einer Person nach einer PTCA (perkutane transluminale Koronarangioplastie) zu finden.
Einige Autoimmunstörungen und andere Krankheiten wie beispielsweise Infektionen, Entzündungen, Neoplasie-Myokardinfarkt-Anfälle oder vorübergehende ischämische Anfälle, Venenthrombosen, Arterienthrombosen, Schwangerschaftsvoruntersuchungen, Bindegewebskrankheiten, Thrombozytopenie, orale Empfängnisverhütungstherapie, Migräne/Konfschmerzen oder pulmonale Hypertonie stehen in Zusammenhang mit dem Auftreten Phospholipid-bindender Antikörper. Phospholipid-bindende Antikörper sind heterogene Immunglobuline der Klasse G, M oder A. Einige dieser Autoantikörper erkennen Phospholipide (anionische oder/und hexagonale Phase) in Verbindung mit anderen Proteinen, die an der äußeren Oberfläche von Mikropartikeln und/oder Prokoagulationszellen präsentiert werden können. Beispiele für diese Proteine sind β&sub2;-GP-I (β&sub2;-Glycoprotein-I), Prothrombin, Protein C und Protein S (Triplett, D.A., Antiphospholipid antibodies and thrombosis. A consequence, coincidence, or cause? Arch. Pathol. Lab. Med. 1993, 117, 78-88; Oosting et al., Antiphospholipid antibodies directed against a combination of phospholipids with prothrombin, protein C, protein S, An explanation for their pathogen ic mechanisms; Blood 1993, 81, 2618-2625). Es besteht Bedarf an einem einfachen Verfahren zum Nachweisen dieser Phospholipid-bindenden Antikörper.
Apoptose - oder programmierter Zelltod - kann vermehrt zu zirkulierenden Phosphatidylserin enthaltenden Zellfragmenten führen (sogenannte apoptotische Körper). Der Nachweis zirkulierender apoptotischer Körper, die freiliegendes Phosphatidylserin tragen, könnte für die Diagnose einer hochgradigen in vivo-Apoptose hilfreich sein, die mit wesentlichen Krankheiten wie etwa AIDS, Krebs, Autoimmunstörungen oder Arteriosklerose in Zusammenhang steht. Das Ausmaß der zirkulierenden apoptotischen Körper könnte die Entstehung oder Entwicklung der Krankheit anzeigen, besonders dann, wenn sich die zelluläre Herkunft der Mikropartikel bestimmen läßt.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein einfaches und schnelles Verfahren zur Bestimmung des präthrombotischen Zustands eines Individuums, zur Diagnose verschiedener Gefäßkrankheiten wie z. B. Verschluß peripherer Arterien, Arteriosklerose, diabetische Angiopathie, Vaskulitis, Präeklampsie, Lupus erythematodes oder Angina pectoris, sowie zur Diagnose und Überwachung des Zustands einer Person nach einer PTCA (perkutane transluminale Koronarangioplastie) bereitgestellt, indem die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen bestimmt werden. Es hat sich gezeigt, daß die Menge der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen im Blut eines Individuums mit dem präthrombotischen Zustand dieses Individuums sowie mit den obenerwähnten Gefäßkrankheiten in Zusammenhang steht. Diese Analysen könnten auch zur Diagnose von Risikofaktoren und zur Überwachung des Zustands einer Person nach einer PTCA angewandt werden. Mit diesem Verfahren ist es auch möglich, zirkulierende apoptotische Körper unterschiedlicher Herkunft zu bestimmen, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, die zu Zellschädigung führen, wie beispielsweise AIDS, Krebs, Autoimmunstörungen oder Arteriosklerose. Zudem ist der Begriff Mikropartikel so zu verstehen, daß auch diese apoptotischen Körper unterschiedlicher Herkunft darunter fallen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen bereit, bei dem eine die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltende Probe mit einem spezifischen Rezeptor für eine auf den Mikropartikeln und Prokoagulationszellen präsentierte Verbindung vermischt wird, wobei der Rezeptor unter solchen Bedingungen direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden ist, daß ein Komplex des an die feste Phase gebundenen Rezeptors und dem Mikropartikel oder der Prokoagulationszelle gebildet wird, die feste Phase von der flüssigen Phase getrennt und die Menge an Mikropartikeln und/oder Prokoagulationszellen auf der festen Phase oder nach Abtrennung der festen Phase mit Hilfe geeigneter Methoden bestimmt wird (Fig. 2).
Neben dieser heterogenen Bestimmungsmethode ist auch die Anwendung homogener Verfahren möglich, d. h., Verfahren, bei denen keine Trennung der festen Phase von einer flüssigen Phase notwendig ist. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen bereit, bei dem eine die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltende Probe mit einem spezifischen Rezeptor für eine auf den Mikropartikeln und/- oder stimulierten Prokoagulationszellen präsentierte Verbindung unter solchen Bedingungen vermischt wird, daß ein Komplex der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen und dem Rezeptor gebildet wird, und die Menge an Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen mit Hilfe geeigneter Methoden bestimmt wird. Sollte eine Präzipitation oder Agglutination auftreten, so muß der Rezeptor wenigstens bivalent sein. In diesem Fall kann die Menge an Mikropartikeln und/oder stimulierten Pro koagulationszellen mit Hilfe einer nephelometrischen oder turbidimetrischen Messung bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Variante des obigen Tests angewandt werden, um eine spezielle Kategorie zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen zu bestimmen, bei der eine die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltende Probe mit einem spezifischen Rezeptor 1 für eine auf den Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentierte Verbindung vermischt wird, wobei der Rezeptor unter solchen Bedingungen direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden ist, daß ein Komplex des an die feste Phase gebundenen Rezeptors 1 und dem Mikropartikel oder der Prokoagulationszelle gebildet wird, gegebenenfalls die feste Phase von der flüssigen Phase abgetrennt wird, ein Rezeptor 2 an die Mikropartikel und/oder Prokoagulationszellen gebunden wird, wobei Rezeptor 2 für einen Marker der speziellen Kategorie der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen spezifisch ist, und der Komplex aus Rezeptor 1, Mikropartikeln oder stimulierten Prokoagulationszellen und Rezeptor 2 mit Hilfe geeigneter Methoden bestimmt wird (Fig. 2).
Bei einer weiteren Variante des Tests zur Bestimmung der speziellen Untergruppe oder Kategorie der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen wird die Probe mit einem Rezeptor für eine auf den Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen präsentierte untergruppenspezifische Verbindung vermischt, und die Bindung der zirkulierenden Mikropartikel oder stimulierten Prokoagulationszellen an den Rezeptor wird mit Hilfe geeigneter Methoden bestimmt. Der untergruppenspezifische Rezeptor muß auf eine Verbindung gerichtet sein, die nur auf zirkulierenden Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen und nicht auf ruhenden Zellen präsentiert wird. Beispiele für diese Rezeptoren sind Annexin V für freiliegende Prokoagulationsphospholipid-Flecke, spezifische Antikörper für die aktive/funktionelle Konformation des Plättchenmembran-Glycoproteinkomplexes GPIIb/IIIa oder der Monozyten- oder Lymphozytenadhäsionsrezeptor LFA-1 oder endotheliales Thrombomodulin.

o Annexin V und Prokoagulationsphospholipid-Fleck:

Dachary-Prigent J. et al., Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups; Blood 81, 2554-2565.

o GPIIb/IIIa:

Abrams C. und Shattil S.J., Immunological detection of activated platelets in clinical disorders; Thromb. Haemostats. 65 (1991), 67-473.

o LFA-I:

Sattan N. et al., Monocyte vesiculation, J. Immunol. 153 (1994), 3245-3255: A mechanism for dissemination of membrane-associated procoagulant activities following stimulation by lipopolysaccaride (1994), vorgelegt; Hedman H. und Lundgren E., Regulation of LFA-I activity in human B cells; J. Immunol. 149 (1992), 2295-2299.

o Thrombomodulin:

Hamilton K. et al., Complement proteins C5b-9 induce vesiculation of the endothelial plasma membrane and expose catalytic surface for assembly of the prothrombinase complex; J. Biol. Chem. 265 (1990), 3809-3814.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Variante des obigen Tests angewandt werden, um Phospholipid-bindende Antikörper in einer Blutprobe nachzuweisen, umfassend das Mischen der Blutprobe mit Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen unter Bedingungen, die das Binden von in der Blutprobe vorhandenen Phospholipid-bindenden Antikörpern an die Mikropartikel, stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen ermöglichen, und Bestimmen der Phospholipid-bindenden Antikörper mit Hilfe geeigneter Methoden (Fig. 3).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der Nachweis und die Charakterisierung stimulierter oder aktivierter Blut- und/oder Gefäßzellen und ausgeschütteter Prokoagulationsmikropartikel kann als Schlüsselschritt zum Verständnis der Thrombosepathogenese erachtet werden. Zirkulierende stimulierte oder aktivierte (die beiden Begriffe können verwendet werden, um das gleiche auszudrücken) Prokoagulationszellen oder von diesen stammende Fragmente und Mikropartikel treten als Marker präthrombotischer Zustände auf und verbreiten auch Koagulationsreaktionen. Ein derartiges duales Verhalten erfordert eine Bewertung auf quantitativer und qualitativer Grundlage. Das Nachweisverfahren muß schnell sein, um die Entwicklung einer Thrombose in angemessener Weise verhindern zu können.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung des präthrombotischen Zustands einer Person und zur Diagnose verschiedener Gefäßkrankheiten und Risikofaktoren sowie zur Überwachung des Zustands eines Individuums nach einer PTCA bereitgestellt, bei dem die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen bestimmt werden. Der Begriff Mikropartikel steht für kleine Teilchen, die von stimulierten Prokoagulationszellen, hauptsächlich Plättchen, durch Ausschüttung von Mikropartikeln stammen (Zwaal R.F.A et. al., Mechanism and function of changes in membrane-phospholipid asymmetry in platelets and erythrocytes; Biochem. Soc. Trans. 21 (1993), 248-253). Der Begriff Prokoagulationszellen steht für ganze stimulierte Prokoagulationszellen und Fragmente derselben, die anionische Phospholipide auf ihrer äußeren Oberfläche präsentieren. Unter den Begriff Mikro partikel gemäß dieser Definition fallen auch die vorstehend beschriebenen apoptotischen Körper unterschiedlicher Herkunft.
Für die Bestimmung dieser Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen kann jede geeignete Methode angewandt werden, etwa homogene oder heterogene Immunassays oder funktionelle Tests.
Da die Konzentration der zirkulierenden Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen im Blut recht niedrig ist, wird bevorzugt, daß der erste Schritt des vorliegenden Verfahrens das Binden der Mikropartikel oder Zellen an eine feste Phase durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor ist. Dadurch wird eine Konzentrierung und Trennung der Mikropartikel und Zellen von anderen Blutzellen und anderen Verbindungen im Blut oder in den Gefäßen möglich.
Gleichwohl ist es auch möglich, die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen mit Hilfe eines homogenen Verfahrens ohne einen dazwischenliegenden Trennungsschritt zu bestimmen. Zum Beispiel können die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen mit Hilfe eines wenigstens bivalenten Rezeptors präzipitiert oder agglutiniert werden. Präzipitation oder Agglutination können direkt, beispielsweise mit Hilfe nephelometrischer oder turbidimetrischer Messungen gemessen werden. Es besteht auch die Möglichkeit, die Konzentration mit anderen homogenen Verfahren, etwa einem (Elektro)Chemilumineszenz-Verfahren (EP-A-0 580 979, WO 87/06706) zu messen. In diesem Fall kann der Rezeptor auch monovalent sein.
Als spezifischer Rezeptor kann jeder Rezeptor verwendet werden, der an ein natürlich vorkommendes Molekül auf der Oberfläche der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen bindet. Ein solches Molekül muß für die Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen spezifisch sein. Spezi fisch heißt, daß dieses Molekül oder dieser Marker nur auf diesen Mikropartikeln oder Zellen und nicht auf ruhenden Zellen, z. B. auf ruhenden Plättchen präsentiert werden darf, oder daß dieses Molekül oder dieser Marker im Vergleich zu den Vorläuferzellen in größerer Menge an der Oberfläche der Mikropartikel oder stimulierten Zellen präsentiert wird. Vorzugsweise ist der Rezeptor auf Phospholipide an der Oberfläche der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen gerichtet. Annexin, insbesondere Annexin V, ein Phospholipid- und Calcium-bindendes Protein, das auch als Plazenta- Antikoagulationsprotein-I oder vaskuläres Antikoagulationsprotein-α bezeichnet wird (Barton G.J. et al., Amino acid sequence analysis of the annexin super-gene family of proteins; Eur. J. Biochem. 198 (1991), 749-760), wurde als Struktur- und funktionelle Sonde (Mosser G. et al., Sub-domain structure of lipid-bound annexin-V resolved by electron image analysis; J. Mol. Biol. 217 (1991), 241-245; Ravanat C. et al., Use of annexin-V and its binding to lipid vesicles; J. Mol. Biol. 226 (1992), 1271-1278; Ravanat C. et al., A neutron solution scattering study of the structure of annexin-V to demonstrate the role of phosphatidylserine exposure in the maintenance of haemostatic balance by endothelial cells; Biochem J. 282 (1992), 7-13; Freyssinet J.-M. et al., The catalytic role of anionic phospholipids in the activation of protein C by factor Xa and expression of its anticoagulant function in human plasma; Blood Coagulat. Fibrinol. 2 (1991), 691-698) für katalytische Phospholipide bei Koagulationsreaktionen charakterisiert. Aufgrund seiner ausgeprägten Fähigkeit, mit Vitamin K-abhängigen Proteinen um die Bindung an Oberflächen mit anionischen Phospholipiden zu konkurrieren, verhält sich Annexin V in Gegenwart von Calcium wie ein starker Antagonist in Phospholipid-abhängigen Koagulationsreaktionen (Ravanat C. et al., A neutron solution scattering study of the structure of annexin-V to demonstrate the role of phosphatidylserine exposure in the maintenance of haemostatic balance by endothelial cells; Biochem. J. 282 (1992), 7-13). Es war deshalb überraschend, daß Annexin V bei einem diagnostischen Verfahren zur Bestimmung von Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen ohne negative Veränderung der Phospholipid-abhängigen Koagulationsreaktion eingesetzt werden kann. Weitere spezifische Rezeptoren sind zum Beispiel Phospholipid-bindende Antikörper oder Antikörper, die gegen in die Phospholipide der Mikropartikel eingebettete Proteine gerichtet sind.
Die spezifischen Rezeptoren, etwa Annexin, insbesondere Annexin V, oder die spezifischen Antikörper für die an der Oberfläche der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen präsentierten Verbindungen können mit Hilfe in der Fachwelt bekannter Methoden wie etwa Adsorption oder kovalente Verknüpfung über bifunktionelle Agenzien direkt auf die Oberfläche einer festen Phase aufgebracht werden. Bevorzugt wird die indirekte Bindung der spezifischen Rezeptoren an die feste Phase, weil dadurch die Verwendung universell beschichteter fester Phasen wie z. B. Streptavidin-beschichteter fester Phasen möglich wird, und weil eine Vorinkubation des spezifischen Rezeptors mit der Probe in flüssiger Phase möglich ist. In einigen Fällen konnte auf diese Weise die Bindung des Rezeptors an die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen verbessert werden. Der spezifische Rezeptor ist in diesem Fall über ein spezifisches Bindungspaar an die feste Phase gebunden, umfassend ein erstes und zweites Bindungspaarelement (Bpe). Das erste Bpe ist an die feste Phase gebunden und das zweite Bpe ist mit dem spezifischen Rezeptor verknüpft. Beispiele für spezifische Bindungspaare sind in der Fachwelt bekannt, zum Beispiel Hapten/Antikörper, Enzym/Substrat, Enzym/Hemmstoff, Antigen/Antikörper, Avidin oder Streptavidin/Biotin und Zucker/Lektin. Bevorzugt ist die Verwendung von Avidin oder Streptavidin/Biotin als spezifisches Bindungspaar (Fig. 2). Das Verfahren des Bindens von Avidin oder Streptavidin und des Verknüpfens von Biotin mit Proteinen und anderen Molekülen ist in der Fachwelt wohlbekannt, zum Beispiel Bayer und Wilchek, Methods of Biochemi cal Analysis (1980) 26, 1-45. Streptavidin-beschichtete Röhrchen oder Mikrotiterplatten sind im Handel erhältlich.
Als feste Phase können beispielsweise Röhrchen, Perlen, Mikrotiterplatten oder Mikroträger aus Kunststoff, z. B. Polystyrol, Polyvinyl, Polypropylen, Polycarbonat, Polysaccharid, Silicon, oder Glas verwendet werden (E.T. Maggio, Enzyme Immunoassays, CAP. Press, Florida (1980), 175-180; EP-A- 0 063 064; Bioengineering 16 (1974), 997-1003; und Sonderson und Wilson, Immunology 20 (1971), 1061-1065). Die Mikroträger können als kleine Säulen verwendet werden.
Als Probe ist die Verwendung von Vollblut oder Plasma möglich. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von plättchenarmem Plasma. Vorzugsweise wird die Probe mit einer Antikoagulationslösung ergänzt, die beispielsweise Inhibitoren für Thrombin und Faktor Xa enthält. Die Zusammensetzung der Antikoagulationslösung für die Blutprobennahme sollte die Plättchenaktivierung auf einem möglichst niedrigen Niveau halten.
Die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen werden abgefangen, indem die Probe mit dem an die feste Phase gebundenen spezifischen Rezeptor inkubiert wird oder die Probe mit einem löslichen spezifischen Rezeptor inkubiert und der Rezeptor danach an die feste Phase gebunden wird. Die Inkubationszeit richtet sich nach dem spezifischen Rezeptor, d. h., seiner Affinität, und nach der Form der festen Phase. Bei Verwendung von biotinyliertem Annexin V, das an eine Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatte gebunden ist, ist eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur angemessen. Zur optimalen Bindung von Annexin V an Aminophospholipide sollten während des Inkubierens freie Calcium- Ionen in einer Menge von wenigstens 1 mM, jedoch nicht mehr als 10 mM vorhanden sein.
Nach dieser Inkubationszeit sollte die feste Phase gespült werden, um nichtgebundene Probenverbindungen zu entfernen.
Dabei kann eine Pufferlösung mit physiologischen Salz-Konzentrationen und Calcium-Ionen verwendet werden, zum Beispiel 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,1 M NaCl und 1 mM CaCl&sub2;.
Nach dem Abfangen der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen kann die Menge dieser Verbindungen direkt auf der festen Phase oder nach der Abtrennung der Verbindungen von der festen Phase bestimmt werden. Bei Verwendung von Röhrchen oder Mikrotiterplatten als feste Phase wird bevorzugt, die Menge direkt auf dieser festen Phase zu bestimmen. Bei Verwendung einer kurzen Säule, die mit Mikroträgern als feste Phase gefüllt ist, wird bevorzugt, die Mikropartikel und/oder aktivierten Zellen von der Säule zu eluieren und danach die Menge im Eluat zu bestimmen. Da die Messung direkt auf der festen Phase schneller ist, ist diese Methode zweckmäßiger und wird bevorzugt.
Zur Bestimmung der Menge der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen auf der festen Phase oder nach Abtrennung der festen Phase ist jede geeignete Methode zweckmäßig. Vorzugsweise werden die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen über ihre Prokoagulationsaktivität bestimmt, die auf der Verfügbarkeit anionischer Phospholipide in der äußeren Membran der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen beruht (Fig. 2). Die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen werden mit einem Substrat inkubiert, das durch ein Enzym oder einen Enzymkomplex aktiviert werden kann, das/der Prokoagulationsphospholipid-abhängig ist, wie z. B. Prothrombin (Faktor II). Es werden weitere Enzyme, Coenzyme und Kationen, wie z. B. Faktor V, Faktor Xa und Calcium-Ionen zugesetzt, welche für die Aktivierungsreaktion erforderlich sind. Die Prothrombin-Aktivierung ist linear abhängig von der Menge der anionischen Prokoagulationsphospholipide in der Probe. Es wird bevorzugt, die Mikropartikel und/oder stimulierten Zellen in einem ersten Schritt mit einer Mischung aus den erforderli Text fehlt
bin (Faktor II), Faktor V, Faktor Xa und Calcium-Ionen zu inkubieren. Nach einer vorbestimmten Inkubationszeit wird die Aktivierung von Prothrombin (Faktor II) zu Thrombin (Faktor IIa) beispielsweise durch Komplexierung der Calcium-Ionen gestoppt. Ein bevorzugter Komplexbildner ist EDTA. Danach wird ein chromogenes Substrat zugesetzt, das durch Thrombin hydrolysierbar ist, und die Freisetzung des Chromophors wird durch Aufzeichnen der Extinktionsänderung gemessen. Chromogene Substrate für Thrombin sind in der Fachwelt wohlbekannt, zum Beispiel Chromozym® TH (Tos-Gly-Pro-Arg-p-nitroaniliddihydrochlorid) oder D-Phe-pipecolyl-Arg-p-nitroanilid-dihydrochlorid. Der Assay zur Phospholipid-abhängigen Prothrombin-Umwandlungsaktivität erfolgte in Anlehnung an Connor J. et al., Differentiation-dependent expression of phosphaditylserine in mammalian plasma membranes: Quantitative assessment of outer leaflet lipid by prothrombinase complex formation; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3184-3188. Die Konzentration der verschiedenen Reagenzien ist derart, daß über einer weiten Konzentrationsbereich der präsentierten Prokoagulationsphospholipide Linearität gewahrt ist. Die bevorzugte Endkonzentration der jeweiligen Verbindungen beträgt 2,5 uM für Faktor II, 33 pM für Faktor V, 11 pM für Faktor Xa, 1,3 mH für CaCl&sub2;, 5 mM für EDTA und 70 für Chromozym® TH (Connor J. et al., Differentiation-dependent expression of phosphaditylserine in mammalian plasma membranes: Quantitative assessment of outer leaflet lipid by prothrombinase complex formation; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3184- 3188).
Die Bestimmung der Mikropartikel und/oder stimulierten Zellen über ihre Prokoagulationsaktivität kann allgemein angewandt werden, z. B. Mikropartikel und/oder Zellen, die an eine feste Phase gebunden sind oder aus einer festen Phase freigesetzt werden.
Zur Bestimmung der an die feste Phase gebundenen Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen wird auch bevorzugt, einen zweiten Rezeptor einzusetzen, der spezifisch für ein Molekül an der Oberfläche der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen ist. Der Nachweis wird mit Hilfe eines Sandwich-Assay durchgeführt, der in der Fachwelt wohlbekannt ist. Der zweite Rezeptor kann der gleiche wie der erste Rezeptor sein, oder er kann auf ein anderes Molekül oder Epitop gerichtet sein, das an der Oberfläche der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen präsentiert wird. Das an der Oberfläche der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen präsentierte Molekül kann ein Molekül sein, das spezifisch für diese Zellen ist, d. h., ein Molekül, das nicht oder in weit geringerem Ausmaß auf ruhenden Zellen vorhanden ist. Dieses Molekül kann auch ein gewöhnliches Molekül sein, das auf stimulierten und ruhenden Zellen präsentiert wird. Notwendig ist nur, daß einer der beiden beim Sandwich-Assay verwendeten Rezeptoren für die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen spezifisch ist. Dies kann der erste oder der zweite Rezeptor sein.
Zur Bestimmung der Gesamtmenge der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen ist die Verwendung eines Rezeptors bevorzugt, der auf Verbindungen gerichtet ist, die allen Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen gemeinsam sind. Vorzugsweise ist der zweite Rezeptor ein Antikörper oder Annexin V. Bevorzugt sind Antikörper, die auf anionische Phospholipide (Rote et al., Immunologic detection of phosphadityl serine externalization during thrombininduced platelet activation; Clin. Immunol. Immunopathol. 66 (1993), 193-200; Nomura et al., Antiphospholipid antibodies bind to platelet microparticles in idiopathic autoimmune thrombocytopenic purpura; Ann. Hematol. 65 (1992)) oder Annexin V gerichtet sind (Dachary-Prigent J. et al., Annexin-V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups; Blood 81, 2554-2565).
Die Bindung des zweiten Rezeptors wird mit Hilfe geeigneter Methoden erfaßt. Der zweite Rezeptor kann mit einem Enzym, (elektro)chemilumineszenz-, fluoreszenz- oder mit irgendeiner anderen Markierung markiert ein. Es ist auch möglich, eine indirekte Markierung zu verwenden, z. B. einen Rezeptor, beispielsweise einen Antikörper, der auf den zweiten Rezeptor gerichtet ist, welcher mit den vorstehend genannten Markierungen markiert ist. Diese indirekte Markierung hat den Vorteil, daß eine "universelle Markierung", zum Beispiel ein markierter Anti-Fc-Antikörper verwendet werden kann. Beispiele und Methoden für die direkte oder indirekte Markierung des zweiten Rezeptors sind in der Fachwelt bekannt (Coligan J.E., Kruibeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. und Strober W. (1992, 1994), Current protocols in Immunology; Wiley Interscience, New York).
Bei der homogenen Methode zur Bestimmung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen wird die Probe mit einem spezifischen Rezeptor inkubiert. Dieser Rezeptor muß auf ein Molekül gerichtet sein, das allen Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen gemeinsam ist, zum Beispiel anionische Phospholipide.
Im Falle einer Agglutinations- oder Präzipitationsreaktion muß der Rezeptor wenigstens bivalent sein, um die Verbrückung wenigstens zweier Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen zu ermöglichen, was zur Präzipitation oder Agglutination führt. Der Rezeptor ist vorzugsweise ein Antikörper. Es ist auch möglich, monovalente Rezeptoren wie etwa Annexin V oder bivalente Rezeptoren zu verwenden, die vernetzt oder an Träger gebunden sind, um Rezeptorkomplexe zu bilden, die wenigstens bivalent sind. Die Methoden zum Vernetzen von Rezeptoren oder zum Binden von Rezeptoren an Trä ger wie etwa Rinderserumalbumin, Dextrane, Polysaccharide oder Latex-Partikel sind in der Fachwelt wohlbekannt.
Die Präzipitation oder Agglutination der Komplexe aus Rezeptor/Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen wird vorzugsweise mit Hilfe nephelometrischer oder turbidimetrischer Methoden bestimmt.
In einer weiteren Ausführungsform der wie vorstehend beschriebenen heterogenen Methode ist der erste Rezeptor auf eine Verbindung gerichtet, die allen Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen gemeinsam ist, und der zweite Rezeptor ist auf eine Verbindung, ein Molekül oder einen Marker an der Oberfläche der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen gerichtet, welche einer Untergruppe oder Kategorie von Mikropartikeln und stimulierten Zellen gemeinsam sind (Fig. 2). Dadurch ist es möglich, die spezielle Kategorie der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen zu bestimmen und so auf die Herkunft der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen zu schließen. Beim Herkunftsort kann es sich beispielsweise um Thrombozyten, Monozyten oder Endothelzellen handeln.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht daher in einem Verfahren zur Bestimmung einer Untergruppe oder Kategorie zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen durch Mischen einer die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltenden Probe mit einem spezifischen Rezeptor 1 für eine Verbindung, die auf den Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentiert wird, wobei der Rezeptor unter solchen Bedingungen direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden ist, daß die Bildung eines Komplexes des an die feste Phase gebundenen Rezeptors 1 und dem Mikropartikel oder der Prokoagulationszelle ermöglicht wird, gegebenenfalls Abtrennen der festen Phase von der flüssigen Phase, Binden eines Rezeptors 2 an die Mikropartikel und/oder Prokoagulatioszellen, wobei Rezeptor 2 für einen Marker der Kategorie oder Untergruppe der Mikropartikel und Prokoagulationszellen spezifisch ist, und Bestimmen des Komplexes aus Rezeptor 1 Mikropartikel oder stimulierter Prokoagulationszelle oder Rezeptor 2 mit Hilfe geeigneter Methoden.
Als Rezeptor 2 wird bevorzugt ein Antikörper gegen einen untergruppenspezifischen Marker, ein solches Molekül oder eine solche Verbindung an der Oberfläche der Mikropartikel und stimulierten Zellen verwendet. Beispiele für diese Marker sind die Thrombozyten-Marker GPIb, GPIX, GPIIb/IIIa, Thrombospondin, oder der Marker für Endothelzellen Thrombomodulin oder der Marker für Monozyten CD14 oder TF (Gewebefaktor, der sich auch auf Mikropartikel findet, die von stimuliertem Endothel ausgeschüttet werden) oder GMP140 (P-Selektin), das sowohl auf aktivierten Plättchen als auch auf Endothelzellen angetroffen wird, oder die Marker für apoptotische Körper CD4 und CD11a.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einer Abänderung dieses Tests zur Bestimmung der Untergruppe zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen. Dieses Verfahren zur Bestimmung der Untergruppen von Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen umfaßt das Mischen einer Probe mit einem Rezeptor für eine auf den Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentierten Untergruppen-spezifischen Verbindung und das Bestimmen der Bindung dieses Rezeptors mit Hilfe geeigneter Methoden. Rezeptor für eine untergruppenspezifische Verbindung bedeutet einen Rezeptor, der auf eine Verbindung, ein Molekül oder einen Marker gerichtet ist, die nur auf der Untergruppe und nicht oder weit weniger auf anderen Untergruppen von Mikropartikeln und/ oder stimulierten Prokoagulationszellen und ruhenden Zellen, beispielsweise ruhenden Plättchen, Monozyten oder Endothelzellen vorhanden sind. Zum Beispiel sind einige Phospholipid-bindende Antikörper gegen Proteine in Verbindung mit Phospholipiden gerichtet, d. h., sie binden nicht wesentlich an das Protein oder das Phospholipid alleine.
Diese Bindung des untergruppenspezifischen Rezeptors an die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen läßt sich mit Hilfe bekannter Methoden bestimmen. Der untergruppenspezifische Rezeptor kann zum Beispiel wie vorstehend beschrieben direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden sein. Nach Abfangen der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen einer speziellen Untergruppe kann die Menge wie vorstehend beschrieben direkt auf der festen Phase oder nach deren Abtrennung von der festen Phase beispielsweise über ihre Prokoagulationsaktivität (Prothrombin-Test) oder über einen zweiten Rezeptor, der für die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen spezifisch ist, oder einen Rezeptor, der für einen Marker auf ruhenden Zellen wie etwa Plättchen, Monozyten oder Endothelzellen spezifisch ist, bestimmt werden. Die Bindung des untergruppenspezifischen Rezeptors kann auch direkt über die Präzipitation oder Agglutination der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen durch diesen Rezeptor bestimmt werden, der in diesem Fall - wie vorstehend beschrieben - wenigstens bivalent sein muß. Zur Erzielung einer Agglutination wird der untergruppenspezifische Rezeptor an Partikel wie z. B. Latexpartikel gebunden.
Mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Assays lassen sich nicht nur zirkulierende Mikropartikel und/oder stimulierte Prokoagulationszellen oder Untergruppen derselben nachweisen. Die Assays können geringfügig abgewandelt werden, um Phospholipid-bindende Antikörper in einer Probe zu bestimmen. Es wird daher ein Verfahren zur Bestimmung Phospholipid-bindender Antikörper in einer Probe bereitgestellt, bei dem die Probe mit Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen unter Bedingungen gemischt wird, die das Binden der Phospholipid-bindenden Antikörper an die Mikropartikel oder Pro koagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen ermöglichen, und die Phospholipid-bindenden Antikörper mit Hilfe geeigneter Methoden bestimmt werden.
Die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen können aus menschlichem Blut oder Plasma erhalten werden, insbesondere aus plättchenarmem menschlichen Plasma. Es ist auch möglich, Mikropartikel und/oder stimulierte Prokoagulationszellen aus dem Blut oder Plasma von Tieren zu verwenden, da Phospholipide allgegenwärtige Komponenten sind. Bevorzugt ist die Verwendung synthetischer Liposomen, die Phospholipide in ihrer Membran enthalten. Methoden für die Herstellung von Liposomen sind in der Fachwelt wohlbekannt, zum Beispiel Freyssinet et al., Biochem. J. (1989), 261, 341-348. Bei einer bevorzugten Methode werden Liposomen verwendet, die aus einer Mischung von Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin (1 : 2) bestehen und mit Hilfe des Dialyseverfahrens nach Freyssinet et al. (siehe oben) hergestellt werden.
Die Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder Liposomen können an eine feste Phase gebunden werden, vorzugsweise mit Hilfe von Rezeptoren für Phospholipide, d. h., Phospholipid-bindenden Antikörpern oder Annexin V. Die Rezeptoren können wie vorstehend beschrieben direkt oder indirekt an die feste Phase gebunden werden (Fig. 3).
In der bevorzugten Ausführungsform werden die Mikropartikel, stimulierten Prokoagulationszellen oder Liposomen über Streptavidin oder Avidin/Biotin an eine feste Phase gebunden. Streptavidin- oder Avidin-beschichtete feste Phasen sind in der Fachwelt wohlbekannt. Die Mikropartikel oder Prokoagulationszellen oder Liposomen sind biotinyliert. Die Biotinylierung dieser Mikropartikel, Zellen oder Liposomen läßt sich durch Einbringen biotinylierter Phospholipide in die Membran dieser Partikel bewerkstelligen. Dies kann so erfolgen, daß den Mikropartikeln, stimulierten Prokoagulationszellen oder Liposomen einfach biotinylierte Phospholipide, zum Beispiel biotinyliertes Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylcholin, zugesetzt werden. Die biotinylierten Phospholipide werden in die Membran der Partikel eingebracht. Besonders bevorzugt ist die Anwendung dieser Methode zum Binden synthetisch hergestellter Liposomen an eine feste Phase. Die Liposomen werden hergestellt, indem die anderen Phospholipide beispielsweise mit 1% biotinyliertem Phosphatidylethanolamin oder biotinyliertem Phosphatidylcholin versetzt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder die synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen wie vorstehend beschrieben an eine Annexin V-beschichtete feste Phase gebunden (Fig. 3).
Die zu untersuchende Blutprobe wird mit den Mikropartikeln und/oder Prokoagulationszellen oder Liposomen unter solchen Bedingungen gemischt, daß die Bindung der Phospholipid-bindenden Antikörper in der Blutprobe an die Partikel und die Bindung der Partikel an die feste Phase im Falle indirekter Bindung ermöglicht wird. Die Partikel können gleichzeitig, vor oder nach der Bindung der Antikörper an die Partikel an die feste Phase gebunden werden. Nach Trennung der festen Phase von der flüssigen Phase zur Entfernung etwaiger nichtgebundener Verbindungen und gegebenenfalls einem zusätzlichen Waschschritt für die feste Phase werden die Phospholipidbindenden Antikörper, die über die Mikropartikel, stimulierten Prokoagulationszellen oder Liposomen an die feste Phase gebunden sind, mit Hilfe geeigneter Methoden bestimmt.
Bevorzugt ist die Bestimmung der gebundenen Phospholipidbindenden Antikörper mit Hilfe spezifischer markierter Rezeptoren für die Phospholipid-bindenden Antikörper, etwa Anti- Fc-Antikörper, Anti-Humanimmunglobulin-Antikörper, Anti-Human-IgA, G, M-Antikörper, Anti-Leichtketten-Antikörper, Protein A oder Protein G. Die spezifischen Rezeptoren für die Phospholipid-bindenden Antikörper können wie vorstehend beschrieben direkt oder indirekt markiert werden.
Dieses Verfahren zur Bestimmung Phospholipid-bindender Antikörper kann für den Nachweis spezieller Untergruppen Phospholipid-bindender Antikörper abgewandelt werden. Es ist bekannt, daß einige Autoantikörper spezifisch sind für einen Komplex aus Phospholipiden und speziellen Proteinen, die in der Membran der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthalten oder daran gebunden sind. Dadurch wird es möglich, Kombinationen aus Phospholipid-haltigen Partikeln und Phospholipid-bindenden Proteinen aus Plasma, zum Beispiel β&sub2;-Glycoprotein 1, Prothrombin, Protein S oder Protein C als mögliche Antigene zu bewerten, die für das Antiphospholipid-Syndrom verantwortlich sind, das durch die Gegenwart entsprechender reaktiver Antikörper gekennzeichnet ist. Der erste Vorteil dieses Systems ist seine Vielseitigkeit im Hinblick auf Phospholipide unterschiedlicher Zusammensetzung, die in Kombination mit den vorstehend genannten Phospholipid-bindenden Proteinen zu analysieren sind. Der zweite Vorteil ist, daß das System die Analyse eines möglichen in vitro-Antikoagulationspotentials einiger Phospholipid-bindender Antikörper gestattet, wobei der gleiche Träger verwendet wird, der ihren Nachweis ermöglicht.
Durch die Verwendung der Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen, die des weiteren die genannten Proteine umfassen, wird die Bestimmung untergruppenspezifischer Phospholipid-bindender Antikörper ermöglicht (Fig. 3). Die Proteine können als integrale oder periphere Membranproteine (β&sub2;-Glycoprotein 1, Prothrombin, Protein S, Protein C etc.) in die Phospholipid-haltigen Partikel eingebracht werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Blutgerinnungssystem.
APC: Aktiviertes Protein C
ATIII: Antithrombin III
D.S.: Dermatansulfat
GAG: Glycosaminoglycane
HCII: Heparincofaktor II
HEP: Heparansulfat oder Heparin
PC: Protein C
PS: Protein S
TF: Gewebefaktor
TFPI: Gewebefaktorweg-Inhibitor
TM: Thrombomodulin
II: Prothrombin
IIa: Thrombin
Die anderen römische Ziffern stehen für die entsprechenden Blutgerinnungsfaktoren, die aktiviert sind, wenn ein "a" folgt, und inaktiviert wenn ein "i" folgt.
Fig. 2 zeigt das Prinzip des Nachweises Von zirkulierenden Mikropartikeln oder stimulierten Prokoagulationszellen oder Zellfragmenten mittels ELISA von CDs und/oder GPs oder anhand der Prothrombinase-Aktivität.
GP: Glycoproteine
CD: Differenzierungsantigene
Fig. 3 zeigt das Prinzip des Nachweises von Phospholipid- bindenden Antikörpern mittels ELISA von APL (Phospholipid- bindender Antikörper).
Fig. 4 zeigt den Einfluß des Biotinylierungsverhältnisses von Annexin V auf den Prothrombinase-Assay.
AV/Bi: Biotinylierungsverhältnis von Annexin V
ΔOD/min: Optische Dichte pro Minute
Fig. 5 zeigt den Einfluß der Konzentration von biotinyliertem Annexin V (AV-Bi) auf den Prothrombinase-Assay.
ΔOD/min: Optische Dichte pro Minute
Fig. 6 zeigt den Einfluß der Phospholipid-Konzentration auf den Prothrombinase-Assay.
ΔOD/min. Optische Dichte pro Minute
Fig. 7 zeigt die Prothrombinase-Aktivität im Überstand von U937-Zellen, die zur Herbeiführung einer Apoptose mit Oxysterinen behandelt worden waren.
Fig. 8 zeigt den Nachweis des spezifischen Membranantigens CD11a, das auf der Oberfläche von Mikropartikeln vorhanden ist, die durch biotinyliertes Annexin Va abgefangen werden, das an SA-beschichtete Mikrotiterplatten komplexiert ist.
Fig. 9 zeigt das Abfangen von spezifische Antigene tragenden Mikropartikeln durch die entsprechenden unlöslich gemachten Antikörper.
Fig. 10 zeigt den Nachweis von Prokoagulationsmikropartikeln im Plasma von Patienten mit PNH.
Fig. 11 zeigt die Immobilisierung verschiedener Phospholipid-Antigene auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten für den Festphasen-Nachweis Phospholipid-bindender Antikörper.
Links: Hexagonalphasen-Phospholipide. Rechts: Doppelschicht- Phospholipide; SA und Bi stehen für Streptavidin bzw. Biotin.
In den folgenden Beispielen soll die Erfindung ausführlicher beschrieben werden.

Beispiel 1

Proteine und Reagenzien

Humanblutgerinnungsfaktor X und Prothrombin wurden durch Reinigung Vitamin K-abhängiger Proteinkonzentrate gewonnen, die frei von den üblichen viralen Verunreinigungen waren (Freyssinet J.-M. et al., Interference of blood coagulation vitamin K-dependent proteins in the activation of human protein C; Biochem J. 256 (1988), 501-507). Human-α-thrombin (3000 National Institute of Health (NIH)-Einheiten/mg Protein) wurde hergestellt aus gereinigtem Prothrombin nach Freyssinet J.-M. et al., Interference of blood coagulation vitamin K-dependent proteins in the activation of human protein C; Biochem J. 256 (1988), 501-507. Faktor Xa wurde aus gereinigtem Faktor X erhalten wie beschrieben in Freyssinet J.-M. et al., Activation of human protein C by blood coagulation factor Xa in the presence of anionic phospholipids; Biochem. J. 261 (1989), 341-348. Faktor V wurde von Diagnostica Stago (Asnières, Frankreich) käuflich erworben. Humanplazenta-Annexin V (Plazenta-Antikoagulationsprotein-I) wurde gemäß Funakoshi et al. gereinigt (Funakoshi T. et al., Human placental anticoagulant protein: isolation and characterization; Biochemistry 26 (1987) 5572-5578) und charakterisiert wie veröffentlicht bei Ravanat C. et al., Use of annexin-V and its binding to lipid vesicles; J. Mol. Biol. 226 (1992), 1271-1278. 1-O-n-Octyl-β-D-glucopyranosid, Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten (BM #1487051), Biotin-X-OSu (BM #1008978) und Chromozym TH stammten von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland). Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin aus Rinderhirn, Humanserumalbumin und Calcium-Ionophor A23187 waren Produkte von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Die fluoreszierende Membransonde (rote Fluoreszenz) 1,1'- Dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin (DiIC&sub1;&sub6;(3)) stammte von Molecular Probes (Eugene, OR). Die chromogenen Substrate N-α-Benzoylcarbonyl-D-arginyl-L-glycyl-L-arginin-p- nitroanilid-dihydrochlorid (S-2765) und H-D-Phenylalanyl-L-, pipecolyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydrochlorid (S-2238) wurden von Chromogenix AB (Mölndal, Schweden) käuflich erworben. D-Phenylalanyl-prolyl-arginyl-chlormethylketon (PPACK) und 1,5-Dansyl-glutamyl-glycyl-arginyl-chlormethylketon (Dns- GGACK), zwei potente irreversible Inhibitoren für Thrombin bzw. Faktor Xa, wurden von Calbiochem (San Diego, CA) erhalten. Alle übrigen Reagenzien waren vom höchsten erhältlichen Reinheitsgrad.

Liposomen

Bezugsliposomen aus 33% Phosphatidylserin und 67% Phosphatidylcholin (mol/mol) wurden hergestellt mit Hilfe des Dialyseverfahrens nach Freyssinet J.-M. et al., Activation of human protein C by blood coagulation factor Xa in the presence of anionic phospholipids; Biochem. J. 261 (1989), 341-348.
Für die Phospholipidvesikel-Herstellung (Phosphatidylserin/Phosphatidylcholin 33/66 (mol/mol) 3 mM) wurden die folgenden Reagenzien verwendet:
L-α-Phosphatidyl-L-serin aus Rinderhirn (Sigma): PS 18,18 mg/ml (Chloroform-Lösung)
L-α-Phosphatidylcholin, Typ III-B aus Rinderhirn (Sigma): PC 10 mg/ml (Chloroform-Lösung)
Puffer A (ohne Detergens):
Tris 50 mM, NaCl 150 mM, NaN&sub3; 0,02% (Gew./Vol.), pH 7,5
Puffer B (mit Detergens):
n-Octyl-β-D-glucopyranosid 2% (Gew./Vol.) Puffer A
Arbeitsweise: Man verwende Chloroform-gespülte Glasgeräte 55 ul PS wurden mit 200.ul PC gemischt, unter einem Stickstoff-Strom bei Raumtemperatur eingedampft, in 1 ml Puffer B resuspendiert und gegen Puffer A dialysiert.
Bei einigen Experimenten wurde die DiIC&sub1;&sub6;(3)-Sonde der Phospholipid-Mischung in einem molaren Endverhältnis von 0,1% vor der Dialyse zugesetzt, wodurch sie in die resultierenden Doppelschichtstrukturen eingebracht werden konnte. Bei der Analyse im gefroren-hydratisierten Zustand mittels Kryoelektronenmikroskopie erschienen die Liposomen meist monolamellar, einigermaßen kugelförmig, und hatten einen mittleren Durchmesser von 150 nm, mit Extrema bei 30 und 300 nm (Pigault C. et al., Formation of two-dimensional arrays of annexin-V on phosphatidylserine-containing liposomes; J. Mol. Biol. 236 (1994), 199-208). Die molaren Phospholipid-Konzentrationen wurden unter der Annahme eines mittleren Molekulargewichts von 780 für jede Spezies bestimmt. Für die Verwendung als Abfangstandards mittels unlöslich gemachtem Annexin V wurden die Liposomen in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, verdünnt, enthaltend 0,1 M NaCl und 1 mM CaCl&sub2;. Bei der Analyse mittels Durchflußzytometrie zeigte sich, daß die Kenndaten der DiIC&sub1;&sub6;(3)-markierten Liposomen vergleichbar mit denen von Mikropartikeln waren, die von beiden Zelltypen, einschließlich Plättchen (siehe unten) ausgeschüttet wurden (Dachary-Prigent J. et al., Annexin-V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups; Blood 81, 2554-2565).

Zellen

In Anlehnung an empfohlene Verfahren der ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden die Megakaryozyten- Zellinien HEL und MEG-01 routinemäßig kultiviert. Humanmonozyten wurden geerntet und in Kultur belassen wie beschrieben bei Sattan N. et al., Monocyte vesiculation, J. Immunol. 153 (1994), 3245-3255: A mechanism for dissemination of membrane associated procoagulant activities following stimulation by lipopolysaccaride (1994), eingereicht. Beide Zelltypen wurden auf 1 · 10&sup7; Zellen/ml eingestellt, ehe 3 min lang mit 3 Calcium-Ionophor in Gegenwart von 2 mM CaCl&sub2; bei Raumtemperatur behandelt wurde, um maximale Mikropartikel-Ausschüttung und Phosphatidylserin-Exposition herbeizuführen. Die Zellen und die entsprechenden Überstände wurden durch 1minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g bei Raumtemperatur getrennt. Die Zell-Pellets wurden im gleichen Volumen wie dem ursprünglichen resuspendiert.

Proben von Patienten oder Kontrollpersonen

Die Blutproben wurden durch Venenpunktion in 0,14 M Trinatriumcitrat bei einem Endvolumenverhältnis von 9 : 1 aufgenommen. Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei 180 g und Raumtemperatur erhalten. Die Plättchen wurden mit einem Mikroskop gezählt. Plättchenarmes Plasma (PPP) wurde durch 1minütiges Zentrifugieren von PRP bei 12 000 g und Raumtemperatur erhalten. Ein anderes Verfahren zur Gewinnung von PPP bestand darin, von Plasma auszugehen, das nach 10minütigem Zentrifugieren von Citrat-versetztem Vollblut bei 1500 g und Raumtemperatur gewonnen und ein zweites Mal 1 min lang bei 12 000 g und Raumtemperatur zentrifugiert wurde. Unmittelbar vor der Recalcifizierung wurden die Proben mit PPACK und Dns-GGACK in einer Endkonzentration von jeweils 10 uM versetzt. Bei Verwendung in unverdünntem Zustand wurden die Proben durch Zugabe von CaCl&sub2; in einer Endkonzentration von 30 mM unmittelbar vor dem Zusammenbringen mit unlöslich gemachtem, biotinyliertem Annexin V recalcifiziert. Diese Ausgangs-Calciumkonzentration war bei jeder 2fachen Verdünnung der Proben um das 2fache geringer. Da die Citrat-Endkonzentration 14 mM beträgt, sind wenigstens 21 mM Calcium erforderlich, um den Citrat-Überschuß zu komplexieren. Somit sollte inkrementelles Calcium im Hinblick auf den Wert 21 mM theoretisch ausreichend sein, um eine Wechselwirkung zwischen unlöslich gemachtem Annexin V (siehe unten) und Zellfragmenten zu ermöglichen, die freiliegendes Phosphatidylserin tragen. Im mM-Bereich sollte Calcium allerdings eine optimale Bindung von Fragmenten ermöglichen, die wenigstens 10% Phosphatidylserin tragen, und im 10 mM-Bereich kann diese Schwelle auf 2% abgesenkt werden, wie veröffentlicht in Zitat Pigault C. et al., Formation of two-dimensional arrays of annexin-V on phosphatidylserine-containing liposomes; J. Mol. Biol. 236 (1994) 199-208.

Biotinylierung von Annexin V und Herstellung Streptavidin- Biotin-Annexin V-beschichteter Mikrotiterplatten

Die Biotinylierung von Annexin V wurde bei verschiedenen molaren Biotin/Protein-Verhältnissen im Bereich von 20 : 1 und 2 : 1 erreicht.

Reagenzien

Biotinylierungspuffer: 75 mM KH&sub2;PO&sub4;, 200 mM NaCl, pH 7,7
Biotin-Lösung: 11,4 mM Biotin-X-OSu (MG: 454,5) in DMSO
Aufbewahrungspuffer: 75 mM KH&sub2;PO&sub4;, 200 mM NaCl, Lysin 10 mM, pH 7,7
0,5 mg Annexin V wurden über Nacht bei 4ºC gegen 200 ml Biotinylierungspuffer dialysiert. Annexin V (MG: 35 000) wurde dann auf 1 mg/ml (tAv = 0,6) verdünnt.
Die Biotin-Lösung wurde Annexin V in folgendem Verhältnis zugesetzt:
AV/Biotin (mol/mol) = 1 : 5
Nach 90 min bei 25ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 M Lysin/HCl auf eine Endkonzentration von 10 mM gestoppt. Das biotinylierte Annexin V wurde schließlich über Nacht bei 4ºC gegen Aufbewahrungspuffer dialysiert. Dieses biotinylierte Annexin V kann monatelang bei -80ºC ohne merkliche Einbuße an Antiphospholipid-Potential gelagert werden.
Das biotinylierte Annexin V (Annexin VBi) wurde auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten unlöslich gemacht durch Kontakt von 100 ul/Mulde Annexin VBi-Lösung in 50 mM Tris- Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,1 M NaCl und 3 mg/ml Albumin, bei Konzentrationen im Bereich von 50 ng/ml bis 1 ug/ml über 30 min bei Raumtemperatur. Die Platten wurden dann 3mal mit 200 ul des obigen Puffers gewaschen und sofort zum Abfangen aktivierter Zellen oder Fragmente verwendet.

Abfangen aktivierter Zellen oder abgeleiteter (Mikro)Partikel

Pro Mulde wurden Proben von 100 ul PRP oder 200 ul PPP, recalcifiziert und mit Thrombin- und Faktor Xa-Inhibitoren ergänzt wie vorstehend beschrieben, oder 100 ul Zellsuspension oder entsprechender Überstand, oder 100 Ml Liposomen zugesetzt. Das Inkubieren wurde 30 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt, gefolgt von 4 Waschschritten mit 200 ul 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,1 M NaCl und 1 mM CaCl&sub2;. Bei einigen Kontrollexperimenten wurden Liposomen anstelle von PRP- oder PPP-Proben eingesetzt, und bei anderen wurden 3 mM EDTA anstelle von Calcium verwendet. Die Platten, auf denen sich aktivierte Zellen oder Fragmente befinden sollten, wurden unmittelbar für den Nachweis von Prokoagulationsphospholipiden mittels Prothrombinase-Assay verwendet.

Prothrombinase-Assay

Es wurden die Blutgerinnungsfaktor-Konzentrationen bestimmt, um sicherzustellen, daß die Phosphatidylserin-Konzentration der geschwindigkeitsbeschränkende Parameter bei den linearen Aktivierungsreaktionen von Prothrombin zu Thrombin ist. Es wurden jeweils weniger als 20% des gesamten Proteinsubstrats in die aktivierte Form überführt. Die Messungen wurden auf Streptavidin-Annexin VBi-beschichteten Mikrotiterplatten mit 96 Mulden in 50 mM Tris-Puffer, enthaltend 120 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM CaCl&sub2; und 3 mg/ml Albumin, eingestellt auf pH 7,5, in einem Inkubationsendvolumen von 150 ul dreifach durchgeführt.
Die Gegenwart von Phosphatidylserin wurde nachgewiesen anhand seiner Fähigkeit, die Aktivierung von Prothrombin (2 uM) durch Faktor Xa (10 pM) in Gegenwart von Faktor V(a) (50 pH) und CaCl&sub2; (1,5 mM) zu begünstigen. Der 5fache Überschuß an Faktor V gegenüber Faktor Xa ermöglicht die Minimierung eines möglichen Beitrags des Faktor V-Gegenstücks, das an die Zellen gebunden ist oder daraus freigesetzt wird. Die Inkubation wurde bei den Plättchenproben, Zellsuspensionen und den entsprechenden Überständen 2 h lang bzw. 15 min bei den Kontroll-Liposomen jeweils bei 37ºC fortgesetzt. Die Prothrombin-Aktivierung wurde durch Zugabe eines Überschusses EDTA, d. h., 3 mM Endkonzentration, gestoppt. Dann wurde ein chromogenes Substrat für Thrombin, S-2238 oder Chromozym TH auf eine Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt. Die bei 405 nm aufgezeichnete lineare Änderung der Extinktion wurde anhand einer mit bekannten Mengen Thrombin konstruierten Standardkurve auf die Konzentration von gebildetem Thrombin umgerechnet. Bei den Kontrollen wurde entweder Faktor Xa oder Prothrombin oder beides weggelassen.
Die Tests zur Hemmung der Prothrombinase-Aktivität durch lösliches Annexin V wurden so durchgeführt, daß dieser Phospholipid-Antagonist den jeweiligen Medien unmittelbar vor den Gerinnungsfaktoren in einer Endkonzentration von 1,5 uM zugesetzt wurde. Ziel der letzteren Überprüfung war es, den Phospholipid-abhängigen Charakter der gemessenen Thrombin- Bildung festzustellen.

Beispiel 2

Einfluß des Biotinylierungsverhältnisses von Annexin V

Es wurden verschiedene Protein/Biotin-Molverhältnisse im Bereich von 1 : 2 bis 1 : 20 beim Prothrombinase-Test von Beispiel 1 geprüft. Bei Verhältnissen von 1 : 5 bis : 1 : 10 ergaben sich die besten Markierungsbedingungen nahezu ohne Einbußen an Phospholipid-Bindungsvermögen oder bei der Fähigkeit, Liposomen oder aktivierte Zellen oder abgeleitete Fragmente beim Unlöslichmachen festzuhalten (siehe Fig. 4). Es wurde kein Versuch unternommen, die Anzahl pro Molekül Annexin V gebundener Biotin-Moleküle zu quantifizieren, da sich das Verfahren als einigermaßen reproduzierbar erwies, ohne daß sich die Eigenschaften von Annexin V änderten (bestimmt durch Unlöslichmachen von Annexin VBi auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten und Bestimmung des Phospholipid-Abfangvermögens mittels Prothrombinase-Assay unter Verwendung von Liposomen).

Einfluß von Annexin VBi- und Phospholipid-Konzentration

Mehrere Bedingungen hinsichtlich Annexin VBi-Konzentration und Protein/Biotin-Anfangsverhältnis wurden überprüft. Wie oben wurde das Protein/Biotin-Verhältnis zwischen 1 : 2 bis 1 : 20 variiert, während der Annexin VBi-Konzentrationsbereich 50 ng/ml bis 1 ug/ml betrug. Die Phospholipide wurden in Form von Liposomen in Konzentrationen im Bereich von 0,03 bis 300 uM zugesetzt. Die beste Kombination wurde erzielt, wenn Annexin V mit einem Protein/Biotin-Verhältnis von 1 : 5 biotinyliert und mit 400 ng/ml für die Komplexierung an unlöslich gemachtem Streptavidin eingesetzt wurde (Fig. 5). Unter diesen Bedingungen trat Sättigung bei 60 uM Phospholipid ein (Fig. 6), was ungefähr der maximalen Oberflächenbelegung unter der Annahme entspricht, daß die Liposomen kugelförmig sind und einen mittleren Durchmesser von 1500 Å aufweisen.
Bei Sättigung belief sich die Menge an gebildetem Thrombin auf ~1 nM/min.

Beispiel 3

Abfangen von kultivierten Zellen oder abgeleiteten Fragmenten durch unlöslich gemachtes Annexin VBi

Zur weiteren Feststellung der Fähigkeit von unlöslich gemachtem Annexin VBi, Zellen oder ausgeschüttete Fragmente festzuhalten, die freiliegendes Phosphatidylserin an ihrer äußeren Oberfläche tragen, wurden lysierte Plättchen oder ionophor aktivierte Zellen oder entsprechende Überstände wie vorstehend beschrieben in Annexin V enthaltenden Mulden inkubiert.
Der Überstand der bei einer Anfangskonzentration von 15 · 10&sup7; Zellen/ml lysierten Plättchen war die Quelle für Prokoagulationsphospholipide und ermöglichte, Sättigung unter den gleichen Bedingungen zu erreichen wie mit einer 60 uM Pospholipid enthaltenden Liposomen-Suspension. Interessant ist der Hinweis, daß die Phospholipid-Konzentration, die von 15 · 10&sup6; Plättchen/ml beigesteuert wird, etwa 130 uM beträgt, d. h., die Hälfte der optimalen Liposomen-Konzentration. Der Phosphatidylserin-Anteil in Liposomen ist jedoch wenigstens dreimal höher als der von lysierten Plättchen, da man in letzterem Fall, wo die Phospholipid-Umverteilung als maximal erachtet wird, nicht erwarten kann, daß er größer als 10% (mol/mol) sein wird (Zwaal R.F.A. et al., Platelets and coagulation; in: Zwaal R.F.A. et al., Hrsg., Blood coagulation; Amsterdam, Elsevier Science Publishers B. V. (1986), 141-169). Dies zeigt, daß die induzierbare Phospholipid-abhängige Prokoagulationsaktivität wirkungsvoller als die von Liposomen ist, die spärlich exprimiertes Phosphatidylserin tragen.
Die gleiche Sättigungsamplitude wie die bei Liposomen beobachtete wurde mit Monozyten oder Überstand erhalten, allerdings nach zwei Stunden Inkubieren im Prothrombinase-Assay anstatt 10 mm, was einer Thrombin-Bildungsgeschwindigkeit von -85 pN/min entspricht. Die mit HEL oder MEG-01 oder den jeweiligen Überständen gemessenen Werte waren ~4- bis 5mal niedriger. Die Phospholipid-Zusammensetzung und Verteilung in Monozyten-, HEL- und MEG-01-Plasma ist nicht bekannt, doch kann vernünftigerweise erwartet werden, daß ionophor aktivierte Monozyten bei Einstellung auf die gleiche Konzentration die gleiche Prokoagulationsaktivität wie lysierte Plättchen aufweisen, während die von HEL- und MEG-01-Zellen entsprechend niedriger bliebe.

Beispiel 4

Abfangen zirkulierender aktivierter Plättchen oder ausgeschütteter Mikropartikel durch unlöslich gemachtes Annexin VBi und Bestimmung der damit verbundenen Prothrombinase-Aktivität

Neun Proben von 16 Patienten und 8 Kontrollpersonen wurden nach der Präparation untersucht und ohne Verdünnung wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Die Ergebnisse der Prothrombinaseaktivität-Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt, wobei die Werte auf 3 · 10&sup8; Plättchen/ml normiert sind. Tabelle 1
Systemischer Lupus erythematodes, APL: Antiphospholipid MAG: Myelin-assoziierte Glycosaminoglycane AHT: Arterielle Hypertonie
D/min/1800 = 1 nM Thrombin gebildet/min ? = nicht erfaßt

Beispiel 5

Bestimmung von Phosphatidylserin-haltigen, von U937-Zellen stammenden apoptotischen Körpern

Die Vermehrung der U937-Zellen erfolgt in einer befeuchteten 5% CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC unter Verwendung von RPMI 1640- Medium mit Glutamax-I, ergänzt mit 10% wärmeinaktiviertem Kälberfötenserum, 1 mM Natriumpyruvat, nichtessentiellen Aminosäuren und Gentamicin zu 5 ug/ml. Die Zellen werden normalerweise mit einer Anfangskonzentration von 1 · 10&sup5;/ml auf die Platte gebracht. Die Apoptose wird herbeigeführt durch Behandeln der U937-Zellen mit 40 uM 7β-Hydroxycholesterin oder 5 ug/ml Actinomycin-D bei 37ºC über 8 bis 24 Stunden. Die Zellen müssen 6 h vor der Behandlung zu 3 bis 4·105 Zellen pro ml aufgeimpft werden. Der Zellüberstand wird erhalten durch Zentrifugieren der behandelten Zellen bei 500 g über 7 min. und CaCl&sub2; wird auf eine Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, ehe 200 ul/Mulde Überstand zugegeben werden. Für jedes Experiment muß eine Kontrolle ohne 7β-Hydroxycholesterin oder Actinomycin D durchgeführt werden, und auch das 10% Kälberfötenserum enthaltende Kulturmedium sollte geprüft werden. Es sei betont, daß der Mikropartikelgehalt des 10% Kälberfötenserums niedrig war, wahrscheinlich wegen der Abtrennung eines Großteils der Zellfragmente bei der Ultra- Sterilfiltration. Die Menge der abgefangenen Mikropartikel wird mit dem Prothrombinase-Test bestimmt.
Biotinyliertes Annexin V (AVBi) (siehe Beispiel 1) wurde in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA auf 400 ng/ml verdünnt. 100 ul/Mulde wurden auf Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten gegeben (Boehringer Mannheim GmbH) und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiges AVBi wurde wie vorstehend beschrieben durch Waschschritte mit TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 200 ul/Mulde Zellüberstand beseitigt, und es wurden 10 mM CaCl&sub2; zugesetzt und 30 min lang inkubiert. Nach drei Waschschritten mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; wurde der Prothrombinase-Test durchgeführt.

Prothrombinase-Assay:

(Verdünnungen in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA)
TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA: 90 ul/Mulde
Faktor V 0,5 nM (50 nM, verdünnt 1 : 100): 10 ul/Mulde
Faktor II 0,65 mg/ml (1 mg/ml, verdünnt auf 0,65 mg/ml): 20 ul/Mulde
Faktor Xa 83 pM (2,9 414, verdünnt 1 : 35000): 20 ul/Mulde
CaCl&sub2; 20 mM (1 M, verdünnt 1 : 50): 10 ul/Mulde
2 h Inkubieren bei 37ºC
EDTA Mg²&spplus; 20 mM (80 mM, verdünnt 1 : 4): 50 ul/Mulde
Chromozym TH 1,52 mM (3,8 mM, verdünnt 1 : 2,5): 50 ul/Mulde
Die Änderungen der linearen Extinktion bei 405 nm wurden mit einem Mikroplatten-Lesegerät aufgezeichnet, das mit einer Kinetik-Software ausgestattet war. Die Ergebnisse des Prothrombinase-Tests sind in Fig. 7 gezeigt.
Die Prothrombinase-Aktivität wird mittels Durchflußzytometrie mit einer DNA-Analyse korreliert (Tabelle 2) Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen die Apoptose-assoziierte Exposition von Phosphatidylserin und liefern den Beweis, daß sich das Zell tod-Ausmaß nach Abfangen der resultierenden Vesikel mit Hilfe eines Prothrombinase-Tests ohne weiteres abschätzen läßt.
In einem weiteren Experiment wurde die Herkunft der apoptotischen Zellen nachgewiesen. Hierzu wurden kryolysierte U937- Zellen verwendet, um wie vorstehend beschrieben Lyse-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente apoptotischer Zellen tragen CD11a als Ziel-Antigen. Die Zellen wurden mit AVBi auf einer SA-Platte wie vorstehend beschrieben abgefangen und mit PODmarkierten Antikörpern gegen CD11a nachgewiesen, die im Handel erhältlich sind. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Diese Zellen konnten mit Hilfe dieses Antikörpers nachgewiesen werden, und somit konnte auch die Herkunft der Zellen nachgewiesen werden.

Abfangen von Mikropartikeln, die von apoptotischen U937-Zellen stammen, unter Verwendung spezifischer Biotin-markierter Antikörper

Biotinylierte Antikörper (Anti-CD4 oder Anti-C11a, Leinco Technology, verdünnt auf 1 ul/ml in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA) wurden auf Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten (100 ul/Mulde) gegeben und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssige biotinylierte Antikörper wurden durch Waschschritte mit TBS (3 · 250 ul) beseitigt. Der Zellüberstand der U937-Zellen nach Herbeiführung der Apoptose wie vorstehend beschrieben wurde zugesetzt (200 ul/Mulde) und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden mit TBS gewaschen (3 · 250 ul).

Prothrombinase-Assay:

(Verdünnungen in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA)
TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA: 90 ul/Mulde
Faktor V 0,5 nM (50 nM, verdünnt 1 : 100): 10 ul/Mulde
Faktor II 0,65 mg/ml (1 mg/ml, verdünnt auf 0,65 mg/ml): 20 ul/Mulde
Faktor Xa 83 pM (2,9 ~tM, verdünnt 1 : 35000): 20 ul/Mulde
CaCl&sub2; 20 mM (1 M, verdünnt 1 : 50): 10 ul/Mulde
2 h Inkubieren bei 37ºC
EDTA-Mg²&spplus; 20 mM (80 mM, verdünnt 1 : 4): 50 ul/Mulde
Chromozym TH 1,52 mM (3,8 mM, verdünnt 1 : 2,5): 50 ul/Mulde
Die Änderungen der linearen Extinktion wurden bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät aufgezeichnet, das mit einer Kinetik-Software ausgestattet war.
Die von den apoptotischen Zellen stammenden Mikropartikel wurden mit Biotin-markiertem Anti-CD4 oder Anti-CD11a abgefangen, die auf einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten immobilisiert waren. Die Menge abgefanger Mikropartikel läßt sich mit Hilfe des Prothrombinase-Tests bestimmen. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt.
Diese Ergebnisse stehen damit in Einklang, daß die Menge an CD11a-Antigen in den U937-Zellen höher ist als die an CD4.

Beispiel 6

Nachweis von Prokoagulationsmikropartikeln im Plasma von Patienten mit paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie

Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) ist eine erworbene Stammzellenstörung, bei der die Glycolipid-verankerten Membranproteine einschließlich der Zelloberflächen-Komplementinhibitoren CD55 und CD59 teilweise oder ganz aus der Plasmamembran reifer Blutzellen beseitigt sind (45). Dies führt zu Hyperhämolyse, die von einer Überempfindlichkeit der roten Blutzellen gegenüber aktiviertem Komplement herrührt. Vom klinischen Standpunkt ist PNH durch hämolytische Anämie und einen Hyperkoagulabilitätszustand gekennzeichnet, der häufig zu Thrombose führt. Die Hyperkoagulabilität wird der Hämolyse selbst oder Plättchenfehlern oder einer Hyperaktivierung zugeschrieben.
Die Plasmaproben von mehreren Patienten wurden untersucht, um die Fähigkeit des Systems zur Bewertung des Thrornboserisikos aufzuzeigen, das potentiell mit dieser Krankheit in Zusammenhang steht.
Die aktivierten Zellen und/oder Mikropartikel wurden wie vorstehend beschrieben mit AVBi auf einer SA-beschichteten Mikrotiterplatte abgefangen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt.
Alle sich aus den Patientenproben ergebenden Prothrombinase- Aktivitäten waren außer bei einem Patienten höher als die bei den Kontrollen von Gesunden. Dies läßt sich so erklären, daß dieser eine Patient vor kurzem eine Transfusion erhalten hatte und zum Zeitpunkt der Analyse keine mangelhaften roten Blutzellen oder Plättchen im Hinblick auf CD55, CD58 und CD59 aufwies. Andere Patienten weisen einen signifikanten Anteil von roten Blutzellen und Plättchen auf, in denen CD55, CD58 und CD59 nicht mehr nachgewiesen werden können. Der Zusammenhang von PNH und aplastischer Anämie wirft die bislang ungelöste Frage auf, ob diese beiden Störungen unterschiedliche Manifestationen der gleichen Krankheit sind. Jedenfalls entwickelt ein erheblicher Teil der Patienten mit aplastischer Anämie sekundär eine Art von PNH.

Kontrollen

Alle vorstehenden Beobachtungen wurden hinsichtlich der Spezifität des Abfangens von aktivierten Zellen oder abgeleiteten Fragmenten durch Annexin VBi kontrolliert. Werden sie durch Annexin VBi festgehalten, so können Liposomen oder sowohl aktivierte Zellen als auch ausgeschüttete Fragmente mit einem Überschuß EDTA wieder freigesetzt werden, d. h., es kann keine Prothrombinase-Aktivität nach einer solchen Be handlung nachgewiesen werden. Eine erstaunliche Beobachtung ist die der möglichen Wiederverwendbarkeit des Systems: nach der Durchführung einer Messung ist einfaches Waschen mit Tris-Puffer, der EDTA anstatt Calcium enthält, ausreichend, um die Fähigkeit des Systems zum Abfangen wiederherzustellen.
Es konnte keine Prothrombinase-Aktivität gemessen werden, wenn entweder Faktor Xa oder Prothrombin beim Prothrombinase- Assay weggelassen wurden, und lediglich eine Andeutung von Aktivität wurde beobachtet, wenn Faktor V fehlte. Bei Lagerung unter 0ºC ist Annexin VBi wochenlang stabil.

Beispiel 7

Nachweis von Phospholipid-bindenden Antikörpern (APL) und Annexin II-bindenden Antikörpern (AAII)

Man nimmt an, daß Phosphatidylserin eine Determinante der retikuloendothelialen Erkennung ist, die zur Beseitigung zirkulierender Membranbruchstücke führt (Allen T., Williamson und Schlegel R.A., Phosphatidylserine as a determinant of reticuloendothelial recognition of liposome models of the erythrocyte surface; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 8067-8071). Es ist jedoch denkbar, daß das retikuloendotheliale System bei fortgesetzter Schädigung der Zellmembran überfordert sein könnte, und daß ein Überschuß an anionischem Phospholipid zunehmend Koagulationsreaktionen auslösen könnte. Unter solchen Umständen könnte die Freisetzung sequestrierter Phospholipide am Anfang des Thrombose-assoziierten Antiphospholipid-Syndroms stehen (McNeil H.P., Chesterman C.N. und Krilis S. A, Immunology and clinical Lrnportance of antiphospholipid antibodies; Adv. Immunol. 1991, 49, 193- 280). Das Vorhandensein der APL geht einher mit erhöhtem Risiko für Thrombose, Thrombozytopenie und Fötenabgang, so daß ihr Nachweis von herausragender Bedeutung ist.

Herstellung von Phospholipid-Vesikeln zur Verwendung beim Nachweis Phospholipid-bindender Antikörper

Card/PC/Chol/PE-Bi 2,7 : 10,5 : 4 : 1 (mol) 1 mM
Cardiolipin (Card) aus Rinderherz, 5 mg/ml, Ethanol-Lösung MG: 1500 g/mol.
L-α-Phosphatidylcholin (PC) aus Rinderhirn, 10 mg//ml, Chloroform-Lösung, MG: 778 g/mol
Cholesterin (Chol) aus Schweineleber, 40 mg/ml, Chloroform- Lösung, MG: 386 g/mol
N-(6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)dipalmitoyl-L-α-phosphatidylethanolamin (PE-Bi), 5 mg/ml, Chloroform-Lösung, MG: 1132 g/mol
Puffer A (ohne Detergens):
(Tris-HCl 9,52 g, Tris-Base 1,77 g, NaCl 13,2 g, NaN&sub3; 10% 3 ml, Auffüllen mit H&sub2;O auf 1,5 l)
Tris 50 mM
NaCl 150 mM
NaN3 0,02% (Gew./Vol.)
pH 7,5
Puffer B (mit Detergens):
n-Octyl-β-D-glucopyranosid 2% (Gew./Vol.), 0,1 g in 5 ml
Puffer A
(BM, Ref: 737062)

Verfahren:

33,3 ul Card wurden mit 33,3 ul PC, 1,6 ul Chol und 9,2 ul PE-Bi auf Eis gemischt, unter einem Stickstoff-Strom bei Raumtemperatur eingedampft, in 500 ul Puffer B resuspendiert, gegen 3 · 500 ml Puffer A bei 4ºC über 18 bis 24 h dialysiert und bei 4ºC gelagert (nicht länger als einen Monat).

Nachweis der Phospholipid-bindenden Antikörper

Card/PE-Bi-Vesikel, 1 mM, wurden in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA auf 1 : 150 verdünnt, 100 ul/Mulde wurden auf Streptavidinbeschichtete Mikrotiterplatten gegeben, 30 min bei 4ºC inkubiert, mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (4 · 200 ul/Mulde) gewaschen und durch 30 min Inkubieren bei 4ºC mit 10% Rinderserum (Vol./Vol.), n TBS, 1 mM CaCl&sub2; (100 ul/Mulde) neutralisiert.
Die Mulden wurden mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 ul/Mulde) gewaschen, die Serumprobe, verdünnt auf 1 : 100 (oder höher wenn stark positiv) in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, Rinderserum 10% (Vol./Vol.), wurde zugesetzt (50 ul/Mulde), 2 h bei 4ºC inkubiert und mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 ul/Mulde) gewaschen; GAHu/IgG(H+L)HRPO, verdünnt auf 1 : 1000 in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, Rinderserum 10% (Vol./Vol.) (50 ul/Mulde), wurde zugesetzt, 1 h bei 4ºC inkubiert und mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 ul/Mulde) gewaschen. Es wurde OPD zu 0,4 mg/ml zugesetzt (50 ul/Mulde), 4,5 min bei Raumtemperatur inkubiert und 6 N H&sub2;SO&sub4; wurde zugegeben (50 ul/Mulde). Die Extinktion wurde bei 492 nm abgelesen.

Herstellung von Phospholipid-Vesikeln zur Verwendung beim Nachweis Annexin II-bindender Antikörper

PS/PC/PE-Bi 25 : 74 : 1 (mol) 3 mM
L-α-Phosphatidyl-L-serin (PS) aus Rinderhirn, 10 mg/ml, Chloroform-Lösung, MG: 780 g/mol
L-α-Phosphatidylcholin (PC) aus Rinderhirn, 10 mg/ml, Chloroform-Lösung, MG: 778 g/mol
N-(6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)dipalmitoyl-L-α-phosphatidylethanolamin (PE-Bi), 5 mg/ml, Chloroform-Lösung, MG: 1132 g/mol
Puffer A (ohne Detergens):
(Tris-HCl 9,52 g, Tris-Base 1,77 g, NaCl 13,2 g, NaN&sub3; 10% 3 ml, Auffüllen mit H&sub2;O auf 1,5 l)
Tris mM
NaCl 150 mM
NaN&sub3; 0,02% (Gew./Vol.)
pH 7,5
Puffer B (mit Detergens):
n-Octyl-β-D-glucopyranosid 2% (Gew./Vol.), 0,1 g in 5 ml
Puffer A
(BM, Ref: 737062)

Verfahren:

100 ul PS wurden mit 300 ul PC und 12 ul PE-Bi auf schmelzendem Eis gemischt, unter einem Stickstoff-Strom bei Raumtemperatur eingedampft, in 1700 ul Puffer B resuspendiert und gegen 3 · 500 ml Puffer A bei 4ºC über 18 bis 24 h dialysiert.

Nachweis der Annexin II-bindenden Antikörper

PS/PC/PE-Bi-Vesikel, 25 : 74 : 1 (mol), 3 mM, wurden in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 3 g/l HSA auf 1 : 400 verdünnt. 100 ul/Mulde wurden auf Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten gegeben, 30 min bei 4ºC inkubiert und mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 ul/Mulde) gewaschen. Annexin II, verdünnt auf IO ug/ml in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, 10% Rinderserum (Vol./Vol.), wurde zugesetzt (100 ul/Mulde), 30 min bei 4ºC inkubiert und mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 ul/Mulde) gewaschen. Die Serumprobe, verdünnt auf 1 : 100 (oder höher wenn stark positiv) in TBS, 1 mM CaCl&sub2; (50 ul/Mulde), Rinderserum 10% (Vol./Vol.), wurde zugesetzt, 2 h bei 4ºC inkubiert und mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 Mulde) gewaschen. GAHu/IgG(H+L)/HRPO (Ziege-Anti-Human/IgG(H+L)/Meerrettichperoxidase), 0,7 mg/ml, verdünnt auf 1 : 1000 in TBS, 1 mM CaCl&sub2;, (50 ul/Mulde), Rinderserum 10% (Vol./Vol.) wurde zugesetzt, 1 h bei 4ºC inkubiert und mit TBS, 1 mM CaCl&sub2; (3 · 200 ul/Mulde) gewaschen. OPD, o-Phenylendiamin-dihydrochlorid (Sigma, Ref.: P 9187) zu 0,4 mg/ml (50 ul/Mulde) wurde zugesetzt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde 6 N H&sub2;SO&sub4; zugegeben, und die Extinktion wurde bei 492 nm abgelesen.

Vergleich der erfindungsgemäßen APL- und AAII-Assays mit Verfahren im Stand der Technik

Bei den meisten Festphasenimmungssays zum Nachweis von APL wird auf Polystyrol aufbeschichtetes Cardiolipin als Antigen verwendet. Diese auf Platten aufgebrachten Lipide nehmen den Aufbau eines einschichtigen Films an. Bei den erfindungsgemäßen Assays werden Hexagonalphasen- oder Doppelschicht-Phospholipide unterschiedlicher Zusammensetzung verwendet. Diese sind beispielsweise über die Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung fest und reproduzierbar an den festen Träger gebunden (siehe Fig. 11). Dies ist sicherlich von Vorteil für die Untersuchung der Beschaffenheit und Vielfalt der APL und der möglichen klinischen Zusammenhänge. Der Hauptgrund für die Verwendung von Doppelschicht- oder Hexagonalphasen-Phospholipiden in Feststoff-Assays liegt darin, daß diese Aufbaumodelle den Strukturen von Membran und ausgeschütteten Fragmenten weitaus näher kommen.
10 Proben, die bei Verfahren im Stand der Technik als positiv befunden wurden (Durchflußzytometrie und Cardiolisa-Assay von Biomedical Diagnostics, Frankreich) wurden mit den APL- und AAII-Assays getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Alle 10 positiven Proben waren auch im APL-Assay positiv. Die Patientenproben LA und BE waren im AAII-Nachweistest positiv. Beim AAII-Assay werden Antikörper gegen einen Komplex aus Annexin II und Phospholipiden nachgewiesen. Tabelle 3
* Jedes ELISA-Ergebnis ist ausgedrückt als ein Mehrfaches der OD des Kontroll-Pools. Die ELISAs wurden mit Monoschicht-Phospholipiden als Abfangantigen durchgeführt. Bei unserem APL-Nachweistest werden Doppelschicht-Phospholipide und β&sub2;-Glycoprotein-1 verwendet, das mit dem als Probenverdünnung verwendeten 10% Rinderserum eingebracht wird.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, umfassend:

(a) Mischen einer die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltenden Probe mit einem spezifischen Rezeptor für eine Verbindung, die auf den Mikropartikeln und Prokoagulationszellen präsentiert wird, wobei der Rezeptor unter solchen Bedingungen direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden ist, daß ein Komplex des an die feste Phase gebundenen Rezeptors und dem Mikropartikel und/oder der Prokoagulationszelle gebildet wird;

(b) Trennen der festen Phase von der flüssigen Phase;

(c) Bestimmen der Menge an Mikropartikeln und/oder Prokoagulationszellen auf der festen Phase oder nach Abtrennung der festen Phase mit Hilfe geeigneter Methoden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der spezifische Rezeptor bei Schritt (a) Annexin V ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei Calcium-Ionen bei Schritt (a) zugesetzt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der spezifische Rezeptor über ein spezifisches Bindungspaar an die feste Phase gebunden ist, umfassend ein erstes und zweites Bindungspaarelement (Bpe), wobei das erste Bpe an die feste Phase gebunden ist und das zweite Bpe mit dem spezifischen Rezeptor verknüpft ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Menge an Mikropartikeln und/oder Prokoagulationszellen durch Erfassen der Aktivierung von Prothrombin (Faktor II) zu Thrombin (Faktor IIa) bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei in Schritt (a) Hemmstoffe für Thrombin und/oder Faktor Xa anwesend sind.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 und 6, wobei die Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin erfaßt wird durch Mischen der Mikropartikel und/oder Prokoagulationszellen mit einem Faktor V, Faktor Xa, Prothrombin (Faktor II) und Calcium-Ionen umfassenden Reagens über eine geeignete Zeitspanne, Anhalten der Reaktion durch Komplexieren der Calcium-Ionen, und Bestimmen des Thrombins anhand seiner Fähigkeit, ein chromogenes Substrat zu hydrolysieren.

8. Verfahren zur Bestimmung zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, umfassend:

(a) Mischen einer die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltenden Probe mit einem spezifischen Rezeptor für eine Verbindung, die auf den zirkulierenden Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentiert wird, wobei der Rezeptor wenigstens bivalent ist unter Bedingungen, bei denen ein Komplex aus den zirkulierenden Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen und dem Rezeptor gebildet wird;

(b) Bestimmen der Menge an Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen durch nephelometrische oder turbidimetrische Messung.

9. Verfahren zur Bestimmung zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, umfassend:

(a) Mischen einer die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltenden Probe mit einem spezifischen Rezeptor für eine Verbindung, die auf den zirkulierenden Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentiert wird, wobei der Rezeptor unter solchen Bedingungen auf Partikel aufgebracht wird, daß ein Komplex aus den zirkulierenden Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen und dem Rezeptor gebildet wird;

(b) Bestimmen der Menge an Mikropartikeln und/oder stimulierten Prokoagulationszellen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der spezifische Rezeptor ein mit Annexin V überzogenes Partikel ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das mit Rezeptor überzogene Partikel ein mit Avidin oder Streptavidin überzogenes Partikel ist, woran ein biotinylierter Rezeptor gebunden ist.

12. Verfahren zur Bestimmung einer speziellen Kategorie oder Untergruppe zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, umfassend:

(a) Mischen einer die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltenden Probe mit einem spezifischen Rezeptor 1 für eine Verbindung, die auf den Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentiert wird, wobei der Rezeptor unter solchen Bedingungen direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden ist, daß ein Komplex des an die feste Phase gebundenen Rezeptors 1 und dem Mikropartikel oder der stimulierten Prokoagulationszelle gebildet wird;

(b) gegebenenfalls Abtrennen der festen Phase von der flüssigen Phase;

(c) Binden eines Rezeptors 2 an die Mikropartikel und/oder Prokoagulationszellen, wobei Rezeptor 2 für einen Marker der speziellen Kategorie oder Untergruppe der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen spezifisch ist;

(d) Bestimmen des Komplexes aus Rezeptor 1, Mikropartikeln oder stimulierten Prokoagulationszellen und Rezeptor 2 mit Hilfe geeigneter Methoden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Schritte (a) und (c) gleichzeitig durchgeführt werden.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13, wobei Rezeptor 2 ein Antikörper gegen einen Thrombozyten-Marker wie etwa GPIb, GPIX, GPIIb/IIIa, Thrombospondin oder einen Marker für Endothelzellen wie etwa Thrombomodulin oder einen Marker für Monozyten wie etwa CD 14 ist.

15. Verfahren zur Bestimmung einer speziellen Kategorie oder Untergruppe zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, umfassend:

(a) Mischen einer die zirkulierenden Mikropartikel und/- oder stimulierten Prokoagulationszellen enthaltenden Probe mit einem Rezeptor für die untergruppenspezifische Verbindung, die auf den zirkulierenden Mikropartikeln und stimulierten Prokoagulationszellen präsentiert wird, wobei der Rezeptor direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden ist;

(b) Bestimmen der Bindung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen an den Rezeptor mit Hilfe geeigneter Methoden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die feste Phase ein Partikel wie etwa ein Latexpartikel ist, und die Bestimmung der Bindung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen an den Rezeptor durch Messen der Agglutination der Partikel durchgeführt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei nach Schritt (a) die feste Phase von der flüssigen Phase getrennt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei in Schritt (b) die Bindung durch Erfassen der Aktivierung von Prothrombin (Faktor II) zu Thrombin (Faktor IIa) bestimmt wird.

19. Verfahren zur Bestimmung Phospholipid-bindender Antikörper in einer Probe, umfassend:

(a) Mischen der Blutprobe mit Mikropartikeln und/oder Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen unter Bedingungen, die das Binden von in der Blutprobe vorhandenen Phospholipidbindenden Antikörpern an die Mikropartikel oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen ermöglichen;

(b) Bestimmen der Bindung der Phospholipid-bindenden Antikörper mit Hilfe geeigneter Methoden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei in Schritt (b) die Antikörper durch Messen der Abscheidung der zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen bestimmt werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen an eine feste Phase gebunden sind.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei biotinylierte zirkulierende Mikropartikel und/oder stimulierte Prokoagulationszellen oder synthetische Phospholipid-haltige Liposomen an eine mit Streptavidin oder Avidin überzogene feste Phase gebunden sind.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen und synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen durch Zugabe von biotinyliertem Phosphatidylethanolamin oder biotinyliertem Phosphatidylcholin biotinyliert werden.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen biotinyliert werden indem die Liposomen in Gegenwart von biotinyliertem Phosphatidylethanolamin und/oder biotinyliertem Phosphatidylcholin erzeugt werden.

25. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen an eine mit Annexin V überzogene feste Phase gebunden sind.

26. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 25, wobei die zirkulierenden Mikropartikel und/oder stimulierten Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipid-haltigen Liposomen des weiteren Proteine umfassen, beispielsweise β&sub2;-Glycoprotein 1, Prothrombin, Protein S oder Protein C.

27. Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, die mit Zellschädigung oder Zelltod einhergehen, etwa AIDS, Krebs oder paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie, durch Bestimmen der zirkulierenden apoptotischen Körper unter Verwendung eines spezifischen Rezeptors für eine präsentierte Verbindung auf diesen apoptotischen Körpern.

28. Prüfset zur Bestimmung zirkulierender Mikropartikel und/oder stimulierter Prokoagulationszellen, umfassend:

einen spezifischen Rezeptor für eine auf den Mikropartikeln und Prokoagulationszellen präsentierte Verbindung, der an eine feste Phase gebunden ist oder daran gebunden werden kann;

sowie weitere Verbindungen, die zur Bestimmung der Quantität der Bindung des spezifischen Rezeptors an die Mikropartikel und Prokoagulationszellen erforderlich sind.

29. Prüfset zur Bestimmung einer speziellen Kategorie oder Untergruppe zirkulierender Mikropartikel und/oder Prokoagulationszellen, umfassend:

einen Rezeptor, der für einen Marker der speziellen Kategorie oder Untergruppe der Mikropartikel und stimulierten Prokoagulationszellen spezifisch ist, der an eine feste Phase gebunden ist oder daran gebunden werden kann;

sowie weitere Verbindungen, die zur Bestimmung der Quantität der Bindung der beiden Rezeptoren an die Mikropartikel und Prokoagulationszellen erforderlich sind.

30. Prüfset zur Bestimmung Phospholipid-bindender Antikörper, umfassend:

Mikropartikel und/oder Prokoagulationszellen oder synthetische Phospholipid-haltige Liposomen;

sowie weitere Verbindungen, die zum Bestimmen der Bindung Phospholipid-bindender Antikörper auf den Mikropartikeln, Prokoagulationszellen oder synthetischen Phospholipidhaltigen Liposomen erforderlich sind.