DE3685937T2

DE3685937T2 - Testverfahren mit oberflaechengebundenem fibrinogen und loesliches markiertes fibrinogen.

Info

Publication number: DE3685937T2
Application number: DE8686902720T
Authority: DE
Inventors: George J Doellgast
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-14
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2006-04-15
Also published as: EP0221927A1; EP0221927A4; DE3685937D1; JP2529677B2; CA1270193A; ATE78098T1; US4668621A; EP0221927B1; JPS62502938A; WO1986006489A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Bereich der Erfindung

Es besteht wesentliches Interesse daran, die Gegenwart verschiedener Blutfaktoren, die beim Auftreten oder Hemmung von Gerinnung beteiligt sind, nachweisen zu können. Zwei der klassischen Verfahren umfassen den Einsatz genetisch defizienter Plasmen oder Mischungen von Koagulationsfaktoren, denen ein wesentlicher Faktor fehlt, und in einem Fall die Untersuchung der Bildung eines Gerinnsels unter Einsatz einer Vielfalt physikalischer Techniken. Im anderen Fall werden spezifische synthetische Substrate für einzelne Koagulationsfaktoren eingesetzt, wobei derartige Faktoren Enzyme sind oder die Wirkung von Enzymfaktoren modulieren. Diese Techniken weisen zahlreiche Nachteile auf, sie sind kostspielig, machen technische Fertigkeiten zur Durchführung der Untersuchung notwendig, und es gibt Schwierigkeiten beim Erhalt und/oder der Herstellung von Reagenzien.
Es gibt daher eine deutliche Notwendigkeit, rasche und wirksame Bestimmungsverfahren zu schaffen, um den Nachweis von Blutfaktoren zu automatisieren. Außerdem besteht, trotz der großen Anzahl an Immunoassays, die gegenwärtig mit unterschiedlichen Vorschriften und Markern verfügbar sind, immer noch Interesse daran, Bestimmungsverfahren zu schaffen, die hohe Empfindlichkeit und rasche Durchführung ermöglichen und geeignet sind, eine große Vielzahl an interessierenden Analyten nachzuweisen.

Beschreibung des Standes der Technik

Die CRC Handbuchreihe über Klinische Laborwissenschaft (Haupt-Hrgs. Seligson), Abschnitt I: Hematology, Band III (Hrsg. Schmidt), 1980, faßt Bestimmungsverfahren für einzelne Faktoren kurz zusammen. Der Einsatz synthetischer Substrate wird in Fareed et. al., Clin.Chem. (1983) 29: 225-236 beschrieben. Die Folgenden berichten, daß Fibrinogen sich äußerst eng an Kunststoffoberflächen bindet: Parsons, Meth. Enzymology (1981) 73: 224-239; Pesce, Biochim. Biophys.Acta (1977) 492: 399-407: und Morrisey, Ann.N.Y.Acad.Sci. (1977) 283:50-64. Die Folgenden berichten, daß an Kunststoff gebundenes Fibrinogen als eine Matrix zur Fibrinablagerung dienen kann: Ihlenfeld und Cooper, J.Biomed.Mat.Res. (1979) 13:577-591 und Packman et al., J.Lab.&Clin.Med. (1969) 73:686- 697.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen eines Blutfaktors oder Analyten wie in den Ansprüchen 1 und 6 definiert. Des weiteren betrifft die Erfindung ein neues Konjugat.
Neue Verfahren werden geschaffen, die auf der enzymkatalysierten Insolubilisierung von markiertem Fibrinogen durch Bildung von markiertem Fibrin in Gegenwart von insolubilisiertem Fibrinogen basieren, das ebenfalls der enzymkatalysierten Fibrinbildung unterworfen ist, wodurch ein markierter Fibrin-insolubilisierter Fibrinkomplex an der Stelle des insolubilisierten Fibrinogens gebildet wird. Das Verfahren kann zum Nachweis einer großen Vielzahl von Analyten eingesetzt werden, da es geeignet ist, direkt Blutfaktoren, die an der Gerinnselbildung oder Hemmung von Gerinnselbildung beteiligt sind, und indirekt eine große Vielzahl von Analyten einschließlich Haptene, Antigene und Rezeptoren, insbesondere Antikörper, nachzuweisen.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Am vorliegenden Verfahren sind an ein festes Substrat gebundenes Fibrinogen, markiertes Fibrinogen, Prothrombin und solche andere Zusatzreagienzen beteiligt, die mit der Bildung von Fibrin durch Thrombin und dem Nachweis des interessierenden Analyts in Verbindung stehen. Es kann entweder eine Endpunktbestimmung angewendet werden, wobei ein Plateauwert als ein Analog zur Gerinnselbildung beobachtet wird, oder es kann irgendein Zwischenstadium gewählt werden, in dem eine einzelne oder eine Vielzahl von Bestimmungen durchgeführt wird bzw. werden, um tatsächlich ein Feststellen der Rate für die Komplexbildung zu ergeben. Sobald der Komplex gebildet wurde, kann die Menge an Marker, der im Komplex vorhanden ist, leicht in Übereinstimmung mit der Art des Markers festgestellt werden.
Verschiedene Vorschriften können angewendet werden, die vom Analyten abhängig sind. Verschiedene Analyten machen verschiedene Vorschriften und Reagenzien notwendig. Allen Vorschriften gemeinsam ist an einen Träger gebundenes Fibrinogen und markiertes Fibrinogen allein, oder in Kombination mit unmarkiertem Fibrinogen.
Thrombinbestimmungen machen keine zusätzlichen Reagenzien zur Gerinnselbildung notwendig, obwohl andere Reagenzien hinzugefügt werden könnten. Wenn der Analyt Thrombin aktiviert oder hemmt, wird Thrombin dem Untersuchungsmedium für einen derartigen Analyten hinzugefügt.
Wenn ein Gerinnungsfaktor der Analyt ist, ist es notwendig, die anderen Faktoren, die der Analyt benötigt, um Thrombin aus Prothrombin zu erzeugen, sowie Prothrombin in das Untersuchungsmedium einzubeziehen. Auf ähnliche Weise wird dann, wenn der Analyt einen bestimmten Faktor aktiviert oder hemmt, dieser Faktor mit den zusätzlichen Faktoren, die zur Spaltung von Prothrombin zu Thrombin notwendig sind, einbezogen. Die Mischung aus Faktoren kann verdünntes Plasma sein, dem der interessierende Faktor fehlt, oder eine Mischung aus gereinigten Faktoren, der der interessierende Faktor fehlt, um die Koagulationskette zu vervollständigen.
Schließlich können Analyt-Konjugate zu einem Agens eingesetzt werden, das am Gerinnen oder dem Modulieren der Gerinnung beteiligt ist. Das Agens kann Prothrombin, Thrombin, ein anderer Gerinnungsfaktor als Fibrinogen oder ein Aktivator oder Inhibitor für Thrombin oder einen anderen Gerinnungsfaktor sein. Als ein Ergebnis der Komplexbildung zwischen Analyt und seinem komplementären Bindeglied, das die Gerinnselbildungsrate beeinflußt, hat das Agens eine Wirkung auf die Gerinnung. (Mit Komplexbildung ist die nicht-kovalente Bindung eines Liganden und seines komplementären Rezeptors gemeint, wobei der Ligand und der Rezeptor ein spezifisches Bindungspaar definieren.)
Die verschiedenen Reagenzien werden gemischt und hinreichend lange inkubiert, damit Reaktion entweder in einem Zwischenstadium auftritt oder sich Gerinnsel bilden. Die Flüssigphase wird dann entfernt, die Festphase gewaschen, um jeden nicht spezifisch gebundenen Marker zu entfernen, und die Menge von an die Oberfläche gebundenem Marker als Kennzeichen für die Menge an gegenwärtigem Analyt bestimmt.
Wie bereits erwähnt, können die vorliegenden Bestimmungsverfahren entweder "direkt" oder "indirekt" durchgeführt werden, wobei die indirekte Vorgangsweise eine kompetitive oder sekundäre Interaktion umfaßt, welche die Bildung von Thrombin oder Thrombinaktivität beeinflußt, während mit direkt gemeint ist, daß der interessierende Analyt eine direkte Wirkung, entweder Aktivierung oder Hemmung, auf die Entstehung von Thrombin oder Thrombinaktivität hat.
Die ersten Bestimmungsverfahren, die bei der direkten Vorgangsweise zu behandeln sind, sind die Bestimmungsverfahren, die Blutfaktoren zum Gegenstand haben. Die Vorschrift des Bestimmungsverfahrens variiert etwas je nachdem, ob der Faktor ein Bestandteil des extrinsischen oder des intrinsischen Weges ist oder an beiden Wegen beteiligt ist, was als allgemeiner Weg bezeichnet wird. Die am intrinsischen Weg beteiligten Faktoren umfassen VIII, IX, XI und XII, während die am extrinsischen Weg beteiligten Faktoren III (Gewebsfaktor) und VII umfassen. Die am allgemeinen Weg beteiligten Faktoren umfassen V, X, XIII, I (Fibrinogen) und II (Prothrombin).
Plasmen, denen der humane Gerinnungsfaktor fehlt, sind im Handel erhältlich, wobei dem Plasma ein spezifischer Faktor oder eine Gruppe von Faktoren fehlt. Diese Plasmen können bei den Bestimmungsverfahren und als Standards zum Vergleich mit Plasmen verwendet werden, von denen vermutet wird, daß sie eine genetische Defizienz oder einen anderen Grund dafür haben, darin inkompetent zu sein, einen aktivierbaren Gerinnungsfaktor aufzuweisen. Die Plasmen, von denen angenommen wird, daß ihnen die Faktoren des intrinsischen Wegs (VIII, IX, XI und XII) fehlen, können durch Celite oder Kaolin plus Lipid stimuliert werden, während Plasma, das defiziert ist, was den extrinsischen Weg (VII) betrifft, durch Gewebsfaktor (Thromboplastin, III) stimuliert werden kann. Es ist auch möglich, Mischungen aus gereinigten Faktoren minus dem interessierenden Faktor herzustellen, wobei in einigen Fällen Enzyme eingesetzt werden, die einzelne Faktoren wie Schlangengift-Faktor-X-Aktivator oder Faktor-V-Aktivator aktivieren können. Dieser Ansatz ist besonders beim Messen von Faktoren des allgemeinen Wegs (X, II, V) wünschenswert, weil weniger gereinigte Faktoren notwendig sein sollten.
In vielen Fällen ist es nicht notwendig, Faktoren der gleichen Spezies wie die Spezies des Analyten einzusetzen, da in den meisten Fällen Faktoren von unterschiedlichen Spezies Kreuzaktivierung ergeben. Daher können die Faktoren von so verschiedenen Spezies wie Maus, Kaninchen, Ratte, Affe, Kuh oder Mensch zum Einsatz kommen, wobei der oder die Faktoren mit Proben titriert werden können, die bekannte Aktivitätsmengen bezüglich der verschiedenen Gerinnungsfaktoren und der Brauchbarkeit der speziellen bestimmten Spezies aufweisen. Daher ist es nicht notwendig, beim vorliegenden Bestimmungsverfahren humane Faktoren für humane Analyten einzusetzten, obwohl sich das als wünschenswert erweisen könnte.
Die vorliegende Technik kann nicht nur bei spezifischen Gerinnungsfaktoren eingesetzt werden, sondern auch bei natürlich auftretenden oder synthetischen Materialien, die einen oder mehrere Faktoren aktivieren oder hemmen können. Daher kann die vorliegende Methodik auch zum Messen der Gegenwart von Materialien eingesetzt werden, welche die Aktivität eines oder mehrerer der Blutgerinnungsfaktoren modulieren.
Wenn man mit dem Feststellen der Aktivität eines speziellen Faktors in einer Probe beschäftigt ist, nimmt man eine Blutprobe, verdünnt sie zu einer oder mehreren, üblicherweise eine Vielzahl von Verdünnungen, und fügt sie einem Plasma hinzu, dem der zu bestimmende Faktor fehlt. Auf diese Art ist der Beitrag der Probe zur Gerinnselbildung mit Ausnahme des Analyten vernachlässigbar gering, sodaß die beobachtete Wirkung ausschließlich das Ergebnis des speziellen interessierenden Faktors im Plasma ist, oder aber der Beitrag kann auf Standards bezogen werden. Auf ähnliche Weise fügt man, wenn man einen endogenen Aktivator oder Inhibitor untersuchen möchte, der in einer physiologischen Probe vorhanden sein kann, Verdünnungen des Plasmas zu einem Medium hinzu, das alle Faktoren enthält, wobei die Faktoren im Medium in ausreichender Menge vorhanden sind, um den Beitrag aus der Probe wesentlich zu übertreffen. Alternativ dazu kann, wenn das spezielle zu analysierende Material beträchtlich konzentriert und von anderen Faktoren, die beim Gerinnungsweg beteiligt sind, befreit werden kann, das Konzentrat dann verwendet werden, und die Menge der verschiedenen im Medium vorhandenen Faktoren kann von einer beträchtlichen Verdünnung von normalem Plasma bis zu einem Konzentrat reichen.
Die verschiedenen Bestandteile können gleichzeitig oder nacheinander zusammengebracht werden. Vorzugsweise werden die Probe und markiertes Fibrinogen in einem Medium, das die geeigneten Faktoren aufweist, mit dem an einen Träger gebundenen Fibrinogen kombiniert, gefolgt vom Hinzufügen eines Aktivierungsagens wie Kalzium. Die Mischung kann dann hinreichend lange inkubiert werden, damit Reaktion auftritt. Unter den Umständen kann die Reaktion in Raten- oder Endpunktvorgangsweise durchgeführt werden, wobei letzteres besonders vorzuziehen ist. Es sollte beachtet werden, daß es eine Zeitspanne gibt, während der kein beobachtbares Signal auf der Basis von mit der Oberfläche verbundenem Marker vorhanden ist, und dann einen sehr raschen Anstieg an mit der Oberfläche verbundenem Marker, wobei ein Wert erreicht wird, der außerhalb des Anzeigebereichs liegt. Somit kann man dadurch, daß man verschiedene Konzentrationen der Probe hat, die höchste Konzentration beobachten, welche als erste Konzentration den maximalen Wert oder einen Wert unmittelbar unter dem maximalen Wert ergibt. Dieser Wert kann dann in die Konzentration oder aktive Menge eines speziellen Faktors, Aktivators oder Inhibitors umgelegt werden.
Von gleicher Wichtigkeit ist die Tatsache, daß das vorliegende Verfahren eine einfache Technik zum Nachweisen eines jeden Analyten durch Ermöglichung von Komplexbildung zur Moduulierung der Thrombinaktivität schafft. Somit kann der Einsatz der Kombination aus Thrombin, an einen Träger gebundenem Fibrinogen und markiertem Fibrinogen mit jedem System gekoppelt werden, welches die Modulierung der Thrombinaktivität ermöglicht. Eine große Vielzahl von Systemen ist entwickelt worden und kann beim vorliegenden Nachweissystem eingesetzt werden.
Bei einer Ausführungsform wird ein Thrombinaktivator oder -inhibitor mit dem interessierenden Analyten verbunden, wobei die Bindung von Antikörper oder anderem Rezeptor an den interessierenden Analyten den Thrombinaktivator oder -inhibitor (-modulator) am Interagieren mit Thrombin hindert. Dann kann eine kompetitive Bestimmung zwischen dem Konjugat und dem Analyten in bezug auf einen Rezeptor für den Analyten durchgeführt werden, gefolgt vom Kombinieren des Mediums für die kompetitive Bestimmung mit bekannten Mengen an Thrombin und markiertem Fibrinogen in der Gegenwart von gebundenem Fibrinogen. Wenn man ausschließlich damit beschäftigt ist, ob der Analyt unterhalb oder oberhalb einer bestimmten Schwellenkonzentration vorhanden ist, kann leicht festgestellt werden, ob Gerinnung innerhalb eines vorherbestimmten Zeitraums auftrat, als Anzeichen für die Gegenwart des Analyten oberhalb der Schwellenkonzentration. Wenn eine quantitative Bestimmung der Analytmenge gewünscht wird, kann man die Bestimmung als Testreihe mit variierenden Konzentrationen der Probe durchführen und die Konzentration als Anzeige für die Konzentration des Analyten bestimmen, bei welcher der Plateauwert oder der Wert unmittelbar unterhalb des Plateaus erreicht wird.
Alternativ dazu kann man einen Faktor in der Gerinnungskette (z.B. Thrombin, Xa, VIIa, Gewebsfaktor) mit Analyt, insbesondere Haptenanalyt konjugieren, und eine homogene oder heterogene Bestimmung durchführen. Die homogene Bestimmung umfaßt das Binden von Antikörper an den Faktor, der seine Aktivität moduliert. Die heterogene Bestimmung umfaßt das Binden des Faktorkonjugats an einen Träger, der einen Rezeptor für den Analyten enthält. Man führt eine kompetitive Bestimmung zwischen Analyt und an den Faktor konjugiertem Analyt durch und entfernt dann den Überstand. Die Menge an gebundenem Faktor wird dann durch ein Bestimmungsverfahren in bezug auf eine spezifischen, an die Festphase gebundenen Faktor festgestellt. Die Menge an gebundenem Faktor ist umgekehrt proportional zur Menge an Analyt in der Probe und durch Einsatz der oben beschriebenen Technik kann man die Menge an Analyt in der Probe qualitativ oder quantitativ bestimmen. Bei einer ähnlichen Technik kann eine Affinitätssäule eingesetzt werden, wobei die Menge an in der Säule aufgehaltenem Faktor umgekehrt proportional zu der Menge an Analyt in der Probe ist. Der zum Konjugieren an den Analyten gewählte Faktor hängt von der für das Bestimmungsverfahren gewünschten Empfindlichkeit ab. So können die Faktoren VIIa und III (Gewebsfaktor) im Picogramm/ml-Bereich nachgewiesen werden, während Thrombin im Nanogramm/ml Bereich nachgewiesen werden kann. Die Möglichkeit, einen Empfindlichkeitsbereich zur Bestimmung irgendeines Analyten zu wählen, mit einem einzigen Verfahren zum Feststellen des Endpunktes der Bestimmung, ist einer der bedeutenden Vorteile dieses Verfahrens.
Alternativ dazu können monoklonale Antikörper hergestellt werden, die für einzelne Faktoren spezifisch sind, welche ihre Aktivität hemmen. Durch Konjugieren von Antikörper und Analyt, Herbeiführen einer Kompetition zwischen dem Analyten des Antikörperkonjugats und dem Analyten in der Probe um das entsprechende Glied des spezifischen, an eine Oberfläche gebundenen Bindungspaars, steht die Menge an hemmendem Antikörper im Überstandsmedium in Beziehung zur Menge an Analyt in der Probe. Der Überstand wird dann mit dem Nachweissystem zum Bestimmen der Analytmenge in der Probe kombiniert.
Man kann auch eine ELISA-Technik einsetzen, wobei ein Faktorkonjugat eingesetzt wird, das mit Analyt für das entsprechende Bindungsglied, welches an einen Träger gebunden ist, in Konkurrenz steht. Die Menge an Faktorkonjugat, das an die Oberfläche gebunden ist oder im Überstand zurückgehalten wird, kann dann unter Verwendung des Nachweissystems festgestellt werden.
Verbindungen, die als Thrombininhibitoren oder -aktivatoren eingesetzt werden können umfassen Benzamidin, anti-Thrombin III, Serinproteaseinhibitoren, α&sub2;-Macroglobulin, α&sub1;-Antitrypsin, C-1-Esteraseinhibitor.
Als ein Marker für das Fibrinogen kann jedes Molekül eingesetzt werden, das die Gerinnung nicht beeinträchtigt, aber die Bestimmung ermöglicht. Eine große Vielzahl von Markern ist eingesetzt worden, wie Enzyme, Radionuklide, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, Enzymsubstrate und Cofaktoren oder Enzyminhibitoren. Die Marker können entweder direkt oder indirekt an das Fibrinogen gebunden werden, wobei verschiedene Brückenglieder verwendet werden können, wie Antikörper, Hapten-Rezeptoren, z.B. Biotin-Avidin, oder Polynukleotide. Es existieren zahlreiche Patente, die den Einsatz dieser verschiedenen Materialien beschreiben, wobei die folgenden die Gruppe veranschaulichen: die US- PSen Re 29169; Re 29 955; 3654090; 3690834; 3817837; 3867517; 3935074; 3975511: 3996345; und 4020151.
Das an den Träger gebundene Fibrinogen kann auf verschiedene Arten vorhanden sein, wobei es vorteilhafterweise an die Wände von Mikrotiter- Näpfen oder die Wände von Kapillaren gebunden ist, an Partikel gebunden ist, z.B. magnetische Partikel, Polysaccharide oder ähnliche, oder an eine andere Oberfläche, die es ermöglicht, daß das Gerinnsel an einer Stelle lokalisiert ist, wo der Marker gemessen werden kann. Von besonderem Interesse sind Mikrotiterplatten, wobei das Signal in einem Mikrotiterplattenleser gemessen werden kann. Diese Leser sind jetzt im Handel erhältlich.
Das Fibrinogen kann in unterschiedlichen Konzentrationen auf die Oberfläche des Trägers aufgetragen werden. Vorteilhafterweise kann eine Lösung aus Fibrinogen aufgesprüht, aufgetragen oder durch eine andere vorteilhafte Vorgangsweise auf die Oberfläche aufgebracht und trocknen gelassen werden. Die Menge an Fibrinogen beträgt im allgemeinen etwa 1 bis 10 ug/Napf. Jede entsprechend gepufferte Lösung, im allgemeinen mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 9, kann eingesetzt werden. Nachdem die Oberfläche beschichtet worden ist, kann sie unter Bedingungen von Umgebungs- oder leicht erhöhter Temperatur mit oder ohne Vakuum trocknen gelassen werden. Um nicht-spezifische Bindung an die Oberfläche wesentlich zu vermindern oder zu eliminieren, kann die Oberfläche dann mit einem inerten Protein wie Serumalbumin beschichtet werden, wobei die Oberfläche mit einer Lösung mit von etwa 1 bis 20 mg/ml Protein hinreichend lange in Kontakt gebracht wird, damit das Protein sich an die Oberfläche bindet, gefolgt von Waschen und mildem Trocknen. Das Fibrinogen sollte dann in einer mäßig feuchten Umgebung gehalten werden, um seine fortwährende Wirkung sicherzustellen, was dadurch erreicht werden kann, daß eine geringe Menge Wasser mit der Oberfläche in Kontakt gehalten wird, zum Beispiel durch Abdichten der Näpfe bis unmittelbar vor der Verwendung.
Das Bestimmungsverfahren kann unter milden Temperaturbedingungen durchgeführt werden, im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 40ºC, meistens von etwa 20 bis 37ºC. Die Konzentration der verschiedenen Reagenzien variiert sehr stark, je nach der speziellen Vorschrift, danach, was gemessen wird, dem interessierenden Konzentrationsbereich des Analyten, ob eine qualitative oder quantitative Bestimmung notwendig ist, der Zeit für das Bestimmungsverfahren und ähnlichem. So kann die Bestimmungszeit im Bereich von etwa 1 min bis 6 h liegen, meistens von etwa 1 min bis 2 h. Inkubationszeiten können von etwa 1 min bis 2 h oder mehr variieren. Das eingesetzte Medium ist normalerweise ein wässeriges Medium, wobei geringe Mengen an polaren organischen Lösungsmitteln enthalten sein können, gewöhnlich weniger als 40 Vol-%, meistens weniger als etwa 10 Vol-%. Die Lösung ist normalerweise auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 9, meistens von etwa 7 bis 8,5 gepuffert. Verschiedene Puffer können eingesetzt werden, wie Phosphat, Tris oder ähnliche, die Koagulationsreaktionen nicht hemmen.
Faktor-Aktivatoren von einer anderen Quelle als Säugetierblut können bei einer Vielzahl von Vorschriften als Marker verwendet werden. Faktor- Aktivatoren wie Schlangengift-Faktor-X-Aktivator, z.B. ein Proteasebestandteil von Russell's Viperngift, kann sowohl bei heterogenen als auch bei homogenen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden.
Bei heterogenen Bestimmungsverfahren kann das Enzym der Marker oder der Blutfaktor sein, auf den das Enzym als der Marker wirkt. Alternativ dazu kann ein Antikörper oder anderer Rezeptor für das Enzym, wobei der Enzym-Rezeptor-Komplex enzymatische Wirkung beibehält, der Marker sein. So kann der Marker jede Verbindung sein, die eine Bindung der Protease ergibt.
Das Bestimmungsverfahren kann durch das Kombinieren geeigneter Reagenzien durchgeführt werden, wie in einem kompetitiven Bestimmungsverfahren Analyt-Enzym-Konjugat mit dem homologen spezifischen Bindungspaarglied an einen Träger gebunden -- oder einem Sandwichtyp Bestimmungsverfahren -- ein homologes spezifisches Bindungpaarglied-Enzymkonjugat und das gleiche oder ein anderes homologes spezifisches Bindungspaarglied an einen Träger gebunden -- wobei ein Inkubieren der Mischung ermöglicht wird und dann zusätzliche Reagenzien für das Fibrinogen zur Fibrinreaktion hinzugefügt werden und Bestimmung der Menge an gebildetem Fibrin.
Bei der "homogenen" Technik (siehe US-PS-3817837) wird die Protease an den Analyten oder eine mit dem Analyten immunologisch kompetitive Verbindung, gewöhnlich ein Hapten, konjugiert, sodaß nach dem Binden des Rezeptors die enzymatische Aktivität in Bezug auf die Menge an an Enzym gebundenem Rezeptor moduliert, gewöhnlich verringert wird. Indem man Analyt und Konjugat um eine begrenzte Menge an Rezeptor konkurrieren treten läßt, kann die sich ergebende enzymatische Aktivität mit der Menge an Analyt im Medium in Beziehung gebracht werden.
Das vorliegende Verfahren kann mit jedem Ligandtyp, haptenisch oder antigenisch, Rezeptoren oder Polynukleotiden angewendet werden. Abgesehen von den zuvor beschriebenen Blutfaktoren können pharmazeutische Wirkstoffe, Hormone, Enzyme, Lymphokine, Neurotransmitter, Membranproteine, regulatorische Proteine oder Wachstumsfaktoren alle von Interesse sein.
Um den Einsatz der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, können Sets geschaffen werden, welche die verschiedenen Reagenzien enthalten. In bevorzugten Verhältnissen, sodaß die Empfindlichkeit des Verfahrens optimiert wird. Zur Bestimmung von Blutfaktoren können Prothrombin, markiertes Fibrinogen, Fibrinogen-beschichtete Behälter, insbesondere Mikrotiterplatten und ein oder mehrere Plasmen mit Faktordefirienz zum Nachweis verschiedener Faktoren vorgesehen sein. Die verschiedenen Reagenzien mit Ausnahme des Fibrinogen-beschichteten Trägers können als lyophilisierte Reagenzien vorgesehen sein, die rekonstituiert sein können, und sind in Kombination mit Puffern, Stabilisatoren, inerten Proteinen wie Serumalbuminen oder ähnlichem vorgesehen. Für einige Anwendungen kann es wünschenswert sein, Reagenzien in Mikrotiternäpfen bei für das Bestimmungsverfahren geeigneten Konzentrationen zu lyophilisieren. Wenn andere als Blutfaktoren beteiligt sind, können die Sets das Konjugat des Analyten und ein die Thrombin-Aktivität modulierendes Molekül in Kombination mit Thrombin anstelle von Prothrombin enthalten. Auch andere Reagenzien können in dem Set enthalten sein, wie Enzymsubstrate und Cofaktoren, wobei ein Enzym ein Marker ist.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung.

VERSUCHSTEIL

Fibrinogen-Peroxidase-Konjugat

Dieses wurde nach dem Verfahren von Nakane und Kawaoi (J.Histochem.Cytochem (1974) 22:1084) unter Verwendung von 40 mg Meerrettichperoxidase und 300 mg humanem Fibrinogen hergestellt. Das Molverhältnis von Peroxidase zu Fibrinogen im Endprodukt betrug 0,39. Dieses wurde mit unmarkiertem Fibrinogen auf eine Konzentration von 0,72 mg/ml Fibrinogen mit einem Molverhältnis von 0,12 Mol Peroxidase pro Mol Fibrinogen verdünnt und in 50%igem Glycerin bei -20ºC gelagert.

Thrombinbestimmung

Bei der ersten Bestimmung wurden Mikrotiterplatten pro Napf mit 150 ul von 50 ug/ml Fibrinogen in 10 mM Tris-Acetat-gepufferter Salzlösung (TABS), pH 7,6, die 10 mM EDTA enthielt, über Nacht bei 4ºC beschichtet. Die Lösung wurde von der Platte entfernt und 100 ul einer 10 ug/ml Lösung von Peroxidase-Fibrinogen in 3,8 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) in TABS, das 10 mM Kalziumchlorid enthielt, wurde dem Napf hinzugefügt. 50 ul Thrombin in einer Verdünnung von 0,1 bis 0,00078 NIH Einheiten/ml (300,25ng/ml) wurde jedem Napf über verschiedene Zeiträume von 0-160 min hinzugefügt, wonach die Lösung von der Platte gewaschen wurde. Peroxidasebestimmung wurde unter Verwendung von Ortho-Phenylendiamin als Indikatorfarbstoff durchgeführt, mit 11 min Inkubation. Die optische Dichte wurde bei 490 nm unter Einsatz eines Mikrotiterplattenlesers mit den folgenden Ergebnissen gemessen: [Thrombin] (NIH Einheiten/ml) Inkubationszeit (min)
Nicht nur der Endpunkt (0.D > 2), sondern auch die Partialreaktion (0,4 < 0.D, < 2) kann als ein Maß für Thrombinaktivität verwendet werden. Der vorletzte Wert vor dem Endpunkt oder eine annähernde Extrapolation auf die Konzentration von Thrombin, die einen 0.D. Wert von 1 ergibt, kann verwendet werden, um diese Bestimmung zu standardisieren. Für den obigen Versuch wird dieser Wert bei folgenden Thrombinkonzentrationen erreicht: Inkubationszeit (min) [Thrombin] für 0.D.=1
Bei der nächsten Bestimmung wurden Benzamidin und D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-argininchlormethylketon (PPACK) dem Thrombin am Beginn der Bestimmung hinzugefügt. Das Hinzufügen dieser Inhibitoren erhöhte die Thrombinkonzentration, die notwendig war, um äquivalente Bindung von Peroxidasefibrin an die Festphase zu erreichen. Die prozentuelle Hemmung kann von der erhöhten Thrombinkonzentration, die notwendig ist, um äquivalente Aktivität zu erreichen, als
% Hemmung = 100* (1-To/Ti)
berechnet werden, wobei To die Thrombinkonzentration ist, die ein 0.D.= 1 in Abwesenheit von Inhibitor ergibt, und Ti die Thrombinkonzentration ist, die eine 0.D.=1 in Gegenwart einer gegebenen Inhibitorkonzentration ergibt. Die Hemmung durch diese beiden Inhibitoren in einer 80minütigen Bestimmung ist im folgenden zu sehen: [PPACK], nM % Hemmung [Benzamidin], mM % Hemmung
Die Hemmung durch diese beiden Inhibitoren stand im Einklang mit ihren bekannten Affinitäten und Wirkungsmechanismen wie in Markwardt et al., (Eur.J. Biochemistry (1968) 6:502; Kettner und Shaw, Thrombosis Research (1979) 14:969 im Detail beschrieben. Der gleiche Ansatz kann verwendet werden, um Inhibitorkonzentration von natürlichen Thrombininhibitoren wie Antithrombin III zu messen. Die Inhibitorkonzentration wird dabei durch eine Standard-Hemmungskurve unter Einsatz eines gereinigten Inhibitors bestimmt, wobei dann äquivalente Thrombinhemmung durch die Testprobe erzielt wird. Das Testen mehrerer Inhibitorverdünnungen bei einer einzigen Thrombinkonzentration erscheint als der zweckmäßigste Ansatz zum Messen von Inhibitorkonzentration.

Messung von Faktor III (Thromboplastin, Gewebsfaktor)

Bei dieser Untersuchung wurde die Bestimmung so abgewandelt, daß normales menschliches Plasma als Substrat verwendet wurde. Fibrinogen aus normalem Plasma wurde mit Polyäthylenglykol 1000 bei einer Endkonzentration von 10% wie in Masri et al. (Thrombosis and Haemostasis (1983) 49: 116) beschrieben ausgefällt. Der Überstand wurde mit einem gleichen Volumen an 100%igem Glycerin gemischt und bei -70ºC eingefroren gelagert, oder in flüssiger Form bei -20ºC. Zur Bestimmung wurden 50 ul verdünnter Gewebsfaktor in 20mM Kalziumchlorid, 1mg/ml BSA, TABS in die Platte abgegeben, gefolgt von 100 ul pro Napf an verdünntem Plasma in 2mM EDTA, 3,8mg/ml BSA, 3,6 ug/ml Peroxidase-Fibrinogen und 0,6%ige Kaninchengehirn-Cephalinsuspension in TABS. Der Endpunkt der Bestimmung war dem für Thrombin ähnlich, d.h. die Thromboplastinkonzentration, die einen 0.D.-Wert von 1 ergab. Die bei verschiedenen Plasmakonzentrationen und Inkubationszeiten erzielten Ergebnisse sind unten zusammengefaßt. Die Empfindlichkeit der Bestimmung war wie erwartet abhängig von der Substratkonzentration und Inkubationszeit. Die Empfindlichkeitsgrenze lag unter 1ng/ml rohem Gehirnthromboplastinprotein.

Konzentration von menschlichem Gehirnthromboplastin in ng/ml an rohem Protein, was einen 0.D.-Wert von 1 bei verschiedenen Plasmakonzentrationen und Inkubationszeiten ergibt

Die Bestimmung wurde unter Einsatz von vier Verdünnungsreihen bei jeder Konzentration von normalem menschlichem Plasma durchgeführt. Inkubation fand bei 37ºC statt; die Peroxidasebestimmung dauerte 8 min bei 37ºC. Zeit (min) Menge an pro Napf hinzugefügtem Plasma (ul) * HB = high blank
Die Spezifität der Bestimmung wurde durch ihre Wiederholung in Plasmasubstraten bestätigt, denen jeweils ein spezifischer Faktor fehlte. Äquivalente Aktivität wurde in normalem Plasma und in Plasmen mit Defizienz bezüglich VIII, IX, XI und XII erzielt. Keine Aktivität (Defizienz an X und II) oder 100-fach geringere Aktivität (Defizienz an V und VII) war in Substratplasmen meßbar, die bei Faktoren defizient waren, was den extrinsischen oder allgemeinen Weg betrifft.

Bestimmung von Leukozytgewebsfaktor

Bei dieser Bestimmung wurde die Gewebsfaktoraktivität von aus peripherem Blut von normalen Versuchstieren isolierten Monozyten sowohl vor als auch nach dem Inkubieren in Kulturmedium gemessen. Die Daten sind für die Anzahl von im Bestimmungsnapf vorhandenen Zellen standardisiert, die eine 0.D. von 1 für die Gewebsfaktorbestimmung ergaben. Leukozyten wurden aus mit Zitrat behandeltem Blut durch Zentrifugieren von Buffycoat -Zellen über eine Ficoll-hypaque-Schicht und Sammeln der Grenzflächenzellen isoliert. Zellen werden in einem Gewebskulturmedium inkubiert, das aus 1 x RPMI, 25mM HEPES, 1 x Penizillin und Streptomycin und 0,5% Lactoalbuminhydrolysat besteht. Dieselben Zellen wurden ohne Inkubation und nach Inkubation für mehrere Stunden oder über Nacht (16h) getestet. Eine drastische Induktion der Gewebsfaktoraktivität wurde, wie unten zu sehen, gemessen.
Gewebsfaktorspiegel in aus peripherem Blut isolierten Leukozyten. Die Daten sind als Anzahl von Zellen pro Napf ausgedrückt, die nach der angegebenen Inkubationszeit isoliert wurden, was einen 0.D.-Wert von 1 bei einer spezifischen Bestimmung für Gewebsfaktor ergab. Versuch Stunden Zellen/Napf
Die außerordentliche Empfindlichkeit dieser Bestimmung kann zur Messung von Gewebsfaktorspiegeln in isolierten Blutzellen oder anderen Fraktionen eingesetzt werden. Die Bestimmung scheint geeignet, die Menge an in einer einzelnen Zelle vorhandenem Gewebsfaktor unter einigen Bedingungen zu messen. Das kann für das klinische Testen von in vivo aktivierten Zellen oder als Adjunkt zum Sortieren von Zellen durch Identifizieren der Zellpopulation, die Gewebsfaktor enthält, nützlich sein.

Andere Faktoren des extrinsischen Wegs

Die Messung anderer Faktoren des extrinsischen Wegs wurde durch eine Modifikation der Bestimmung erreicht, in der 50 ul verdünnte Faktoren in 2 mM EDTA, 1mg/ml BSA, TABS in den Napf gegeben wurden, 50 ul verdünnte monodefiziente Plasmen in 2mM EDTA-TABS, das 7,6mg/ml BSA, 7,21ug/ml Peroxidase-Fibrinogen und 1,2% Kaninchengehirncephalinsuspension enthielt. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 50 ul Gewebsfaktor in Gang gesetzt, der in 1mg/ml BSA, 20 mM Kalziumchlorid, TABS, verdünnt war. Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse für Bestimmungen der Faktoren VII und VIIa, in ng/ml an Faktoren, die bei den geeigneten Plasmakonzentrationen und Inkubationszeiten feststellbar sind.

Bestimmung der Faktoren VII und VIIa in Plasma mit Defizienz bei Faktor VII

Bestimmungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, wobei mehrere Plasmakonzentrationen und Inkubationszeiten angewendet wurden. Vier Verdünnungsreihen wurden für jede Bedingung untersucht. Die Thromboplastinkonzentration wurde für jede Plasmakonzentration folgendermaßen variiert: 0,1 ul Plasma, 300 ng/ml Thromboplastin; 0,2 ul, 120 ng/ml; 0,4 1ul, 30ng/ml; 0,8 ul; 9 ng/ml. Die Peroxidasebestimmung dauerte in jedem Fall 8 Minuten. Die gezeigten Werte sind die Konzentrationen der Faktoren VII oder VIIa, in ng/ml in der endgültigen Inkubationsmischung, was einen 0.D.-Wert von 1 unter diesen Bedingungen ergibt. Faktor Zeit (min) Menge an Plasma pro Napf (ul) HB= high blank
Bei der Bestimmung mit der größten Empfindlichkeit in dieser Reihe können weniger als 5pg/ml Faktor VIIa in 150 ul Probe gemessen werden. Eine ähnlich hohe Empfindlichkeit für die Bestimmung der Faktoren II, X und V wurde in vergleichbaren Bestimmungen erzielt, unter Einsatz von geeigneten defizienten Plasmen.
Dieses Verfahren ist sowohl für die Bestimmung von Antikörpern gegen Gerinnungsfaktoren als auch für den Einsatz dieser Antikörper zum Messen von Gerinnungsfaktoren nützlich. Bei der nächsten Bestimmung wurde die Fähigkeit spezifischer polyklonaler Kaninchenantikörper, die Aktivität von Thrombin und Xa zu hemmen, gemessen. Antikörperpräparate wurden durch Adsorption auf Säulen von Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Agarose und Eluieren in 0,5 M Essigsäure, oder auf Säulen der Faktoren II- oder X-Agarose und Eluieren in 0,025 M Zitrat-Natriumzitrat, pH 3 gereinigt. Diese Antikörperpräparate wurden zu Endproteinkonzentrationen von 3- 15 ug/ml verdünnt und in bezug auf Hemmung von Thrombin und Xa getestet. Thrombinbestimmung erfolgte wie oben beschrieben. Xa-Bestimmung erfolgte in einem Substrat, das aus einer Mischung aus Prothrombin, Faktor-Va, Peroxidase-Fibrinogen, Kaninchengehirncephalin und BSA bestand. Das Ergebnis wird als die Faktorkonzentration präsentiert, die notwendig ist, um einen O.D.-Wert von 1 in Gegenwart des angegebenen Antikörpers zu erhalten. Antikörper Konzentration ug/ml Thrombin NIH Einheiten/ml Anti-X gerein. auf X-Agar Anti-II gerein. auf II-Agar Anti-VII gerein. auf Ziegen anti-Kan. Anti-X gerein. auf Ziegen anti-Kan. Anti-II gerein. auf Ziegen anti-Kan.
Antikörper gegen Faktor II hemmte Thrombin um 60-80% bei diesen Konzentrationen, und Antikörper gegen Faktor X war um mehr als 98% hemmend. Die Hemmung war für das jeweilige Antigen spezifisch und stand in Beziehung zur Reinheit des Antikörpers, da spezifischer affinitätsgereinigter Antikörper stärker hemmend war als das IgG vom gleichen immunisierten Tier.
Zusätzlich zur Hemmung eines spezifischen Faktors können Antikörper, die an Epitope binden, welche die Wirkung des Faktors nicht beeinflussen, in Verbindung mit der spezifischen Gerinnungsbestimmung verwendet werden, um sehr geringe Konzentrationen dieser aktivierten Faktoren zu untersuchen. Als ein Beispiel dafür wurde in der nächsten Bestimmung die Bindung von Faktor Xa an einen monoklonalen Antikörper bestimmt, der mit Faktor X reaktiv ist. Bei dieser Bestimmung wurden Mikrotiterplatten, die mit Ziegen-anti-Maus-IgG beschichtet waren, mit O,9-667ng/ml monoklonalem Antikörper und 0,16-20ng/ml Faktor Xa 16h lang bei 4ºC inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und ein Faktor-Xa-spezifisches Substrat, das aus Faktor II, Faktor Va, BSA und Kaninchengehirncephalin bestand, wurde der Platte hinzugefügt und bei 37ºC 40 und 60 min lang inkubiert. Bei dieser Bestimmung erzeugtes Thrombin wurde durch Übertragen von 50 ul der Mischung in eine Bestimmungsplatte gemessen, die Peroxidasefibrinogen und BSA in TABS-Puffer enthielt. Nach 40minütiger Inkubation wurden die Platten gewaschen und gebundene Peroxidase gemessen. Die in diesem Fall erhaltenen Werte für optische Dichte waren: 40 min Inkubation [Monoklonaler Antikörper], ng/ml Blindprobe (Blank) 60 min Inkubation [monoklonaler Antikörper], ng/ml Blindprobe (Blank)
Die Empfindlichkeit dieses kombinierten Festphasenimmunoassays und Festphasenkoagulationsassays ist hoch; weniger als 0,2 ng pro ml Faktor Xa konnten in 0,15 ml Probe nachgewiesen werden, oder etwa 23 pg Xa pro Probe. Das würde den Einsatz von Xa oder anderen aktivierten Gerinnungsfaktoren bei sensitiven Immunoassays von spezieller Bedeutung machen. Die immunochemische Reaktion mit an Antigen oder Antikörper konjugiertem aktiviertem Gerinnungsfaktor könnte in einem Bestimmungsmedium durchgeführt werden, in dem sowohl geeigneter Antikörper und Fibrinogen an der Festphase befestigt wären, und die darauffolgende Bestimmung von gebundenem Gerinnungsfaktor würde dann zum Befestigen von markiertem Fibrinogen führen. Jede Gruppe, die kovalent an ein Antigen oder einen Antikörper gekoppelt werden kann, um zum Nachweis von immunochemischen Komplexen beizutragen, könnte ebenso an Fibrinogen befestigt sein. Der Vorteil des kombinierten Einsatzes von Gerinnungsfaktorkonjugaten mit darauffolgenden Koagulationsketten- Reaktionen, welche die Menge an berichtbarem Liganden vergrößern, der an die Festphase gebunden ist, besteht darin, daß die Nachweisempfindlichkeit weniger einschränkend ist. Für jedes Molekül an gebundenem aktiviertem Faktor wird eine große Zahl von Molekülen des Fibrin-Konjugats an die Festphase gebunden. Niedrige Konzentrationen von Gerinnungsfaktorkonjugat werden beim Immunoassay eingesetzt, was Vorteile bei kompetitiver Immunoassayanordnung und den Kosten des Einsatzes dieser Assaytechnik hat. Die Empfindlichkeit kann durch den Einsatz von Faktoren weiter verstärkt werden, die früher in der Koagulationskette aktiv sind, wie Faktor VIIa oder Gewebsfaktor, oder jedes Enzym, das beim Stimulieren der Koagulation aktiv sein kann. Derartige Enzyme müssen nicht notwendigerweise aus Säugetierquellen erhalten werden, sondern können auch von Bakterien oder anderen Spezies isoliert werden, die Koagulationsaktivatoren erzeugen. Ein derartiges Enzym ist die Faktor-X-aktivierende Protease, die in Russel's Viperngift enthalten ist, ein Enzym, das 5-10% des gesamten Proteins in diesem Gift darstellt und äußerst aktiv beim Stimulieren der Koagulation durch Hydrolyse von Faktor X zu Xa ist. Bestimmungen dieses Enzyms sind äußerst empfindlich, wie unten zu sehen:

Bestimmung von Russell's Viperngift-Faktor-X-Aktivator unter Einsatz von normalem Plasma als Substrat

Bestimmungen wurden in einem Substrat durchgeführt, das aus Tris-gepufferter Salzlösung, pH-Wert 8, bestand, die Kaninchengehirncephalin, Peroxidase-Fibrinogen und BSA enthielt, plus der angegebenen Menge an pro Napf hinzugefügtem normalem menschlichem Plasma, mit einem Endvolumen von 150 ul. Die Bestimmung von Peroxidase dauerte in jedem Fall 8 Minuten. Die gezeigten Werte sind die Konzentrationen von Russell's Viperngift-Faktor-X-Aktivator, in Picogramm/ml in der Endinkubationsmischung, was einen O.D.Wert von 1 unter diesen Bedingungen ergibt. Zeit Menge an pro Napf hinzugefügtem Plasma (ul) HB = high blank
Eine niedrigere Grenze von 30-50 Femtogramm/ml wurde bei dieser Bestimmung erreicht, in einem Volumen von 150 ul, oder 4,5-7,5 Femtogramm dieses Enzyms. Da das Molekulargewicht des Enzyms 60 000 Dalton beträgt, ist das umgelegt eine Nachweisgrenze von 0,075 Attomol, oder weniger als 20 000 Moleküle des Enzyms. Diese niedrige Nachweisgrenze wäre der Hauptwert dieses Enzyms, das in Immunbestimmungen, Rezeptor-Bindungs-Bestimmungen oder Blotting-Bestimmungen unter Einsatz von Protein- oder Nukleinsäurekonjugaten dieses Enzyms verwendet wird.

Einsatz von Russell's Viperngift-Faktor-X-Aktivator als ein Konjugat für Immunoassays vom ELISA-Typ

Um die Nützlichkeit dieses Enzyms für Immunoassays zu bewerten, wurden Konjugate aus Russell's Viperngift-Faktor-X-Aktivator mit Faktor X und mit zwei monoklonalen Antikörpern gezogen gegen Faktor X (BG-X2 und BG-X4) hergestellt, die mit bestimmten Epitopen auf Faktor X reaktiv waren. Der Einsatz dieses Systems, um die Nützlichkeit dieses Enzyms als ein konjugierendes Enzym zu testen, ermöglichte einen strengen Test der Möglichkeiten dieses Systems, da eine mögliche Nebenreaktion bei Assays, bei denen dieses Enzym eingesetzt wird, der Proteaseabbau von reagierender Spezies sein würde. Durch den Einsatz des natürlichen Substrats des Enzyms bei Assays könnte diese mögliche Nebenreaktion ausgeschlossen werden.
Der erste Test war ein kompetitives Assay, wobei Faktor X und das Konjugat von Faktor X mit Russell's Viperngift-Faktor-X-Aktivator eingesetzt wurde. Platten wurden mit Ziegen-Anti-Maus-IgG und Fibrinogen beschichtet, und Mischungen aus Faktor X, Konjugat und monoklonalem Antikörper BG-X4 mit einer Konzentration von 10ng/ml wurden über Nach in Tris-gepufferter Salzlösung bei 4ºC inkubiert, die 20 mg/ml Gelatine enthielt. Als eine Kontrolle wurde ein ähnlicher Versuch einbezogen, bei dem zum Vergleich Peroxidase-markierter Faktor-X eingesetzt wurde. Nach dem Inkubieren wurden die Platten dreimal mit Gelatine-Tris-gepufferter Salzlösung gewaschen und 40 bis 60 min lang in bezug auf gebundenes Konjugat in einem Substrat getestet, das aus einer Mischung aus den Faktoren II,V und X, Peroxidase-Fibrinogen, Kaninchengehirncephalin und Tris-gepufferter Salzlösung, pH 8, bestand, die 5mg/ml Gelatine enthielt. Zur Kontrollbestimmung unter Einsatz von Peroxidase-markiertem Faktor X wurde Peroxidasebestimmung direkt auf der Platte 40 min lang durchgeführt; für Bestimmungen unter Einsatz von Russell's Viperngiftkonjugat dauerte die Peroxidasebestimmung 40 min; (40 min Inkubation mit der Giftenzymassaymischung) oder 20min (60 min Inkubation mit der Giftenzymassaymischung). Die Ergebnisse für diese kompetitive Bestimmung sind unten zu sehen, ausgedrückt als O.D. (490) unter diesen Bedingungen: Markierter Faktor X Konzentration von unmarkiertem Faktor X (ug/ml) Peroxidase-X
Der tatsächliche Bereich für diese Bestimmung betrug daher von 3 bis 20 000 ng/ml für Bestimmungen, bei denen Russell's Viperngiftenzymkonjugat eingesetzt wurde, und von 250 - 20 000 für das Peroxidasekonjugat. Die niedrige Nachweisgrenze des Viperngiftenzymkonjugats, die den Einsatz von viel niedrigeren Konjugatniveaus bei dieser kompetitiven Assay ermöglichten, führten zu einer viel höheren Empfindlichkeit des Assays.

"Sandwichassay"

In diesem Fall wurden Konjugate von monoklonalem Antikörper BG-X2 hergestellt, und eine Platte wurde mit Fibrinogen plus Antikörper gegen Faktor X beschichtet, entweder als: (1) Immunabsorbierender-gereinigter polyklonaler Antikörper gegen Faktor X, (2) monoklonaler Antikörper BG-X2 (d.h. der gleiche Antikörper, der markiert war), oder (3) monoklonaler Antikörper BG-X4 (d.h. ein Antikörper der mit einem Epitop reaktiv ist, das sich von dem unterscheidet, mit dem der BG-X2-Antikörper reaktiv ist). Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC mit Faktor X plus dem markierten BG-X2 Antikörper in 20 mg/ml Casein in Tris-gepufferter Salzlösung pH 7,8, die 2mM EDTA enthielt, inkubiert und wurden dreimal in 20mg/ml Gelatine in Tris-gepufferter Salzlösung gewaschen, die 2mM EDTA enthielt. Eine Bestimmung in bezug auf gebundenes Konjugat wurde wie oben beschrieben und für die angegebenen Inkubationszeiten durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Probe 10mg/ml Gelatine enthielt. Ein Assay in bezug auf gebundene Peroxidase wurde unter Einsatz eines kinetischen Plattenlesers durchgeführt, wobei ein Substrat eingesetzt wurde, das aus Tetramethylbenzidin in Tris-Zitratpuffer, pH 5,2, der 20% Äthanol enthielt, bestand. Die angegebenen Werte sind die Anzahl der milli-O.D.-Einheiten pro Minute für jede Probe. Antikörper auf Platte Konzentration von Faktor X (ng/ml) Minuten Bestimmung Polyclonal anti-X Monoclonal BG-X2 Monoclonal BG-X4
Dieses Sandwichassay hat somit ein Empfindlichkeitspotential von weniger als 50 Picogramm/ml, wenn diese relativ einfache Vorschrift verwendet wird. Der Kontrollversuch unter Einsatz des gleichen Antikörpers auf der Platte, wie dünn der markiert worden war, zeigte, daß die Bestimmung für das monomere Faktor-X-Molekül spezifisch ist. Negative O.D.-Veränderungen können unter diesen Bedingungen als ein Assayartifakt betrachtet werden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart eines anderen Blutfaktors als Fibrinogen oder Prothrombin, der an der Blutgerinnung beteiligt ist, welches Verfahren umfaßt:

Kombinieren einer Probe, von der vermutet wird, daß sie zumindest einen Blutgerinnungsfaktor enthält, der als der Analyt zu bestimmen ist, mit Prothrombin, markiertem Fibrinogen und an eine Oberfläche gebundenem Fibrinogen, in Gegenwart irgendeines für die Bildung von Thrombin aus Prothrombin notwendigen zusätzlichen Blutfaktors;

Inkubieren der Mischung für ausreichend lange Zeit, damit sich Fibrin bildet und zumindest teilweise Ablagerung des markierten Fibrinogens in Gang gesetzt wird; und

Feststellen der Menge von an die Oberfläche gebundenem oder im Überstand vorhandenem Marker als ein Maß für die Analytmenge in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Marker ein Enzym ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das genannte Enzym Peroxidase ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Blutfaktor ein Faktor von V bis XII ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der genannte Faktor ein Gerinnungsinhibitor oder -aktivator ist.

6. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart eines Analyten, das umfaßt:

Kombinieren in einem Assaymedium einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den genannten Analyten enthält

(a) ein Konjugat, das umfaßt:

den genannten Analyten oder

eine Verbindung, die fähig ist, mit dem genannten Analyten in Konkurrenz um ein homologes spezifisches Bindungspaarglied zu treten oder

ein homologes spezifisches Bindungspaarglied;

direkt oder indirekt mit einer Verbindung verbunden, die fähig ist, an einer Gerinnungskette teilzunehmen, und

(b) ein an einen Träger gebundenes homologes spezifisches Bindungspaarglied;

Inkubieren der genannten Mischung ausreichend lange, damit die genannte Gerinnungskettenverbindung im Verhältnis zu der Analytmenge in der genannten Probe an den genannten Träger gebunden wird;

Trennen der an den Träger gebundenen von der ungebundenen Gerinnungskettenverbindung;

Kombinieren der an den Träger gebundenen oder ungebundenen Gerinnungskettenverbindung mit Fibrinogen, das an ein Substrat gebunden ist, markiertes Fibrinogen und alle verbleibenden Glieder, die zusammen mit der genannten Gerinnungskettenverbindung zur Gerinnung notwendig sind; und

In-Beziehung-setzen der Menge an Marker, die an das genannte Substrat gebunden oder im Überstand vorhanden ist als ein Maß für die Analytmenge in der Probe.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die genannte Gerinnungskettenverbindung Thrombin oder Prothrombin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die genannte Gerinnungskettenverbindung ein Schlangengift-Faktor-X-Aktivator ist.

9. Konjugat eines Schlangengift-Faktor-X-Aktivators und einer organischen Verbindung, das für das Verfahren nach Anspruch 6 nützlich ist.

10. Konjugat nach Anspruch 9, worin die genannte organische Verbindung ein Immunoglobulin ist.