DE60026023T2 - Verfahren zum immunologischen bestimmen von pivka-ii - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet:
  • Die vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Immunassay mittels einer Antigen-Antikörper-Reaktion zur spezifischen und hoch sensitiven Messung von PIVKA-II (Protein, induziert durch Vitamin-K-Abwesenheit oder durch Antagonist-II) in Serum oder Plasma durch Hinzugabe von Thrombin und/oder eines Antikörpers, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert, zu den Reagenzien, wobei ein anti-Fibrinogen-Antikörper und/oder ein anti-Fibrin-Antikörper als der Antikörper verwendet wird, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert.
  • Stand der Technik:
  • Gemeinsam mit AFP (α-Fetoprotein) wird PIVKA-II (Protein, induziert durch Vitamin-K-Abwesenheit oder durch Antagonist-II) in klinischen Untersuchungslaboratorien weithin als ein Marker zur Detektion von Leberzelltumoren erfasst, der bei Leberzellkrebspatienten spezifisch erhöht ist. Im Allgemeinen werden magnetische Kügelchen, Glaskügelchen, Kunststoffplatten, Latexe oder ähnliches, auf denen PIVKA-II-spezifische, monoklonale oder polyklonale Antikörper adsorbiert sind, einer ersten Reaktion mit Serum oder Plasma unterzogen, dann wird, nachdem sie zur B/F-Trennung gewaschen wurden, eine zweite Reaktion durchgeführt, bei der mit einem Enzym, einem fluoreszierenden Material, einem Radioisotop, einem Ru-Komplex oder ähnlichem markierte, für humanes Prothrombin spezifische, polyklonale oder monoklonale Antikörper hinzugegeben werden, und weiter wird, nachdem sie zur B/F-Trennung gewaschen wurden, die Absorption oder die Lumineszenz des Enzyms, des fluoreszierenden Materials, des Radioisotops oder des Ru, die an den durch die Antigen-Antikörper-Reaktion gebildeten Immunkomplex gebunden sind, gemessen, um PIVKA-II im Serum oder im Plasma zu bestimmen (U.S. 4,780,410).
  • Bis jetzt wurde PIVKA-II durch einen Enzymimmunassay (EIA) gemessen, aber der EIA ist schwach in der Sensitivität mit einem niedrigen Positivsignalanteil für ein relativ kleines Hepatom, so dass ein Elektrochemilumineszenz-Immunassay (ECLIA), bei dem ein Antigen oder ein Antikörper mit einem Ru-Komplex markiert wird, unlängst für die weitere, hoch sensitive Messung entwickelt wurde (WO 87/06706, WO 90/05301, U.S. 5,641,623). Die Anwendung des Elektrochemilumineszenz-Immunassays führte erfolgreich zu einer höheren Sensitivität bei der PIVKA-II-Messung. Um eine höhere Sensitivität nicht nur in dem ECLIA, sondern auch in einem Enzymimmunassay, einem Chemilumineszenzassay, einem Radioisotopassay, in der Latex-Turbidimetrie oder ähnlichem zu erzielen, sollte der Einfluss einer unspezifischen Reaktion in einer Probe berücksichtigt werden.
  • Im Verlauf von Studien zur Beseitigung des Einflusses der unspezifischen Reaktion in einer Probe bei der PIVKA-II-Messung wurde herausgefunden, dass die Empfindlichkeit und Spezifität der Messung dadurch verbessert werden konnten, dass zu den Reagenzien Thrombin und/oder ein Antikörper, der hoch sensitiv mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert, hinzugegeben wird/werden, wobei ein anti-Fibrinogen-Antikörper und/oder ein anti-Fibrin-Antikörper als der Antikörper verwendet wird, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert. Bei den Substanzen, die einer solchen unspezifischen Reaktion in der Probe zurechenbar sind, richtete sich die Aufmerksamkeit zunächst auf Fibrin und seine verwandten Substanzen in der Probe und zweitens auf Thrombin, das an Fibrin oder seine verwandten Substanzen gebunden ist. Insbesondere, wenn ein polyklonaler Antikörper gegen humanes Prothrombin als ein zweiter Antikörper oder ein markierter Antikörper verwendet wird, kann er der Beeinflussung durch diese Substanzen mit der unspezifischen Reaktion unterliegen, so dass er falsch positive Signale bei der Messung von PIVKA-II verursacht. Es wird berichtet, dass die Proteinstruktur von Prothrombin sich aus einem F1-Fragment, einem F2-Fragment und aus Thrombin zusammensetzt. Der für die Messung von PIVKA-II verwendete, markierte Antikörper kann nicht nur ein anti-Prothrombin-Antikörper, sondern auch ein anti-F1-Antikörper, ein anti-F2-Antikörper oder ein anti-(F1 + F2)-Antikörper sein. Jedoch können in Anbetracht der Reinheit dieser Antikörper oder der Ähnlichkeit von Thrombin zum Antigen diese Antikörper auch mit gebundenem oder freiem Thrombin in einer Probe reagieren. Außerdem sind bei der Messung von PIVKA-II Fibrin oder seine unlöslichen, verwandten Substanzen in einer Probe physikalisch auf Träger wie magnetische Kügelchen, Glaskügelchen, Latexe, Plastikplatten oder ähnlichem physikalisch adsorbiert, so dass sie das Phänomen von falsch positiven Signalen bei der Messung ansteigen lassen.
  • Um die Beeinflussung, die den fibrinartigen verwandten Substanzen zurechenbar ist, und die Beeinflussung, die Thrombin zurechenbar ist, zu vermeiden, werden Antikörper, die mit den humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagieren, z. B. anti-Fibrinogen-Antikörper oder anti-Fibrin-Antikörper und/oder Thrombin, zu den Reagenzien hinzugegeben, wodurch es gelingt, eine sehr kleine Menge an PIVKA-II genau zu bestimmen, während die unspezifische Reaktion effektiv inhibiert wird, was zum Erreichen der vorliegenden Erfindung führt.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Immunassay mittels einer Antigen-Antikörper-Reaktion zur spezifischen und hoch sensitiven Messung von PIVKA-II in Serum oder Plasma dadurch bereitzustellen, dass Thrombin und/oder ein Antikörper, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert, zu den Reagenzien hinzugegeben wird, wobei ein anti-Fibrinogen-Antikörper und/oder ein anti-Fibrin-Antikörper als der Antikörper verwendet wird, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert.
  • Offenbarung der Erfindung:
  • Um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, umfasst ein Immunassay für PIVKA-II gemäß der vorliegenden Erfindung die Schritte der Zugabe von Thrombin und/oder eines Antikörpers, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert, zu den Reagenzien, und der Messung von PIVKA-II in Serum oder Plasma, wobei ein anti-Fibrinogen-Antikörper und/oder ein anti-Fibrin-Antikörper als der Antikörper verwendet wird, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert.
  • Das oben beschriebene Thrombin ist vorzugsweise ein thrombinhaltiges, tierisches Serum und/oder aufgereinigtes Thrombin, das erhitzt oder nicht erhitzt sein kann.
  • In der vorliegenden Erfindung umfassen die Antikörper, die mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagieren, beispielsweise anti-Fibrinogen-Antikörper, anti-Fibrin-Antikörper oder ähnliche, welche vorzugsweise polyklonale Antikörper sind, insbesondere diejenigen, die nicht nur mit Fibrinogen oder Fibrin, sondern auch mit fibrinartigen verwandten Substanzen wie FDP, Fibrinopeptid A oder Fibrinopeptid B stark reagieren. Als das Thrombin werden aufgereinigte Präparationen von jenen verwendet, die aus Menschen oder Tieren wie Kühen, Schweinen, Schafen, Pferden, Kaninchen oder Hühnern gewonnen wurden. Außerdem kann die Verwendung einer breiten Auswahl von thrombinhaltigen tierischen Seren wie Rinderserum, Schafserum, Schweineserum, Pferdeserum, Hühnerserum und Kaninchenserum, die aus anderen Tieren als den Tierarten gewonnen wurden, die zur Gewinnung der markierten Antikörper oder der zweiten Antikörper immunisiert wurden, zu einer Reaktionsinhibierung der anti-Thrombin-Antikörper führen, die als Verunreinigungen in den markierten Antikörpern auftreten.
  • Als die in der vorliegenden Erfindung verwendeten markierten Antikörper oder sekundären Antikörper können nicht nur humane, polyklonale Antikörper gegen Prothrombin, F1, F2 oder F1 + F2 verwendet werden, sondern auch humane, monoklonale Antikörper gegen Prothrombin, F1, F2 oder F1 + F2. F1 und F2 sind hier Peptide, die Prothrombin bilden. Es können auch polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung mit synthetischen Peptiden hergestellt wurden, welche die Antigenität von Prothrombin aufweisen.
  • Die Beispiele der vorliegenden Beschreibung zeigen die Anwendung auf einen Elektrochemilumineszenz-Immunassay. Die vorliegende Erfindung ist auch in der Erprobung eines Chemilumineszenzassays, eines Radioisotopassays oder ähnlichem nützlich, um eine höhere Empfindlichkeit zu erzielen. In der vorliegenden Erfindung werden Antikörper wie anti-Fibrinogen-Antikörper und anti-Fibrin-Antikörper, die mit fibrinartigen verwandten Substanzen wie Fibrinogen, Fibrin, FDP, Fibrinopeptid A und Fibrinopeptid B reagieren, vorzugsweise durch Immunisierung mit vom Menschen stammenden, fibrinartigen verwandten Substanzen erhalten, aber es können auch Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung mit fibrinartigen verwandten Substanzen wie von Tieren stammenden Fibrinogen, Fibrin oder ähnlichem erhalten wurden und die mit vom Menschen stammenden fibrinartigen verwandten Substanzen kreuzreagieren. Die Antikörper wie anti-Fibrinogen-Antikörper oder anti-Fibrin-Antikörper, die für fibrinartige verwandte Substanzen spezifisch sind, werden vorzugsweise bei der ersten Reaktion des Zwei-Schritt-Sandwich-Verfahrens zu einer Reaktionslösung hinzugegeben. Andererseits wird Thrombin vorzugsweise bei der zweiten Reaktion zu der Lösung mit dem markierten Antikörper oder zur Lösung mit dem sekundären Antikörper hinzugegeben, wobei dessen hinzugegebene Menge vorzugsweise zwischen 1 und 50 NIH/ml beträgt. Jene Antikörper, die spezifisch für fibrinartige verwandte Substanzen sind, wie anti-Fibrinogen-Antikörper oder anti-Fibrin-Antikörper, ein aufgereinigtes Thrombin und ein Thrombin-haltiges tierisches Serum, können einzeln oder gemeinsam verwendet werden, wie die Gelegenheit es erfordert.
  • Die thrombinhaltigen tierischen Seren, wie Rinderserum, Schafserum, Schweineserum, Pferdeserum, Hühnerserum und Kaninchenserum, die von anderen Tieren als den Tierarten erhalten wurden, die zum Erhalt der markierten Antikörper oder der sekundären Antikörper immunisiert wurden, können vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 20% hinzugegeben. Diese Tierseren, die von anderen Tierarten erhalten wurden, können, wenn nötig, mit Tierseren gemischt werden, die von den gleichen Tieren erhalten wurden, wie die Tierarten, die zum Erhalt des markierten Antikörpers oder des sekundären Antikörpers immunisiert wurden.
  • Falls die Enzymaktivität des Thrombins stark ist, wenn das Thrombin zu den Reagenzien hinzugegeben wird, kann die Immunreaktion nachteilig beeinflusst werden, während, wenn die tierischen Seren zu jenen Reagenzien hinzugegeben werden, die die markierten Antikörper oder die sekundären Antikörper enthalten, die Stabilität der Reagenzien nachteilig beeinflusst werden kann, und daher wird vorzugsweise ein Proteaseinhibitor zur Inhibierung der Enzymaktivität des Thrombins zu den Reagenzien hinzugegeben, zu denen Thrombin oder die Tierseren hinzugegeben werden.
  • Es ist möglich, als Proteaseinhibitor Inhibitoren zu verwenden, die auf Seite 452 in „Rinsho Koso Handbook (Clinical Enzyme Handbook)" (1. Auflage, herausgegeben von Kitamura, Baba et al. und erschienen am 10. September 1982 bei Kodansha Scientific Co.), d. h. proteinöse Plasmainhibitoren, Hirudin, Benzamidin und synthetische Inhibitoren wie PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), NPGB und/oder ähnliche. Jedoch sind diese Inhibitoren nicht ausreichend zur Inhibierung der Enzymaktivität von Thrombin, und folglich wurde gefunden, dass, sogar wenn eine aufgereinigte Thrombinpräparation einer Hitzebehandlung, z. B. bei ungefähr 40 bis 65°C, unterzogen wird, die Enzymaktivität wesentlich verringert wird, ohne seine Antigenität zu verlieren.
  • Eine kommerzielle, aufgereinigte Präparation von Thrombin sollte in erster Linie in gekühlter oder gefrorener Form gelagert werden und sollte nicht einer hohen Temperatur ausgesetzt werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Heiztemperatur für Thrombin beträgt 30 bis 70°C, besonders bevorzugt 40 bis 60°C, so dass die Heizzeit auf 15 bis 60 Minuten verringert werden kann. Selbstverständlich zielt dieses Erhitzen darauf, die Enzymaktivität des Thrombins zu inaktivieren, und daher sind, insoweit das Enzym ohne Verlust einer Antigenität inaktiviert werden kann, die Heiztemperatur und die Heizzeit nicht auf die obigen Bereiche beschränkt.
  • Wenn das tierische Serum, das von anderen Tierarten erhalten wurde als den Tieren, die zum Erhalt des markierten Antikörpers immunisiert wurden, im Voraus zur Verwendung als Thrombin erhitzt wurde, beträgt die Heiztemperatur vorzugsweise 50 bis 65°C und die Heizzeit vorzugsweise 15 bis 60 Minuten. Jedoch können die Heizzeit und die Heiztemperatur selbstverständlich im Bedarfsfall ohne besondere Einschränkung reguliert werden. Weiterhin kann das tierische Serum, wenn nötig, ohne Erhitzen verwendet werden.
  • Die beste Art und Weise zum Ausführen der Erfindung:
  • Im Nachfolgenden wird die vorliegende Erfindung durch Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, aber diese Beispiele sind nur zu erläuternden Zwecken gezeigt und sollen nicht als einschränkend ausgelegt werden.
  • Beispiel 1
  • Ein Beispiel zur Messung mit einem Elektrochemilumineszenz-Immunassay in einem automatischen Analysegerät Picolumi 8220
  • Nachdem 50 μl einer Probe zu 150 μl einer Reaktionslösung gegeben wurden, wurden 25 μl magnetische Kügelchen mit darauf immobilisiertem, monoklonalem anti-PIVKA-II-Antikörper hinzugegeben. Nachdem sie für 9 Minuten bei 30°C umgesetzt wurden, wurden 350 μl einer Picolumi-BF-Waschlösung (10 mM Tris-Puffer) hinzugegeben und die mit einem Magneten festgehaltenen magnetischen Kügelchen wurden dreimal gewaschen. Zu den so der ersten Reaktion unterzogenen magnetischen Kügelchen wurden 200 μl einer Lösung mit Ru-markiertem Antikörper, die 1 μg/ml eines Ru-markierten anti-Humanprothrombin-Antikörpers (erhalten aus Kaninchen) enthielt, hinzugegeben, und diese wurden für 9 Minuten bei 30°C reagieren gelassen. Die mit einem Magneten festgehaltenen magnetischen Kügelchen wurden in gleicher Weise dreimal mit der Picolumi-BF-Waschlösung gewaschen. Nach Zugabe von 300 μl einer lumineszierenden Picolumi-Elektrolytlösung, die 0,1 M Tripropylamin enthielt, wurden die magnetischen Kügelchen auf die Oberfläche einer Elektrode befördert, und die Lumineszenz des an die magnetischen Kügelchen gebundenen Ru wurde gemessen, und die Menge an PIVKA-II in der Probe wurde bestimmt.
  • Reagenzienzusammensetzung
    • Reaktionslösung: 50 mM Tris-Puffer (pH 7,8), 0,150 M NaCl, 0,01% Tween 20, 0,1% NaN3, 5% Kaninchenserum (erhitzt).
    • Lösung mit Ru-markiertem Antikörper: 50 mM Trispuffer (pH 7,8), 0,150 M NaCl, 0,01% Tween 20, 0,1% NaN3, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Ru-markierter anti-Humanprothrombin-Antikörper (erhalten aus Kaninchen), 5% Kaninchenserum (erhitzt).
  • Herstellung von Festphasenmagnetkügelchen mit monoklonalem anti-PIVKA-II-Antikörper
  • 1 ml an 30 mg/ml magnetischen Kügelchen (4,5 Micron) wurden in ein Teströhrchen gegeben und mit einem Magneten festgehalten, und nachdem der Überstand verworfen wurde, wurde 1 ml an 0,5 mg/ml monoklonalem anti-PIVKA-II-Antikörper (in 150 mM Phosphatpuffer, pH 7,8) zu den Magnetkügelchen hinzugegeben, und diese wurden unter Rühren einen Tag lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nachdem die magnetischen Kügelchen gewaschen wurden, wurden 2 ml 1% BSA-Phosphatpuffer dazu hinzugegeben, und die magnetischen Kügelchen wurden unter Rühren einen Tag lang bei Raumtemperatur geblockt. Im Falle der Verwendung wurden die magnetischen Kügelchen mit dem 1%-igen BSA-Phosphatpuffer auf 1 mg/ml verdünnt.
  • Herstellung eines Ru-markierten anti-Humanprothrombin-Antikörpers
  • 68 μl einer Ru-Komplexverbindung aus mit einer Succinimidgruppe modifiziertem Ruthenium-tri-dipyridyl wurden zu 1 ml an 1 mg/ml anti-Humanprothrombin-Antikörper hinzugegeben, der aus einer Immunisierung von Kaninchen stammte, und diese wurden unter Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten reagieren gelassen, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 2 M Glycin beendet, und die Probe wurde unter Rühren bei Raumtemperatur für 10 Minuten weiter reagieren gelassen. Schließlich wurde die Probe auf Sephadex G-25 (zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer äquilibriert) aufgetragen, und Fraktionen mit Ru-gebundenem Protein wurden gesammelt. Der so erhaltene Ru-markierte anti-Humanprothrombin-Antikörper wurde im Fall der Verwendung auf 1 μg/ml verdünnt.
  • 180 μg/ml an anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) wurde zu jeder Reaktionslösung hinzugegeben, eine Kontrolllösung ohne den anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) und 8 Humanseren wurden verwendet, um ihre Spezifität zu vergleichen. Jedes Serum wurde mit n = 3 gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Jene Reagenzien mit dem anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) weisen eine niedrige Streuung in den gemessenen Werten und die Abwesenheit einer unspezifischen Reaktion auf. Tabelle 1
    Figure 00080001
    • K.V.
    kritische Varianz
  • Beispiel 2
  • In diesem Beispiel wurde die gleiche Reagenzienzusammensetzung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass 10 NIH/ml einer aufgereinigten Präparation an Rinderthrombin oder menschlichem Thrombin zu der Lösung mit Ru-markiertem Antikörper hinzugegeben wurden. Diese Probe, welche besonders hohe unspezifische Reaktionen zeigte, wurde ausgewählt und gleichzeitig für PIVKA-II mit n = 10 gemessen. Die Ergebnisse dieser Probe und einer Kontrollprobe, bei der weder das Rinderthrombin noch das menschliche Thrombin hinzugegeben wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Wenn die aufgereinigte Präparation von Rinder- oder menschlichem Thrombin zu dem Reagenz hinzugegeben wurden, verbesserte sich die Spezifität der Probe im Vergleich mit der Kontrollprobe. Dieses Probeserum wurde für 10 Minuten bei 3.000 Upm zentrifugiert und ein daraus erhaltener Überstand zeigte 80 mAU/ml.
  • Beispiel 3
  • In diesem Beispiel wurde die gleiche Reagenzienzusammensetzung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass 180 μg/ml anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) zu der Reaktionslösung hinzugegeben wurden und dass 10 NIH/ml Rinderthrombin zu der Lösung mit dem Ru-markierten Antikörper hinzugegeben wurden. Diese Probe, die eine hoch unspezifische Reaktion aufwies, wurde gleichzeitig für PIVKA-II mit n = 10 gemessen. Die Ergebnisse dieser Probe und einer Kontrollprobe, zu der weder der anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) noch das Rinderthrombin hinzugegeben wurden, sind in Tabelle 2 mit den Ergebnissen aus Beispiel 2 gezeigt. Die Zugabe von sowohl dem anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) als auch dem Rinderthrombin führt zu einer viel größeren Zunahme in der Spezifität für PIVKA-II im Vergleich zu der Zugabe von Rinderthrombin allein.
  • Tabelle 2
    Figure 00090001
  • Beispiel 4
  • 500 NIH einer aufgereinigten Präparation von Rinderthrombin wurden zu 1 ml 50 mM Tris-Puffer (0,15 M NaCl, pH 7,8) hinzugegeben und für 30 Minuten in einem thermostatisierten Wasserbad bei 50°C erhitzt. In diesem Beispiel wurde die gleiche Reagenzienzusammensetzung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass 180 μg/ml anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) zu der Reaktionslösung hinzugegeben wurden und dass die hitzebehandelte, aufgereinigte Präparation des Rinderthrombins bei einer Konzentration von 5 NIH/ml zu der Lösung mit dem Ru-markierten Antikörper hinzugegeben wurde. PIVKA-II wurde gemessen, wobei diese Probe mit einer hohen unspezifischen Reaktion verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Probe und einer Kontrollprobe, zu der weder der anti-Humanfibrinogen-Antikörper (erhalten aus Kaninchen) noch das erhitzte Rinderthrombin hinzugegeben wurden, sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 offensichtlich ist, zeigte sich in diesem Beispiel die inhibitorische Wirkung der Probelösungen gegen die unspezifische Reaktion in gleicher Weise wie in Beispiel 3. Die Enzymaktivität dieses erhitzten Thrombins, wie es unter Verwendung von Chromozyme TH (Boehringer) gemessen wurde, reduzierte sich auf 1/5 im Vergleich mit derjenigen des nicht erhitzten Thrombins.
  • Tabelle 3
    Figure 00100001
  • Beispiele 5 und 6
  • In diesem Beispiel wurde die gleiche Reagenzienzusammensetzung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass 5% nicht erhitztes Kaninchenserum (eine Kontrolle, bei der die finale Konzentration des Kaninchenserums 10% betrug), 5% nicht erhitztes Pferdeserum (Beispiel 5) bzw. 5% nicht erhitztes Schafserum (Beispiel 6) zu der Lösung mit dem Ru-markierten Antikörper hinzugegeben wurden. Diese Probe, die eine hoch unspezifische Reaktion aufwies, wurde auf seine inhibierende Wirkung gegen die unspezifische Reaktion gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00110001
  • Im Vergleich zur Kontrolle wurde die unspezifische Reaktion in der Probe, zu der Pferdeserum oder Schafserum hinzugegeben wurde, inhibiert. Diese Probe, die eine hoch unspezifische Reaktion aufwies, wurde für 10 Minuten bei 3.000 Upm zentrifugiert, und ein daraus erhaltener Überstand zeigte 74 mAU/ml.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit:
  • Wie oben beschrieben, kann gemäß der vorliegenden Erfindung PIVKA-II in Serum oder Plasma spezifisch und hoch sensitiv durch Zugabe von Thrombin und/oder eines Antikörpers, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert, zu den Reagenzien gemessen werden, wobei ein anti-Fibrinogen-Antikörper und/oder ein anti-Fibrin-Antikörper als der Antikörper verwendet wird, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert.

Claims (2)

  1. Ein Immunassay auf PIVKA-II in Serum oder Plasma, der die folgenden Schritte umfasst: (a) die Zugabe von Thrombin und/oder eines Antikörpers, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert, zu den Reagenzien; und (b) das Messen von PIVKA-II in Serum oder Plasma; wobei ein anti-Fibrinogen-Antikörper und/oder ein anti-Fibrin-Antikörper als der Antikörper verwendet wird, der mit humanfibrinartigen verwandten Substanzen reagiert.
  2. Der Immunassay gemäß Anspruch 1, wobei ein thrombinhaltiges tierisches Serum und/oder aufgereinigtes Thrombin als das Thrombin verwendet werden.
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