CN103270419B - 用于通过宫颈细胞的悬液样本预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(cin)病变的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变的方法。所述方法的多个方面包括从液体宫颈细胞样本获得形态测量数据和生物标志物数据，然后使用两种类型的数据预测所述受试者是否具有CIN病变。本发明还提供可用于实践所述方法的系统。所述方法和系统可用于多种应用，包括宫颈癌筛查应用。

Description

用于通过宫颈细胞的悬液样本预测受试者是否具有宫颈上皮 内瘤样(CIN)病变的方法和系统
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2011年5月9日提交的美国临时专利申请序列号61/484,142和2010年11月12日提交的美国临时专利申请序列号61/413,302的提交日的优先权，这些申请的公开内容以引用方式并入本文。
简介
从1949年起，巴氏(PAP)涂片已成为宫颈癌筛查的基石。根据定义，PAP涂片是对涂在载玻片上的细胞执行染色然后通过显微镜进行观察。在宫颈液基细胞学(LBC)出现以后，使用刷子获取宫颈细胞，悬在固定液中，然后涂到载玻片上，再进行染色。经过充分培训的细胞学技术人员和细胞病理学技术人员查看染色后的切片，从而寻找异常细胞的证据，如表1中的特征所表明。
表1
*N/C=核质比。
由于对于PAP涂片而言必须使用载玻片，因此要对LBC的单独等分试样执行用于宫颈癌筛查的其他生物标志物（尤其是用于HPV DNA的分子学检测的那些生物标志物）的检测。虽然诸如p16的一些生物标志物可在载玻片上进行检测，但是通量不能满足美国每年获得的六至七千万个宫颈细胞学标本以及全世界超过一亿五千万个样本的需要。另外，对载玻片执行的分子学技术繁琐而又耗时，这些特征不适于宫颈癌筛查。
在临床上，将PAP切片和HPV检测一起使用，虽然它们是截然不同的两种技术。PAP涂片对于高级别宫颈病变（宫颈前癌和宫颈癌）具有相对低的灵敏度(50%)和相对高的特异性(90%)。相反，HPV DNA检测则对于高级别宫颈病变（宫颈前癌和宫颈癌）具有高灵敏度(>90%)，但特异性低(30%)。这些性能特征支持了将这些检测组合使用以实现有效的宫颈癌筛查。一些研究人员力图仅使用HPV检测进行宫颈癌筛查（初步HPV筛查），但是，当前的HPVDNA检测的特异性不及使用PAP涂片的形态学评估，从而产生一个问题：需要大量不必要的阴道镜/活组织检查程序。因此，单独通过HPV检测来替代PAP涂片仍极具争议。
发明概要
本发明提供了预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变的方法。该方法的多个方面包括：通过在悬液中测定液体宫颈细胞样本从样本获得形态测量数据以及生物标志物数据和/或非特异性细胞数据，然后使用不同类型的数据预测受试者是否具有CIN病变。本发明还提供可用于实践该方法的系统。该方法和系统可用于多种应用，包括宫颈癌筛查应用。
本发明的多个方面包括预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变的方法。在一些情况下，该方法包括从受试者的悬液形式的标记液体宫颈细胞样本获得数据，其中该数据包括形态测量数据和选自以下的数据：生物标志物数据、DNA含量数据、核化百分比数据以及它们的组合；以及通过数据预测受试者是否具有CIN病变，例如CIN2+病变。预测的特征可在于85%或更高的灵敏度和/或85%或更高的特异性。数据可通过使用流式细胞术装置分析液体样本而获得，例如，在包括使样本流过照明源和一个或多个光学检测器的方法中。形态测量数据可包括选自以下的数据：前向光散射数据、侧向光散射数据、图像数据以及它们的组合。在一些情况下，标记液体样本为生物标志物标记液体样本，其中数据包括生物标志物数据，并且其中生物标志物数据包括每个细胞的生物标志物定量数据，其中每个细胞的生物标志物定量数据可包括荧光标记检测数据。在一些情况下，该方法还包括制备宫颈细胞的生物标志物标记液体样本。宫颈细胞的生物标志物标记液体样本可通过将初始宫颈细胞样本与特异性结合宫颈癌生物标志物的荧光标记的生物标志物探针接触而制备。宫颈癌生物标志物可以是核酸，例如HPV核酸（诸如E6、E7核酸）或蛋白质（例如p16、E6、E7）。该方法可包括将初始宫颈细胞样本与两种或更多种不同的荧光标记的生物标志物探针（每一种都特异性结合不同的宫颈癌生物标志物）接触。在一些情况下，将初始宫颈细胞样本中的细胞固定和透化，然后再与特异性结合宫颈癌生物标志物的荧光标记的生物标志物探针接触。在一些情况下，该方法还包括在确定异常细胞存在于样本中时建议采用宫颈活组织检查。在一些情况下，标记的液体样本为DNA标记的液体样本，其中数据包括DNA含量数据、核化百分比数据或两者。
本发明的多个方面还包括系统，其包括：
流动通道；
光源，其被构造成将光导向流动通道的测定区；
第一检测器，其被构造成从流动通道的测定区接收光并产生形态测量数据；
第二检测器，其被构造成从流动通道的测定区接收光并产生附加数据；以及
信号处理模块，其被构造成从第一和第二检测器接收形态测量数据和附加数据，并基于形态测量数据和附加数据输出预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变的结果。系统可被构造成执行本发明的方法，包括上面概述的那些方法。
本发明的多个方面还包括确定受试者样本中癌细胞的存在的方法，该方法包括：从受试者的悬液形式的标记液体宫颈细胞样本获得数据，其中该数据包括形态测量数据和选自以下的数据：生物标志物数据、DNA含量数据、核化百分比数据以及它们的组合；以及通过数据确定样本中是否存在癌细胞。数据可通过使用流式细胞术装置分析液体样本而获得，例如，在包括使样本流过照明源和一个或多个光学检测器的方法中。形态测量数据可包括选自以下的数据：前向光散射数据、侧向光散射数据、图像数据以及它们的组合。在一些情况下，标记的液体样本为生物标志物标记的液体样本，其中数据包括生物标志物数据，并且其中生物标志物数据包括每个细胞的生物标志物定量数据，其中每个细胞的生物标志物定量数据可包括荧光标记检测数据。在一些情况下，该方法还包括制备宫颈细胞的生物标志物标记的液体样本。宫颈细胞的生物标志物标记的液体样本可通过将初始宫颈细胞样本与特异性结合宫颈癌生物标志物的荧光标记的生物标志物探针接触而制备。宫颈癌生物标志物可以是核酸，例如HPV核酸（诸如E6、E7核酸）或蛋白质（例如p16、E6、E7）。该方法可包括将初始宫颈细胞样本与两种或更多种不同的荧光标记的生物标志物探针（每一种都特异性结合不同的宫颈癌生物标志物）接触。在一些情况下，将初始宫颈细胞样本中的细胞固定和透化，然后再与特异性结合宫颈癌生物标志物的荧光标记的生物标志物探针接触。在一些情况下，该方法还包括在确定异常细胞存在于样本中时建议采用宫颈活组织检查。在一些情况下，标记的液体样本为DNA标记的液体样本，其中数据包括DNA含量数据、核化百分比数据或两者。
附图简述
图1显示了使用纵横比与面积点阵图识别宫颈液基细胞学(LBC)标本中的完整单一细胞（分类）的仪器设置。
图2显示了使用如图1中所示的仪器设置通过N/C（核质）比分析识别LBC标本中的异常细胞。增加的N/C比表示异常细胞。
图3A和图3B显示了对于LBC标本中的单一细胞获得的示例性数据。对于各细胞，示出了明视场图象、显示E6/E7mRNA杂交(FITC)的图像、显示DNA定量(DAPI)的图像以及显示E6/E7和DAPI图像复合的图像。图3A显示了具有高N/C比的细胞为E6/E7阳性的，并具有异常DNA含量。图3B显示了具有低N/C比的细胞为E6/E7阴性的，并具有正常DNA含量。
图4是点阵图，显示了E6/E7mRNA的过表达存在于DNA含量升高的细胞中。使用DNA染色试剂（DAPI；X轴）进行了细胞周期分析，通过E6/E7mRNA探针（FITC；Y轴）检测了E6/E7mRNA。分类示出了异常细胞（具有E6、E7过表达和升高的DNA含量）。
图5A和图5B显示了点阵图，示出了LBC标本的N/C比（Y轴）和DNA含量（X轴）以识别异常细胞。图5A显示了正常宫颈细胞（上图）和LSIL宫颈细胞（下图）的N/C比与DNA含量的点阵图。图5B显示了HSIL宫颈细胞（上、下图）的N/C比与DNA含量的点阵图。此替代形式只使用1种染色试剂，即，非特异性DNA染色试剂。
图6显示了宫颈细胞学样本中细胞的组合侧向（正交）光散射（Y轴）和电子体积（X轴）的点阵图。该图显示了样本中的不同细胞可用这些形态测量参数加以描绘。四种不同的分类标识碎片、宫颈阴道部(ectocervical)细胞、宫颈内膜细胞和多形核白细胞(PMNS)。此分类可用于对所关注的细胞分类，以根据本发明的多个方面进行分析。
具体实施方式
本发明提供了预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变的方法。该方法的多个方面包括：通过在悬液中测定液体宫颈细胞样本从样本获得形态测量数据以及生物标志物数据和/或非特异性细胞数据，然后使用不同类型的数据预测受试者是否具有CIN病变。本发明还提供可用于实践该方法的系统。该方法和系统可用于多种应用，包括宫颈癌筛查应用。
在对本发明进行更详细描述前，应当理解，本发明不限于所述的特定实施方案，因此，当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语只是出于描述特定实施方案的目的，不旨在进行限制，因为本发明的范围将由所附权利要求书加以限制。
如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值（直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指出）以及该所述范围内的任何其他所述值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在所述较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。如果所述范围包含所述限值的一个或两个，则排除这些所含限值一者或两者的范围也包括在本发明内。
本文使用前面带有术语“约”的数值来提供某些范围。在本文中，将术语“约”用于提供对其后的精确数字以及接近或靠近该术语之后的数字的数字的字面支持。在确定数字是否接近或靠近具体列举的数字时，接近或靠近未列举的数字可以是在其所处背景中提供与具体列举的数字基本上等同效果的数字。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述代表性示例方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利以引用方式并入本文中，就像具体和单独地指明每一出版物或专利以引用方式并入一样，并且以引用方式并入本文中以结合所引用的出版物公开和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用仅是为了揭示在本申请的提交日之前的背景技术。这些背景技术不应解释为承认在先发明揭示了本发明。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。
应当注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。还应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为在结合权利要求要素的详述使用诸如“单独”、“仅”等排他性术语时或使用“负”限制时的前置基础。
应当认识到，为清楚起见在单独实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中以组合方式提供。相反，为简明起见在单个实施方案的背景下描述的本发明的多个特征也可单独地提供或以任何合适的子组合提供。实施方案的所有组合由本发明具体涵盖并在本文进行公开，正如单独和明确地公开每一种组合一样，所达到的程度为此类组合将涵盖可操作的过程和/或装置/系统/试剂盒。此外，在描述此类变量的实施方案中列出的所有子组合也由本发明具体涵盖并在本文进行公开，正如在本文单独和明确地公开化学基团的每一种这样的子组合一样。
在阅读本公开后对本领域的技术人员将显而易见的是，本文所述和所示的各个实施方案的每一个具有分立的组件和功能，它们可在不脱离本发明范围或精神的情况下与其他若干实施方案任一个的特征相分离或相组合。任何列举的方法均可按列举的事件顺序或按任何其他在逻辑上可行的顺序执行。
在进一步描述本发明的实施方案中，将首先更详细地描述方法实施方案的多个方面。接下来，将综述可用于实践本发明方法的系统的实施方案。
方法
如上所概述，本发明的实施方案涉及预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变或宫颈癌的方法。术语“CIN病变”（在本领域中也称为宫颈非典型增生）以其常规含义使用，以指代宫颈表面上鳞状细胞的异常生长。如本领域中所已知，CIN病变可在组织学上分级为CIN1、CIN2/3、CIN2和CIN3。CIN1病变是那些限于上皮的基底1/3的病变，并且相对于其他类别的病变发展成癌变的风险最低。CIN2病变的特征在于限于上皮的基底2/3的中度非典型增生。CIN3病变（本领域的技术人员有时称之为原位宫颈癌）通过存在穿过上皮2/3以上的严重非典型增生而归类。CIN2/3类别（即CIN2+）统指CIN2和CIN3两种病变。
本发明的实施方案的特征在于以高灵敏度和特异性预测受试者中CIN病变的存在。所谓预测是指不实际进行受试者宫颈的活组织检查而预言或预见受试者中CIN病变的存在。术语灵敏度和特异性以其常规含义使用。因此，灵敏度是被正确识别的实际阳性样本（与假阳性样本相对）的比例的度量，而特异性是被正确识别的阴性样本的度量。本发明的实施方案可预测任何类型的CIN病变的存在与否。本发明的实施方案还可预测CIN病变的类型，例如，CIN病变是否为CIN1、CIN2+、CIN2或CIN3病变。方法的实施方案以高灵敏度和特异性进行这种预测，例如，是否存在病变，存在什么类型的病变（诸如是否存在CIN2+病变）。在一些情况下，灵敏度为85%或更高，诸如90%或更高，包括95%或更高。在一些情况下，特异性为85%或更高，诸如87%或更高，包括90%或更高。
该方法的多个方面包括从受试者的悬液形式的标记液体宫颈细胞样本（例如，用生物标志物标记和非特异性细胞标记进行标记的液体样本）获得以下两者：(1)形态测量数据和(2)生物标志物数据和/或非特异性细胞数据。换句话讲，从受试者采集宫颈细胞的液体样本，其中宫颈细胞为流体培养基（例如，如下文将更详细地描述）中的悬液形式，并进行测定以获得形态测量数据和生物标志物/非特异性细胞数据。因此，根据该方法多个方面的标记的液体样本可以是生物标志物标记的液体样本、非特异性细胞标记的液体样本或生物标志物和非特异性细胞标记的液体样本。进行测定的宫颈细胞的标记液体样本可根据任何便利的方案提供。
在一个实施方案中，通过从宫颈获取细胞样本并将其与合适的流体培养基组合，从而制备初始流体宫颈细胞样本。用于采集宫颈细胞的任何便利方案均可采用。所关注的方案的实例包括采用宫颈刷或扫帚式装置从宫颈和宫颈内膜的表面采集细胞的方案。可用于本发明方法的宫颈细胞采集装置的实例的说明在美国专利号2,955,591、3,626,470、3,815,580、3,877,464、3,881,464、3,945,372、4,127,113、4,175,008、4,700,713、4,754,764、4,762,133、4,754,764、4,873,992、4,862,899、4,953,560、5,445,164、5,787,891、5,795,309、6,387,058和6,740,049中有所提供。
在采集后，可根据需要将细胞样本与合适的液体培养基组合。所关注的培养基包括但不限于：盐水或平衡盐溶液（诸如汉克斯平衡盐溶液、最低必需(MEM)组织培养基、POLYSALTM溶液和生理盐水）；细胞学培养基，例如通用收集培养基(UCM)；在美国专利号7,371,518（其公开内容以引用方式并入本文）中描述的通用收集培养基；标准运送培养基(STM)，PRESERVCYTTM流体培养基(Cytyc,Inc.(Boxborough,Mass.))；CytoRichTM流体培养基(TriPath,Inc.(Burlington,N.C.)等等。
需要时，可在进行下一过程前对采集的初始样本的足够性进行评估。例如，可使样本的等分试样接受光散射分析，以确定样本中是否存在足够的靶细胞，例如，如美国专利号6,329,167中所述；该专利的公开内容以引用方式并入本文。
在制备后，可根据需要将所得的初始流体宫颈细胞样本固定和/或透化。因此，本发明的方法包括将样本与合适的固定试剂接触而将细胞样本固定。所关注的固定试剂为在所需的时间点固定细胞的那些固定试剂。可以采用任何便利的固定试剂，其中合适的固定试剂包括但不限于：甲醛、多聚甲醛、甲醛/丙酮、甲醇/丙酮、IncellFP(IncellDx,Inc)等。例如，据发现，以大约1%至2%的最终浓度使用的多聚甲醛是良好的交联固定剂。在一些情况下，将样本中的细胞通过将细胞与透化试剂接触而透化。所关注的透化试剂是允许标记的生物标志物探针（例如，如下文将更详细地描述）进入细胞内环境的试剂。可以采用任何便利的透化试剂，其中合适的试剂包括但不限于：温和洗涤剂，诸如Triton X-100、NP-40、皂苷等；甲醇等等。还可取的是将细胞用阳性重金属对照（例如用重金属（例如铱等）标记的DNA嵌入剂）进行标记。还可在固定前根据需要将细胞用活力染料染色，例如溴化乙锭、碘化丙锭、DAPI、RhCl3等。
在某些实施方案中，并如上文所综述，进行测定以获得形态测量和生物标志物数据的样本为生物标志物标记的样本。因此，样本是已针对一种或多种所关注的生物标志物进行了标记的样本。所谓“生物标志物标记的样本”是指已与特异性结合到所关注生物标志物（如果该生物标志物存在于细胞样本中）的经标记的生物标志物探针（例如，如下文将更详细地描述）接触的样本。所关注的生物标志物包括但不限于宫颈癌生物标志物。宫颈癌生物标志物是与众不同的生物学或生物学衍生的指示物，例如核酸或蛋白质，它们的存在与受试者发展为宫颈癌的倾向或宫颈癌在受试者中的存在有关联或联系。因此，所关注的生物标志物包括核酸和蛋白质分析物，其在细胞中的存在和/或量可用于至少预测受试者患宫颈癌的倾向。所关注的生物标志物包括但不限于：HPV基因的HPV表达产物，诸如HPV基因L1、L2、E2、E4、E5、E6或E7；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，例如p14、p15INK4b、p16（即，如Serrano,M.,et al.,Nature,1993Dec.16;366(6456):704-7中所述的p16INK4a）、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF1/CIP1和p27KIP1；细胞周期调节蛋白，例如p14ARF；与宫颈癌相关的特异性microRNA或染色体3q改变，诸如在美国专利公布号20100234445（该专利公布的公开内容以引用方式并入本文）中所述；等等。
在本发明方法中进行测定的生物标志物标记的液体宫颈细胞样本可使用任何便利的标记方案加以制备。在一些实施方案中，生物标志物标记的液体样本的制备包括将初始宫颈细胞样本与特异性结合宫颈癌生物标志物的经标记的生物标志物探针接触。取决于将执行的特定测定法，可将初始样本与单种标记的生物标志物探针或两种或更多种不同标记的生物标志物探针（结合不同分子组成的不同生物标志物）组合，其中此类不同标记的生物标志物探针的数量可以为两种或更多种，例如，三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种等等，例如，其中该测定法为两种或更多种生物标志物的多重测定法。
在将初始样本与标记的生物标志物探针接触时，将样本与一种或多种标记的生物标志物探针接触，以产生反应混合物。所关注的标记的生物标志物探针包括特异性结合域和标记域。特异性结合域包括特异性结合所关注的生物标志物的捕获配体。取决于特定的测定法，所关注的生物标志物可以为多种不同类型的分子，包括但不限于：蛋白质、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白以及这些分子的相应片段；核酸，例如DNA和RNA，诸如mRNA等。因此，捕获配体是结合所关注的生物标志物的配体，其中该捕获配体当然可以根据待检测的生物标志物的具体类型而变化，例如蛋白质生物标志物的抗体，mRNA生物标志物的寡核苷酸。在某些实施方案中，捕获配体与其特异性结合的生物标志物分子当以结合复合物彼此特异性结合时，它们之间的亲和力通过以下大小的KD（解离常数）来表征：10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-13M或更小、10-14M或更小，包括10-15M或更小。
如上指出，可将多种不同类型的特异性结合剂用作捕获配体，其中结合剂的特定类型至少部分地根据所关注的生物标志物分子的特定类型加以选择。所关注的特异性结合剂包括抗体结合剂、蛋白质、肽、半抗原、核酸等。如本文所用的术语“抗体结合剂”包括足以结合所关注的分析物的多克隆或单克隆抗体或片段。抗体片段可以为例如单体Fab片段、单体Fab'片段或二聚F(ab)'2片段。也落在术语“抗体结合剂”范围内的是通过抗体工程产生的分子，诸如单链抗体分子(scFv)或由单克隆抗体产生的人源化或嵌合抗体（通过替换重链和轻链的恒定区以产生嵌合抗体，或同时替换恒定区和可变区框架部分以产生人源化抗体）。所关注的核酸结合剂是特异性结合细胞中的生物标志物核酸的核酸。这些核酸的长度可以变化，只要寡核苷酸足以用作特异性结合剂即可，并且在一些情况下在13至100nt的范围内，诸如14至50nt，例如15至25nt。构成这些核酸结合剂的寡核苷酸可以为DNA或RNA或根据需要为其合成类似物。
除了特异性结合域外，标记的生物标志物探针还包含可检测的标记。所关注的可检测的标记为荧光染料。荧光染料（荧光团）可选自适用于成像应用（例如流式细胞术）的许多染料中的任一种。大量的染料可从许多来源商购获得，诸如Molecular Probes(Eugene,OR)和Exciton(Dayton,OH)。所关注的荧光团的实例包括但不限于：4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸茋-2,2'二磺酸；吖啶及衍生物，诸如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐（萤黄VS）；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素及衍生物，诸如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素（AMC，香豆素120）、7-氨基-4-三氟甲基香豆素（香豆素151）；花菁及衍生物，诸如荧光桃红(cyanosine)、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"-二溴邻苯三酚磺酞（溴焦酚红）；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二乙基氨基香豆素；二乙烯三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰基二氢-茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯（DNS，丹磺酰氯）；4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红及衍生物，诸如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红及衍生物，诸如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；溴化乙啶；荧光素及衍生物，诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素氯三嗪基、萘并荧光素和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；造礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；丽丝胺罗丹明、萤黄；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及衍生物，诸如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4（CibacronTM亮红3B-A）；罗丹明及衍生物，诸如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物（德州红）、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸及铽螯合衍生物；呫吨；或它们的组合。也可使用本领域技术人员已知的其他荧光团或其组合，例如可得自Molecular Probes(Eugene,OR)和Exciton(Dayton,OH)的那些。
如果采用多种不同的标记的生物标志物探针，则每种不同探针的标记可被选择为提供有区别的信号。例如，在其中采用第一和第二不同标记的生物标志物探针的实施方案中，第二探针中的标记是这样一种荧光标记，其产生的荧光信号可区别于第一探针的标记的第一荧光信号。因此，在激发第一和第二荧光标记时产生的第一和第二荧光信号可彼此间存在区别，这表示两者可被同时检测并且一者的信号不改变或更改另一者的信号。每种不同的标记可产生与任何其他标记有区别的信号。例如，可将细胞用第三荧光标记染色，该标记产生的第三荧光信号可与第一和第二荧光信号有区别。
在一些情况下，所采用的标记的生物标志物探针是HPV E6、E7寡核苷酸荧光标记探针。此类探针的长度可以变化，在一些情况下在13至100nt的范围内，诸如14至50nt，例如15至25nt。此类探针的特定序列可以变化。所关注的具体序列包括但不限于存在于HPVOncoTectTM E6、E7mRNA检测试剂盒(incellDx,Menlo Park,CA)的探针混合物中的那些序列。
HPV E6/E7基因（或mRNA）特异性的示例性探针序列包括在Faulkner-Jones等人的文献中所述的那些（J.Virol Methods1993vol.41pages277-296；以引用方式并入本文）。下面提供了Faulkner-Jones等人的文献中表1的序列，其示出了此类示例性的HPV E6/E7特异性探针序列。
HPV E6/E7的附加示例性探针序列包括在Plummer等人的文献中所述的那些（Diagnostic Mol.Path.1998vol.7,pages76-84；以引用方式并入本文）。下面提供了Plummer等人的文献中表1的序列，其示出了此类示例性的HPV E6/E7探针序列。
可用于本文所述的方法和系统的附加HPV特异性探针序列可使用任何便利的探针设计方法进行设计和测试。
在制备反应混合物中，可使用任何便利的方案将样本与标记的生物标志物探针组合。组合可根据需要通过混合而进行。将样本与标记的生物标志物探针接触在提供探针与其样本中的相应生物标志物（若存在）结合的孵育条件下进行。在一些情况下，将探针和样本在15至50℃诸如20至约40℃范围内的温度下接触和组合。接触可通过混合或搅拌（例如通过涡旋等）进行，以提供反应组分和样本的充分组合。
然后，可将所得的混合物维持或孵育一段时间，再进行形态测量数据和生物标志物数据测定，例如通过流式细胞术分析（例如，如下文将更详细地描述）进行测定。在一些情况下，将反应混合物在约15至50℃诸如20至约40℃范围内的温度下孵育一段约30分钟至72小时范围内的时间，诸如1小时至24小时，包括1小时至3小时。在上面的孵育步骤之后，可对样本进行立即测定，或进行保存以在以后测定。如果保存，则在一些实施方案中，将样本保存在降低的温度下，例如在冰上。
如果需要，可对所得的反应混合物进行洗涤，例如，以除去任何未结合的探针和其他样本组分。洗涤可使用任何便利的方案进行，例如，通过将反应混合物与合适的洗涤缓冲液组合，然后从流体中分离细胞。给定的洗涤方案可根据需要包括一个或多个不同的洗涤步骤。在任何洗涤方案后，可将标记的细胞重悬在合适的液体中，例如洗涤缓冲液或另一种缓冲液中，以供随后分析，例如通过流式细胞术分析法进行分析。
在一些实施方案中，如上所述，除了生物标志物标记外或在不存在生物标志物标记的情况下，将标记的液体细胞样本用非特异性细胞染色剂进行标记（或染色）。可使用任何便利的方案将细胞用非特异性染色剂染色。所关注的非特异性细胞染色剂为DNA特异性染色剂。DNA特异性的（或与单链多核苷酸相比优先结合双链多核苷酸）并因此可用作非特性染色剂的染料和染色剂包括但不限于：Hoechst33342（2'-[4-乙氧基苯基]-5-[4-甲基-1-哌嗪基]-2,5'-二-1H-苯并咪唑）和Hoechst33258（2'-[4-乙氧基苯基]-5-[4-甲基-1-吡嗪基]-2,5'-二-1H-苯并咪唑）以及Hoechst系列的其他染料；SYTO40、SYTO11、12、13、14、15、16、20、21、22、23、24、25（绿）；SYTO17、59（红）、DAPI、DRAQ5TM（对双链DNA具有高亲和力的蒽醌染料）、YOYO-1、碘化丙啶、YO-PRO-3、TO-PRO-3、YOYO-3和TOTO-3、SYTOX绿、SYTOX、甲基绿、吖啶均二聚物、7-氨基放线菌素D、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。取决于特定的染色剂和测定法，染色剂可在生物标志物的定量中用作细胞周期等的指示。
在制备标记的样本后，例如如上所述，对样本进行测定以获得形态测量以及生物标志物和/或非特异性细胞数据。在一些情况下，对样本的相同等分试样（即，相同物理量的样本）进行测定，以获得形态测量和生物标志物/非特异性细胞数据。因此，这些实施方案有别于其中使用一种方案（例如基于载玻片的方案）对样本的第一等分试样进行形态测量数据测定而使用另一方案（例如流式细胞术方案）对样本的第二等分试样进行测定的方案。
形态测量数据是指可以从其得出细胞形态学信息（即，关于细胞大小、形状和/或结构的信息）的任何类型的数据。所关注的形态测量数据包括但不限于选自以下的数据：前向光散射数据、侧向光散射数据、图像数据以及它们的组合。所关注的形态学参数包括但不限于：核面积、周长、纹理或空间频率内容、质心位置、形状（即，圆形、椭圆形、杠铃形等）、体积以及任何这些参数的比例。所获得的形态测量数据可以针对细胞整体或其一部分，例如细胞的细胞质。在一些情况下，形态测量数据可包括细胞是正常还是异常的实际指定，包括异常细胞的类型。例如，形态测量数据可在一些情况下包括给定细胞是异常的指定，例如细胞是：非典型鳞状细胞，例如未明确意义的非典型鳞状细胞(ASC-US)、除外高级别鳞状上皮内病变的非典型鳞状细胞-不能排除HSIL(ASC-H)；低级别鳞状上皮内病变（LGSIL或LSIL）；高级别鳞状上皮内病变（HGSIL或HSIL）；鳞状上皮细胞癌；未明示非典型腺细胞(AGC-NOS)；非典型腺细胞、疑似AIS或癌（AGC-赘生性）；以及原位腺癌(AIS)。
生物标志物数据是指可从其得出细胞的生物标志物信息的任何类型的数据。在一些情况下，生物标志物数据是这样的数据，其包括用在测定法中的标记的生物标志物探针的标记所发出的信号。生物标志物数据可以是以下形式：发射光的存在和振幅、细胞或光信号所来自的其他物体中的离散位置数、信号源的相对放置以及细胞中各位置发射的光的颜色（波长或波段）。生物标志物数据可以采取定性、半定量或定量数据的形式。定性数据简单地为存在或不存在生物标志物。半定量数据或定量数据是提供细胞中生物标志物量的某些指示（例如拷贝数、浓度等）的数据。例如，半定量数据可以采取指示所关注的生物标志物的拷贝数高于某一阈值数的形式。定量数据提供细胞中生物标志物的绝对值的指示，例如拷贝数、量等。半定量和定量数据可统称为生物标志物定量数据。
在一些情况下，所关注的生物标志物是受试者感染高风险HPV菌株时存在的mRNA。所关注的mRNA包括HPV E6、E7mRNA。在这些实施方案中，可确定所关注的mRNA物种的绝对拷贝数，使得获得所关注的mRNA物种的定量数据。在其中生物标志物为HPVE6、E7的一些情况下，确定每个细胞E6、E7mRNA物种的总量。在这些情况下，所关注的是识别每个细胞的HPVE6、E7mRNA拷贝数为2个或以上的细胞，诸如5个或以上，包括10个或以上、50个或以上、100个或以上、200个或以上、500个或以上，因为这些细胞可与宿主中CIN病变的存在有关联。在一些情况下，在本发明方法中获得的生物标志物数据提供每个细胞存在2至1000个HPV E6、E7mRNA拷贝的信息，例如每个细胞5至750个HPV E6、E7mRNA拷贝，包括每个细胞10至500个HPV E6、E7mRNA拷贝。在一些情况下，所获得的生物标志物数据是如美国专利号7,524,631中所述的每个细胞的HPV E6、E7mRNA拷贝数数据，该专利的公开内容以引用方式并入本文。测定拷贝数可以包括将单个与合适的对照进行比较，例如，如通过非特异性DNA染色（诸如下文所述）、通过参考值等提供的对照。
在一些情况下，还提供光度测量值。光度测量值使得能够测定核光密度、细胞质光密度、背景光密度以及任何这些值的比例。
非特异性细胞数据是可以从其得出细胞中样本的非特异性（即，非生物标志物特异性）细胞信息的任何类型的数据。在一些情况下，非特异性细胞数据是包括由用于测定法中的非特异性细胞染色剂发射的信号的数据。非特异性细胞数据可以是以下形式：发射光的存在和振幅、细胞或光信号所来自的其他物体中的离散位置数、信号源的相对放置以及细胞中各位置发射的光的颜色（波长或波段）。非特异性细胞数据可以采取定性、半定量或定量的形式。例如，定量或半定量非特异性细胞数据可以包括关于使用DNA染色剂（例如，如上所述）获得的细胞的DNA含量的数据。其他定量数据包括电子体积(EV)。因此，非特异性细胞数据可提供细胞中非特异性细胞成分的绝对或相对值（例如，拷贝数、量等）的指示。半定量和定量数据可统称为非特异性细胞定量数据。定性非特异性细胞数据可提供关于细胞特定功能存在与否的信息。例如，在用DNA染色剂染色的细胞中，可确定细胞核的存在与否（例如，样本中有核细胞的数量，也称为核化百分比）。
应注意，如果要在单一标记的液体细胞样本中对多个不同的标记进行检测，例如，用于单一样本中的生物标志物探针标记和非特异性细胞染色剂，则所用的标记和染色剂可选择为提供有区别的信号（如上文针对在单一样本中使用多种生物标志物探针所述）。例如，在其中采用标记的生物标志物探针和DNA染色剂的实施方案中，生物标志物探针的标记为产生与DNA染色剂的荧光信号有区别的荧光信号的荧光标记。因此，在激发生物标志物探针标记和DNA染料时产生的荧光信号可彼此间存在区别，这表示两者可被同时检测并且一者的信号不改变或更改另一者的信号。每种不同的标记可产生与任何其他标记有区别的信号。例如，可将细胞用三种荧光标记染色，这些荧光标记在激发时产生彼此间有区别的三种不同的荧光信号。
以上类型的数据（例如形态测量、生物标志物和非特异性细胞数据）可使用任何便利的方案得自样本的相同等分试样。在一些情况下，采用收集各种类型的数据的流式细胞术方案。流式细胞术是一种熟知的方法，它采用多参数数据识别和区别流体培养基中不同的粒子（例如细胞）类型，即，根据标记（波长、密度）、大小等彼此之间存在变化的粒子。在通过流式细胞术分析如上所述制备的样本时，首先将样本的等分试样引入流式细胞仪的流路。当处于流路中时，样本中的细胞基本上一次一个地通过一个或多个感测区，其中将每一个细胞单独地暴露在单波长的光源（或在一些情况下，两个或更多个不同的光源）下并单独地记录每个细胞的形态测量参数（例如光散射参数）和/或生物标志物参数（例如荧光发射）的测量值。对每个细胞记录的参数进行实时分析，或根据需要存储在数据存储和分析装置（诸如计算机）中以供随后分析。
更具体讲，在流式细胞仪中，悬液中的细胞基本上一次一个地在流路中通过一个或多个感测区，其中在每个感测区中通过能量源对每个细胞照明。能量源可以包括发射单波长光的照明器，诸如通过激光器（例如He/Ne或氩）或具有合适滤光片的汞弧灯提供的照明器。例如，488nm的光可在具有单一感测区的流式细胞仪中用作发射波长。对于发射两种不同波长的光的流式细胞仪，可采用附加波长的发射光，其中所关注的具体波长包括但不限于：535nm、635nm等。
与感测区域相串联，当细胞通过感测区并被能量源照明时，将检测器（例如集光器，诸如光电倍增管（或“PMT”）、图像采集器（例如电荷耦合器件(CCD)的形式）等）用于记录通过每个细胞的光（通常称为前向光散射）、与细胞流过感测区的方向正交而反射的光（通常称为正交或侧向光散射）以及从细胞发出的荧光（如果用荧光标记进行了标记）。所获得的每种类型的数据（例如前向光散射（或FSC）、正交光散射(SSC)和荧光发射（FL1、FL2等）和图像等等）包括每个细胞（或每个“事件”）的单独参数。
流式细胞仪还包括数据采集、分析和记录装置，诸如计算机，其中多个数据通道在每个细胞通过感测区时从各检测器记录由各细胞发出的形态测量和生物标志物数据。分析系统的目的是对细胞分类和计数，其中每个细胞作为一组数字化参数值来表示自己。在本发明的方法中通过流式细胞术测定细胞时，可将流式细胞仪设置为在选定的参数上触发，以便区别所关注的细胞与背景和噪音。“触发”是指为参数的检测预设的阈值。它通常被用作检测细胞通过激光束的手段。检测到超出选定参数的阈值的事件则触发该细胞光散射和荧光数据的采集。而对于导致低于阈值的反应的所测培养基中的细胞或其他成分，则不采集数据。触发参数可以是细胞通过光束所致的前向散射光的检测。流式细胞仪然后检测和收集细胞的光散射和荧光数据。
然后，基于对整个群采集到的数据，通过“分类”进一步分析所关注的特定亚群。为了选择合适的分类，对数据作图，以便获得可能最佳的亚群分离。这一程序通常通过在二维点阵图上对前向光散射(FSC)与侧向（即，正交）光散射(SSC)作图而完成。流式细胞仪操作者然后选择所需的细胞亚群（即，在分类内的那些细胞）并排除不在该分类内的细胞。需要时，操作者可通过使用光标在计算机屏幕上围绕所需的亚群画一条线而选择相应的分类。然后通过对这些细胞的其他参数（诸如荧光）作图，只对在该分类内的那些细胞进行进一步的分析。
可以采用能够从液体样本的相同等分试样获得形态测量数据和生物标志物/非特异性细胞数据（例如，如上所述）的任何流式细胞仪。所关注的是在美国专利号6211955、6249341、6256096、6473176、6507391、6532061、6563583、6580504、6583865、6608680、6608682、6618140、6671044、6707551、6763149、6778263、6875973、6906792、6934408、6947128、6947136、6975400、7006710、7009651、7057732、7079708、7087877、7190832、7221457、7286719、7315357、7450229、7522758、7567695、7610942、7634125、7634126、7719598中所述的那些流式细胞仪系统；这些专利的公开内容以引用方式并入本文。
从宫颈细胞样本的相同等分试样获得的形态测量和生物标志物/非特异性细胞数据（例如，如上所述）用于如上所述预测受试者是否具有CIN病变。形态测量、生物标志物和非特异性细胞数据的各种组合可用于预测受试者是否具有CIN病变。所关注的组合包括但不限于以下：a)联合E6、E7mRNA定量的核质(N/C)比分析（例如，以识别异常细胞）；b)联合通过DAPI染色和E6、E7mRNA杂交信号绿色荧光进行的细胞周期分析的N/C比分析；c)联合通过p16染色和E6、E7mRNA杂交信号绿色荧光进行的细胞周期分析的N/C比分析；d)联合通过DAPI（或其他DNA染色剂）染色进行的细胞周期分析的N/C比分析，等等。
增加的或高N/C比包括0.25或更高、0.30或更高、0.4或更高、0.5或更高、0.6或更高、0.7或更高、0.8或更高、0.9或更高、0.95或更高等的N/C比。
除了N/C比外，可将核面积(NA)评估用作形态测量数据。可将例如与正常中间鳞状细胞的核相比具有增加的核面积的宫颈细胞样本中的细胞识别为异常细胞。异常细胞可具有1.25或更大、1.75或更大、2.0或更大、2.25或更大、2.75或更大、3.0或更大、3.25或更大、3.5或更大等的核面积与核面积比（所关注的细胞的核面积/正常中间鳞状细胞的核面积）。这里应注意，使用标准显微镜观测，核面积估计值的准确度较低（参见例如Schmidt etal.,2008,“Visual estimates of nucleus-to-nucleus ratios:can we trust our eyesto use the Bethesda ASCUS and LSIL size criteria?”Cancer114(5):287-93）。本发明的多个方面提供核面积的更准确和可重现的评估。
附加数据参数也可用于分析宫颈细胞样本中的细胞，包括侧向（正交）光散射、前向散射和电子体积（EV；细胞大小的度量；基于Coulter原理）。此类参数可用于识别待分析的样本中细胞群或亚群的异常细胞的存在（参见例如图6及其在本文中的说明）。例如，分析EV和DNA含量（例如使用DAPI）允许区分去核和有核鳞状细胞。
在一些情况下，该方法包括确定所测定的细胞样本包含癌细胞。在这些实施方案中，该方法包括识别样本中一种或多种癌细胞的存在，其中识别基于例如如上所述的形态测量和生物标志物数据而进行。此类实施方案可以或可以不包括预测受试者中CIN的存在，因为这些实施方案的方法识别样本中实际的癌细胞的存在。
在一些情况下，在将样本引入细胞仪后的短时间内进行预测CIN病变的存在。因此，可在6小时或更短的时间内向用户提供结果，诸如3小时或更短，例如2小时或更短，包括1小时或更短。需要时，从受试者获取样本到向受试者提供结果的总体测定时间为6小时或更短，诸如5小时或更短，例如4小时或更短，包括3小时或更短，例如2小时或更短。
在一些情况下，该方法还包括如果方法导致预测出受试者中存在CIN病变则对受试者执行进一步的分析。例如，如果本发明的方法导致预测出受试者中存在CIN2+病变，则该方法然后可进一步包括向受试者提供采取进一步措施（例如以进一步诊断程序的形式，诸如活组织检查）的建议。在一些情况下，该方法包括采取进一步的诊断措施。进一步的诊断措施可包括阴道镜，其中对宫颈进行放大视觉检查，以识别宫颈表面上的异常细胞。如果活组织检查表明可能存在癌变或癌前病变，则可以采取进一步的诊断和治疗程序，诸如宫颈环形电切术(LEEP)和锥形切除术，其中摘取宫颈的内环以进行病理学检查。
虽然该方法适于与许多不同的雌性哺乳动物受试者一起使用，但是所关注的是将该方法与人类女性受试者一起使用，诸如10岁或以上的人类女性受试者，例如15岁或以上，包括20岁或以上。
装置和系统
本发明的多个方面还包括用于实践主题方法的系统。所关注的系统包括被构造成测定液体样本的形态测量和生物标志物数据（例如，如上所述）的流式细胞仪。所关注的流式细胞仪包括但不限于以下美国专利号中所述的那些装置：4,704,891、4,727,029、4,745,285、4,867,908、5,342,790、5,620,842、5,627,037、5,701,012、5,895,922和6,287,791，它们在必要时可加以改良以包括获得如上所述的图像数据的能力；以及在以下美国专利号中所述的那些细胞仪：6211955、6249341、6256096、6473176、6507391、6532061、6563583、6580504、6583865、6608680、6608682、6618140、6671044、6707551、6763149、6778263、6875973、6906792、6934408、6947128、6947136、6975400、7006710、7009651、7057732、7079708、7087877、7190832、7221457、7286719、7315357、7450229、7522758、7567695、7610942、7634125、7634126、7719598，这些专利的公开内容以引用方式并入本文。
在一些情况下，流式细胞仪包括：流动通道；被构造成将光导向流动通道的测定区的至少第一光源（其中在一些情况下，细胞仪包括两个或更多个光源）；被构造成从流动通道的测定区接收第一波长的光的第一检测器，以及被构造成从流动通道的测定区接收第二波长的光的第二检测器；以及被构造成获得细胞图像数据的图像检测器。这样的细胞仪除了图像检测器外将具有至少两个检测通道。在一些情况下，该装置可包括两个以上的检测通道，例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个等。
本发明的多个方面还包括信号处理模块，其被构造成从第一和第二检测器接收形态测量数据和生物标志物数据，并基于形态测量数据和生物标志物数据输出预测受试者是否具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变的结果。信号处理模块可以整合到细胞仪中作为单一装置，或与细胞仪分开，其中信号处理模块和细胞仪彼此通信，例如通过有线或无线通信协议。
因此，本发明的多个方面还包括被构造成例如如上所述预测受试者中CIN病变存在的系统，例如基于计算机的系统。“基于计算机的系统”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。本发明的基于计算机的系统的最低硬件要求包括中央处理单元(CPU)、输入装置、输出装置和数据存储装置。技术人员可容易地认识到，目前可用的基于计算机的系统的任何一种均适用于本发明。数据存储装置可包括可记录如上所述的本发明信息的任何产品，或可访问此类产品的存储访问装置。
为“记录”数据，计算机可读介质上的编程或其他信息是指使用本领域已知的任何此类方法存储信息的过程。可以根据用于访问所存储的信息的装置，选择任何便利的数据存储结构。多种数据处理器程序和格式均可用于存储，例如文字处理文本文件、数据库格式等。
“处理器”是指将执行所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文的任何处理器可以是可编程的数据微处理器，诸如以电子控制器、主机、服务器或个人计算机（台式或便携）的形式存在。如果处理器是可编程的，则合适的编程可从远程位置传递到处理器，或之前保存在计算机程序产品（诸如便携式或固定式计算机可读存储介质，无论是基于磁、光学还是固态器件的）中。例如，磁介质或光盘可携带编程，并可通过在其相应位置与每个处理器通信的合适读取器读取。
主题系统的实施方案包括以下组件：(a)有利于在系统与一个或多个用户之间传输信息的通信模块，例如通过用户计算机，如下所述；以及(b)用于执行本发明定量分析方法中涉及的一项或多项任务的处理模块。
在某些实施方案中，描述了一种计算机程序产品，包括在其中存储有控制逻辑（计算机软件程序，包括程序代码）的计算机可用介质。控制逻辑在通过计算机的处理器执行时导致处理器执行本文所述的功能。在其他实施方案中，主要使用例如硬件状态机在硬件中执行某些功能。硬件状态机的具体实施以便执行本文所述的功能可使用任何便利的方法和技术实现。
除了例如如上所述的传感器装置和信号处理模块外，本发明的系统可包括多个附加组件，诸如数据输出装置，例如监视器和/或扬声器；数据输入装置，例如接口、键盘等；流体处理组件；电源等等。
在一些情况下，该系统还可包括其反应混合物衍生物（例如，由其产生的洗涤后的细胞），其中反应混合物如上所述而制备，例如通过将样本、一种或多种标记的生物标志物探针以及任选的非特异性染色剂组合而制备。
功用
主题方法和系统可用于其中需要检测预测受试者中CIN病变的多种不同的应用。此类应用包括研究和诊断应用，例如其中诊断受试者的宫颈癌存在或发展成宫颈癌的倾向的应用，例如如上所述。本文所述的方法和系统的临床功用提供在早期和晚期检测和筛查HPV相关发病和宫颈癌发展的强有力工具，从而允许提供治疗性干预以防止疾病进展以及有机会提供早期治疗。此外，主题方法和系统可用于HPV相关疾病或病症的预后或风险评估，以监测HPV相关疾病或病症的变化，以及监测抗HPV药物或治疗的疗效，诸如抗HPV疫苗或抗HPV候选疫苗。
计算机相关实施方案
本发明的多个方面还提供多种计算机相关实施方案。具体地讲，在之前章节中所述的数据分析方法可使用计算机执行。因此，本发明提供基于计算机的系统分析使用上述方法产生的数据以便检测或预测CIN病变。
在某些实施方案中，以“编程”的形式将该方法编码到物理计算机可读介质上，其中如本文所用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和/或数据以进行执行和/或处理操作的任何存储或传输介质。存储介质的实例包括软盘、磁带、CD-ROM、硬盘驱动器、ROM或集成电路、磁光盘或计算机可读卡，诸如PCMCIA卡等等，而不论此类装置是否在计算机内部或外部。可将包含信息的文件“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”意指记录信息使得之后可被计算机访问和检索。所关注的介质为非暂时性介质，即，其中编程与物理结构相关（例如记录到物理结构上）的物理介质。非暂时性介质不包括通过无线协议传输的电子信号。
关于计算机可读介质，“永久性存储器”是指为永久性的存储器。永久性存储器不因计算机或处理器的供电中断而擦除。计算机硬盘驱动器、CD-ROM、软盘和DVD是永久性存储器的所有实例。随机存取存储器(RAM)是非永久性存储器的实例。永久性存储器中的文件可以编辑和重写。
试剂盒
在又一方面，本发明提供用于实践例如如上所述的主题方法的试剂盒。主题试剂盒可包含例如如上所述的标记的生物标志物探针。此外，试剂盒可包含如上所述的非特异性染色剂。此外，试剂盒可包含可用于给定测定法中的一种或多种附加组合物，包括但不限于：缓冲剂、稀释剂、固定试剂、透化试剂等。试剂盒还可以包含如上所述的样本获取装置，例如宫颈刷。上述组分可存在于单独的容器中或一种或多种组分可加以组合到单个容器中，例如玻璃或塑料小瓶中。
除了上述组分外，主题试剂盒还将包含用于执行主题方法的说明。这些说明可以多种形式存在于主题试剂盒中，而这些形式中的一种或多种可存在于试剂盒中。这些说明可存在的一种形式是作为合适介质或基材（例如在其上印刷信息的一张或多张纸）上、试剂盒包装中、包装说明书中的印刷信息。另外的方式将是在其上记录信息的计算机可读介质，例如磁盘、CD等。可存在的另外方式是网址，其可通过互联网在远处访问信息而使用。任何便利的方式均可存在于试剂盒中。
以举例说明而非限制的方式提供以下实施例。
实验
获得宫颈液基细胞学(LBC)标本的1ml样本等分试样，在室温下以1000xg离心5分钟。将所得的细胞沉淀在磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH7.4中洗涤两次，将细胞在室温下使用IncellFP(Incelldx,Menlo Park,CA)固定和透化1h。将所得的固定和透化细胞使用两种不同的预杂交缓冲液（PBS和2XSSC）洗涤两次，并针对所有已知的高风险HPV类型，通过将杂交缓冲液（5XSSC，30%甲酰胺）与荧光标记的HPV E6、E7mRNA探针混合物混合而制备杂交混合物（探针混合物来自存在于HPV OncoTectTM E6、E7mRNA检测试剂盒(incellDx,Menlo Park,CA)中的那些）。在预热到43±1℃的水浴中进行30分钟杂交反应，然后用两种杂交后缓冲液（2XSSC，Triton X-100和0.1X SSC，Triton X-100）对细胞进行严格洗涤，以便除去未结合的探针。将细胞在含有2%胎牛血清的1ml PBS中洗涤，然后重悬在60μl PBS、0.05%TritonX-100和1μg/ml DAPI中。在仪器上运行前，将200μl10μM EDTA的PBS溶液加入。使用注射器将样本匀化，然后在ImageStream仪器(Amnis Inc,Seattle,WA)上运行。对仪器进行设置以使用纵横比与面积点阵图（例如，如图1所示）区分完整的单一细胞。该设置允许：(1)通过N/C（核质）比分析而识别异常细胞（参见例如图2）；以及(2)通过DAPI染色以及E6、E7mRNA杂交信号的绿色荧光对E6、E7mRNA定量（参见图3A和图3B）。
作为另外一种选择，可将通过DNA染色试剂（例如，细胞的DAPI或DRAQ5染色）和E6、E7mRNA杂交信号的绿色荧光进行的细胞周期分析用于检测异常细胞。例如，如图4中的柱状图可见，E6/E7mRNA的过表达（Y轴）存在于DNA含量升高（X轴，DNA染色剂为DRAQ5）的细胞中。
将符合表1中公认的基于载玻片的标准的形态学测量以及基于逐个细胞的E6、E7mRNA过表达（所有测量都针对细胞悬液进行）结合使用，分别将CIN2+检测的灵敏度和特异性增加到了>95%和>90%。这种在单一测定中的性能大大超过了PAP涂片和HPV DNA联合用于检测CIN2+病变时的检测性能。
这种方法可用于用p16抗体替代E6、E7mRNA检测、或用导向与宫颈癌相关的特异性microRNA或染色体3q改变的探针替代E6、E7mRNA探针、或用E6、E7导向抗体替代E6、E7mRNA探针。
作为另外一种替代形式，可将通过与形态测量（例如，细胞的核/质比）联合的DNA染色试剂进行的细胞周期分析用于检测异常细胞。例如，图5A和图5B显示了正常宫颈细胞（图5A，上图）、LSIL宫颈细胞（图5A，下图）和HSIL宫颈细胞（图5B，两图）的N/C比（Y轴）与DNA含量的柱状图。此替代形式只使用1种染色试剂，即，非特异性DNA染色试剂。
此外，如下表2中所示，我们发现了通过使用DNA染色剂确定的样本中鳞状细胞的核化程度与细胞学异常的严重性相对应。具体地讲，样本中鳞状细胞的核化百分比增加对应于细胞学异常的严重性增加。在表2中，正常鳞状细胞具有约50%的核化百分比，LSIL鳞状细胞具有约80%的核化百分比，以及HSIL鳞状细胞具有90%以上的核化百分比。因此，约80%或更高的受试者样本中鳞状细胞的核化百分比表明受试者具有宫颈上皮内瘤样(CIN)病变（例如LSIL或HSIL），其中样本中约90%或更高的核化百分比表明受试者具有高级别鳞状上皮病变(HSIL)。
表2：作为异常Pap涂片诊断的决定因素的鳞状细胞群的核化
LSIL-低级别鳞状上皮病变
HSIL-高级别鳞状上皮病变
宫颈细胞样本可包含与本文所述的筛查测定无关的细胞类型（和其他碎片），因此将它们从分析中排除将是有利的。图6显示了宫颈细胞学样本中细胞的组合侧向（正交）光散射（Y轴）和电子体积（X轴）的点阵图。该图显示了样本中的不同细胞（和其他组分）可使用这些形态测量参数加以描绘。四种不同的分类标识碎片、宫颈阴道部细胞、宫颈内膜细胞和多形核白细胞(PMNS)。分类可用于识别所关注的细胞，以根据本发明的多个方面进行筛查（例如，宫颈内膜和/或宫颈阴道部细胞）。
虽然已通过举例说明和实施例出于清晰理解的目的比较详细地描述了前述发明，但是按照本发明的教导对于本领域的普通技术人员将显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神和范围的情况下可对本发明作出某些变化和修改。
因此，前文仅仅阐述了本发明的原理。应当理解，本领域的技术人员将能够设想出虽然本文未明确描述或示出但体现本发明原理并包括在其精神和范围内的各种安排。此外，本文详述的所有实例和条件语言主要是为了有助于读者理解本发明的原理以及使发明人贡献的概念促进本领域的发展，并且应当视为对此类具体详述的实例和条件没有限制。此外，本文详述本发明原理、方面和实施方案及其具体实施例时的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物两者。另外，此类等同物旨在包括当前已知的等同物以及将来开发的等同物，即，执行相同功能的所开发的任何要素，而无论结构如何。本发明的范围因此不旨在限于本文所示和所述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。

Claims (12)

1.一种非诊断目的的确定是否宫颈上皮内瘤样(CIN)细胞存在于标记液体宫颈细胞样本的方法，所述方法包括：
通过流式细胞术装置分析核酸生物标志物标记液体宫颈细胞样本获得数据，其中所述宫颈细胞在液体介质中是悬液形式的并且包含非特异性的DNA标记，其中所述数据包括包含核面积(NA)评估、核质(N/C)比分析或其组合的形态测量数据，和核酸生物标志物数据；以及
通过所述形态测量数据和所述核酸生物标志物数据确定是否CIN细胞存在于所述样本中，其中当所述样本中的细胞具有1.25或更大的核面积与核面积比、0.25或更高的N/C比，或者两者都有时，确定CIN细胞存在于所述样本中，其中所述核面积与核面积比是指所述样本中的细胞的核面积/正常中间鳞状细胞的核面积。
2.根据权利要求1所述的方法，其中CIN细胞为CIN2+细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定的特征在于85％或更高的灵敏度和/或85％或更高的特异性。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述确定的特征在于85％或更高的灵敏度和/或85％或更高的特异性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述形态测量数据包括图像数据。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸生物标志物数据包括每个细胞的生物标志物定量数据。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括制备宫颈细胞的所述核酸生物标志物标记的液体样本。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述制备包括：将初始宫颈细胞样本与固定和透化试剂组合，以固定和透化所述细胞；以及将所述固定和透化的细胞与特异性结合宫颈癌核酸生物标志物的荧光标记的核酸生物标志物探针接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述宫颈癌核酸生物标志物为E6 mRNA、E7 mRNA或其组合。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括将初始宫颈细胞样本与各自特异性结合不同宫颈癌核酸生物标志物的两种或更多种不同的荧光标记的核酸生物标志物探针接触。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在确定CIN细胞存在于样本中时建议采用宫颈活组织检查。
12.一种系统，包括：
流动通道；
光源，其被构造成将光导向所述流动通道的测定区；
第一检测器，其被构造成从所述流动通道的所述测定区接收荧光并产生包括核面积(NA)评估、核质(N/C)比分析或其组合的形态测量数据；
第二检测器，其被构造成从所述流动通道的所述测定区接收光并产生附加数据；以及
信号处理模块，其被构造成从所述第一和第二检测器接收所述形态测量数据和附加数据，并基于所述形态测量数据和附加数据输出是否宫颈上皮内瘤样(CIN)细胞存在于样本中的结果，其中所述系统被构造成执行权利要求1至11中任一项所述的方法。
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Assignee: GUANGZHOU IMPROVE MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Assignor: INCELLDX, INC.

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Denomination of invention: METHODS AND SYSTEMS FOR PREDICTING WHETHER A SUBJECT HAS A CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA (CIN) LESION FROM A SUSPENSION SAMPLE OF CERVICAL CELLS

Granted publication date: 20171205

License type: Exclusive License

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