JP7119771B2 - 目的細胞の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれる目的細胞を検出する方法に関する。特に本発明は、試料中に含まれる目的細胞の膜透過工程を最適化することで、目的細胞を高精度に検出する方法に関する。

近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織懸濁液や、細胞培養液といった試料から細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、癌患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣと表記）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。

しかしながら、ＣＴＣは存在確率が非常に少なく（試料が癌患者由来の全血の場合、全血１ｍＬあたり数個程度）、高感度な検出を必要とする。ＣＴＣは通常、ＤＡＰＩ（４’，６－ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ－２－ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）などの核標識試薬で標識され、サイトケラチン（ＣＫ）やｐ６３など上皮系細胞に特異的に有するタンパク質（ＣＫとｐ６３は細胞内に発現）に対する標識抗体で標識され、かつＣＤ４５など白血球に特異的に有するタンパク質（ＣＤ４５は細胞膜表面に発現）に対する標識抗体では標識されない細胞をＣＴＣとして判定している。しかしながらＣＴＣの中には前記上皮系細胞に特異的に有するタンパク質に対する標識抗体では標識されないＣＴＣもあり（特許文献１）、当該ＣＴＣを検出するには、偽陽性・偽陰性を無くすために、ＣＴＣ以外の夾雑細胞（例えば、白血球）も明瞭かつ正確に標識し、高精度に細胞を検出する必要がある。

ＷＯ２０１５／１１２９５５号

本発明の課題は、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞を明瞭かつ正確に標識することで、当該目的細胞を高精度に検出する方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明は以下の通り例示できる。
［１］
試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞を検出する方法であって、
１）試料中の目的細胞および夾雑細胞膜透過する工程、
２）当該目的細胞および当該夾雑細胞にそれぞれ特異的に有するタンパク質を認識する物質で標識する工程、および
３）これら標識の有無に基づき前記目的細胞を検出する工程、
を含み、目的細胞および夾雑細胞の膜透過を８５％（ｖ／ｖ）から９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで処理することで行なう、検出方法。
［２］
目的細胞が腫瘍細胞であり、目的細胞に特異的に有するタンパク質が上皮系の細胞内タンパク質であり、夾雑細胞の標識を夾雑細胞膜に特異的に有するタンパク質を認識する物質で行なう、［１］に記載の検出方法。
［３］
試料が血液試料であり、夾雑細胞が白血球であり、夾雑細胞に特異的に有するタンパク質が白血球の膜タンパク質であり、目的細胞の標識を目的細胞内に特異的に有するタンパク質を認識する物質で行なう、［１］または［２］に記載の方法。

本発明は、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞を膜透過し、当該目的細胞および当該夾雑細胞にそれぞれ特異的に有するタンパク質を認識する物質で標識後、これら標識の有無に基づき前記目的細胞を検出する方法において、目的細胞および夾雑細胞の膜透過を８５％（ｖ／ｖ）から９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで処理することで行なうことを特徴としている。本発明の検出方法は、特に試料中に含まれる目的細胞数が少なく、かつ夾雑細胞数が当該目的細胞数と比較して極めて多い場合に有用であり、例えば、本発明を血液中に含まれる血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出に適用することで、ＣＴＣ検出結果に対する信頼性が向上し、精度高く癌を検出できる。

本発明の検出方法で利用可能な、細胞保持装置の一例を示す図である。 本発明の検出方法で利用可能な、細胞保持装置の別の態様を示す図である。 図１に示す細胞保持装置を用いた、細胞の保持および検出を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明における試料の一例として、全血、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水、腹腔洗浄液などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁して得られる組織懸濁液や、前記生体試料または前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液、があげられる。このうち生体試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。

試料が血液試料である場合の、試料中に含まれる目的細胞の一例としては、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、各種幹細胞があげられる一方、試料中に含まれる夾雑細胞は目的細胞以外の細胞を指し、試料が血液試料である場合の夾雑細胞の具体例としては、前記試料中に含まれる細胞である白血球、赤血球、血小板および小胞、ならびにこれら細胞または前述した目的細胞由来のデブリがあげられる。なお本発明における血液試料は、全血、血清、血漿、臍帯血、成分採血液といった血液検体に限らず、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料や、当該血液検体より分離して得られる、前記血液検体由来の細胞を含む画分も、血液試料に含まれる。

本発明では、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞の膜透過処理を行なう。しかしながら膜透過処理は膜タンパク質の損傷や溶出のおそれがある。そのため、細胞内タンパク質および膜タンパク質を標識する際は、膜透過試薬およびその濃度の最適化が必要である。本発明者らは前記膜透過試薬の最適化検討を行なった結果、膜透過試薬として８５％（ｖ／ｖ）から９８％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて細胞を処理することで、膜タンパク質の損傷や溶出を最小限にしつつ、効率的な細胞膜透過が行なえることを見出した。本発明の方法は、目的細胞と夾雑細胞を分離せずに、双方とも標識する際に特に有用である。例えば、目的細胞が特異的に有するタンパク質と夾雑細胞が特異的に有するタンパク質が、それぞれ細胞内と細胞膜に存在する場合、認識物質が膜透化することを可能にし、かつ、膜タンパク質の損傷を抑制する必要があるためである。

本発明では、前述した膜透過処理後、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞を当該目的細胞および当該夾雑細胞にそれぞれ特異的に有するタンパク質を認識する物質で標識し、当該標識の有無に基づき試料中に含まれる目的細胞を検出する。

本発明において、目的細胞（夾雑細胞）が特異的に有するタンパク質とは、目的細胞（夾雑細胞）に特異的に存在するタンパク質であって、目的（夾雑）細胞の識別を可能にするタンパク質のことをいう。ここで、目的細胞（夾雑細胞）に特異的に存在する、とは、目的細胞（夾雑細胞）には存在し、かつ夾雑細胞（目的細胞）には存在しないこと、または、目的細胞（夾雑細胞）における存在量が夾雑細胞（目的細胞）よりも多いこと、を意味する。

本発明において、目的細胞（夾雑細胞）に特異的に有するタンパク質を認識する物質として好ましくは、前記タンパク質と特異的に結合可能な物質（以下、特異的結合物質、とも表記する）と光学的に検出可能なシグナルを発することが可能な標識物質との複合体が挙げられる。特異的結合物質の一例として、前記タンパク質に対する抗体や、前記タンパク質と特異的に結合可能なリガンド／レクチンがあげられる。標識物質は、光学的に検出可能なシグナル（蛍光、化学発光、燐光など）を発することが可能な物質であれば特に限定はなく、一例として、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ローダミンといった蛍光色素や、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼといった化学発光基質との反応を触媒する酵素があげられる。

特異的結合物質と標識物質との複合体形成は、公知の方法により両物質を化学的に直接結合させてもよいし、特異的結合物質にビオチン（アビジンまたはストレプトアビジン）を、標識物質にアビジンまたはストレプトアビジン（ビオチン）を、それぞれ結合させた後、ビオチン－アビジン（ビオチン－ストレプトアビジン）結合を介して間接的に両者を結合させてもよいし、
特異的結合物質と特異的に結合可能な物質（抗体、リガンド、レクチン）を標識物質に結合させた後、特異的結合物質と前記物質との相互作用（抗原抗体反応など）により間接的に両者を結合させてもよい。

本発明で実施する、試料中に含まれる目的細胞および夾雑細胞の膜透化は、具体的には以下の（Ｉ）または（ＩＩ）に示す標識において好適である。
（Ｉ）試料中に含まれる目的細胞内に特異的に有するタンパク質を認識する物質および試料中に含まれる夾雑細胞膜に特異的に有するタンパク質を認識する物質で標識
（ＩＩ）試料中に含まれる目的細胞膜に特異的に有するタンパク質を認識する物質および試料中に含まれる夾雑細胞内に特異的に有するタンパク質を認識する物質で標識
本発明で実施する標識の具体例を以下に示す。

試料が前述した血液試料であり、目的細胞が腫瘍細胞（ＣＴＣ）であり、夾雑細胞が白血球である場合は、ＣＴＣ内に特異的に有するタンパク質であるサイトケラチン（ＣＫ）やｐ６３を認識する物質、および白血球膜に特異的に有するタンパク質であるＣＤ４５（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ：ＬＣＡ）やＣＤ５０（ＩｎｔｅｒＣｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－３：ＩＣＡＭ－３）を認識する物質で標識すればよい。なおＣＫにはＣＫ１からＣＫ２０まで２０種類のタンパク質が知られているが、そのいずれもがＣＴＣ内に特異的に有するタンパク質として使用可能である。

試料が腫瘍組織の懸濁液であり、目的細胞が腫瘍関連線維芽細胞（ＣＡＦ）であり、夾雑細胞が白血球である場合は、ＣＡＦ内に特異的に有するタンパク質であるα－ＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）を認識する物質、および白血球膜に特異的に有するタンパク質であるＣＤ４５やＣＤ５０を認識する物質で標識できる。

試料がｉＰＳ細胞を内胚葉に分化させた後の溶液であり、目的細胞が未分化のｉＰＳ細胞であり、夾雑細胞が前記内胚葉である場合は、ｉＰＳ細胞膜に特異的に有するタンパク質であるＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ－３）やＴＲＡ－１－６０を認識する物質、および内肺葉内に特異的に有するタンパク質であるＳＯＸ１７やＨＮＦ－３（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ－３）を認識する物質で標識できる。

本発明では、前述した標識の有無に基づく検出の他に、追加の検出を行なってもよい。追加検出の一例として、ＤＡＰＩ（４’，６－ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ－２－ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）、ヘマトキシリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）などの核標識試薬を用いた有核細胞の検出や、オレンジＧ、ライトグリーン、エオシンなどの細胞質標識試薬を用いた細胞検出や、明視野像に基づく細胞の大きさ／形状／模様の違いによる検出があげられる。

本発明を実施する際、細胞検出までの間に、劣化した細胞の形状崩壊や、劣化した細胞内のＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子やタンパク質等が分解する現象が生じると、溶液からの目的細胞および夾雑細胞に含まれるタンパク質を用いた検出・解析能が低下する。そのため、前述した膜透過処理の前または前述した膜透過処理と同時に、前記細胞の劣化を抑制する固定処理を行なうと好ましい。固定処理用試薬としては、アルデヒド類、酸類、アルコール類などの有機溶剤、重金属元素などが挙げられるが、本発明はこれに限定されない。

アルデヒド類は、タンパク質の既存の結合様式（例えば、ジスルフィド結合や水素結合など）を解離させ、新たな結合を形成する。その結合は、リジン、アルギニン等のアミノ基末端やトリプトファン、チロキシン等の芳香族活性炭素との共有結合であったり、別のアミノ酸末端残基と連結して形成されるメチレン架橋であったりする。これらの新たな結合によってタンパク質の高次構造を変化させたり、このような結合や架橋に関与しない遊離分子もポリペプチド鎖をホールドすることによってさらなる変性を防いだりすることができ、タンパク質構造を安定化するとともに、細胞原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができる。固定処理用試薬として利用可能なアルデヒド類としては、ホルムアルデヒドが代表的であり、グルタルアルデヒドやグリオキサールなども含まれる。また、直接作用するものではないが、それ自体が加水分解等を受けることによってホルムアルデヒド等の安定化剤を遊離する、ホルムアルデヒドドナー（ホルムアルデヒド供与体）なども、固定処理用試薬として利用できる。ホルムアルデヒドドナーの一例として、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５－ブロモ－５－ニトロ－１，３－ジオキサン、ブロノポール（２－ブロモ－２－ニトロプロペイン－１ ，３－ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３－ジメチロール－５，５－ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム－１５（メセナミン ３－クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、メテンアミン、パラホルムアルデヒドが挙げられる。

酸類は、強いタンパク質凝固作用があるため、固定処理用試薬として利用できる。一例として、ピクリン酸、タンニン酸、オスミウム酸、酢酸、氷酢酸、三塩化酢酸（トリクロロ酢酸：ＴＣＡ）、クロム酸などやその塩が挙げられる。

アルコール類は、強力な脱水と脂質溶解によりタンパク質を不溶化・変性させる作用があるため、固定処理用試薬として利用できる。中でも、エタノール、メタノール、アセトンが非常によく用いられる。またクロロホルムのような有機溶剤も、アルコール類と同様な効果を有しており、固定処理用試薬として利用できる。

重金属元素としては、クロム、マンガン、亜鉛などが固定処理用試薬として利用できる。

本発明を、例えば血液試料中に含まれるＣＴＣの検出のような、試料中に含まれる目的細胞数が少ない、および／または夾雑細胞数が極めて多い系に適用する場合、あらかじめ試料中に含まれる目的細胞を濃縮する、および／または夾雑細胞を低減させる工程（以下、目的細胞濃縮工程という）を行なうと、目的細胞の検出を効率的に行なえる点で好ましい。目的細胞濃縮工程は、試料中に含まれる目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）を低減することで目的細胞をより選択的に回収できれば特に制限はない。例えば、目的細胞と目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）との大きさの違いを利用して分離濃縮するフィルター法、細胞表面の抗体発現プロファイルの違いを利用し、前記抗体を結合した磁性粒子を用いて目的細胞を分離濃縮する磁気ビーズ法、細胞間の比重差を利用した比重差分離法が例示できる。なかでも比重差分離法は、短時間で選択的に目的細胞を濃縮できることから、目的細胞濃縮工程として特に好ましい。

以下、比重差分離法による目的細胞濃縮工程について詳細を示す。

比重差分離法による目的細胞の濃縮（夾雑細胞の低減）は、目的細胞と目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）が比重差によって分離できれば特に制限はない。例えば、密度勾配溶液が入った遠沈管に目的細胞を含む試料を重層後、遠心分離操作を行なうことで、目的細胞を含む画分と目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）を含む画分とに分離させ、前記目的細胞を含む画分を回収することで、目的細胞を濃縮（夾雑細胞の低減）させればよい。ここで用いる密度勾配溶液は、それ自身でまたは遠心分離によって密度勾配を形成する液体状の物質であり、目的細胞の密度（比重）を特定し、その分離に適当なものを選択して使用すればよい。選択の指標としては、例えば栄養成分、ｐＨ、等張性があげられる。密度勾配溶液の具体例としては、ショ糖、グリセロール、デキストラン、メトリザミド、イオディキサノール、ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合体、ポリビニルピロリドンの被膜をもつコロイド状シリカ粒子、スクロースポリマー、ジアトリゾ酸、イオヘキソールがあげられ、市販品として、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ（以上、ＧＥヘルスケア製）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ、ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（以上、Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ製）などが知られている。

遠心分離操作は、一般には１０００×ｇから２０００×ｇ程度の低速で実施すればよいが、目的細胞の密度や使用する密度勾配溶液の密度を勘案し、当該目的細胞が密度勾配溶液の上に維持される条件を選択すればよい。例えば目的細胞が腫瘍細胞であり、上記条件で遠心分離操作を行なう場合、濃縮対象である腫瘍細胞の種類に応じて密度勾配溶液の密度を１．０６０から１．１０５ｇ／ｍＬまでの範囲に設定することができる。中でも、腫瘍細胞の濃縮率を高める観点から、密度勾配溶液の密度は１．０７５ｇ／ｍＬ以上が好ましく、１．０８０ｇ／ｍＬ以上とするとより好ましい。一方、同じ理由から、密度勾配溶液の密度は１．１００ｇ／ｍＬ以下が好ましく、１．０９６ｇ／ｍＬ以下とするとより好ましく、１．０９３ｇ／ｍＬ以下とするとさらにより好ましい。腫瘍細胞の濃縮に最も好ましい密度勾配溶液の密度は、１．０８２から１．０９１ｇ／ｍＬまでの範囲である。

密度勾配溶液の浸透圧は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４５０ｍＯｓｍ／ｋｇまでの範囲で適宜設定すればよいが、３００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇまでの範囲とするとより好ましい。密度勾配溶液のｐＨは、目的細胞が損傷を受けない範囲で任意に選択することができ、通常の細胞の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．８までの範囲に設定すればよい。

比重差分離法による目的細胞濃縮工程を行なう際、目的細胞に特異的に結合する物質または目的細胞以外の成分（夾雑細胞など）に特異的に結合する物質を添加することにより、目的細胞を更に効率的に分離することができる。なお、前記特異的に結合する物質と多孔質シリカ粒子等比較的密度が小さい物質とを結合させれば、見かけ上の密度を小さくすることができる。前記特異的に結合する物質としては、目的細胞（または夾雑細胞など目的細胞以外の成分）と特異的に結合可能な抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、レクチンといった生体高分子を例示できる。また前述した密度を調整する目的で使用可能な物質としては、前述した多孔質シリカ粒子の他に、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカルボネート等のポリビニル化合物に代表される有機ポリマー、ポリスチレンラテックス、ナイロン、ポリテレフタレート等の共重合体、ガラス、シリカ、ジルコニア等の無機材料、セルロース、デキストラン、アガロース、セルロース、セファロース等の生体ポリマー、赤血球などの生体試料が例示できる。

比重差分離法による目的細胞濃縮工程を行なう際、夾雑細胞を積極的に除去する操作を追加してもよい。例えば、血液試料から比重差分離法によりＣＴＣの濃縮操作を行なう際、赤血球を積極的に除去する溶血操作を追加してもよい。前記夾雑細胞を積極的に除去する操作は、遠心分離操作前に行なってもよいし、遠心分離操作後に行なってもよい。なお夾雑細胞を積極的に除去する操作を遠心分離操作前に行なう場合は、その後遠心分離操作を追加すると好ましい。

本発明により目的細胞を検出するには、例えば、目的細胞を含む試料（または当該試料をあらかじめ前述した目的細胞濃縮工程により濃縮した試料）を希釈、懸濁などの処理をした後、スライドに塗布または保持部を有した基板に展開し、塗布された、または保持部に保持された細胞を顕微鏡などの光学的手段を用いて検出すればよい。前述した検出方法のうち、保持部を有した基板に試料を展開し、保持部に保持された細胞を検出する方法は、高感度かつ高精度に１細胞ごとを観察／解析できる点、および後の検出で細胞の再標識を行なう際、保持された細胞が剥離されるおそれが軽減される点で好ましい。

本発明において、目的細胞を含む試料を展開し検出するのに好ましい装置の一例として、図１から図３に示す細胞保持装置があげられる。
図１および図３に示す細胞保持装置１００は、
貫通孔１１１を有した平板状の絶縁膜１１０と、
貫通孔１２１を有した平板状の遮光膜１２０と、
導入口１３１および排出口１３２を有した平板状のスペーサ１３０と、
遮光膜１２０の下面およびスペーサー１３０の上面と密着するよう設けた電極１４１・１４２と、
電極１４１・１４２同士を接続する導線１５０と、
電極１４１・１４２に信号を印加する交流電源１６０と、
を備えている。絶縁膜１１０が有する貫通口１１１と遮光膜１２０が有する貫通孔１２１とは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう絶縁膜１１０および遮光膜１２０を備えている。貫通孔１１１、貫通孔１２１および遮光膜１２０の下部に密着して設けた電極１４１により、細胞保持装置１００内に細胞を保持可能な保持部１７０が構成され、導入口１３１から細胞を含む液体を導入すると保持部１７０へ細胞が導入される。遮光膜１２０は、絶縁膜１１０自体の自家蛍光に起因するバックグラウンドノイズや隣接する保持部１７０からの漏れ光に起因するクロストークノイズなどの光ノイズを低減することができ、各保持部１７０に保持された細胞由来の光のみを高感度かつ高精度に検出することができる。電極１４２はスペーサ１３０上面に密着して備えており、導入口１３１から導入した、目的細胞を含む試料の飛散や蒸発を防止している。なお保持部１７０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極１４２はスペーサ１３０から取り外し可能な構造となっている。また電極１４１・１４２をＩＴＯ（酸化インジウムスズ）などの透明電極にすると、保持部１７０に保持された細胞を、顕微鏡や光学検出器を用いて検出可能となるため、好ましい。

前述した細胞保持装置１００のうち、電極基板については、図１に示す装置のように絶縁膜１１０、遮光膜１２０およびスペーサ１３０を上下方向に挟むよう備えてもよいし、図２に示す装置のように遮光膜１２０の下面のみに＋極１４１ａおよび－極１４１ｂを設けた櫛形電極の態様で電極１４１を備えてもよい。

保持部１７０の大きさは、１個の目的細胞のみを保持可能な大きさとすると、検出工程にて標的細胞の検出が容易になる点で好ましい。なお細胞保持装置１００へ展開させる試料中に含まれる細胞数（目的細胞と夾雑細胞との和）が、細胞保持装置１００に設けた保持部１７０の数よりも多いことが予想される場合は、適切な細胞数が展開されるように希釈したり、展開に供する試料をあらかじめ計量するとよい。

目的細胞を含む試料（または当該試料をあらかじめ前述した目的細胞濃縮工程により濃縮した試料）の細胞保持装置１００への展開は、細胞検出に適した間隔で基板上に分布させることができれば任意の手法を用いることができ、単に前記試料を細胞保持装置１００へ展開させるのみでもよいが、その後、振動や誘電泳動力を与えるなどして細胞を細胞保持装置１００に設けた保持部１７０へ積極的に保持させる操作を追加してもよい。特に、前記保持させる操作を、誘電泳動力を与えることで行なうと、生きた細胞を数秒程度の極めて短い時間で保持部１７０に保持できる点で好ましい。誘電泳動力４００を細胞３００に作用させるには、保持部１７０を含めた細胞保持装置１００内の空間を液体で満たした状態で、保持部１７０の部分に電気力線が集中するよう、交流電源１６０を用いて電極１４１・１４２へ所定の波形を有する交流電圧を印加すればよい（図３）。なお保持部１７０をアレイ状に均等に設けると、電極間に印加した電圧によって生じる電界が各保持部１７０にほぼ均等に生じ、各保持部１７０に対して同じように細胞３００を誘導し捕捉できるため好ましい。

交流電源１６０を用いて電極１４１・１４２へ印加する交流電圧の大きさは、保持部１７０に細胞３００を移動／保持可能な誘電泳動力４００を発生させるのに十分な電圧であればよい。具体的には、ピーク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１０ｋＨｚから１０ＭＨｚ程度の正弦波、矩形波、三角波、台形波等の波形の交流電圧が例示できる。特に１つの保持部に対し１個の細胞のみを保持させたい場合は、周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚの矩形波を用いると好ましい。矩形波は、正弦波、三角波、台形波などの他の波形と比較し、瞬時に設定したピーク電圧に到達するため、細胞を保持部へ速やかに移動させることでき、２個以上の細胞が重なる態様で保持部に保持される確率を低くできる（１つの保持部に１個の細胞のみを保持する確率が高くなる）。細胞は電気的にコンデンサーと見なすことができるが、矩形波のピーク電圧が変化しない間は、保持部に保持された細胞には電流が流れ難くなって電気力線が生じ難くなり、この結果、細胞を保持した保持部には誘電泳動力が発生し難くなる。従って、一度保持部に細胞が保持されると、別の細胞が同一の保持部に保持される確率は低くなり、代わりに電気力線が生じ誘電泳動力が発生している他の保持部（細胞を保持していない、空の保持部）に、順次、細胞が保持される。

なお図１から図３に示す細胞保持装置１００に備える交流電源１６０は、直流成分を有しない交流電圧を発生する電源が好ましい。直流成分を有する交流電圧を電極へ印加すると、直流成分により発生した静電気力（電気泳動力）により細胞が特定の方向に偏った力を受けて移動し、誘電泳動力による細胞保持が困難になるからである。また直流成分を有する交流電圧を印加すると、細胞を含有する懸濁液に含まれるイオンが電極表面で電気反応を生じて発熱し、細胞が熱運動を起こすため誘電泳動力による動きを制御できなくなり、保持部への移動／保持が困難になる。本明細書において、直流成分を有する交流電圧とは、周波数デューティ比が５０％でない電圧、オフセットを有する電圧、周期が極端に長い（例えば１秒以上）電圧などをいう。

細胞保持装置１００に備える保持部１７０に保持された目的細胞および夾雑細胞は、目的細胞および夾雑細胞にそれぞれ特異的に有するタンパク質を認識する物質を用いて、前記目的細胞および夾雑細胞を標識化した後、前記標識を別途設けた検出部２００を用いて光学的に検出する。検出部２００の一例としては蛍光顕微鏡が例示できる。細胞の固定・膜透過処理は、標識前に行なえばよいが、保持部に細胞を保持した後に行なう方が、前記細胞が保持部から剥離されるおそれが軽減される点で好ましい。

蛍光顕微鏡を用いて目的細胞を検出する場合は、前記標識としてＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ローダミンといった蛍光色素を用い、当該蛍光色素に対応した励起光を標識化した細胞に照射し、当該照射により得られる前記標識化した細胞由来の蛍光の強度に基づき検出すればよい。標識化した細胞への照射に用いる光源としては、ハロゲンランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプ、レーザー、ＬＥＤ等を用いることができ、前記光源からの光は、必要に応じて光学フィルターやミラー、レンズ等によって構成される光学手段により観察領域（標識化された細胞が保持された保持部）に照射されればよい。前記照射により観察領域から得られる蛍光シグナル情報として、蛍光物質が発する蛍光から検出した蛍光強度、蛍光強度のピーク値、蛍光強度の最小値、蛍光強度の平均値、蛍光強度の積分値などの蛍光強度から算出された数値が例示できる。また前記照射により観察領域から得られるシグナル情報は、前記蛍光に関する情報の他に、広い波長域での透過光、反射光による光強度分布から構成される像（明視野）なども得られる。このうち明視野情報からは、細胞の直径、細胞の面積、細胞の体積、細胞の周囲長、真円度など細胞形態に関する情報が取得できる。そのため、前述した蛍光強度による検出の他に、明視野像に基づく目的細胞の大きさ／形状／模様などの外観の情報をあわせることで、より精度高く目的細胞の検出を行なうこともできる。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。また本発明では目的細胞および夾雑細胞を両方標識するが、本実施例では輝度分布を確認するために目的細胞の標識と夾雑細胞の標識とを分けて行なっている。

実施例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ－ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解後、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ－ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ－ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。

（２）イミダゾリジニル尿素２ｇ、分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２ｇ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１００ｍｇ、および塩化ナトリウム６００ｍｇを、超純水１００ｍＬに溶解し、得られた溶液を安定化剤として用いた。

（３）目的細胞としてヒト前立腺がん細胞株（ＬＮＣａＰ）を、５％ＣＯ_２環境下、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭグルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて培地から剥離し、チューブに回収した。回収後、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。なお本実施例で目的細胞として用いた腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ）はサイトケラチン（ＣＫ）を発現する細胞株である。

（４）（３）のＬＮＣａＰ細胞の懸濁液に、（２）の安定化剤を等量添加し、得られた溶液を保存処理した目的細胞懸濁液とした。

（５）保存処理した目的細胞懸濁液を室温で１０分放置し、１０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離後、上清を除去した細胞懸濁液に、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液を５倍量添加し、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。

（６）遠心後の上清を除去した後、細胞ペレットを、（１）のＰＥＧ－ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液１ｍＬで再懸濁した。

（７）再懸濁液を３００×ｇで５分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、再度、細胞ペレットを、ＰＥＧ－ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液１ｍＬで再懸濁した。

（８）（７）で上清を除去した細胞懸濁液を、以下に示す方法で図１および図３に示す細胞保持装置１００に保持した後、腫瘍細胞を検出した。なお細胞保持装置１００には、直径φ３０μｍ、深さ４０μｍの保持部１７０を設けている。
（８－１）導入部１３１から、（３）で回収した細胞の懸濁液を導入した後、交流電源２６０から各電極１４１・１４２に交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚ、矩形波）を印加し、誘電泳動力により前記細胞を保持部２７０に保持させた。
（８－２）導入部１３１から、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリ－Ｌ－リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を、前記交流電圧を印加しながら導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、排出部１３２から前記水溶液を吸引除去した。
（８－３）導入部１３１から、１％ＨＣＨＯ溶液を導入し、１０分間静置することで細胞を固定した後、排出部１３２から前記試薬を吸引除去した。その後、導入部１３１から、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した前記試薬を洗浄した。
（８－４）導入部１３１から、以下に示すいずれかの試薬を導入し、１０分間静置することで細胞膜を透過した後、排出部１３２から前記試薬を吸引除去した。その後、導入部１３１から、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した前記試薬を洗浄した。
（導入した膜透過試薬）
９８％（ｖ／ｖ）エタノール
９５％（ｖ／ｖ）エタノール
９０％（ｖ／ｖ）エタノール
８５％（ｖ／ｖ）エタノール
７５％（ｖ／ｖ）エタノール
５０％（ｖ／ｖ）エタノール
２５％（ｖ／ｖ）エタノール
（８－５）導入部１３１から、ブロッキング溶液を導入し、１０分間静置することで細胞膜を透過した後、排出部１３２から前記試薬を吸引除去した。その後、導入部１３１から、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した前記試薬を洗浄した。
（８－６）導入部１３１から、目的細胞である腫瘍細胞を標識するためのＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識抗サイトケラチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製）（以下、ＣＫ－ＦＩＴＣと表記）および核染色試薬であるＤＡＰＩ（４’，６－ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ－２－ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）（同仁化学研究所製）を混合した細胞染色液を導入し、細胞標識を行なった（２５℃、３０分）後、導入部１３１から、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を導入することで、残留した前記試薬を洗浄した。
（８－７）保持部１７０に保持された全ての細胞を観察するために、コンピューター制御式電動ステージおよびＣＭＯＳカメラ（浜松ホトニクス製ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０）を備えた蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ製ＩＸ７１）を用いて全ての保持部の明視野像および蛍光画像を撮影した。
（８－８）（８－７）で撮影した画像を解析ソフトウェアＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて解析を行ない、ＤＡＰＩで染色されない（細胞核を有さない）細胞をＬａｂＶＩＥＷ上で排除し、ＣＫ－ＦＩＴＣで標識される細胞を目的細胞である腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ）として検出した。
（８－９）（８－８）で検出した目的細胞におけるＣＫの輝度分布を０から２５５の２５６階調で解析し、検出した細胞に占める高輝度（２００以上）の細胞の割合を算出した。

結果を表１に示す。８５～９８％（ｖ／ｖ）エタノールで膜透過処理した場合、ＣＫ高輝度の目的細胞（腫瘍細胞）の割合が比較的高かった。一方、７５％（ｖ／ｖ）、５０％（ｖ／ｖ）、および２５％（ｖ／ｖ）エタノールを膜透過試薬として用いたときは、ＣＫ高輝度の目的細胞（腫瘍細胞）は殆ど検出されなかった。以上の結果から、膜透過試薬として８５％（ｖ／ｖ）から９８％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて細胞を処理することで、目的細胞内タンパク質の損傷や溶出による輝度低下が防げることがわかる。

実施例２
（１）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ－２Ｋ採血管（ＶＰ－ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に３ｍＬ採血後、前記採血管に実施例１（２）で調製した安定化剤３ｍＬを添加し、得られた溶液を保存処理した希釈血液試料とした。
（２）保存処理した希釈血液試料を室温で１０分放置し、７５μＬの白血球・赤血球結合剤（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した後、チューブ内で密度１．０８６ｇ／ｍＬの密度勾配溶液上に重層し、室温で２０００×ｇで１０分間遠心した。
（３）遠心後、上清を５０ｍＬ容量の容器に回収した。
（４）回収後数分以内に０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で３０ｍＬまでメスアップ後、３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。当該操作により上清に混入した赤血球が破壊される。
（５）遠心後の上清を除去した後、細胞ペレットを、実施例（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ－ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
（６）再懸濁液を３００×ｇで５分間、室温で遠心分離後、上清を除去し、再度、細胞ペレットを、ＰＥＧ－ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血液成分を除去し、目的細胞（本実施例ではＣＴＣなどの腫瘍細胞）を濃縮するための操作である。
（７）実施例１（８－６）で導入する染色試薬として、白血球を標識するためのＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ製）（以下、ＣＤ４５－ＰＥと表記）および核染色試薬であるＤＡＰＩ（４’，６－ＤｉＡｍｉｄｉｎｏ－２－ＰｈｅｎｙｌＩｎｄｏｌｅ）（同仁化学研究所製）を混合した試薬を用いた他は、実施例１（８）と同様な方法で（６）で上清を除去した細胞懸濁液中に残存する白血球を検出し、検出した白血球におけるＣＤ４５の輝度分布を０から２５５の２５６階調で解析した後、検出した細胞に占める高輝度（２００以上）の細胞の割合を算出した。

結果を表２に示す。８５～９８％（ｖ／ｖ）エタノールで膜透過処理した場合、ＣＤ４５高輝度の白血球の割合が比較的高かった。一方、７５％（ｖ／ｖ）、５０％（ｖ／ｖ）、および２５％（ｖ／ｖ）エタノールを膜透過試薬として用いたときは、ＣＤ４５高輝度の白血球の割合が５％以下と低かった。以上の結果から、膜透過試薬として８５％（ｖ／ｖ）から９８％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて細胞を処理することで、白血球膜タンパク質の損傷や溶出による輝度低下が防げることがわかる。

実施例１の結果と実施例２の結果とを組み合わせて検討したところ、８５～９８％（ｖ／ｖ）エタノールで膜透過処理した場合、ＣＫ高輝度の目的細胞（腫瘍細胞）の割合およびＣＤ４５高輝度の白血球の割合がいずれも高かった。このことから膜透過試薬として８５％（ｖ／ｖ）から９８％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて細胞を処理することで、目的細胞内タンパク質および夾雑細胞膜タンパク質の損傷や溶出による輝度低下をともに防げることがわかる。

１００：細胞保持装置
１１０：絶縁膜
１１１：貫通孔
１２０：遮光膜
１２１：貫通孔
１３０：スペーサ
１３１：導入口
１３２：排出口
１４１・１４２：電極
１４１ａ：＋極
１４２ｂ：－極
１５０：導線
１６０：交流電源
１７０：保持部
２００：検出部
３００：細胞
４００：誘電泳動力
５００：光

Claims (3)

1. 試料中に含まれる腫瘍細胞および白血球を検出する方法であって、
   １）試料中の腫瘍細胞および白血球を膜透過する工程、
   ２）当該腫瘍細胞および当該白血球がそれぞれ特異的に有するタンパク質を認識する物
   質で標識する工程、および
   ３）これら標識の有無に基づき前記腫瘍細胞を検出する工程、
   を含み、腫瘍細胞および白血球の膜透過を８５％（ｖ／ｖ）以上９５％（ｖ／ｖ）未満のエタノールで処理することで行なう、検出方法。
2. 腫瘍細胞が特異的に有するタンパク質が上皮系の細胞内タンパク質であり、白血球の標識を白血球が特異的に有するタンパク質を認識する物質で行なう、請求項１に記載の検出方法。
3. 試料が血液試料であり、白血球が特異的に有するタンパク質が白血球の膜タンパク質であり、腫瘍細胞の標識を腫瘍細胞が腫瘍細胞内に特異的に有するタンパク質を認識する物質で行なう、請求項１または２に記載の方法。

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