KR20030005359A - 갈산 유도체 및 이의 내인성 응고의 검사를 위한 용도 - Google Patents

갈산 유도체 및 이의 내인성 응고의 검사를 위한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내인성 응고 경로용 접촉 활성제 및 응고 이상의 검사에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 활성제는 갈산, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 갈레이트의 유도체이다.

Description

갈산 유도체 및 이의 내인성 응고의 검사를 위한 용도{GALLIC ACID DERIVATIVES AND USE FOR EXPLORING ENDOGENETIC COAGULATION}
"내인성 경로"에 의해 개시되는 응고는 혈액이 음전하 표면과 접촉되는 것에 의한 시험관내에서 발생된다. 이것은 생체내에서 피브린 응괴의 성장의 부수적인 강화를 제공한다.
"내인성 경로"에 의해 개시되는 응고(이후에 "내인성 응고"로 표현됨)의 검사는 응고 이형의 시험관내 검출을 위한 테스트에 사용되거나, 또는 항응고 활성이 있는 물질로 처치된 환자를 감시하기 위해서 사용된다.
내인성 응고 경로는 음전하와 접촉하는 인자 XII(f.XII)의 활성화에 의해 시험관내에서 개시된다. 기타의 효소 인자, 예컨대 인자 XI(f.XI), 칼리크레인 전구체(PK), 고 분자량 키니노겐(HMWK), 항혈우병 인자 B 및 조인자로 알려진 인자 IX(f.IX) , 항혈우병 인자 A(f.VIIIc)의 존재하에서, 효소 형태의 다단계 활성화 반응은 혈소판 인지질(PF3) 및 칼슘(Ca2+)의 동시 존재하에서 개시된다.
일련의 활성화 반응의 말기에, 활성화된 인자 IX(f.IX)는 프로트롬빈으로 알려진 인자 II(f.II) 및 인자 X(f.X)를 비롯한 효소의 제2 계열의 다단계 활성화 반응을 차례로 일으킨다. 여기서, 활성화는 혈소판 인자(PF3), 칼슘(C2+) 및 조인자, 인자 V(f.V)의 존재하에 달성된다.
제2 활성화 다단계 반응은 피브리노겐을 혈액 또는 혈장 응괴의 주요한 구성성분인 피브린으로 변형시키는 트롬빈(f.IIa)의 형성중에 종결된다.
내인성(시험관내) 응고 경로에 대한 간단한 반응은 하기와 같이 예시될 수 있다.
일반적으로, 응고 검사는 출혈 증후군에 걸릴 수 있는 환자에서의 생물학적 이형을 찾거나, 응고 수준에서 질병의 효과를 조사하거나, 또는 직접적 또는 간접적으로 응고를 변형시킬 수 있는 의학적 치료를 조사하기 위해서 수행된다.
이를 위하여, 여러가지 테스트가 내인성 응고 경로에 관련된 인자의 정성적 또는 정량적 관찰로부터 조사되도록 제시되어 왔고, 각종의 이형이 피브린 형성에영향을 미치는 것은 트롬빈에 의한 피브리노겐의 변형에 기인한다.
내인성 응고(또한 내재성 응고로써 알려짐)를 검사하는 각종의 테스트들은 상업적으로 입수가 용이하며, 특히 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 테스트, APTT가 언급될 수 있고, 이것은 내인성 경로에 관련된 인자의 수준에서 혈장 샘플에서의 이형 또는 결핍을 검출할 수 있고, 이 이형은 정상 한계치에 포함되지 않는 응고 시간에 의해 나타난다.
APTT 테스트는 가장 흔하게 발생하는 본질적인 출혈증, 즉 빌레브란트 병 및 혈우병 A 및 B를 식별하기 위해서 수행된다. 또한, 이 테스트는 헤파린 치료를 모니터하기 위해 빈번히 사용된다.
APTT 테스트의 원리는 칼슘 이온과 함께 테스트용 혈장 샘플 및 혈소판 막의 인지질의 대체물에 음전하 인자 XII 활성제(접촉 활성제)를 첨가하는 단계로 구성된다.
측정된 응고 시간은 접촉 활성제, 혈소판 대체물, 칼슘을 첨가한 후 응고가 나타날 때까지의 시간에 해당한다. 이 시간은 혈장내에 있는 1%의 프로트롬빈을 트롬빈으로 변형시키는데 필요한 시간이다. 이후, 피브린은 단시간에 걸쳐 형성된다. 칼슘은 이 시스템에 대한 개시 원소이다.
APTT 테스트를 수행하기에 적당한 활성제는 비교적 다양하다. 이들은, 예를 들면, 실리카, 유리 또는 카올린 등의 고체 활성제, 또는 엘라지산 및 이의 유도체 등의 액체 활성제, 또는 설파타이드를 포함한다.
고체 활성제를 기초한 시약은 널리 이용되지만, 이것들은 특정 단점이 있다.이들이 포함하는 카올린 또는 실리카의 입자는 응고 테스트 동안 침전되는 경향이 있다. 따라서, 계속적으로 교반시켜야 하므로 시약의 불안정성에 관련된 문제와 자동화 장치에서의 테스트 수행중에서의 곤란성을 야기한다. 또한, 카올린 등의 활성제는 광학 응고 측정을 수행하는 데에 사용될 수 없다.
액체 활성제는 고체 활성제에 대한 대안이다. 그러나, 엘라지산 등의 활성제는 테스트 결과에서의 변화를 유도할 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들의 민감도는 이전 시약의 민감도에 비하여 감소된다. 각종 문헌에서는 이러한 시약의 성능을 향상시키는 것으로 제안되어 왔다. 예컨대, 국제 특허 출원 WO-A-91/16453에서는 엘라지산, 페놀 및 금속 이온을 기초한 시약, 바람직하게는 덱스트란 설페이트와 관련된 시약을 제안한다.
용액내에 있는 기타의 접촉 활성제가 기재되어 있는데, 특히 유럽 특허 EP-A-0 525 035에서는 프로필 갈레이트 및 타닌에서 선택된 히드록시 치환 방향족 화합물을, 국제 특허 출원 WO-A-98/44352에서는 엘라지산을, 미국 특허 US-A-5 550 028에서는 테트라히드록시-1,4-퀴논을 개시하였다.
또한, 설파타이드는 내재성 경로를 경유한 응고를 위한 활성제 화합물로서 제안되어 왔다. 그러나, 이 활성 수준이 항상 충분한 것으로 간주되지는 않으며, 이 화합물은 기타의 시판되는 활성제에 비하여 비교적 비싼 추가의 단점이 있다.
따라서, 신규한 응고 시약이 요구되거나, 경제적 관점에서 이점이 되고, 충분한 안정성 및 민감성을 갖고, 짧은 활성화 시간을 유도하고, 자동화 분석 장치에서 생산 테스트를 대량 제조하도록 사용될 수 있는 산물을 제공하도록 기존 시약을향상시키는 것이 요구된다.
본 발명은 내인성 응고에 대한 활성제 화합물 및 이의 검사에 대한 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 내인성 응고에 참여할 수 있고, 이 내인성 응고를 검사할 수 있고 이형을 검출할 수 있는 시스템 및 테스트의 제조에 참여할 수 있는 이러한 대안의 접촉 활성제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 APTT 형인 내인성 응고의 검사에 대한 분석에서 이 활성제의 용도에 관한 것이다.
특히 구체예에 따르면, 내인성 응고의 활성제는 특정 병변에 직면한 응고 시간의 몇가지 이상과 관련하여, APTT에 사용되는 시약의 반응의 민감도를 조절하는 화합물과 관련이 있다.
내인성 응고를 활성화시킬 수 있는 물질의 연구와 관련하여, 본 발명자들은 APTT 테스트에서 현재 응고 활성제로 사용되는 화합물, 특히 갈산을 출발물질로 하는 화합물에 비하여 이로운 용해도 특성을 갖는 화합물을 연구해 왔고, 이들은 내인성 응고를 활성화시킬 수 있는 유도체를 연구해 왔다.
본 발명의 영역에 관계되지 않은 영역에서, 특허 출원 DE 27 50 560 A1에서는 갈산이 에틸렌 글리콜 또는 각종 폴리에틸렌 글리콜과 에스테르화 반응하여 얻은 에스테르를 개시한다. 이 에스테르는 콘크리트를 포함하는 합성물에 포함되는 유리 섬유에 대한 보호 물질로서 사용된다.
식료품중에서의 지방 및 오일의 열화를 방지하고자 사용하는 산화방지제 화합물의 다른 분야에서, Weetall H.H(Applied Biochemistry and biotechnology 11권, 1985)에서는 특별한 알콜 및 디올을 사용하여 갈산으로부터 에스테르를 합성하는 것을 제안한다. 이 문헌에는 에스테르 및 디올 에스테르가 아스페르질루스 니거(Aspergillus niger)로부터 탄닌산 분해 효소를 사용하여 실제 합성되는 경우, 산물의 특정 성질이 측정되도록 유지된다는 것을 상세히 설명한다.
해당 시약은 응혈 촉진성 활성을 가질 수 있는, 즉 PF3 및 칼슘의 존재하에서 37℃에 혈장 샘플을 항온 처리한 후, 인자 XII를 활성화 인자 XIIa로 활성화시킬 수 있는 내인성 응고 경로를 위한 접촉 활성제이다.
화합물은 가용성이거나, 필요한 경우 변경하여 가용성으로 될 수 있는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다.
상기 화학식에서,
ㆍA는또는에서 선택되고, 여기서, Mq+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
ㆍR은(여기서, m은 2, 3, 4 또는 5이고 n은 1~170의 정수임) 또는 -AA1-AA2-.........-AAr(여기서, AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수임)를 나타낸다.
상기 정의된 화합물의 특정예에서, 본 발명은 특히 수용액에 용해될 수 있는 이점을 가진 화합물에 관한 것이다. 이것들은 완전 용해되는 것이 바람직하다.
상기에 정의된 R에 의해 구성되는 측쇄는 n의 값이 1 이상 170 미만 사이에 있는 바람직한 것을 말한다. 특히, n은 바람직하게는 1~50의 범위, 예를 들면 1~30의 범위, 이롭게는 1~20의 범위에 있는 것이 바람직하다.
특히, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 바람직한 화합물의 한 군은 하기 화학식 II으로서 정의된다.
상기 화학식에서,
R은(여기서, m은 2, 3, 4 또는 5이고 n은 1~170의 정수임) 또는 -AA1-AA2-.........-AAr(여기서, AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수임)를 나타낸다.
본 발명의 첫번째 바람직한 구체예에서, 상기 화학식 I 또는 II중의 한가지에서, R은을 나타내고, 여기서 m 및 n은 상기 정의된 것과 같다.
이롭게도, 본 발명의 명세서에서 화학식 II의 화합물은 R이 -[-O-CH2-CH2-]n-OH를 나타내는 것이고, 여기서, n은 1~170, 바람직하게는 1~10의 정수이다.
본 발명의 화합물 II의 바람직한 형태는 폴리에틸렌 글리콜 갈레이트의 산화 형태에 해당한다.
이 산화 형태는 화학식 II에 존재하는 방향족 고리의 -OH 기중 하나의 알카리성 매질에서 산화하여 생성되는 퀴논 형태이다.
추가예에서, 또한 본 발명의 화합물은 본 발명의 명세서에 정의된 1가 또는 2가 양이온과 결합한 화학식 III의 이온화 형태에 해당하는 하기 화학식의 부류에 의해 구성될 수 있다.
상기 화학식에서, R은을 나타내고, 여기서 m은 2, 3, 4 또는 5이고, n은 1~170의 정수이고, Mq+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이다.
4 위치에서의 퀴논 이외에, 화학식 III의 본 발명의 화합물의 이 두번째 특정 예는 매질의 pH가 pKa 보다 큰 경우에 형성되는 이온화 형태(나트륨 알콜레이트)에서 2개의 -OH 작용기(3- 및 5-위치임)를 포함한다.
특히, 본 발명은 염기성 형태에서 산화된 모노에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜의 갈레이트에 관한 것이고, 상기 화합물은 알카리성 매질에서 양이온과 결합된 것이다.
이것은 R이 상기 정의된 것과 같고, m=2 및 n=1인 에틸렌 글리콜 갈레이트의 염기성 형태인 것이 바람직하다.
산화된 에틸렌 갈레이트의 염기성 형태는 수용성이다.
사용할 수 있기 위해서, 얻은 조성물의 pH는 생리학적 허용값으로 감소되어야 한다. 생리학적 pH에서 퀴논의 나트륨 형태(화학식 III) 쪽으로의 평형의 이동은 여기에 직접 응고 특성을 주는 양이온을 첨가하여 가속 및 안정화될 수 있다.
상술된 화학식 I의 화합물에 대해, 본 발명은 이롭게도 하기 화학식 I로 정의된 화합물을 제공한다.
화학식 I
상기 화학식에서,
ㆍA는이고,
ㆍR은 -CH2-CH2-OH이며,
Mq+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
이 화합물들은 각각 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 산성 형태 및 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 염기성 형태 또는 염 형태이다.
염기성 퀴논염 형태는 355 nm의 파장에서 검출할 수 있는 노란색에 의해 특징되어 지고, 수성 매질에서의 가용성으로 인해 특히 이롭다.
상술된 바와 같이 본 발명의 화합물을 제조하기 위해 하기 페이지에서 양이온 Mq+는 금속 양이온, 특히 Mn2+또는 Cu2+또는 Co2+인 것이 이롭다.
또는, 이 양이온은 본 발명의 화합물의 제조 동안 알카리성 매질에서 가열하여 제공되는 반대 이온 등의 비금속 양이온으로 구성될 수 있다. 이 제조 방법은 다음 페이지에서 정의되고, Mq+는 Na+, K+또는 NH4 +인 것이 이롭다.
양이온의 농도는 정상 참조 샘플에 대해 관찰되는 응고 시간의 함수로서 정의될 수 있다. 이 농도는 금속 양이온에 대해 5 마이크로몰(μM)에서 15 μM까지의 범위, 바람직하게는 약 10 μM인 것이 이롭다.
추가의 특정예에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물의 부류를 제공한다.
화학식 I
상기 화학식에서,
ㆍA는또는에서 선택되고, 여기서 Mq+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
ㆍR은 -[-NH-CH2-CH2-]n-NH2를 나타내며, n이 1~170의 정수이다.
특히, R의 정의에서 n은 1~50의 범위, 예를 들면 1~30의 범위, 이롭게는 1~20이다.
폴리에틸렌 디아민 갈레이트의 바람직한 형태는 방향족 고리상의 -OH기의 한개를 산화시켜서 발생하는 퀴논 형태이다. 이것은 하기 화학식과 일치한다.
상기 화학식에서, n은 1~170의 정수이고, 바람직하게는 1~50의 범위, 예를 들면 1~30의 범위, 이롭게는 1~20의 범위에 있다.
상기 화학식에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 같은 것이 특히 바람직하다.
이것은 에틸렌 디아민 갈레이트(n=1)인 것이 이롭다.
또한, 본 발명의 화합물은 단일 또는 2가 양이온, 특히 금속 양이온과 결합한 형태로 존재할 수 있다. 이 화합물은 하기 구조를 갖는다.
상기 화학식에서,
ㆍn은 1~170의 정수이고,
ㆍMq+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이다.
특히, n은 1~50의 범위, 예를 들면 1~30의 범위, 이롭게는 1에서 20 사이에있다.
특히, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인 것이 바람직하다.
세번째 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 I으로 특징되어 지는 화합물을 제공한다.
화학식 I
상기 화학식에서,
ㆍA는또는에서 선택되고, 여기서, Mq+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
ㆍR은 아미노산 잔기 또는 펩티드이다.
본 발명의 첫번째 2개의 구체예에서 표시된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 방향족 고리상에 -OH 기중의 하나의 산화에 따라 발생하는인퀴논 형태 또는, 1가 또는 2가 양이온과 결합한(여기서, M, q 및 p는 상기 정의를 갖음)인 형태로 존재한다.
상기 화합물을 제조하는 바람직한 아미노산은인 세린이다.
이 경우에, 본 발명의 화합물은(여기서, M, q 및 p는 상기 정의를 갖음)를 갖는 것이 이롭다.
또한, 본 발명은 동일한 족 또는 동일한 군에서 선택된 화합물이거나, 대조적으로 상기 정의된 다른 부류 또는 군에 속하는 화합물인지에 상관 없이, 다수의 화합물의 혼합물, 특히 상기 정의한 것으로부터 선택되는 2 이상의 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
특히, 조성물은 하기 화학식 I의 2 이상의 기타의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
화학식 I
이 화합물은 기 A에 대해 동일하거나 상이하고, 기 R에 대해 동일하거나 상이하고, A 및 R은 상기 정의된 바와 같다.
바람직하게, 본 발명은 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트(EGGox)의 산성 및 염기성 형태를 각각 구성하는 하기 화학식 IV 및 V의 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
상기 화학식에서, M, q 및 p는 상기 정의된 정의를 갖는다.
따라서, 이 조성물은 알카리성 매질에서 가열되거나, 금속 양이온이 존재하게 되는 경우, 에틸렌 글리콜 갈레이트로부터 얻은 케토-에놀 평형의 산물에 해당하는 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 산성 및 염기성 형태의 혼합물을 포함한다.
산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 산성 및 염기성 형태 사이의 평형은 반응조건을 조절하여, 특히 pH, 또는 반응 매질에 존재하는 양이온의 농도를 변경하여 이들의 형태의 한쪽 또는 다른 쪽으로 이동시킬 수 있다.
이롭게도, 정의된 조성물은 용액, 바람직하게는 수용액인 것을 특징으로 한다.
특정예에서, 상기 정의 내용에서의 본 발명은 화학식 V의 염기성 형태, 즉 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트가 우세하게 되는 조성물에 관한 것이다.
이 수용성 염기성 형태는 내인성 응고, 특히 내인성 응고를 검사하는 시험관내 테스트를 수행하기 위한 활성화 조성물을 구성하는 것에 관하여 매우 이로운 특성을 갖는다.
본 발명의 특별한 구체예에서, 상기 정의중 한가지를 갖는 조성물은 생리학적 허용 가능한 알카리성 pH를 갖는다. 이 pH는 EGG를 산화시킨 후 예를 들면, 완충 용액 분자 {MOPS [(N-모르폴리노)프로판설폰산] 또는 TRICINE [N-트리스(히드록시메틸)메틸-글리신], 바람직하게는 MOPS 분자가 선택됨}의 존재하에서 조정된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 조성물은 케토-에놀 평형에 의해 생성되고, 하기 화학식을 갖는 갈레이트의 여러 형태들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, M, q 및 p는 상기 주어진 정의 중에 하나를 갖는다.
갈산 에스테르의 에놀레이트의 하나 또는 기타의 것의 형태의 존재는 반응 조건에 따라 다르기 때문에, 케토-에놀 평형을 이동시켜서 제조된 갈레이트 형태중 하나를 보다 많거나, 보다 적은 양으로 얻을 수 있다.
본 발명의 명세서내에서, 화학식 V를 갖는 산화된 갈레이트의 염기성 형태의 존재를 우세하게 하는 경향이 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 화합물 및 조성물은
ㆍ에틸렌 글리콜을 사용하여 갈산을 에스테르화하고, 하기 화학식의 에틸렌 글리콜 갈레이트(EGG)로 구성되는 반응 산물중 하나를 회수하는 단계,
ㆍEGG를 알카리성 매질과 접촉시키고, 70℃~90℃의 범위의 온도까지 가열하여 케토-에놀 평형을 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 수행하여 정의될 수 있다.
케토-에놀 평형 형성 반응은 80℃에서 24 시간 동안 수행되는 것이 이롭다.
상기 방법을 사용하여 산화된 형태 쪽으로 이동한 혼합물인 3개의 갈레이트 형태의 혼합물이 생성된다.
얻은 조성물은
ㆍpH를 조절하여 얻은 케토-에놀 평형을 안정화시키는 단계,
ㆍ알카리성의 pH의 상태에서 용액내에서 화학식 IV 및 V의 화합물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
EGG의 산화된 형태는 수산화나트륨, 특히 과량의 수산화나트륨의 존재하에서 형성되어, 케토-에놀 평형을 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 염기성 형태쪽으로 이동시킨다. 열처리는 70℃~90℃의 범위의 온도, 바람직하게는 80℃의 온도에서 24 시간 동안 수행된다.
용액의 pH는 알카리성의 pH이고, 수산화나트륨의 작용은 얻은 케토-에놀 평형을 안정화시키는데에 기여하는 완충 용액을 첨가함으로써 정지될 수 있다. 본 발명의 조성물의 pH는 7.6~7.8인 것이 특히 바람직하다.
예를 들면, 첨가된 완충 용액은 MOPS 또는 TRIS 완충 용액일 수 있다.
조성물은 100 μM~1000 μM의 범위의 농도로 본 발명의 화합물을 함유한다.
본 발명의 명세서에 정의된 조성물 및 화합물은 혈장 샘플과 접하여 내인성 응고를 활성화시킬 수 있다. 다시 말하면, 이들은 약 37℃의 온도에서 PF3 및 칼슘의 존재하에서 혈장 샘플과 접촉되고 항온 처리된 후, 인자 XII를 인자 XIIa로 활성화시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 혈액 샘플에서 내인성 응고의 시험관내 검사에 사용되는, 시약중에 상기 정의된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 포함하는 시약의 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 시약은 하기 화학식의 활성화된 형태에서 갈산(갈레이트)의 염을 포함한다.
상기 화학식에서, M, q 및 p는 상기 정의된 바와 같고,
R은(여기서, m은 2, 3, 4 또는 5이고, n은 1~170의 정수임) 또는 -AA1-AA2-.........AAr(여기서, AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수임)를 나타낸다.
특히, R의 정의의 내용의 범위내에서 n은 바람직하게는 1~50의 범위, 예를 들면 1~30의 범위, 이롭게는 1~20의 범위에 있는 것이 이롭다.
상기 화학식에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 같은 것이 특히 이롭다.
본 발명의 화합물의 농도를 결정하는 것은, APTT 시스템에서 건강한 피실험자의 혈장에 대한 예상 응고 시간이 일반적으로 28 초~40 초라는 사실을 고려한다. 이 명세서에서, 응고 테스트에 사용되는 본 발명의 화합물 및 기타의 구성 요소의 농도는 건강한 혈장의 샘플에 대한 소정 응고 시간으로 정의될 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물의 농도는 100 μM~1000 μM가 될 수 있다.
시약의 주 구성 요소의 농도를 최적화하는 것은 30명 이상의 건강한 피실험자에게서 얻은 혈장 샘플의 범위에 대한 이 간격내의 응고 시간을 얻고자하는 것이라 할 수 있다.
또한, APTT 시약의 활성 원칙에 입각한 생화학 매개 변수를 최적화하여 시간이 연장되도록 할 수 있고, 이에 의해 APTT 테스트에 의해 나타나는 특정 질병에 대한 검출 민감도를 조절한다. 따라서, 예를 들면 20% 이상의 건강한 표준 피실험자에 대한 시간의 연장은 루프스 항응고 증후군의 경우에 나타난다. 비분류된 헤파린 항응고제로 처치된 피실험자에서의 혈장의 경우, 시간 연장은 표준 시간의 1.5~3.0 배의 비율에 이르는 것으로 나타난다. A 형 및 B 형 혈우병에 대해서는, 가장 높을 수 있는 민감도가 요구되고, 큰 시간 연장이 요구된다.
이렇게 구성된 시약은 활성화 에틸렌 글리콜 갈레이트를 포함하는 것이 바람직하다. 얻은 케토-에놀 평형 및 생리학적 허용 가능한 pH에서의 안정화로 인해 활성이 생긴다.
본 발명의 특별예에서, 기재된 조성물 또는 시약 시스템에서 갈레이트, 특히 에틸렌 글리콜 갈레이트에서의 농도는 100 μM~1000 μM의 범위, 바람직하게는 100 μM인 것이 이롭다.
또한, 본 발명은 내인성 응고를 검사하는, 특히 APTT 테스트를 수행하는 시약의 제조를 위한, 상기 정의된 것 중 임의의 화합물 또는 임의의 조성물에 관한 것이다. 여기서, 상기 화합물 또는 조성물은 본 발명의 화합물 또는 조성물의 반응의 민감도를 조절하는 활성을 갖는 구성 요소와 관련이 있다.
민감도의 조절은, 루프스 항응고의 유형의 병변에 의해 감염된 환자 또는 예를 들면 비분류된 헤파린 항응고제를 기준으로 항응고 기재로 치료받은 환자에서 얻은 혈장의 샘플상에서 관찰되는 응고 시간의 연장의 축소에 있을 수 있다.
선택적으로, 이 민감도의 조절은 비-병리학적 혈장 샘플상에서 측정된 응고 시간의 감소로 이루어질 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 조성물을 사용하여 제조되는 시약의 민감성을 조절하는데에 적합한 이 구성 요소로는 폴리아미노산, 특히 치환된 폴리아미노산, 특히 치환은 숙시닐(-CO-CH2-CH2COOH)기 또는 글루타릴(-OC(CH2)3CO)기로 치환된 아미노기와 관련되어 부분적으로 치환된 것이다.
치환은 치환된 폴리아미노산이 민감도에 대해 더 이상 조절 결과를 달성할 수 없는 조건에서 초기 구성성분의 공간 형태 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않아야 한다.
이러한 이유로, 완전 치환된 폴리아미노산은 선험적으로 편리하지 않다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 조절 성분은 치환된 폴리리신(D- 또는 L- 폴리리신 또는 이의 혼합물), 특히 숙시닐화된 것이고, 예를 들면 이것은 치환된 L-폴리리신, 이롭게는 숙시닐화된 L-폴리리신이다. 특히, 본 발명자는 시그마(SIGNMA) 카탈로그(2001~2002)에서 시판되는 숙시닐화된 L-폴리리신을 사용했다. 또한, 글루타릴화된 폴리리신도 사용될 수 있다.
이롭게도, 숙시닐화된 L-폴리리신은 20,000~300,000 Da의 범위, 바람직하게는 50,000~300,000 Da의 범위의 분자량을 가진 것으로 사용될 수 있다.
APTT 테스트를 수행하기 위해 제조되는 시약에서 조절 성분의 농도와, 특히 숙시닐화된 L-폴리리신(시그마)의 농도는 10~100 ㎍/ml의 범위, 바람직하게는 50~100 ㎍/ml내에 있다.
치환된 폴리아미노산, 특히 숙시닐화된 폴리리신은 APTT 등의 내인성 응고의 검사를 위한 테스트에 사용되는 시약을 제조하는 동안 임의의 시간에 첨가될 수 있다.
내인성 응고에 대한 접촉 활성제 이외에, 본 발명의 시약 시스템은 혈소판 막에서 인지질에 대한 대체물을 포함한다. 이 대체물은 포유 동물의 뇌에서 추출된 인지질의 현탁액인 세팔린일 수 있다.
또한, 본 발명은 기타의 시약과는 별도의 형태로, 내인성 경로에 관련된 인자의 활성화를 개시하는 Ca2+이온을 함유하는 시약 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 시약 및, 적절하게는 APTT 테스트를 수행하기 위해 사용되는 다른 구성 요소는 키트에 배치될 수 있다.
응고 및 특히 내인성 응고를 검사하기 위한 본 발명의 화합물, 조성물 또는 시약은 혈액 샘플에 대한, 특히 혈장 샘플에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 측정하는데에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 출원인은 이롭게도 혈소판 결핍 혈장을 사용하였다.
이 측정의 범위에서, 이 테스트를 수행하는 정상 조건은 특히 샘플 제조에 관한 것이다.
예를 들면 샘플이 더이상 응고되지 않도록 샘플내에 함유된 Ca2+이온과 착체를 형성하기 위해 혈장 샘플을 초기에 구연산염으로 처리한다.
그 다음, 샘플은 응고 활성제인 본 발명의 화합물 또는 조성물 및 인지질 대체물을 사용하여 항온 처리된다. 그 다음 Ca2+이온은 착체되어 응고를 개시시키는 것과 동일한 양으로 첨가된다.
본 발명의 화합물 또는 조성물의 활성은 이들의 pH가 생리학적 허용값인 것이 요구된다.
또한, 본 발명의 화합물, 조성물 또는 시약은 전혈의 응고 시간 또는 혈장의 응고 시간을 측정하는데에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 내인성 응고 경로에 관련된 응고 인자를 검사하는 시약의 시스템의 제조에 대해 상기 기재된 것에 해당하는 화합물 또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 관련 인자는 원칙적으로 인자 XII, XI, IX 및 VIII이다.
이러한 관계에서, 본 발명은, 예를 들면 빌레브란트 병, 혈우병 A 및 B 또는 항응고제의 검출에 관계가 있는 이형의 검출에 관한 것이다. 이러한 이형은 APTT 시간이 정상치 범위 밖에 해당하는 데, 이러한 정상치는 20 초 및 40 초 사이이다.
따라서, 본 발명은
ㆍ내인성 응고 경로를 활성화할 수 있는 조건하에서, 혈소판 막의 인지질의 대체물의 존재하에서 혈소판 결핍 혈장 샘플을 본 발명에 의한 화합물 또는 조성물과 접촉시키는 단계,
ㆍ혈장 샘플에서 착체된 이 이온의 양과 동일량의 Ca2+이온을 첨가하는 단계,
ㆍ피브리노겐을 피브린으로 변형시키는데 필요한 시간을 측정하는 단계를 포함하는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
특히, 상기 방법을 수행하는 방법에서, 혈장 샘플은 혈소판 결핍 혈장으로 구성되고, 응고 활성제는 혈장과 함께 37℃에서 약 2~5 분 동안 항온 처리된다. 인지질 막 대체물은 반응의 개시에서 첨가될 수 있거나, 활성제와 혼합될 수 있거나, 반응 동안 개별적으로 첨가될 수 있다.
이 때, 예를 들면, 20 mM~25 mM의 범위의 농도에서 염화칼슘의 형태로 칼슘 이온이 첨가된다. 피브린 형성에 필요한 시간을 측정한다.
정상 응고 상태에 해당하는 시간 간격(즉, 20 초 및 40 초 사이임)을 벗어난 경우, 측정된 시간은 내인성 응고 경로의 매개 변수중 하나가 부재인 것을 비롯하여, 비정상적인 양으로 존재하거나, 항응고 화합물이 테스트 혈장내에 존재한다는 것을 나타낸다.
테스트 혈장은 내인성 응고 경로에 대한 인자를 비정상 양으로 포함하는 경우, 본 발명은 해당 인자가 결핍된 시스템을 사용하여 해당 인자의 정량 분석을 수행할 수 있으며, 이 시스템에서 기타의 모든 매개변수는 과량으로 주입한다. 이 시스템에서, 연구하고자 하는 혈장을 첨가한 후에, 분석되는 인자만이 제한량으로 존재한다.
또한, 본 발명은
ㆍ1 이상의 알콜 작용기를 함유하는 화합물의 존재하에서 갈산을 에스테르화하거나, 1 이상의 아민 작용기를 함유하는 화합물의 존재하에서 갈산을 아미드화시키는 단계,
ㆍ얻은 갈산 유도체를 OH-이온과 접촉시켜서 하기 화학식 II의 화합물을 형성시키는 단계,
ㆍ하기 화학식 III의 착체를 형성할 수 있는 조건하에서, 금속 양이온 Mq+(여기서, q는 1 또는 2임)을 첨가하는 단계,
ㆍMOPS 또는 TRICINE 등의 완충 용액을 첨가하여 생리학적 허용 가능한 pH에서 화합물 II 및 III 사이에서 얻은 평형을 안정화시키는 단계,
ㆍ얻은 용액을 회수하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
화학식 I
화학식 II
화학식 III
상기 화학식에서,
ㆍA는또는에서 선택되고, 여기서, Mq+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
ㆍR은(여기서, m은 2, 3, 4 또는 5이고, n은 1~170의 정수임) 또는 -AA1-AA2-..........-AAr(여기서, AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수임)을 나타낸다.
이 방법은 에틸렌 글리콜의 존재하에서 에스테르화 반응을 수행하여 에틸렌 글리콜 갈레이트를 형성하는 것이 바람직하고, 이에 의해 반응이 완결된 경우, 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 산성 및 염기성 형태와 필요한 경우 에틸렌 글리콜 갈레이트의 잔량을 특히 함유하는 케토-에놀 평형의 산물을 회수하게 된다.
이러한 방법에서의 정의는 본 발명의 화합물 또는 조성물의 바람직한 부류 또는 군의 정의를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 이것은 원칙적으로 화학식 V의 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트의 염기성 형태를 회수하는 것이 바람직할 수 있고, 이를 위하여 이것은 이 염기성 형태 쪽으로 평형을 이동시키는 것이 이로울 수 있다.
추가의 방법은 내인성 응고 활성화 특성을 갖는 본 발명에 의한 화학식 A의 화합물을 제조에 대해 본 발명자에 의해서 개발되었다. 이 방법은
ㆍ갈산을 에스테르화하는 단계,
ㆍ얻은 갈산을 70℃~90℃의 범위, 바람직하게는 80℃까지의 범위의 온도로 16~24 시간의 범위, 바람직하게는 24 시간 동안 완충 용액 내에 알카리성 pH에서 가열하는 단계,
ㆍ용액내에 존재하는 갈산 에스테르의 다른 형태를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 기타의 특징 및 이점은 본 발명의 주요 물질의 바람직한 구체예 및 실행예를 구성하는 하기의 실시예로부터 분명해진다.
실시예 1
이 실시예에서, 다양한 양이온을 사용하여 본 발명에 따라 제조된 APTT 시약을 사용하여 응고 시간을 측정한다. 기타의 유형의 혈장을 테스트하고, 정상 및 질병을 나타내는 것 모두를 APTT 테스트에 의해서 판명하였다.
ㆍCK-Prest = 접촉 활성제가 카올린인 표준 APTT 시약
ㆍ풀(pool) N = 건강한 피실험자에서 유래하는 혈장의 등가량의 혼합물
ㆍCCN = 응고 제어 정상: 대조용 혈장, 정상 수준
ㆍCCP = 응고 제어 병변: 대조용 혈장, 질병 수준
ㆍ헤파린 = 나트륨 또는 칼슘 염의 형태로 비분류된 헤파린을 기준으로 항응고 처리를 받은 환자에서 나온 혈장
ㆍ루프스 = 루프스 항응고 증후군을 나타내는 환자에서 나온 혈장
ㆍdef.f VIIIc = f VIIIc 결핍(혈우병 A)을 나타내는 환자에서 나온 혈장
이것은 지혈 장치(STA-Diagnostica Stago)를 사용하여 측정한다.
응고 시간(초)
양이온 대조용 혈장 헤파린 루프스 F VIII 결핍
Pool N1098 CCN CCP 배취1635 배취1726 배취021 16%
Cu 36.3 41.7 69.7 45.1 57.2 63.1 50.0
Mn 37.8 34.2 54.9 73.1 51.0 63.6 52.4
Co 97.6 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Cd 114.6 137.2 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Ni 120.8 137.3 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Cs 121.0 122.5 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Sr 125.6 130.9 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Zn 127.6 >140.0 >140.0 >129.1 >140.0 >140.0 >140.0
Cr >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Fe 112.3 132.7 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
Mo 120.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0
표준:CK-Prest 30.4 30.9 52.7 60.2 130.8 45.5 45.9
실시예 2
이 실시예에서, 각종 혈장에 대한 응고 시간은 갈산의 아미드 또는 에스테르로부터 얻은 APTT 시약에서 측정된다.
ㆍ정상 혈장 = 정상 피실험자에게서 얻은 혈장의 등가량의 풀
ㆍCCN = 응고 제어 정상: 대조용 혈장, 정상 수준
ㆍCCP = 응고 제어 병변: 대조용 혈장, 질병 수준
ㆍ헤파린 = 나트륨 또는 칼슘 염의 형태로 비분류된 헤파린을 기준으로 항응고 처리를 받은 환자에서 나온 혈장
ㆍ루프스 = 루프스 항응고 증후군을 나타내는 환자에서 나온 혈장
ㆍdef.f VIIIc = f VIIIc 결핍(혈우병 A)을 나타내는 환자에서 나온 혈장
자동 지혈 장치(STA-Diagnostica Stago)를 사용하여 얻은 응고 시간(초)
갈산 유도체 정상 및 제어 헤파린 루프스 fVII결핍
아미드 n [μM] 풀 N LIK 800 CCN CCP 배취1706 배취0811 배취021 25%
H2N-(CH2)n-NH2 2 100 111.5 138.1 177.9 228.4 >300.0 167.6 113.0
이중 아미드 갈레이트 3 100 110.9 119.3 177.9 243.9 >300.0 155.8 111.3
2 100 148.2 170.6 203.8 - >300.0 >300.0 128.5
H2N-CH-(CH2OH)-COOH - 100 245.0 210.9 189.3 - >300.0 232.6 153.0
에스테르
HOCH2-CH2-OH 100 37.4 32.7 50.5 65.7 112.5 45.7 35.6
표준 - - 33.9 33.7 49.3 66.9 61.1 35.9 40.5
상기 표를 통해서, 표준 시약, CK-Prest를 사용하여 얻은 결과에 가장 가까운 것은 에틸렌 글리콜 갈레이트를 사용하여 얻은 것이라는 것을 알 수 있다.
실시예 3
80℃에서 24 시간 동안 가열한 후, pH 7.00으로 완충된 500 μM의 에틸렌 글리콜 갈레이트 용액은 APTT 응고 테스트에서 활성을 띠었다. 하기 표 3은 분자의 활성화 운동을 나타낸다.
에틸렌 글리콜 갈레이트 용액의 응혈 촉진 활성을 표준 시약(CK-PREST, 활성제가 카올린인 APTT 시약)의 응혈 촉진 활성과 비교하였다. 응고 시간의 측정에 사용되는 장치는 자동 STA Diagnostica Stago 지혈 장치(시리즈 n°307)를 사용하였다.
응고 활성이 나타남과 동시에 355 nm에서 노란색이 나타났다.
테스트 혈장은 성질 대조용 혈장이다.
CCN = 응고 제어 정상; CCP = 응고 제어 병변, 배취 n°980901
제조된 APTT 시약 = 에틸렌 글리콜 갈레이트, 500 μM, 80℃에서 산화됨 + 트리신, 50 mM, pH 7.00 + 세팔린(혈소판 인지질에 대한 대체물)
응고 시간(초)
80℃에서의 가열시간 표준:CK PREST APTT-에틸렌 글리콜 갈레이트
CCN CCP CCN CCP OD(355 nm)
T0 - - >140.0 >140.0 0.102
T1h 34.9 49.2 >140.0 >140.0 0.223
T2h 35.3 49.1 >140.0 >140.0 0.356
T3h 35.1 48.4 >140.0 >140.0 0.573
T4h 34.8 49.5 >140.0 >140.0 0.792
T5h 35.0 50.1 136.9 134.8 0.966
T6h 35.1 48.4 118.4 118.5 1.155
T7h 35.1 48.2 108.2 110.4 1.308
T8h 35.7 47.8 94.9 100.2 1.458
T9h 35.0 48.2 88.8 95.1 1.563
T10h 35.0 48.4 81.4 87.9 1.650
T11h 35.3 48.3 71.3 80.7 1.754
T12h 35.0 48.6 65.7 75.5 1.859
T13h 34.7 48.4 61.6 71.0 1.926
T14h 35.1 48.8 55.0 66.3 2.028
T26h 35.2 49.1 37.6 54.4 2.616
T27h 35.0 49.5 36.3 53.5 2.712
T28h 35.0 47.9 35.6 53.7 2.720
T30h 35.0 48.3 35.8 54.1 2.766
T34h 35.1 49.5 34.5 52.5 2.750
실시예 4
보통 생물계에서 사용되는 것으로부터 선택된 각종 완충 분자들은 적절한 가열 시간(<4 일) 동안 표준 시약(CK-PREST)의 응혈 촉진 활성에 가까운 상당한 응혈 촉진 활성을 생성한다. 이것들은 하기 분자들이다.
ㆍTRINCINE: N-트리스(히드록시메틸)메틸 글리신
ㆍHEPES: N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산
ㆍMOPS: (N-모르폴리노)프로판설폰산
ㆍTRIS: [트리스-(히드록시메틸)아미노메탄]
TRIS를 사용하는 경우 에틸렌 글리콜 갈레이트의 활성화동안 침전물이 생성되고, HEPES 완충 용액을 사용하는 경우 장시간 가열해야 하기 때문에, TRICINE 및 MOPS 완충 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 하기 표 4에서는 2개의 대조용 혈장(정상 및 병변), 건강한 제공자로부터 얻은 1개의 혈장 풀 및 APTT 응고 시스템에서 검출 가능한 질환을 나타내는 4개의 혈장에 대해 얻은 성능을 나타낸다.
ㆍ풀 N = 다수의 정상 혈장의 풀
ㆍCCN = 응고 제어 정상: 대조용 혈장, 정상 수준
ㆍCCP = 응고 제어 병변: 대조용 혈장, 병변 수준
ㆍLA: 루푸스 항응고 증후군을 나타내는 환자에서 얻은 혈장
ㆍHep = 칼슘 염의 형태에서 비분류된 헤파린을 기준으로 항응고 처리를 받은 환자에서 얻은 혈장. 2 수준의 헤파린혈증을 갖는 2개의 혈장을 테스트한다: 0.09 및 0.034 IU/ml
ㆍdef.f VIIIc = 40% 인자 VIIIc 활성을 갖는 혈우병 A에서의 혈장
얻은 응고 시간은 초로 나타낸다.
4개의 완충 용액을 사용하여 제조된 각각의 시약을 사용하여 얻은 반응 민감도는 환자의 혈장에 대하여 얻은 응고 시간을 정상 풀에서 얻은 응고 시간으로 나누거나, 병리학적 응고 제어(CCP)를 정상 제어(CCN)의 시간으로 나누어서 나타낸다.
응고 시간(초)
혈장 표준 CK-Prest배취n°980201 APTT-에틸렌 글리콜 갈레이트
TRICINE HEPES MOPS TRIS
PN (배취 n°10-98) Sec R Sec R Sec R Sec R Sec R
30.5 = 39.4 - 35.6 - 37.0 - 32.3 -
CCN (배취 n°972751) 31.5 - 38.7 - 33.5 - 35.4 - 31.9 -
CCP (배취 n°972751) 52.3 1.66 56.8 1.47 52.0 1.46 56.5 1.60 72.1 2.26
LA (배취 n°MA221) 45.6 1.50 76.3 1.94 64.6 1.81 67.7 1.83 58.8 1.82
Hep, (0.09 IU/ml) 59.6 1.95 49.5 1.26 48.7 1.37 52.5 1.42 55.2 1.71
Hep, (0.34 IU/ml) 117.4 3.85 67.1 1.70 71.7 2.01 81.4 2.20 107.3 3.32
Def. VIIIc(40%) 45.9 1.50 55.1 1.40 51.0 1.43 53.4 1.44 48.3 1.50
실시예 5
APTT 시약의 용도는 두가지 목적을 가질 수 있다.
ㆍ정상-비정상 반응을 갖는 내인성 혈액 응고 경로의 일반적 검사;
ㆍ내인성 응고 경로에 관련된 응고 인자(f XII-XI-IX-VIIIc)의 분석적 및 정량적 검사;
ㆍ응고 인자내에서 특별하게 결핍된 시스템을 사용하여 내인성 경로에서 임의의 응고 인자를 환자의 혈장내에서 분석하는 것이 가능하다. 모든 기타의 매개 변수는 과량으로 주입하였다. 분석되는 인자만이 제한량으로 존재한다. 이 인자의 활성은 동일한 조건하에서 제조된 보정 곡선과 비교한 후 양을 정하였다. 결핍의 크기에 따라, 응고 시간은 다소 연장되었다.(인자 VIIIc에 대한 예를 참조)
자동화 지혈 장치(STA Diagnostica Stago)를 사용하여 얻은 응고 시간(초)
VIIIc의 양(%) 표준:CK PREST 배취n°991621 APTT-에틸렌 글리콜 갈레이트
0 88.2 92.9
12 43.4 51.1
23 39.4 45.8
35 36.8 42.3
47 34.7 40.3
59 33.6 38.8
70 32.6 37.8
82 31.6 36.3
94 30.6 35.4
105 30.0 34.7
117 29.7 34.0
실시예 6
APTT 시약의 응고 활성은 두가지 활성 원칙의 병합 작용이 필요하다.
ㆍ분자가 내인성 경로의 접촉상을 활성화시키는 것. 사실, 이것은 80℃까지 가열되어 활성화된 에틸렌 글리콜 갈레이트이다.
ㆍ토끼뇌를 클로로포름으로 추출하여 얻은 혈소판 막, 세팔린의 인지질의 대체물
따라서, 구성된 APTT 시약의 최적 활성은 에틸렌 글리콜 갈레이트 및 세팔린의 농도에 따른다.
하기 표 6은 여러 질환 및 몇가지 대조예에 대한 대표적인 혈장에 대해서 얻은 결과를 나타낸다.
에틸렌 글리콜 갈레이트 [μM] 응고 시간(초)
제어 배취 n°80901 혈장(LA)MA 030 혈장배취1635 헤파린배취 1726 혈장def fVIIc
정상 배취
0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 117.4
10 130.6 >140.0 >140.0 >140.0 >140.0 121.9
25 124.5 103.3 103.3 >140.0 >140.0 73.1
50 88.6 99.6 66.6 73.1 >140.0 44.8
75 46.5 67.4 50.4 48.3 86.6 38.6
100 38.4 46.2 47.5 48.0 80.0 38.2
200 35.2 42.5 46.7 48.5 75.4 37.7
300 34.3 39.6 44.2 47.7 73.7 37.5
400 32.9 39.6 43.4 47.0 75.1 37.2
500 32.6 48.5 43.0 47.3 76.1 37.5
1000 33.4 51.5 42.5 47.9 76.3 37.1
CK Prest 배취 n°981201 34.2 47.6 38.3 57.1 121.5 38.9
100 μM~1000 μM의 범위의 농도 사이에서 선택할 수 있다. 여기서, 바람직한 농도는 100 μM의 농도이다.
최적 세팔린 농도의 결정
자동 지혈 장치(STA Diagnostica Stago)를 사용하는 응고 시간(초)
출발 물질의 세팔린 희석 정상 pl. 풀 배취 05-99 LA 배취 n°MA 2623 혈장, 헤파린 배취 n°1680 f VIIIc 결핍 혈장 배취 GK903901
1:200 44.8 106.7 64.5 60.0
1:100 39.7 79.7 60.3 54.7
1:50 36.9 52.0 59.4 52.1
1:40 36.4 48.3 59.0 51.1
1.5:50 37.1 45.4 59.3 51.5
1:30 37.1 43.1 60.5 52.2
1:20 38.3 41.8 66.3 54.0
CK Prest 배취 n°981201 33.0 38.6 84.8 49.5
실시예 7: 염화망간의 농도 선택
이 실시예에서, 응고 시간은 본 발명에 따라 제조된 APTT 시약을 사용하여 염화망간의 농도를 변화시켜서 측정한다.
테스트 혈장은 성질 제어 혈장이다. 두 수준(정상 수준 및 병변 수준)이 사용되었다.
시판용의 CK Prest 시약을 동시에 테스트하고 표준으로 구성하였다.
자동 지혈 장치(STA Diagnostica Stago)를 사용하여 얻은 응고 시간(초)
혈장 샘플 MnCl2[μM]의 농도 CK-Prest(표준 시간)
0 1 2 10 20
정상 제어 144.2 50.8 40.7 34.8 41.6 31.8
병변 제어 125.9 51.6 48.2 49.5 56.1 49.7
10 μM의 농도를 사용하는 것이 바람직하다.
실시예 8
각종 병리학적 상태에서 관찰되는 응고 시간의 특정 이형에 대하여 APTT 시약의 반응의 민감도를 조절할 수 있다는 것은 이로울 수 있다. 이 조절은 반응의 민감도가 관계되는 한 특정 특징을 갖는 시약을 얻는 것을 목표로 하고, 이 특징은 제조 로트에서 다른 로트로 재현 가능하다.
본 발명자는 에틸렌 글리콜 갈레이트를 함유하는 APTT 시약에서 숙시닐화된 L-폴리리신(시그마)을 첨가한 경우, 루푸스 항응고 증후군 환자 또는 비분류된 헤파린을 기초한 항응고로 처리된 환자에서 얻은 혈장에서의 응고 시간을 줄일 수 있다는 것을 관찰했다. 또한, 숙시닐화된 L-폴리리신의 용도는 정상 집단에서 얻은 혈장에 대해 측정하여 응고 시간을 감소시키는 것으로 관찰되어 왔다.
시약의 민감도의 수준을 정의하기 위해서, 아미노기의 수준에서 숙시닐 또는 글루타릴기가 다소 치환된 폴리아미노산의 용도를 통해서 관찰할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예 중 하나는 부분적으로 치환된 L-폴리리신을 사용하는데에 있다. 하기 표 9 및 10은 실시예 내에서 사용되는 각종 대조용 혈장에서 얻은 결과를 요약한다.
CCN: 응고 제어 정상
CCP: 응고 제어 병변
풀 N: 다수의 정상 혈장의 풀
LA: 루프스 항응고 증후군이 나타나는 환자에서의 혈장
헤파린: 비분류된 헤파린을 기초하여 항응고 처리를 받은 환자에서의 혈장
Def VIII C: 40% 인자 VIII 활성을 갖는 혈우병 A 환자에서의 혈장
STA Diagnostica Stago 자동 장치로 측정한 응고 시간(초)
숙시닐화된 L-폴리리신-분자량:20,000~30,000 CK Prest 표준
[㎍/ml] 0.0 5.0 7.5 10.0
CCN 32.9 32.0 32.4 37.3 33.3
CCP 56.1 51.7 49.2 53.5 49.9
풀 N 38.2 35.8 34.9 34.5 34.1
LA 1 44.7 44.1 45.2 49.0 34.2
헤파린 1 153.7 105.2 92.7 94.3 89.6
Def. F.VIII:C 50.2 51.1 52.0 54.2 40.5
STA Diagnostica Stago 자동 장치로 측정한 응고 시간(초)
숙시닐화된 L-폴리리신-분자량:20,000~30,000 CK Prest표준
[㎍/ml] 0.0 7.5 50 100
CCN 34.5 32.3 30.7 30.1 32.6
CCP 55.2 54.0 52.9 53.4 48.2
풀 N 40.5 38.6 36.5 36.7 35.0
LA 2 57.7 51.3 50.1 51.6 56.2
헤파린 2 102.6 90.9 87.6 87.8 62.0
Def. F.VIII:C 51.1 50.0 46.8 47.1 39.8
본 발명의 범위내에서 숙시닐화된 L-폴리리신의 용도에 대해, 숙시닐화된 L-폴리리신의 분자량은 50,000~300,000 Da의 범위내에 있는 것이 바람직하고, 농도는 분자량의 범위에 대해 50 ㎍/ml인 것이 바람직하다.

Claims (42)

  1. 하기 화학식 I의 화합물.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    ㆍA는또는(여기서, Mq+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것임)에서 선택되고,
    ㆍR은(여기서 m은 2, 3, 4 또는 5이고, n은 1~170의 정수임) 또는 -AA1-AA2-........-AAr이고, 여기서 AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수이며,
    단, m이 2, 3 또는 4인 경우에 화합물은이 아니다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 II를 갖는 화합물.
    화학식 II
    상기 화학식에서, R은 -[-O-CH2-CH2-]n-OH이고, 여기서 n은 1~170의 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 III를 갖는 화합물.
    화학식 III
    상기 화학식에서,
    ㆍR은 -[-O-CH2-CH2-]n-OH이고, 여기서 n은 1~170의 정수이며,
    ㆍM+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 한다.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 화학식 II 또는 III를 갖는 화합물로서, 여기서 R은 -[-O-CH2-CH2-]n-OH이고, 여기서 n은 1~10의 정수인 것인 화합물
  5. 제4항에 있어서, n은 1인 것인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 I를 가진 화합물.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    ㆍA는이고, 여기서 M+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
    ㆍR은 -CH2-CH2-OH이다.
  7. 제1항에 있어서, 하기 화학식 I를 가진 화합물.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    ㆍA는이고, M+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이고,
    ㆍR은 천연 또는 외래 아미노산 잔기 또는 펩티드, 바람직하게는 세린이다.
  8. 하기 화학식 I를 갖는 2 이상의 다른 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물로서,
    화학식 I
    해당하는 두개의 화합물은 기 A에 대해 동일하거나 다르고, 기 R에 대해 동일하거나 다르고, 이러한 기 A 및 기 R은
    ㆍA가또는(여기서, M+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것임)에서 선택되고,
    ㆍR은(여기서 m은 2, 3, 4 또는 5이고, n은 1~170, 바람직하게는 1~50, 1~30 또는 1~20의 정수임) 또는 -AA1-AA2-........-AAr(여기서, AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수임)를 나타내도록 하는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 산화된 에틸렌 글리콜 갈레이트(EGGox)의 산성 및 염기성 형태를 각각 구성하는, 하기 화학식 IV 및 V의 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    화학식 IV
    화학식 V
    상기 화학식에서, M+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 한다.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 케토-에놀 평형에 의해서 생성되는 에틸렌 글리콜 갈레이트의 다른 형태를 포함하고, 하기 화학식 I를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    ㆍA는또는(여기서, M+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것임)에서 선택되며,
    ㆍR은 -CH2-CH2-OH이다.
  11. ㆍ갈산을 에틸렌 글리콜로 에스테르화하고, 하기 화학식 VII를 가진 에틸렌 글리콜 갈레이트(EGG)로 구성된 반응 산물 중 하나를 회수하는 단계,
    화학식 VII
    ㆍEGG와 알카리성의 매질을 접촉시켜서 케토-에놀 평형을 이동시키는 단계 및 70℃~90℃ 범위의 온도로 24 시간 동안 가열하는 단계를 포함하는 방법을 수행하여 얻어질 수 있는 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 방법이
    ㆍpH를 조정하여 얻은 케토-에놀 평형을 안정화시키는 단계,
    ㆍ알카리성의 pH에서 용액중의 화학식 IV 및 V의 화합물을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. ㆍ갈산을 에스테르화하는 단계,
    ㆍ얻은 갈산 에스테르를 완충 용액중에서 알카리성의 pH에서 16~24 시간 동안 70℃~90℃의 범위의 온도로 가열하는 단계,
    ㆍ용액내에 존재하는 갈산 에스테르의 다른 형태를 회수하는 단계를 수행하여 얻을 수 있는 화합물.
  14. 제1항 내지 제7항, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액의 형태에 있는 것인 화합물.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 얻을 수 있는 화합물의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 V를 갖는 염기성 EGGox를 주로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    화학식 V
    상기 화학식에서, M+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이다.
  17. 제8항 내지 제10항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화된 평형 상태에서 화학식 IV 및 V의 화합물을 함유하고, 생리학적으로 허용 가능한 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제8항 내지 제10항 또는 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 IV 및 V의 화합물의 혼합물을 함유하고, pH가 7.6~7.8의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제8항 내지 제10항 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 시료와 접촉하여 내인성 응고를 활성화시킬 수 있고, MOPS 및 TRICINE 완충 용액에서 선택된 완충 용액을 더 포함하는 것인 조성물.
  20. 제8항 내지 제10항 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 함유하는 화합물이 혈장 시료와 접촉하여 내인성 응고를 활성화하기에 충분한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온이 금속 양이온인 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제21항에 있어서, 금속 양이온이 Mn2+, Cu2+및 Co2+에서 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온이 금속 양이온인 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 금속 양이온이 Mn2+, Cu2+및 Co2+에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제1항 내지 제7항 또는 제11항 내지 제14항 또는 제21항 또는 제22항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 화학식(여기서, m은 2, 3 또는 4임)의 화합물, 또는 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 또는 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 조성물을 내인성 응고 활성제를 구성하도록 하는 조건하에서 포함하고, 혈소판 막의 인지질의 대체물을 더 포함하는 내인성 응고의 시험관내 테스트에 사용하기 위한 시약의 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 내인성 응고 활성제가 하기 화학식 III의 활성화된 형태의EGG를 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 시스템.
    화학식 III
    상기 화학식에서, M+는 양이온이고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
    ㆍR은(여기서 m은 2, 3, 4 또는 5이고, n은 1~170의 정수임) 또는 -AA1-AA2-........-AAr이며, 여기서 AA는 천연 또는 외래 아미노산이고, r은 1~10의 정수이다.
  27. 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 또는 제23항 또는 제24항 또는 제25항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이의 EGG 농도가 100 μM~1000 μM의 범위에 있는 것을 특징으로 하는 조성물 또는 시약.
  28. 민감성을 조절할 수 있고, 치환된 폴리-아미노산인 구성체와 결합된 제1항내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 화학식(여기서, m은 2, 3, 4임)에 반응하는 화합물, 또는 제8항 내지 제24항 또는 제27항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제25항 또는 제26항의 시약.
  29. 제28항에 있어서, 숙시닐화 폴리리신과 결합한 것인 화합물, 조성물 또는 시약.
  30. 제29항에 있어서, 분자량이 20,000~300,000 Da의 범위인 숙시닐화 폴리리신과 결합한 것인 화합물, 조성물 또는 시약.
  31. 제28항에 있어서, 글루타릴화된 폴리리신과 결합한 것인 화합물, 조성물 또는 시약.
  32. 내인성 응고의 시험관내 검사용 테스트를 생성하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 화학식(여기서, m은 2, 3 또는 4임)의 화합물 또는 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 또는 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 시약, 또는 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  33. 내인성 경로에 의한 응고의 검사를 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는, 화학식(여기서, m은 2, 3 또는 4임)의 화합물 또는, 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 또는 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제25항 또는 제26항의 시약, 또는 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  34. 제33항에 있어서, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 측정하는 것인 용도.
  35. 제32항에 있어서, 활성화된 전혈의 응고 시간을 측정하는 것인 용도.
  36. 제32항에 있어서, 활성화된 혈장의 응고 시간을 측정하는 것인 용도.
  37. 내인성 응고 경로에 관련된 응고 인자의 검사를 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 또는 화학식(여기서, m은 2, 3 또는 4임)의 화합물 또는, 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 또는 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제25항 또는 제26항의 시약, 또는 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  38. ㆍ알콜 작용기를 함유하는 화합물의 존재하에서 갈산을 반응시키는 단계,
    ㆍ얻은 갈산 에스테르를 알카리성의 매질과 접촉시켜서 하기 화학식 II의 화합물을 형성하는 단계,
    ㆍ하기 화학식 III의 착체를 형성할 수 있는 조건하에서 금속 양이온 Mq+(q는 1 또는 2임)를 첨가하는 단계,
    ㆍ완충 용액을 첨가하여 생리학적 허용 가능한 pH에서 화합물 II 및 III에서 얻은 평형을 안정화시키는 단계,
    ㆍ얻은 용액을 회수하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.
    화학식 I
    화학식 II
    화학식 III
    상기 화학식에서
    ㆍA는또는에서 선택되고, 여기서 M+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
    ㆍR은 -[-O-CH2-CH2-]n-OH를 나타내고, n은 1~170의 정수이다.
  39. 제38항에 있어서, 에스테르화 반응은 에틸렌 글리콜 갈레이트(EGG)를 형성하기 위하여 에틸렌 글리콜의 존재하에서 수행하며, 케토-에놀 평형에 관련된 이 EGG 형성물의 혼합물을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 하기 화학식 V의 EGG의 가용성 형태가 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
    화학식 V
    상기 화학식에서, M+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이다.
  41. ㆍ갈산을 에스테르화시키는 단계,
    ㆍ얻은 갈산 에스테르를 70℃~90℃의 범위의 온도까지 16~24 시간 동안 알카리성 pH에서, 완충 용액 내에서 가열하는 단계,
    ㆍ용액내에 존재하는 갈산 에스테르의 여러가지 형태를 회수하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    A는또는에서 선택되고, 여기서 M+는 양이온을 나타내고, q는 1 또는 2이고, p는 p×q=2가 되도록 하는 것이며,
    ㆍR은 -[-O-CH2-CH2-]n-OH를 나타내고, 여기서 n은 1~170의 정수이다.
  42. ㆍ내인성 응고 경로의 활성화를 가능케 하는 조건하에서, 혈소판 막의 인지질에 대한 대체물의 존재하에서, 혈소판 결핍 혈장 샘플을, 제1항 내지 제7항 또는 제11항 내지 제14항 또는 제21항 또는 제22항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 화학식(여기서, m은 2, 3 또는 4임)의 화합물, 또는 제8항 내지 제10항 또는 제15항 내지 제20항 또는 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제25항 또는 제26항의 시약 시스템, 또는 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계,
    ㆍCa2+이온을 20 mM~25 mM의 범위의 양으로 첨가하는 단계,
    ㆍ피브리노겐을 피브린으로 변형시키는데 필요한 시간을 측정하는 단계를 포함하는, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 측정하는 방법.
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