FR2822462A1 - Composes activateurs de la coagulation endogene utilisation pour l'exploration de la coagulation endogene - Google Patents

Composes activateurs de la coagulation endogene utilisation pour l'exploration de la coagulation endogene Download PDF

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Abstract

L'invention a pour objet des activateurs contact pour la voie endogène de la coagulation et leur utilisation pour explorer les anomalies de la coagulation.Les activateurs de l'invention sont des dérivés de l'acide gallique et de préférence des gallates de polyéthylène glycol.

Description

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COMPOSES ACTIVATEURS DE LA COAGULATION ENDOGENEUTILISATION POUR L'EXPLORATION DE LA COAGULATION ENDOGENE
La présente demande est relative à des composés activateurs de la coagulation endogène et ä leur utilisation pour son exploration.
La coagulation initiée par la voie endogène résulte in vitro, de l'exposition du sang au contact d'une surface chargée négativement. In vivo, elle renforce secondairement la croissance du caillot de fibrine.
L'exploration de la coagulation initiée par la voie endogène (désignée ci-après par l'expression coagulation endogène}}), est utilisée dans le cadre de tests de détection in vitro, d'anomalies de la coagulation ou pour le suivi de patients traités avec des substances à activité anticoagulante.
La voie endogène de la coagulation est initiée in vitro par l'activation du facteur XII (F. XII) au contact de charges négatives. En présence d'autres facteurs
Figure img00010002

enzymatiques tels que le facteur XI (F. xl), la pré-Kalikréine (PK), les kininogènes de haut poids moléculaire (KHPM), le facteur IX (F. IX) encore appelé facteur antihémophilique B et un cofacteur, le facteur anti-hémophilique A (F. Vlilc), une suite d'activations en cascade, de type enzymatique, s'enclenche en présence simultanément de phospholipides plaquettaires (PF3) et de calcium (Ca++).
A l'issue de cette série d'activations, le facteur IX activé (F. IXa) amorce à son tour l'activation en cascade d'une seconde série d'enzymes, comprenant le facteur X (F. X), le facteur Il (F. II) encore appelé prothrombine ; cette activation s'effectue en présence de facteur plaquettaire (PF3) de calcium (Ca++) et d'un cofacteur, le facteur V (F. V).
Cette seconde cascade d'activations aboutit ä la formation de thrombine Flla), qui transforme le fibrinogène en fibrine, constituant majeur du caillot sanguin ou plasmatique.
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Le schéma simplifié de la voie endogène (in vitro) de la coagulation peut être illustré comme suit :
Figure img00020002
De façon générale, l'exploration de la coagulation est pratiquée pour rechercher chez un patient, une anomalie biologique pouvant participer à un syndrome hémorragique ou pour suivre les conséquences d'une pathologie au niveau de la coagulation ou également pour assurer un suivi de traitement médical susceptible de modifier directement ou indirectement la coagulation.
A cet effet, différents tests sont à ce jour proposés pour rechercher, à partir de l'observation qualitative ou quantitative de facteurs intervenant dans la voie endogène la coagulation, différentes anomalies affectant la formation de fibrine résultant de la transformation du fibrinogène par de la thrombine.
Différents tests sont disponibles sur le marché pour explorer la coagulation endogène (encore appelée coagulation intrinsèque) et en particulier on citera la méthode de détermination du temps de thromboplastine partiellement activée ( Activated Partial Thromboplastine Time ou APTT) qui permet de détecter sur
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Figure img00030001

un échantillon de plasma, des anomalies ou des déficits intervenant au niveau de facteurs impliqués dans la voie endogène, anomalies se traduisant par des temps de coagulation en dehors des limites de la normalité.
Le test APTT est notamment pratiqué pour le dépistage des affections hémorragiques constitutionnelles les plus fréquentes, à savoir la maladie de Willebrand et les hémophilies A et B. Ce test est également fréquemment utilisé pour le contrôle d'une thérapie par l'héparine.
Schématiquement, le principe d'un test APTT consiste ä ajouter ä l'échantillon de plasma testé, un activateur du facteur Xt) chargé négativement (activateur contact) et, un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire ainsi que des ions calcium.
Le temps de coagulation mesuré correspond ä la période entre l'addition de l'activateur contact, du substitut plaquettaire, du calcium, et l'apparition d'un coagulum. C'est le temps nécessaire pour transformer 1% de la prothrombine du plasma, en thrombine. La fibrinoformation qui se déroule alors, intervient sur une courte période de temps. Le calcium est l'élément déclenchant du système.
Les activateurs convenant pour la réalisation de tests APTT sont relativement nombreux. Ceux-ci comprennent par exemple des activateurs solides
Figure img00030002

tels la silice, le verre ou le kaolin, ou des activateurs liquides, tels l'acide ellagique et ses dérivés ou des sulfatides.
Bien que les réactifs à base d'activateurs solides restent largement utilisés, ceux-ci ne sont pas sans présenter certains inconvénients. Ainsi, les particules de kaolin ou de silice qu'ils contiennent ont tendance à sédimenter durant le test de coagulation. Il est donc nécessaire de fournir une agitation continue, d'où un problème d'instabilité des réactifs et des difficultés pour la réalisation de tests dans des dispositifs automatisés. De plus, des activateurs tels que le kaolin ne permettent pas d'effectuer des mesures optiques de la coagulation.
Les activateurs liquides sont une alternative aux activateurs solides.
Cependant, on sait que les activateurs tels que l'acide ellagique sont susceptibles d'induire des variations dans les résultats des tests. De plus, leur sensibilité est diminuée par rapport à celle des précédents. Aussi, des associations diverses ont
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été proposées pour améliorer les performances de tels réactifs. Par exemple dans la demande de brevet WO 91/16453 on préconise un réactif à base d'acide ellagique, de phénol et d'un ion métallique, préférentiellement associé à du sulfate de dextran.
D'autres activateurs contact en solution ont été décrits notamment dans le brevet EP 0525035 pour lequel l'activateur contact est un composé aromatique hydroxy-substitué choisi entre le gallate de propyle ou du tannin, dans la demande de brevet WO 98/44352 pour laquelle l'activateur contact peut notamment être l'acide ellagique ou dans le brevet américain US 5,550, 028 dans lequel l'activateur
Figure img00040002

de contact est la tétrahydroxy-1, 4-quinone.
Les sulfatides ont également été proposés comme composés activateurs de la coagulation par la voie intrinsèque. Toutefois, leur niveau d'activité n'a pas toujours été jugé suffisant, et ces composés présentent en outre l'inconvénient d'être relativement chers par rapport aux autres activateurs disponibles.
Il y a donc encore un besoin de disposer de réactifs de coagulation nouveaux ou d'améliorer des réactifs préexistants pour parvenir à des produits qui, tout en restant intéressants au plan économique, possèdent une stabilité et une sensibilité suffisantes, induisent des temps d'activation courts et soient utilisables sur des automates d'analyse pour la réalisation de tests en grandes
Figure img00040003

series.
L'invention s'intéresse ä de tels activateurs contact alternatifs capables de participer à la voie endogène de la coagulation et à la réalisation de systèmes et de tests permettant d'explorer cette voie endogène de la coagulation et d'y détecter des anomalies.
Les inventeurs se sont intéressés, dans le cadre de la recherche de substances susceptibles d'activer la coagulation endogène, à des composés ayant des propriétés de solubilité intéressantes par rapport aux composés utilisés jusqu'à présent en tant qu'activateurs de la coagulation dans des tests APTT et en particulier, ont recherché à partir de l'acide gallique, des dérivés susceptibles d'activer la coagulation endogène.
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Les réactifs en question sont des activateurs contact de la voie endogène de la coagulation, capables d'avoir une activité procoagulante, c'est à dire d'activer le facteur XII en facteur activé Xlla, après incubation d'un échantillon de plasma, à 37 C en présence de PF3 et de calcium.
De façon préférée pour la réalisation de l'invention, ces composés sont solubles ou susceptibles d'être rendus solubles le cas échéant après modification.
L'invention a donc pour objet un composé de formule
Figure img00050002

dans laquelle : - A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure img00050003
Mq+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2,
Figure img00050004

m étant égal à 2,3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou,
Figure img00050005
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Figure img00060001

AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
Parmi les composés ainsi définis, l'invention concerne, selon un mode de réalisation particulier, ceux qui ont l'avantage de pouvoir être mis en solution et en particulier en solution aqueuse. De préférence, ils sont totalement solubles.
La chaîne latérale constituée par R et dont la signification a été donnée cidessus est telle que la valeur de n est de préférence égale ou supérieure à 1 et inférieure ou égale à 170. En particulier, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
De façon particulièrement préférée, n est égal à 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9 et 10.
Une première famille de composés préférés selon l'invention est définie par la formule suivante :
Figure img00060002

dans laquelle
Figure img00060003

m étant égal à 2,3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou, - AAi-AA2-.......-AAr
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
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Selon un premier mode de réalisation préféré de l'invention, dans l'une des formules (1) ou (II) précédentes, R représente
Figure img00070001

m et n répondant aux définitions données précédemment.
Avantageusement dans le cadre de l'invention, le composé de formule (II)
Figure img00070002

est tel que : R représente tO-CH2-CH2--OH avec n étant un nombre entier entre 1 et 170 n et de préférence entre 1 et 10.
Cette forme préférée du composé (ici) selon l'invention correspond ä la forme oxydée des galates de polyéthylène glycol.
Cette forme oxydée est la forme quinonique résultante de l'oxydation en milieu alcalin d'un des-OH du noyau aromatique présent dans la formule (II).
Selon un autre aspect, les composés de l'invention peuvent également se trouver constituer une famille répondant à la formule suivante correspondant à une forme ionisée de formule (III), associée à des cations mono ou bivalents définis dans le cadre de l'invention :
Figure img00070003

dans laquelle : R représente
Figure img00070004
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Figure img00080001

m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 et Mq+ est un cation avec q égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
Cette deuxième famille particulière, de composés selon l'invention répondant à la formule (III) comprend outre la quinone en position 4, les 2 fonctions-OH (en position 3 et 5) sous forme ionisée (alcoolats de sodium) formée lorsque le pH du milieu est supérieur au pKa.
En particulier, l'invention concerne le gallate de mono-ou poly-éthylène glycol oxydé, dans sa forme basique, ledit composé étant associé à des cations, en milieu alcalin.
De préférence, il s'agit de la forme basique du gallate d'éthylène glycol dans laquelle R a la signification donnée ci-dessus avec m=2 et n=1.
Cette forme basique du gallate d'éthylène glycol oxydé est soluble dans l'eau.
Le pH de la composition obtenue doit être abaissé à une valeur physiologiquement acceptable en vue de son utilisation. Le déplacement de l'équilibre vers la quinone sodée (selon la formule III) à pH physiologique peut être accéléré et stabilisé par l'ajout de cations lui conférant des propriétés coagulantes immédiates.
Parmi les composés répondant à la formule (1) identifiés ci-dessus, l'invention a avantageusement pour objet les composés répondant à la définition suivante :
Figure img00080002

dans lequel - A est :
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Figure img00090001
Figure img00090002
Figure img00090003

Mq+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2. Ces composés sont respectivement la forme acide du gallate d'éthylène glycol oxydé et la forme basique ou salifiée du gallate d'éthylène glycol oxydé.
La forme basique quinone salifiée se caractérise par une couleur jaune détectable à une longueur d'onde de 355 nm et est particulièrement intéressante du fait de sa solubilité en milieu aqueux.
Pour la réalisation des composés selon l'invention tels qu'ils sont définis précédemment et aussi dans les pages suivantes, le cation Mq+ est avantageusement un cation métallique, en particulier Mn2+ ou Cu2+ ou Co2+ Il peut alternativement être constitue par un cation non métallique tel qu'un contre-ion qui est apporté lors de la préparation des composés de l'invention par chauffage en milieu alcalin. Un tel procédé de préparation est défini dans les pages qui suivent et le cation Mq+ est avantageusement Na+, K+ ou NH4+.
La concentration en cation peut être définie en fonction du temps de coagulation que l'on souhaite observer pour un échantillon témoin normal.
Avantageusement, pour les cations métalliques, cette concentration est comprise entre 5 et 15 uM, de préférence autour de 10 pM.
Selon une autre forme de réalisation particulière, l'invention a pour objet une famille de composés répondant à la formule (1)
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Figure img00100001
Figure img00100002

dans laquelle : - A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure img00100003
Figure img00100004

Mq+ représentant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2, /' - Rrepresente--NH-CH2-CH2"NH2 avec n étant un nombre entier entre 1 et 170. n
En particulier dans le cadre de la définition de R, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
Une forme préférée du gallate de polyéthylène diamine est la forme quinonique résultante de l'oxydation d'un des-OH du noyau aromatique. Elle correspond ä la formule suivante :
Figure img00100005

dans laquelle n est un nombre entier entre 1 et 170 ; de préférence compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement 1 et 20.
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Figure img00110001
De façon particulièrement préférée dans les formules ci-dessus"n est égal ä 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10.
Avantageusement, il s'agit du gallate d'éthylène diamine (n =1). Les composés de l'invention peuvent également se trouver sous la forme associée à des cations mono ou bivalents en particulier à des cations métalliques. Ces composés répondent ä la formule suivante :
Figure img00110002

- dans laquelle n est un nombre entier entre 1 et 170.
Mq, est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2.
En particulier, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
De façon particulièrement préférée, n est égal à 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9 et 10.
Selon une troisième forme de réalisation, l'invention a pour objet un composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule (I)
Figure img00110003

dans laquelle - A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure img00110004
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Figure img00120001

Mq+ représentant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
- R est un reste d'acide aminé ou un peptide.
De préférence, comme indiqué dans le cas des deux premiers modes de réalisation de l'invention, les composés de l'invention sont sous la forme quinonique résultant de l'oxydation d'un des-OH du noyau aromatique :
Figure img00120002
Figure img00120003

ou, sous la forme associée ä des cations mono-, ou bivalents :
Figure img00120004
Figure img00120005

dans laquelle M, q et p ont les définitions précédentes.
Un acide aminé préféré pour la réalisation des composés ci-dessus est la sérine où
Figure img00120006
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Dans ce cas le composé de l'invention a avantageusement la formule suivante :
Figure img00130001

M, q et p répondant aux définitions précédentes.
L'invention a également pour objet une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de plusieurs composés, en particulier un mélange d'au moins deux composés parmi ceux identifiés précédemment, qu'il s'agisse de composés appartenant à la même famille ou au même groupe ou au contraire de composés appartenant ä des familles ou à des groupes différents parmi ceux définis précédemment.
En particulier, une composition est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux composés différents de formule :
Figure img00130002

ces composés étant identiques ou différents pour le groupement A et étant identiques ou différents pour le groupement R, A et R ayant les significations données ci-dessus.
L'invention concerne de préférence une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de composés (IV) et (V), constituant respectivement les formes acide et basique du Gallate d'Ethylène Glycol oxydé (GEGox), de formules suivantes :
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Figure img00140001
Figure img00140002

M, q et p ayant les définitions indiquées ci-dessus.
Cette composition comprend donc un mélange des formes acide et basique du gallate d'éthylène glycol oxydé, correspondant aux produits de l'équilibre cétooenolique obtenu à partir du gallate d'éthylène glycol lorsqu'il est soit chauffé en milieu alcalin, soit mis en présence de cations métalliques.
L'équilibre entre les formes acide et basique du gallate d'éthylène glycol oxydé peut être déplacé vers l'une ou l'autre de ces formes en aménageant les conditions de la réaction, et en particulier en modifiant le pH ou la concentration en cations présente dans le milieu de réaction.
Avantageusement, la composition ainsi définie est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une solution et de préférence d'une solution aqueuse.
L'invention a en particulier pour objet, dans le cadre de la définition précédente, une composition dans laquelle la forme basique répondant à la formule (V) du gallate d'éthylène glycol oxydé est prédominante.
Cette forme basique, hydrosoluble, présente des protriétés tout à fait avantageuses pour constituer une composition activatrice de la coagulation endogène notamment pour réaliser un test in vitro pour l'exploration de la coagulation endogène.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition répondant à l'une des définitions précédentes, a un pH alcalin physiologiquement acceptable. Ce pH est ajusté après oxydation du GEG, par exemple en présence de molécules tampon : MOPS ('acide- (N-Morpholino) propanesulfonique) ou
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Figure img00150001

TRICINE : (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-glycine). Avantageusement, la molécule MOPS est choisie.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition est caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange des différentes formes du galate, produites par l'équilibre céto-énolique et répondant à la formule :
Figure img00150002

M, q et p répondant à l'une des définitions ci-dessus.
La présence de l'une ou l'autre des formes de t'notate de l'ester de l'acide gallique est dépendante des conditions de la réaction et l'équilibre céto-énolique peut donc être déplacé pour obtenir une quantité plus ou moins grande de l'une des formes du gallate produites.
On aura tendance dans le cadre de l'invention, à favoriser la présence de la forme basique du gallate oxydé, de formule (V).
Les composés et compositions préférés selon l'invention peuvent également être définis comme résultant de la mise en oeuvre du procédé comprenant les étapes suivantes : - Estérification de l'acide gallique avec l'éthylène glycol et récupération d'un des produits de la réaction constitué par le gallate d'éthylène glycol (GEG) de formule :
Figure img00150003
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Figure img00160001

- Déplacement de l'équilibre céto-énolique par mise en contact du GEG avec un milieu alcalin et chauffage ä une température comprise entre 70 et 90 OC.
La réaction de formation de l'équilibre céto-énolique est conduite avantageusement pendant une durée de 24 h à 80oC.
La préparation selon le procédé ci-dessus conduit à un mélange des 3 formes du galate, ledit mélange pouvant être déplacé vers les formes oxydées.
De façon préférée, la composition ainsi obtenue est caractérisée en ce que le procédé comprend en outre les étapes de : stabilisation de t'équilibre céto-énolique obtenu par l'ajustement du pH.
- recuperation des composés de formule (IV) et (V) en solution, à pH alcalin.
Les formes oxydées du GEG formées en présence de soude et en particulier, on utilisera de la soude en excès pour déplacer l'équilibre céto- énolique vers la forme basique du gallate d'éthylène glycol oxydé. Le traitement par chauffage est réalisé à une température comprise entre 70 et 90oC, de préférence une température de 80 C pendant une durée de 24h.
Le pH de la solution est un pH alcalin, et l'action de la soude peut être arrêtée par l'addition d'un tampon qui contribue à stabiliser l'équilibre céto- énolique obtenu. De façon particulièrement préférée, le pH de la composition selon l'invention est compris entre 7,6 et 7,8.
Le tampon ajoute peut être par exemple un tampon MOPS ou TRIS.
La composition contient les composés selon l'invention dans une concentration comprise entre 100 et 1000 uM.
Les composés et compositions ainsi définis dans le cadre de l'invention, sont capables d'activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma, en d'autres termes sont capables d'activer le facteur Xt) en facteur XIIa, après avoir été mis en contact et incubés avec un échantillon de plasma en présence de PF3 et de calcium, à une température d'environ 37OC.
L'invention a également pour objet un système de réactifs utilisable pour l'examen in vitro de la coagulation endogène sur un échantillon sanguin, lequel
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Figure img00170001

système comprend parmi ses réactifs, un composé ou une composition tels que définis précédemment.
Un réactif préféré selon J'invention comprend un sel de l'acide gallique (galate) sous forme activée, répondant à la formule :
Figure img00170002

M, q et p répondant aux définitions ci-dessus.
Figure img00170003

avec m égal à 2,3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou,
Figure img00170004

- AAl-AAs-.......-AAr
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
En particulier dans le cadre de la définition de R, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
De façon particulièrement préférée dans les formules ci-dessus"n est égal à 1,2, 3,4, 5, 6,7, 8, 9 et 10.
La détermination des concentrations des composés selon l'invention, tient compte du fait qu'en système APTT, les temps de coagulation attendus pour des plasmas issus de sujets sains, sont généralement compris entre 28 et 40 secondes. Dans ce cadre, la concentration des composés selon l'invention et des
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Figure img00180001

autres constituants mis en oeuvre pour le test de la coagulation peut être définie à partir du temps de coagulation recherché pour des échantillons de plasmas sains. En particulier, la concentration des composés selon l'invention peut varier de 100 à 1000 ism.
L'optimisation des concentrations des principaux constituants du réactif vise à obtenir sur une échantillothèque de plasmas issus d'au moins 30 sujets sains, des temps de coagulation compris dans cet intervalle.
En outre, l'optimisation des paramètres biochimiques d'environnement des principes actifs du réactif APTT, permet en allongeant les temps, d'ajuster spécifiquement la sensibilité de détection de certaines pathologies relevant d'un test APTT. Ainsi, par exemple, il sera recherché un allongement de temps par rapport au témoin sujet sain, d'au moins 20% dans les cas de syndromes des Lupus Anticoagulants. Pour des plasmas issus de sujets traités aux anticoagulants de type héparine non fractionnées, ce sont des allongements de temps compris dans des ratios de 1,5 à 3,0 fois le temps témoin qui seront recherchés. Pour des plasmas d'hémophiles de type A et B, la plus grande sensibilité possible est requise et on cherchera à obtenir des allongements de temps importants.
De façon préférée, le réactif ainsi constitue comprend du gallate d'éthylène glycol activé. L'activité résulte de l'équilibre céto-énolique obtenu et de sa stabilisation à un pH physiologiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la concentration en galate, en particulier, en gallate d'éthylène glycol dans la composition ou le
Figure img00180002

système de réactifs décrit, est avantageusement comprise entre 100 et 1000 uM, de préférence 100 ism.
Le système de réactifs selon l'invention comprend, outre l'activateur contact de la voie endogène de la coagulation, un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire. Ce substitut peut être de la céphaline : suspension de phospholipides extraits de cervelles de mammifères.
L'invention concerne aussi un système de réactifs qui comprend en outre, sous forme séparée des autres réactifs, des ions Ca2+ pour déclencher l'activation des facteurs impliqués dans la voie endogène.
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Figure img00190001
L'utilisation des composés, compositions ou réactifs selon l'invention pour l'exploration de la coagulation et plus particulièrement de la coagulation endogène, peut être mise en oeuvre pour mesurer sur un échantillon sanguin et en particulier un échantillon de plasma, le temps de thromboplastine partiellement activée (APTT). A cet égard, on a avantageusement recours à l'utilisation de plasma pauvre en plaquettes.
Dans le cadre de cette mesure, les conditions habituelles de réalisation de ce test sont mises en #uvre, en particulier en ce qui concerne la préparation des échantillons.
Ainsi, l'échantillon du plasma prélevé peut dans un premier temps avoir été
Figure img00190002

traité par exemple avec du citrate de façon ä complexer les ions Ca contenus dans l'échantillon de sorte que l'échantillon ne peut plus coaguler. l'échantillon est ensuite incubé avec un composé ou une composition selon l'invention en tant qu'activateur de la coagulation et des substituts de phospholipides. Des ions Ca2+ sont ensuite ajoutés en quantité équivalente à celle qui a été complexée, pour déclencher la coagulation. l'activité des composés ou compositions selon l'invention nécessite que leur pH ait un valeur physiologiquement acceptable.
Les composés, compositions ou réactifs selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisés pour déterminer le temps de coagulation du sang complet ou le temps de coagulation du plasma.
L'invention permet donc l'utilisation d'un composé ou d'une composition selon la description qui en a été donnée précédemment, pour la préparation d'un système de réactifs pour l'examen des facteurs de coagulation impliqués dans la voie endogène de la coagulation. Les facteurs concernés sont principalement les facteurs XII, XI, IX, VIII.
Dans ce cadre, l'invention concerne par exemple la détection d'anomalies liées à la maladie de Willebrand, aux hémophilies A et B ou la détection d'anticoagulants. Ces anomalies entraînent un temps mesuré d'APTT en dehors des valeurs normales celles-ci étant habituellement situées entre 20 et 40 secondes.
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Figure img00200001
L'invention a donc aussi pour objet une méthode de mesure du temps de thromboplastine partiellement activée (APTT) comprenant les étapes de : - mise en contact d'un échantillon de plasma pauvre en plaquettes avec des composés ou compositions selon l'invention, en présence de substituts des phospholipides de la membrane plaquettaire, dans des conditions permettant l'activation de la voie endogène de la coagulation, - addition d'ions Ca en quantité équivalente à la quantité de ces ions complexés dans l'échantillon de plasma.
- mesure du temps nécessaire ä la transformation du fibrinogène en fibrine.
En particulier, dans le cadre de la mise en oeuvre de la méthode précédente, l'échantillon de plasma est constitue par un plasma pauvre en plaquettes et un activateur de coagulation est incubé avec le plasma pendant une durée de 2 à 5 minutes environ, à 37 oC. Les substituts de phospholipides membranaires sont soit ajoutés dès le début de la réaction, soit mélangés à l'activateur, soit ajoutés individuellement au cours de la réaction.
Puis les ions calcium sont ajoutés, sous la forme par exemple de chlorure de calcium de concentration comprise entre 20 mM et 25 mM. Le temps nécessaire à la formation de fibrine est alors mesure.
Le temps mesuré indique, quand il est compris en dehors de l'intervalle de temps correspondant à une situation de coagulation normale (c'est à dire entre 20 et 40 secondes), qu'un des paramètres de la voie endogène de la coagulation est à un taux anormal, y compris absent, ou qu'il existe des composés anticoagulants dans le plasma testé.
Quand le plasma étudié comporte un facteur de la voie endogène de la coagulation à un taux anormal, l'invention permet alors une analyse quantitative du facteur en question, en utilisant un système déplété en ce facteur, et dans
Figure img00200002

lequel tous les autres paramètres sont par ailleurs introduits en excès. Dans ce système, après avoir ajoute le plasma ä étudier, seul le facteur ä doser se trouve en quantité limitant.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un compose de formule suivante :
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Figure img00210001
Figure img00210002

dans laquelle A représente un ou plusieurs des composés choisis parmi les formules suivantes :
Figure img00210003
Figure img00210004

Mq+ représentant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
Figure img00210005
R représente tO-fCH2OH ou,
Figure img00210006
Figure img00210007

m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou, - AAl-AA2-.......-AAr AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10. le dit procédé comprenant les étapes de :
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- estérification de l'acide gallique, en présence d'un composé ayant au moins une fonction alcool ou amidation de l'acide gallique en présence d'un composé ayant au moins une fonction amine, - mise en contact du dérivé de l'acide gallique obtenu, avec des ions OH-pour former un compose de formule
Figure img00220001

- addition d'un cation métallique Mq+ (avec q égal à 1 ou 2), dans des conditions permettant la formation d'un complexe de formule :
Figure img00220002

- stabilisation de l'équilibre obtenu, entre les composés (II) et (III) à un pH physiologiquement acceptable, par l'addition d'un tampon tel que MOPS ou
TRICINE - recuperation de la solution obtenue.
Ce procédé est de préférence tel que l'estérification est réalisée en présence d'éthylène glycol pour former le gallate d'éthylène glycol, permettant de ce fait de récupérer, à l'issue des réactions mises en oeuvre, les produits de l'équilibre céto-énolique comprenant notamment les formes acides et basiques du gallate d'éthylène glycol oxydé et le cas échéant également une quantité résiduelle de gallate d'éthylène glycol.
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Figure img00230001
Les définitions des familles ou groupes préférés de composés ou de compositions selon l'invention, sont également concernées par la définition du procédé.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, on peut souhaiter récupérer principalement la forme basique de formule (V) du gallate d'éthylène glycol oxydé et pour ce faire, on peut avoir intérêt à déplacer l'équilibre vers cette forme basique.
Une autre méthode a été mise au point par les inventeurs pour préparer un composé de formule A selon l'invention ayant des propriétés activatrices de la coagulation endogène. Ce procédé comprend les étapes de : - estérification de l'acide gallique, - chauffage de l'ester de l'acide gallique obtenu à une température comprise entre 70 et 90 C, de préférence à 80 C pendant une durée comprise entre
16h et 24h de préférence 24 h à pH alcalin, dans une solution tampon, - récupération des différentes formes de l'ester de l'acide gallique présentes en solution.
D'autres propriétés et avantages de l'invention apparaissent à la lecture des exemples qui suivent qui constituent des modes de réalisation préférés de l'objet de l'invention.
EXEMPLE 1
Dans cet exemple, le temps de coagulation est mesuré avec des réactifs APTT fabriqués selon l'invention en utilisant divers cations. Différents types de plasmas sont testés, normaux d'une part, et représentatifs de pathologie relevant d'un test APTT d'autre part : - CK-Prest = réactif APTT de référence dont l'activateur contact est du kaolin, - pool N = mélange en quantités équivalentes de plasmas provenant de sujets sains, - CCN = Coag. Contrôle Normal : Plasma contrôle de qualité niveau normal, - CCP = Coag. Contrôle Patho : Plasma contrôle de qualité niveau pathologique,
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Figure img00240001

- Heparines = plasmas issus de patient recevant un traitement anticoagulant ä base d'héparine non fractionnée sous forme de sels sodiques ou calciques, - Lupus = plasma de patient présentant le syndrome Lupus Anticoagulant, - Def. F Ville = plasma de patient présentant un déficit en f Ville (Hémophile A).
Les mesures sont effectuées sur un automate d'hémostase (STADiagnostica Stago).
Figure img00240002
<tb>
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes
<tb> Plasmas <SEP> contrôles <SEP> Héparinés <SEP> Lupus <SEP> F <SEP> VIII <SEP> def.
<tb>
Cations <SEP> Pool <SEP> N
<tb> CCN <SEP> 16%
<tb> 1098
<tb> Cu <SEP> 36,3 <SEP> 41,7 <SEP> 50,0
<tb> Mn <SEP> 37,8 <SEP> 34,2 <SEP> 54,9 <SEP> 73,1 <SEP> 51,0 <SEP> 63,6 <SEP> 52,4
<tb> Co <SEP> 97,6 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0
<tb> Cd <SEP> 114,6 <SEP> 137, <SEP> 2 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0
<tb> Ni <SEP> 120,8 <SEP> 137,3 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0
<tb> Cs <SEP> 121,0 <SEP> 122, <SEP> 5 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> > 140,0
<tb> Sr <SEP> > 140,0
<tb> Zn <SEP> > 140,0
<tb> Cr <SEP> > 140,0
<tb> Fe <SEP> > 140,0
<tb> Mo <SEP> > 140,0
<tb> référence
<tb> 30,4 <SEP> 30,9 <SEP> 52,7 <SEP> 60,2 <SEP> 130,8 <SEP> 45,5 <SEP> 45,9
<tb> CK-Prest
<tb>
EXEMPLE 2 : Dans l'exemple suivant, les temps de coagulation de différents plasmas sont déterminés à partir de réactifs APTT obtenus à partir des amides ou des esters de l'acide gallique.
- Plasmas normaux = pool en quantités équivalentes de plasmas de sujets normaux, - CCN = Coag. Control Normal : contrôle de qualité niveau normal, - CCP = Coag. Control Patho : contrôle de qualité niveau pathologique, - Heparines = plasmas de patients recevant un traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée sous forme de sels sodiques ou calciques.
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Figure img00250001

- Lupus = plasma de patient présentant un syndrome Lupus Anticoagulants - F VIII déf. = plasma de patient avec déficit en F VN ! c (hemophitie A)
Figure img00250002
<tb>
<tb> Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes <SEP> obtenus <SEP> sur <SEP> automate <SEP> d'hémostase <SEP> (STA-Diagnostica <SEP> Stago).
<tb>
Dérivés <SEP> d'acide <SEP> gallique <SEP> Normaux <SEP> et <SEP> Contrôles <SEP> Héparinés <SEP> Lupique <SEP> F <SEP> VIII <SEP> def.
<tb>
Pool <SEP> N
<tb> Amidés <SEP> [ M] <SEP> CCN <SEP> CCP <SEP> lot <SEP> 1706 <SEP> lot <SEP> 0811 <SEP> lot <SEP> 021 <SEP> 25%
<tb> 800
<tb> 2 <SEP> 100 <SEP> 111,5 <SEP> 138,1 <SEP> 177,9 <SEP> 228,4 <SEP> > 300,0 <SEP> 167,6 <SEP> 113,0
<tb> 2N-(CH2)n-NH2 <SEP> 3 <SEP> 100 <SEP> 110,9 <SEP> 119, <SEP> 3 <SEP> 177,9 <SEP> 243,9 <SEP> > 300,0 <SEP> 155,8 <SEP> 111, <SEP> 3
<tb> double <SEP> gallate <SEP> d'amide <SEP> 2 <SEP> 100 <SEP> 148,2 <SEP> 170,6 <SEP> 203, <SEP> 8- > 300, <SEP> 0 <SEP> > 300, <SEP> 0 <SEP> 128,5
<tb> H2N-CH-(CH2OH)-COOH <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 245,0 <SEP> 210, <SEP> 9 <SEP> 189, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> > 300, <SEP> 0 <SEP> 232,6 <SEP> 153,0
<tb> Ester
<tb> HOCH2-CH2OH <SEP> 100 <SEP> 37,4 <SEP> 32, <SEP> 7 <SEP> 50, <SEP> 5 <SEP> 65,7 <SEP> 112,5 <SEP> 45, <SEP> 7 <SEP> 35,6
<tb> Référence--'33, <SEP> 9 <SEP> ! <SEP> 33, <SEP> 7 <SEP> 49, <SEP> 3 <SEP> 66, <SEP> 9 <SEP> 61,1 <SEP> 35, <SEP> 9 <SEP> 40,5
<tb>
D'après ce tableau, il apparaît donc que les résultats les plus proches de ceux obtenus avec le réactif de référence, le CK-Prest, sont ceux obtenus avec le gallated'éthylèneglycol.
EXEMPLE 3 Après chauffage pendant 24 heures à 80oC, le gallate d'éthylène glycol en solution 500 uM, tamponnée à pH 7,00, devient actif dans un test APTT de la coagulation.
Le tableau ci-dessous montre la cinétique d'activation de la molécule.
Figure img00250003

l'activité procoagulante de la solution de gallate d'éthylène glycol est comparée ä celle d'un réactif de référence : le CK-PREST, réactif APTT dont l'activateur est du kaolin. L'appareil servant à mesurer les temps de coagulation est un automate d'hémostase STA Diagnostica Stago (nO série 307) Parallèlement à l'apparition de l'activité coagulante, une coloration jaune mesurable à 355 nm, apparaît.
Les plasmas testés sont des plasmas de contrôle qualité :
Figure img00250004

CCN = Coag Contrôle Normal. CCP = Coag Contrôle Pathologique lot nO 980901. Réactif APTT réalisé = Gallate d'éthylène glycol à 500 uM oxydé ä 80 C + Tricine 50 mM, pH 7. 00 + Céphaline (substitut de phospholipides plaquettaires).
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Figure img00260001
<tb>
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes.
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> Référence <SEP> :CK <SEP> PREST <SEP> APTT <SEP> - <SEP> gallate <SEP> d'éthylène <SEP> glycol
<tb> chauffage <SEP> : <SEP> : <SEP> To
<tb> 80C <SEP> CCN <SEP> CCP <SEP> CCN <SEP> CCP <SEP> DO <SEP> (355 <SEP> nm)
<tb> To > 140, <SEP> 0 <SEP> > 140,0 <SEP> 0, <SEP> 102
<tb> T1h <SEP> 34,9 <SEP> 49,2 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> 0, <SEP> 223
<tb> T2h <SEP> 35, <SEP> 3 <SEP> 49, <SEP> 1 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> 0,356
<tb> T3h <SEP> 35,1 <SEP> 48,4 <SEP> > <SEP> 140, <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 140, <SEP> 0 <SEP> 0,573
<tb> T4h <SEP> 34,8 <SEP> 49,5 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 792
<tb> T5h <SEP> 35,0 <SEP> 50,1 <SEP> 136,9 <SEP> 134,8 <SEP> 0,966
<tb> T6h <SEP> 35,1 <SEP> 48,4 <SEP> 118, <SEP> 4 <SEP> 118, <SEP> 5 <SEP> 1,155
<tb> T7h <SEP> 35,1 <SEP> 48,2 <SEP> 108, <SEP> 2 <SEP> 110, <SEP> 4 <SEP> 1,308
<tb> T8h <SEP> 35, <SEP> 7 <SEP> 47, <SEP> 8 <SEP> 94,9 <SEP> 100,2 <SEP> 1,458
<tb> T9h <SEP> 35,0 <SEP> 48,2 <SEP> 88,8 <SEP> 95,1 <SEP> 1,563
<tb> T10h <SEP> 35,0 <SEP> 48,4 <SEP> 81,4 <SEP> 87,9 <SEP> 1,650
<tb> T11h <SEP> 35,3 <SEP> 48,3 <SEP> 71,3 <SEP> 80, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 754
<tb> T12h <SEP> 35,0 <SEP> 48,6 <SEP> 65,7 <SEP> 75,5 <SEP> 1,859
<tb> T13h <SEP> 347 <SEP> 48,4 <SEP> 61,6 <SEP> 71,0 <SEP> 1,926
<tb> T14h <SEP> 35,1 <SEP> 48,8 <SEP> 55,0 <SEP> 66,3 <SEP> 2,028
<tb> T26h <SEP> 35,2 <SEP> 49,1 <SEP> 37,6 <SEP> 54,4 <SEP> 2,616
<tb> T27h <SEP> 35,0 <SEP> 49,5 <SEP> 36,3 <SEP> 53,5 <SEP> 2, <SEP> 712
<tb> T28h <SEP> 35,0 <SEP> 47,9 <SEP> 35,6 <SEP> 53, <SEP> 7 <SEP> 2,720
<tb> T30h <SEP> 35,0 <SEP> 48,3 <SEP> 35,8 <SEP> 54,1 <SEP> 2,766
<tb> T34h <SEP> 35,1 <SEP> 49,5 <SEP> 34,5 <SEP> 52,5 <SEP> 2,750
<tb>
EXEMPLE 4 : Diverses molécules tampons, choisies parmi celles habituellement utilisées dans les systèmes biologiques, permettent d'obtenir dans des délais raisonnables de chauffage ( < 4 jours) des activités procoagulantes significatives et proches de
Figure img00260002

celles du réactif de référence CK-PREST. Il s'agit des molécules suivantes : - TRICINE : N-Tris (hydroxymethyl) methyl-glycine - HEPES : acide que - MOPS : acide- (N-Morpholino) propanesulfonique - TR ! S : [7r/s- (hydroxymethy !) aminomethane]
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Figure img00270001

Le tampon Tricine et le MOPS sont utilisés de préférence, car avec le TRIS, un précipité apparaît durant l'activation du galate d'éthylène glycol, et avec le tampon HEPES, il est nécessaire de mener le chauffage durant une période plus longue.
Dans le tableau suivant, sont consignées les performances obtenues sur 2 plasmas contrôles (normal et pathologique), 1 pool de plasmas issus de donneurs sains et 4 plasmas représentatifs de pathologies détectables en système de coagulation de type APTT ; * Pool N = pool de plusieurs plasmas normaux * CCN = Coag. Control Normal : contrôle de qualité de niveau normal * CCP = Coag. Control pathologique : contrôle de qualité de niveau pathologique, * LA : plasma de patient présentant un syndrome Lupus Anticoagulant * Hep : Plasma de patients recevant un traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée sous forme de sel calcique. Deux plasmas, à 2 niveaux
Figure img00270002

d'héparinémie sont testés : 0, 09 et 0, 34 Unité internationale par ml.
* Deaf. Ville = plasma d'hémophile A ä 40% d'activité en facteur Ville.
Les temps de coagulation obtenus sont exprimés en secondes.
La sensibilité de réponse obtenue avec chacun des réactifs fabriqués avec les 4 tampons, est objectivée par le calcul d'un ratio (R) effectue en divisant le temps de coagulation obtenu sur le plasma du patient, par celui obtenu avec le pool normal, ou le temps de coagulation du contrôle pathologique (CCP) par celui du contrôle normal (CCN).
Figure img00270003
<Desc/Clms Page number 28>
Figure img00280001
<tb>
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes
<tb> Référence <SEP> APTT-gallate <SEP> d'éthylène <SEP> glycole
<tb> Plasmas <SEP> CK-Prest
<tb> lot <SEP> ne980201 <SEP> TRICINE <SEP> HEPES <SEP> MOPS <SEP> TRIS
<tb> Sec <SEP> R <SEP> Sec <SEP> R <SEP> Sec <SEP> R <SEP> Sec <SEP> R <SEP> Sec <SEP> R
<tb> PN <SEP> (lot <SEP> n <SEP> 30,5 <SEP> - <SEP> 39,4 <SEP> - <SEP> 35,6 <SEP> - <SEP> 37,0 <SEP> - <SEP> 32,3
<tb> 10-98)
<tb> CCN <SEP> (lot
<tb> 31,5 <SEP> - <SEP> 38,7 <SEP> - <SEP> 33,5 <SEP> - <SEP> 35,4 <SEP> - <SEP> 31,9 <SEP> -
<tb> 972751)
<tb> CCP <SEP> (log <SEP> n
<tb> 52,3 <SEP> 1,66 <SEP> 56,8 <SEP> 1,47 <SEP> 52,0 <SEP> 1,46 <SEP> 56,5 <SEP> 1,60 <SEP> 72,1 <SEP> 2,26
<tb> 972 <SEP> 751)
<tb> LA <SEP> (lot <SEP> n
<tb> 45,6 <SEP> 1,50 <SEP> 73,3 <SEP> 1,94 <SEP> 64,6 <SEP> 1,81 <SEP> 67,7 <SEP> 1,83 <SEP> 58,8 <SEP> 1,82
<tb> MA <SEP> 221
<tb> Hep,
<tb> 59,6 <SEP> 1,95 <SEP> 49,5 <SEP> 1,26 <SEP> 48,7 <SEP> 1,37 <SEP> 52,5 <SEP> 1,42 <SEP> 55,2 <SEP> 1,71
<tb> (0,09 <SEP> Ul/ml)
<tb> Hep, <SEP> 117, <SEP> 4 <SEP> 3,85 <SEP> 67,1 <SEP> 1, <SEP> 70 <SEP> 71,7 <SEP> 2, <SEP> 01 <SEP> 81,4 <SEP> 2,20 <SEP> 107,3 <SEP> 3,32
<tb> (0,34 <SEP> Ul/ml)
<tb> Def. <SEP> VIIIc
<tb> 45,9 <SEP> 1,50 <SEP> 55,1 <SEP> 1,40 <SEP> 51,0 <SEP> 1,43 <SEP> 53,4 <SEP> 1,44 <SEP> 48,3 <SEP> 1,50
<tb> (40%)
<tb>
Figure img00280002

EXEMPLE 5 :
Figure img00280003

L'utilisation d'un réactif APTT peut se concevoir selon 2 finalités : exploration globale de la voie endogène de la coagulation sanguine, avec réponse de type normal-anormal ; exploration analytique et quantitative des facteurs de la coagulation impliqués dans la voie endogène de la coagulation : F Xll-XI-IX-Vlilc. il est possible de doser dans un plasma de patient, un quelconque facteur coagulant de la voie endogène, en utilisant un système déplété spécifiquement en ce facteur. Tous les autres paramètres étant introduits en excès, seul le facteur à doser se trouve alors en quantité limitant. Son activité devient quantifiable après comparaison à une courbe de calibration préalablement
<Desc/Clms Page number 29>
Figure img00290001

établie dans les mêmes conditions. Selon l'importance du déficit, le temps de coagulation est plus ou moins allongé (voir exemple pour le facteur Ville).
Figure img00290002
<tb>
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes <SEP> obtenus <SEP> sur <SEP> un <SEP> automate <SEP> d'hémostase <SEP> (STA
<tb> Diagnostica <SEP> Stago).
<tb>
RéférencePRESTlot
<tb> n aux <SEP> APTT <SEP> - <SEP> gallate <SEP> d'éthylène <SEP> glycol
<tb> 991621
<tb> 0 <SEP> 88,2 <SEP> 92,9
<tb> 12 <SEP> 43, <SEP> 4 <SEP> 51, <SEP> 1
<tb> 23 <SEP> 39, <SEP> 4 <SEP> 45, <SEP> 8
<tb> 35 <SEP> 36, <SEP> 8 <SEP> 42, <SEP> 3
<tb> 47 <SEP> 34, <SEP> 7 <SEP> 40, <SEP> 3
<tb> 59 <SEP> 33, <SEP> 6 <SEP> 38, <SEP> 8
<tb> 70 <SEP> 32, <SEP> 6 <SEP> 37, <SEP> 8
<tb> 82 <SEP> 31, <SEP> 6 <SEP> 36, <SEP> 3
<tb> 94 <SEP> 30, <SEP> 6 <SEP> 35, <SEP> 4
<tb> 105 <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> 34, <SEP> 7
<tb> 117 <SEP> 29, <SEP> 7 <SEP> 34, <SEP> 0
<tb>
Figure img00290003

Sensibilité du reactifAPTT-ga)) ate d'ethytene g) yco !, au deficit en FVlllc, comparée à la référence CK-Prest 100. 0 90. 0--Référence : CK PREST lotn"- \ 991621 80. 0"\--------------------------- \ APTT-gallate dethylène glycol 70. 0---------------------------- 60. 0--\--------------------------------------------QI \h ≈50---V--------------------------------------------- 6 6 6 20. 0 10. 0 0. 0 0 20 40 60 80 100 120 140 F Vlllc (%)
<Desc/Clms Page number 30>
Figure img00300001

EXEMPLE 6 : L'activité coagulante d'un réactif APTT nécessite l'action conjointe de deux principes actifs : - une molécule activatrice de la phase contact de la voie endogène. En
Figure img00300002

l'occurrence, il s'agit du galate d'éthylène glycol activé par chauffage ä 80 C.
- un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire, la céphaline, préparation obtenue à partir d'une extraction chloroformique de cervelles de lapin.
- L'activité optimale du réactif APTT ainsi constitue dépend pour autant des concentrations en galate d'éthylène glycol et de céphaline.
- Les tableaux suivants résument les résultats obtenus sur des plasmas représentatifs de différentes pathologies ainsi que sur des contrôles.
Figure img00300003
<tb>
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> seconde
<tb> Gallate <SEP> d'éthylène <SEP> Contrôle <SEP> lot <SEP> n <SEP> 80901 <SEP> Plasma <SEP> Plasma.
<tb> glycol <SEP> [ M] <SEP> Normal <SEP> Patho <SEP> (LA) <SEP> Plasmas <SEP> Heparinés <SEP> déficient.
<tb>
MA <SEP> 030 <SEP> Lot <SEP> 1635 <SEP> lot <SEP> 1726 <SEP> F <SEP> VIIIc
<tb> 0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> 117, <SEP> 4
<tb> 10 <SEP> 130, <SEP> 6 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> > 140,0 <SEP> 121,9
<tb> 25 <SEP> 124, <SEP> 5 <SEP> 103,3 <SEP> 103,3 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> > 140, <SEP> 0 <SEP> 73,1
<tb> 50 <SEP> 88, <SEP> 6 <SEP> 99, <SEP> 6 <SEP> 66,6 <SEP> 73,1 <SEP> > 140,0 <SEP> 44,8
<tb> 75 <SEP> 46, <SEP> 5 <SEP> 67, <SEP> 4 <SEP> 50,4 <SEP> 48,3 <SEP> 86,6 <SEP> 38,6
<tb> 100 <SEP> 38, <SEP> 4 <SEP> 46, <SEP> 2 <SEP> 47,5 <SEP> 48,0 <SEP> 80, <SEP> 0 <SEP> 38,2
<tb> 200 <SEP> 35, <SEP> 2 <SEP> 42, <SEP> 5 <SEP> 46,7 <SEP> 48,5 <SEP> 75,4 <SEP> 37,7
<tb> 300 <SEP> 34, <SEP> 3 <SEP> 39, <SEP> 6 <SEP> 44, <SEP> 2 <SEP> 47,7 <SEP> 73,7 <SEP> 37, <SEP> 5
<tb> 400 <SEP> 32, <SEP> 9 <SEP> 39, <SEP> 6 <SEP> 43,4 <SEP> 47,0 <SEP> 75,1 <SEP> 37, <SEP> 2
<tb> 500 <SEP> 32, <SEP> 6 <SEP> 48, <SEP> 5 <SEP> 43,0 <SEP> 47, <SEP> 3 <SEP> 76,1 <SEP> 37,5
<tb> 1000 <SEP> 33, <SEP> 4 <SEP> 51, <SEP> 5 <SEP> 42,5 <SEP> 47,9 <SEP> 76,3 <SEP> 37, <SEP> 1
<tb> : <SEP> CK <SEP> Prest <SEP> lotn <SEP> 981201 <SEP> 134, <SEP> 2 <SEP> 47, <SEP> 61 <SEP> 38, <SEP> 3 <SEP> 57, <SEP> 1 <SEP> 121, <SEP> 5 <SEP> 38,9
<tb>
Le choix peut être effectué pour des concentrations comprises entre 100 et 1000 M. Notre préférence se situe à une concentration de 100 pM.
<Desc/Clms Page number 31>
Détermination de la dilution optimale de céphaline
Figure img00310001
<tb>
<tb> Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes <SEP> sur <SEP> automate <SEP> d'hémostase <SEP> (STA <SEP> Diagnostica <SEP> Stago).
<tb>
Plasma.
<tb>
Céphaline <SEP> Pool <SEP> de <SEP> A <SEP> lot <SEP> n <SEP> Plasma. <SEP> déficient
<tb> Dilutions <SEP> de <SEP> la <SEP> matière <SEP> PI. <SEP> Normaux <SEP> MA <SEP> 2623 <SEP> häparinö <SEP> F <SEP> Vilic
<tb> première <SEP> lot <SEP> 05-99 <SEP> Lot <SEP> 1680 <SEP> Lot <SEP> GK
<tb> 903901
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 200 <SEP> 44, <SEP> 8 <SEP> 106, <SEP> 7 <SEP> 64,5 <SEP> 60,0
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> 39, <SEP> 7 <SEP> 79, <SEP> 7 <SEP> 60,3 <SEP> 54,7
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> 36, <SEP> 9 <SEP> 52,0 <SEP> 59,4 <SEP> 52,1
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 40 <SEP> 36, <SEP> 4 <SEP> 48,3 <SEP> 59,0 <SEP> 51,1
<tb> 1,5 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> 37, <SEP> 1 <SEP> 45,4 <SEP> 59,3 <SEP> 51, <SEP> 5
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> 37, <SEP> 1 <SEP> 43,1 <SEP> 60,5 <SEP> 52, <SEP> 2
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 20 <SEP> 38, <SEP> 3 <SEP> 41,8 <SEP> 66,3 <SEP> 54, <SEP> 0
<tb> CK <SEP> Prest <SEP> lot <SEP> n <SEP> 981201 <SEP> 33,0 <SEP> 38,6 <SEP> 84,8 <SEP> 49,5
<tb>
EXEMPLE 7 : Choix de concentration du chlorure de Manganèse Dans cet exemple, le temps de coagulation est mesuré avec des réactifs APTT réalisés selon l'invention, et pour lesquels la concentration en chlorure de Manganèse est variable.
Les plasmas testés sont des plasmas Contrôle Qualité. Deux niveaux sont utilisés : un niveau normal et un niveau pathologique.
Le réactif commercial CK Prest est testé en parallèle et constitue la référence.
Figure img00310002
<tb>
<tb>
Temps <SEP> de <SEP> coagulation <SEP> en <SEP> secondes <SEP> obtenus <SEP> sur <SEP> automate <SEP> d'hemostase <SEP> STA <SEP> Diagnostica <SEP> Stago
<tb> Echantillons <SEP> Prest)
<tb> de <SEP> plasmas <SEP> (temps <SEP> de
<tb> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> 20
<tb> référence)
<tb> Contrôle <SEP> 34,8 <SEP> 41,6 <SEP> 31,8
<tb> normal
<tb> Contrôle <SEP> 125, <SEP> 9 <SEP> 51, <SEP> 6 <SEP> 48, <SEP> 2 <SEP> 49, <SEP> 5 <SEP> 56, <SEP> 1 <SEP> 49, <SEP> 7
<tb> Pathol.
<tb>
De préférence, c'est la concentration 10 M qui est retenue.

Claims (38)

  1. Figure img00320001
    Figure img00320002
    REVENDICATIONS 1. Composé de formule suivante :
    Figure img00320004
    dans laquelle : A est choisi parmi les formules suivantes :
    Figure img00320003
    Figure img00320007
    quepxq=2 ;.R représente--0--CH24--OH, ou . ou n
    Figure img00320006
    M+ représentant un cation et q peut être égal ä 1 ou 2 et p est tel
    Figure img00320005
    m étant égal ä 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou, - AAi-AA2-.......-AAr AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
    Figure img00320008
  2. 2. Composé selon la revendication 1, de formule suivante :
    <Desc/Clms Page number 33>
    Figure img00330001
    Figure img00330003
    dans laquelle R représente
    Figure img00330002
    n étant un nombre entier entre 1 et 170.
    Figure img00330004
  3. 3. Composé selon la revendication 1, de formule suivante :
    Figure img00330005
    dans laquelle - R représente lO-CH2-CH1OH avec n étant un nombre entier entre 1 et 170 n - M+ est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2.
    Figure img00330006
  4. 4. Composé selon la revendication 2 ou la revendication 3 répondant à l'une des formules (11) ou (III) dans laquelle R représente
    Figure img00330007
    <Desc/Clms Page number 34>
    n étant un nombre entier entre 1 et 10.
    Figure img00340001
  5. 5. Composé selon la revendication 4 dans lequel n est égal à 1.
  6. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 ä 5 de formule suivante :
    Figure img00340002
    Figure img00340004
    dans laquelle : - A est
    Figure img00340003
    M+ étant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2, - Rest-CH2-CHz-OH.
    Figure img00340005
  7. 7. Composé selon la revendication 1, de formule suivante :
    Figure img00340006
    Figure img00340008
    dans laquelle : - A est
    Figure img00340007
    <Desc/Clms Page number 35>
    M+ étant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2, - R est un reste d'acide aminé naturel ou exotique ou un peptide, de préférence la sérine.
    Figure img00350001
  8. 8. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'au moins deux composés différents de formule :
    Figure img00350002
    Figure img00350004
    les deux composés en question étant identiques ou différents pour le groupement A et étant identiques ou différents pour le groupement R, lesdits groupements A et R étant tels que : - A est choisi parmi les formules suivantes :
    Figure img00350003
    Figure img00350007
    - R représentef OtCH2 OH. DU n
    Figure img00350006
    M+ représentant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2 ;
    Figure img00350005
    m étant égal ä 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 de préférence entre 1 et 50, 1 et 30 ou 1 et 20 ou, - AAi-AA2-.......-AAr
    Figure img00350008
    <Desc/Clms Page number 36>
    AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
    Figure img00360001
  9. 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de composés (IV) et (V), constituant respectivement les formes acide et basique du Gallate d'Ethylène Glycol oxydé (GEGox), de formules suivantes :
    Figure img00360002
    dans lequel M+ est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que pxq=2.
  10. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle comprend les différentes formes du Gallate d'Ethylène Glycol produites par l'équilibre céto-énolique et répondant à la formule
    Figure img00360003
    danslaquelle - A est choisi parmi les formules suivantes :
    Figure img00360004
    <Desc/Clms Page number 37>
    M+ représentant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2, - Rest-CH2-CH2-OH.
    Figure img00370001
  11. 11. Composé susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé comprenant les étapes suivantes : estérification de l'acide gallique avec l'éthylène glycol et récupération d'un des
    Figure img00370002
    produits de la réaction constitue par le gallate d'éthylène glycol (GEG) de formule :
    Figure img00370003
    - déplacement de l'équilibre céto-énolique par mise en contact du GEG avec un milieu alcalin, chauffage à une température comprise entre 70 et 90 C, pendant une durée de 24h.
    Figure img00370004
  12. 12. Composé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le procédé comprend en outre les étapes de : - stabilisation de l'équilibre céto-énolique obtenu par l'ajustement du pH, - recuperation des composés de formule (IV) et (V) en solution, à pH alcalin.
  13. 13. Composé susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - estérification de l'acide gallique, - chauffage de l'ester de l'acide gallique obtenu à une température comprise entre 70 et 90 OC, pendant une durée comprise entre 16 et 24h à pH alcalin, dans une solution tampon, - recuperation des différentes formes de l'ester de l'acide gallique présentes en solution.
    <Desc/Clms Page number 38>
    Figure img00380001
  14. 14. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 11 ä 13, caractérisé en ce qu'il (elle) est sous la forme d'une solution aqueuse.
  15. 15. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de composés susceptibles d'être obtenus selon un procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
  16. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend majoritairement du GEGox basique de formule :
    Figure img00380002
    M+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
  17. 17. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16, caractérisée en ce qu'elle contient sous la forme d'un équilibre stabilisé, les composés de formules (IV) et (V) et en ce qu'elle a un pH physiologiquement acceptable.
  18. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16, ou 17, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange des composés de formules (IV) et (V) et en ce que son pH est compris entre 7,6 et 7,8.
  19. 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16 à 18, capable d'activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma, comprenant en outre un tampon choisi parmi les tampons MOPS ou TRICINE.
  20. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16 à 19, caractérisée en ce que les composés qu'elle contient sont en concentration suffisante pour activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma.
    <Desc/Clms Page number 39>
    suffisante pour activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma.
    Figure img00390001
  21. 21. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le cation est un cation métallique.
  22. 22. Composé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le cation métallique est choisi parmi Mn2'Cu+ ou Co
  23. 23. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20, caractérisée en ce que le cation est un cation métallique.
  24. 24. Composition selon la revendication 23, caractérisée en ce que le cation métallique est choisi parmi Mn2+, Cu+ ou Co2+.
  25. 25. Système de réactifs utilisable pour l'examen in vitro de la coagulation endogène, comprenant un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 11 à 14 ou 21,22 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23,24 dans des conditions telles qu'il (elle) constitue un activateur de la coagulation endogène, ledit système comprenant en outre un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire.
  26. 26. Système de réactifs selon la revendication 25, caractérisé en ce que
    Figure img00390002
    l'activateur de la coagulation endogène comprend du GEG sous forme activée répondant ä la formule :
    Figure img00390003
    Figure img00390006
    - R représente O-fCH2OH. ou L eno
    Figure img00390005
    dans laquelle - M+ est un cation, q est égal ä 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2,
    Figure img00390004
    <Desc/Clms Page number 40>
    AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
    m étant égal ä 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou, - AAi-AA2-.......-AAr
    Figure img00400001
  27. 27. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23,24 ou réactifs selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que sa concentration en GEG est comprise entre 100 et 1000 uM.
  28. 28. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23,24 ou d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, pour la préparation d'un test pour l'examen in vitro de la coagulation endogène.
  29. 29. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23,24 ou d'un système de réactifs selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26 pour l'exploration de la coagulation par la voie endogène.
  30. 30. Utilisation selon la revendication 29 dans laquelle on détermine le temps de thromboplastine partiellement activée (APTT).
  31. 31. Utilisation selon la revendication 28 dans laquelle on détermine le temps de coagulation du sang complet activé.
  32. 32. Utilisation selon la revendication 28 dans laquelle on détermine le temps de coagulation du plasma activé.
  33. 33. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23,24 ou d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, pour l'examen des facteurs de coagulation impliqués dans la voie endogène de la coagulation.
  34. 34. Procédé de préparation d'un composé de formule suivante :
    <Desc/Clms Page number 41>
    Figure img00410001
    Figure img00410003
    dans laquelle - A est choisi parmi les formules suivantes :
    Figure img00410002
    Figure img00410006
    - réaction de l'acide gallique, en présence d'un compose ayant une fonction alcool, - mise en contact de l'ester de l'acide gallique obtenu, en milieu alcalin, pour former un composé de formule
    Figure img00410005
    M+ représentant un cation, q étant égal ä 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2 et - R représente n étant un nombre entier entre 1 et 170, ledit procédé comprenant les étapes de :
    Figure img00410004
    <Desc/Clms Page number 42>
    Figure img00420002
    - addition d'un cation métallique Mq+ (avec q égal à 1 ou 2), dans des conditions permettant la formation d'un complexe de formule :
    Figure img00420001
    - stabilisation de l'équilibre obtenu, entre les composés (tut) et (III) ä un pH physiologiquement acceptable, par l'addition d'un tampon, - recuperation de la solution obtenue.
    Figure img00420003
  35. 35. Procédé selon la revendication 34 caractérisé en ce que l'estérification est réalisée en présence d'éthylène glycol pour former le gallate d'éthylène glycol (GEG), et en ce que l'on récupère un mélange des formes du GEG impliquées dans l'équilibre céto-énolique.
  36. 36. Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que l'on récupère la forme soluble du GEG répondant à la formule
    Figure img00420004
    M+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
  37. 37. Procédé pour la préparation d'un composé de formule
    Figure img00420005
    dans laquelle
    <Desc/Clms Page number 43>
    Figure img00430002
    A est choisi parmi les formules suivantes :
    Figure img00430001
    M+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q =2.
    Figure img00430003
    - R représente tO-CH2-CH2--OH avec n étant un nombre entier entre 1 et 170 In comprenant les étapes de : - estérification de l'acide gallique, - chauffage de l'ester de l'acide gallique obtenu à une température comprise entre 70 et 90oC, pendant une durée comprise entre 16h et 24h à pH alcalin, dans une solution tampon, récupération des différentes formes de l'ester de l'acide gallique présentes en solution.
  38. 38. Méthode de mesure du temps de thromboplastine partiellement activée (APTT) comprenant les étapes de : - la mise en contact d'un échantillon de plasma pauvre en plaquettes avec un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 11 à 14 ou 21,22 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à
    20 ou 23,24 ou un système de réactifs selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, en présence de substituts des phospholipides de la membrane plaquettaire, dans des conditions permettant l'activation de la voie endogène de la coagulation, - l'addition d'ions Ca en quantité comprise entre 20 et 25 mM, - la mesure du temps nécessaire ä la transformation du fibrinogène en fibrine.
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