KR100292618B1

KR100292618B1 - C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4a의 대량 정제 및 활성화 방법

Info

Publication number: KR100292618B1
Application number: KR1019970060515A
Authority: KR
Inventors: 민창희; 오영림; 이태규
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1997-11-17
Publication date: 2001-06-15
Also published as: KR19990040192A

Abstract

본 발명은 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A의 저해제를 개발하기 위하여 필요한 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A를 고순도 및 고활성도를 가지도록 하면서 비활성 조건에서 대량으로 정제하는 방법 및 활성화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제 및 활성화 방법은 대장균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 형성되는, 대장균에서 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 비활성 상태의 봉지체(Inclusion body)를 수용화하는 단계, 활성화하는 단계 및 분리하는 단계로 이루어진다.

Description

Ｃ 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4Ａ의 대량 정제 및 활성화 방법

본 발명은 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제 및 활성화 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 비구조 단백질 3-4A를 발현시킨 후, 비활성 상태에서 대량으로 정제하고 이를 활성화 하는 방법에 관한 것이다.

따라서 본 발명에 의하여 C 형 간염 바이러스 치료제로 비구조 단백질 3-4A의 저해제 개발에 절대적으로 필요한 비구조 단백질 3-4A를 대량으로 얻을 수 있다.

C 형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus)는 비 A 형 또는 비 B 형 간염을 유발하는 것으로 알려진 간염의 주요 원인이 되는 바이러스로서, 사람에 침입하여 급성 또는 만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여한다고 한다 (Alter, H. J. et al., 1989, N. Eng. J. Med, 321 : 1494-1500). C 형 간염 바이러스는 전 세계 인구의 1% 가 감염되어 있는 것으로 보고된 바 있으며(Purcell, 1994, FEMS Microbial. Rev, 14 : 181-192 ; van der Poel, 1994, Hepatitis C Virus : Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, H. W. Reesink ed., pp.137-193), 새롭게 C 형 간염 바이러스에 감염되는 환자의 수가 매년 약 백만명 정도에 이르는 것으로 추정된다 (Alter, H. J., 1988, A. J. Zuckerman ed., Viral Hepatitis and Liver Disease, pp.537-542). 또한 C 형 간염 바이러스에 감염된 환자들 중 약 40-50% 는 간염이 진전되어 만성 간염 환자가 되고, 약 20% 정도는, 더욱 진전되어 간경변 또는 간암 환자가 되는 것으로 알려져 있다 (Dienstag, J.L., 1986, Semin. Liver. Dis, 6 : 67-81).

C 형 간염 바이러스는 비 A 형 또는 비 B 형 간염 환자의 혈장을 침팬지에 접종시켜 분리함으로써 회수할 수 있다고 보고되었다(Bradley, D. W. et al., 1988, Gatroenterology, 88 : 773-779). 이렇게 얻어진 C 형 간염 바이러스는 9400 염기로 이루어진 양성가닥 리보핵산 형태의 유전자를 가지고 있으며, 이로부터 3010-3033 개의 아미노산으로 이루어지는 다단백질 (polyprotein)을 만들어 낸다 (Choo, Q. L. et al., 1989, Science, 244 : 359-362, Choo, Q. L. et al., 1991, PNAS, 88 : 2451-2455). 상기와 같은 유전자 구조를 고려할 때 C 형 간염 바이러스는 플래비바이러스 (flaviviruses) 또는 페스티바이러스 (pestiviruses)와 유사하므로, C 형 간염 바이러스는 플래비비리대 (Flaviviridae)에 속하는 새로운 속 (genus)으로 분류되었다 (van Doorn, 1994, review. J. Med. Virol, 43 : 345-356).

＆도 1＆은 C 형 간염 바이러스의 다단백질과 비구조 단백질 3 분해효소의 기능을 나타낸 것이다. C 형 간염 바이러스의 다단백질은 아미노 말단으로부터 core-E1-E2-NS2-NS3- NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 의 순서로 구성되어 있다. 즉, 다단백질상의 아미노 말단에는 바이러스의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)와 외피 (envelope)의 구성요소인 구조 단백질 (core, E1, E2)이 존재하고, 그의 카복시 말단 쪽에는 C 형 간염 바이러스가 증식하는데 필수적인 비구조 단백질들 (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)이 위치하고 있다. 이 전구체 다단백질에 세포내 시그날 펩티다제 (signal peptidase) 및 바이러스에 존재하는 단백질 분해효소인 비구조 단백질 2-3 및 비구조 단백질 3(또는 비구조 단백질 3-4A)이 작용하여 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써 9개의 숙성된 바이러스 단백질을 만들어 낸다. 구체적으로 비구조 단백질 3은 비구조 단백질 3 과 4A 사이, 4A 와 4B 사이, 4B 와 5A 사이, 5A 와 5B 사이에 존재하는 4개의 절단 부위에 작용하는 것으로 밝혀져 있다 (Hijikata et al., 1991, PNAS, 88 : 5547-5551, Bartenschlarger et al., 1994, J.Virol, 68 : 5045-5055, Grakoui et al., 1993, J. Virol, 67 : 1385-95, Tomei et al., 1993, J.Virol, 67 : 4017-4026). 또한 이러한 비구조 단백질 3은 조효소인 비구조 단백질 4A 와 결합하고 결합한 조효소와 상호 작용하여 그의 효소 활성이 증가한다고 보고되어 있다 (Shimizu, Y. et al., 1996, J. Virol, 70 : 127-132, Love R. A. et al., 1996, Cell. 87 : 331-342).

C 형 간염 바이러스의 만성적 감염을 효과적으로 치료하기 위하여 보편적인 치료법은 아직까지 개발되어 있지 않으며, 거의 유일하게 인터페론-알파를 C 형 간염 바이러스의 치료제로서 투여하는 것이 시행되고 있다. 그러나 상기 간염 환자에게 인터페론-알파를 투여하는 경우 약 20% 의 환자만이 그 치료 효과를 보인다 (Hoofnagal, J. H., 1994, And. Intern. Med., 39 : 241-275). 또한 세계적으로 가장 널리 발견되는, 특히 아시아, 아메리카, 유럽 지역에서 C 형 간염을 유발하는 주된 바이러스 유형이며, 간경화 또는 간암으로 이행되는 진전율이 높은 C 형 간염 바이러스-1b 형에는 그 효과가 낮아 C 형 간염 바이러스에 의한 간염을 치료하는데 널리 사용할 수 없는 문제점이 있다 (van Doorn, L. J., 1994, review, J. Med. Virol. 43 : 345-356). 또한 최근에 인터페론-내성 서열(Interferon resistance sequence)을 갖는 HCV에 대해서는 효과가 없는 것으로 보고되고 있다. 따라서 C 형 간염 바이러스의 감염에 대한 새로운 치료제 또는 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3은 전구체 다단백질을 절단하여 숙성된 비구조 단백질 3, 4A, 4B, 5A 및 5B 를 생산하는 매우 중요한 작용을 담당하고 있으며, 비구조 단백질 3-4A는 상기 다단백질을 절단하는데 있어서 향상된 절단 능력을 보여주고 있기때문에 새로운 치료법의 중요한 대상이 되고 있다(Kim, J. L. et al., 1996, Cell, 87 : 343-355). 이러한 비구조 단백질 3-4A는 단일 단백질 내에 세린계 단백질 분해효소, 뉴클레오티드 탈인산화 효소 (NTPase) 및 RNA 헬리카제 (helicase) 활성을 나타내는 아미노산 모티프를 갖는 비구조 단백질 3과 54개의 아미노산으로 구성된 비구조 단백질 4A가 콤플렉스를 이루는 구조로 되어 있다. 헬리카제 기능은 비구조 단백질 3의 카복시 말단에 존재하고, 단백질 분해효소 기능은 아미노 말단에 존재하는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 1995, BBRC 215 : 160-165, Han et al., 1995, J. Gen. Virol 76 : 985-993).

C 형 간염 바이러스가 증식하는 과정에서 비구조 단백질 3 의 단백질 분해효소 활성 부위는 다단백질을 절단하여 바이러스 입자가 생성되는데 중요한 작용을 하므로, 이 효소 활성 부위를 포함하는 비구조 단백질 3 을 얻어 그에 대한 저해제 등을 선별할 수 있다면 C 형 간염에 대한 효과적인 치료제를 용이하게 개발할 수 있다. 또한 상기에서 언급한 바와 같이 이러한 비구조 단백질 3을 그의 활성을 증가시키는 조효소인 비구조 단백질 4A 와 결합된 형태로 얻는다면 C 형 간염 치료제를 개발하는데 매우 유용할 것이다.

이에 본 발명자들은 보다 효과적인 C 형 간염 치료제를 개발하기 위하여, 한국 특허출원 제97-5867호를 출원한 바 있다. 상기 본 발명자들의 특허출원 발명은 C 형 간염 바이러스의 유전자를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 비구조 단백질 3-4A 유전자를 얻고, 이를 아미노 말단에 히스티딘 표지가 첨가된 재조합 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터에 클로닝한 다음, 이 발현 벡터를 이용하여 상기 비구조 단백질 3-4A 를 대장균에서 대량 생산하고, 히스티딘 표지 친화 칼럼 등으로 분리·정제함으로써 제조되는, C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 활성 부위를 포함하는 비구조 단백질 3-4A 및 그의 제조방법 등에 관한 것이다.

그러나 상기 본 발명자들의 특허출원 발명은 대장균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 상등액을 취하여 정제, 분리하여 발현된 비구조 단백질 3-4A를 얻었으나, 그 양이 극히 적고 상기 단백질 순도가 떨어지며 낮은 활성도를 보여서 비구조 단백질 3-4A의 저해제 개발에 필요한 양을 공급하기 어려우며 구조 연구나 많은 화합물의 약효 평가를 수행하는데 직접적인 제약이 된다는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 상기 본 발명자들의 선출원 발명에 의하여 대장균에서 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 상기 선출원 발명과는 다른 방법으로 정제하는 방법을 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A의 저해제를 개발하기 위하여 필요한 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A를 고순도 및 고활성도를 가지도록 하면서 비활성 조건에서 대량으로 정제하는 방법 및 활성화하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 C 형 간염 바이러스의 다단백질과 비구조 단백질 3의 단백질 분해효소기능을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 발현, 정제 및 활성화 과정에 따라 전기영동한 결과를 나타낸 것으로서,

레인 1은 분자량 표시자(Marker)

레인 2는 대장균에서 발현된 전체 세포의 전 단백질

레인 3은 수용성 단백질

레인 4는 비수용성 단백질

레인 5는 비수용성 단백질을 수용화시킨 후

레인 6은 비구조 단백질 3-4A의 활성화 단계 후

레인 7은 Ni-킬레이팅 히스티딘 친화 젤 크로마토그래피 단계를 거친 후의 전기영동 결과이다.

본 발명의 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제방법은 대장균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 형성되는, 대장균에서 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 비활성 상태의 봉지체(Inclusion body)를 수용화하는 단계 및 분리하는 단계로 이루어진다.

또한 본 발명의 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제 및 활성화 방법은 대장균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 형성되는, 대장균에서 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 비활성 상태의 봉지체(Inclusion body)를 수용화하는 단계, 활성화하는 단계 및 분리하는 단계로 이루어진다.

본 발명은 대장균에서 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 비활성 상태의 봉지체(Inclusion body)를 정제하고 활성화함으로써 고활성도 및 고순도를 가지는 상기 비구조 단백질 3-4A를 대량으로 얻는다.

본 발명의 비구조 단백질 3-4A는 본 발명자들의 특허출원 제97-5867호에 기재된 방법에 의하여 대장균에서 발현시킬 수 있다. 상기 특허출원 발명에 의하여 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조단백질 3-4A는 아미노산말단에 6개의 히스티딘이 표지되어 있다. 발현된 상기 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 대장균 세포를 초음파 분쇄기 등을 이용하여 파쇄한다. 파쇄되어 형성되는 용액을 원심분리하고, 원심분리에 의하여 침전하여 형성된 봉지체(Inclusion body)를 펠릿(Pellet) 형태로 얻는다.

상기 펠릿을 완충용액으로 세척하고 수용화한다. 수용화는 통상적으로 고농도의 우레아 완충용액을 사용하여 수행할 수 있다. 수용화한 후 원심분리하여 상등액을 취하여 다음 과정인 활성화 및 분리과정을 수행한다.

활성화 과정은 수용화후 분리과정전에 수행할 수 있으며, 분리과정후에 수행할 수도 있다. 활성화는 수용화를 고농도의 우레아 완충용액을 사용하여 수행한 경우에 투석막을 사용하여 우레아를 서서히 제거하여 비활성의 비구조 단백질 3-4A가 리폴딩(refolding)과정을 거쳐 활성화 상태가 되도록 투석을 수회 반복함으로써 달성할 수 있다.

분리과정은 겔 크로마토그래피와 같은 분리수단을 사용함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 비구조 단백질 3-4A는 아미노말단에 6개의 히스티딘이 표지되어 있으므로 Ni-킬레이팅 히스티딘 친화 겔 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 이 때 사용되는 용출용액는 이미다졸을 포함하는 완충용액이 바람직하며 이미다졸의 농도 구배에 의하여 비구조 단백질 3-4A를 분리할 수 있다. 또한, 세파크릴(Sephacryl) 200 겔 크로마토그래피 등을 사용할 수도 있다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

＆〈실시예〉 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A의 정제＆

＆(단계 1) 대장균에서 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A 유전자의 발현＆

특허 출원 제97-5867호에서 제조된 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A의 발현벡터를 이용하여 발현 숙주 대장균 BL21(DE3)를 형질변환시키고 비구조 단백질 3-4A의 발현을 위해 앰피실린 함유 액체 루리아(Luria) 배지를 이용하여 종배 배양 및 2L 배양하였다. 즉, 형질전환된 대장균 세포를 50㎍/㎖의 앰피실린이 함유된 액체 루리아 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액 5㎖를 다시 500㎖의 액체 루리아 배지로 옮겨서 30℃에서 약 6시간 동안 진탕 배양하여 배양액의 흡광도가 600nm에서 약 0.5 가 될 때 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG 를 첨가하였다. IPTG를 첨가한지 3시간이 경과한 다음 원심분리기 (Beckman J2-21 rotor ; JA10)를 이용하여 6,000rpm 에서 10분간 원심분리하고 대장균 세포 침전물을 수거하였다.(＆도 2＆의 2 레인)

＆(단계 2) 대장균에서 한국형 C 형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A의 정제＆

상기와 같이 배양하여 얻은 대장균을 완충용액(20mM 인산나트륨 pH 7.6, 300mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 10% 글리세롤, 0.1% 트윈-20, 1mM β-머캅토에탄올)에 현탁시킨 다음, 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기(Heat Systemas -Ultrasonics, Inc. W225, 미국)를 이용하여 50% 의 출력으로 2분간 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이 용액을 원심분리기 (Beckman J2-21 rotor ; JA20, 미국)로 15,000 rpm 에서 30분간 원심분리한 후 펠릿(Pellet)을 얻었다(＆도 2＆의 4 레인).

상기에서 얻은 펠릿을 완충용액(20mM 트리스 pH 8.0, 300mM NaCl, 1mM MgCl₂, 10% 글리세롤, 0.1% 트윈-20, 1mM β-머캅토에탄올)으로 씻어낸 후 15,000rpm에서 원심분리하여 펠릿을 얻고, 이를 다시 완충용액(20mM 트리스 pH 8.0, 4M 우레아)으로 씻어낸 후 15,000rpm에서 원심분리하여 펠릿을 다시 얻은 후, 이를 완충용액(20mM 트리스 pH 8.0, 8M 우레아)에 수용화시킨 후, 15,000rpm에서 원심분리한 후 상등액을 취하였다.(＆도 2＆의 5 레인)

＆(단계 3) 비활성 상태의 한국형 C형 간염 바이러스 비구조 단백질 3-4A의 활성 화＆

상기에서 얻은 비활성 비구조 단백질 3-4A를 완충용액(20mM HEPES pH 7.5, 8M 우레아, 1mM DTT, 0.25mM 황산아연)으로 0.05mg/ml 농도로 희석시키고, 투석막(MWCO 6kDa, Spectrum사 Spectra/Por 1)을 사용하여 완충용액(20mM HEPES pH 7.5, 1mM DTT, 0.25mM 황산아연) 2L에 대하여 투석시켜 우레아를 서서히 제거하여 비활성 상태의 비구조 단백질 3-4A가 리폴딩(refolding) 과정을 거쳐 활성화 상태의 비구조 단백질 3-4A가 되도록 하였고, 이를 4회 반복하여 우레아를 완전히 제거하였다. 원심분리기(Beckman L8-80M ultracentrifuge, rotor SW28)를 사용하여 25,000rpm에서 60분간 원심분리하고 침전물을 제거하여 활성화된 비구조 단백질 3-4A를 얻었다.(＆도 2＆의 6 레인)

＆(단계 4) Ni-킬레이팅 히스티딘 친화(Ni-chelating Histidine Affinity) 젤 크로마토그라피 단계＆

상기에서 얻은 용액을 Ni-킬레이팅 히스티딘 친화 젤 크로마토그라피로 분리하기 위하여 같은 조성의 완충용액으로 미리 평형시켜 놓은 2ml의 히스티딘 친화 수지 칼럼에 흘려 보내어 6개의 히스티딘이 아미노 말단에 융합되어 있는 비구조 단백질 3-4A 를 수지에 결합시켰다. 비특이적 결합으로 약하게 부착되어 있는 단백질 등은 5mM, 20mM 이미다졸을 포함하는 평형 완충용액 10-20ml로 씻어내었다.히스트딘 표지가 결합된 단백질은 500mM 이미다졸을 함유하는 완충용액 5ml을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 용출시켜 비구조 단백질 3-4A를 90% 이상의 순도로 약 2mg을 얻었다(＆도 2＆의 7 레인)

＆(단계 5) 비구조 단백질 3-4A의 활성도 측정＆

상기 단계 2, 단계 3에서 정제, 활성화된 비구조 단백질 3-4A의 분해 활성도를 형광기질을 사용하여 확인하였다. 형광기질은 10개의 아미노산 4A/4B 펩티드의 아미노말단에 크로모퍼인 DABCYL 기, {4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조일}을, 카르복시말단의 곁가지에 형광기인 EDANS 기, {5-(2-아미노에틸아미노)-1-나프탈렌술포닉 산}을 함유하고 있어서 기질이 분해되면 공명 에너지 전이효과가 중단됨으로 형광현상이 증가하는데, 이를 형광 분광기를 이용하여 기질의 분해속도를 측정하였다. 사용된 기질의 아미노산 서열은 (DABCYL)-DEMEECASHD-(EDANS)이고, 비구조 단백질 3의 효소 분해 활성 효과에 의해 (DABCYL)-DEMEEC와 ASHD-(EDANS)로 분해된다. 최적화된 활성도는 50mM 트리스, 10mM DTT, 2% CHAPS {(3-[(3-콜라미도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판-술포네이트)}, 50% 글리세롤을 포함하는 Ph 7.6의 완충용액이며, 기질 1-6μM, 비구조 단백질 3-4A 10nM, 10% DMSO를 포함하는 200㎕용액에서 분해 반응속도를 30℃에서 10분동안 연속적으로 측정하였다. 형광 분광기는 아민코-보우만 시리즈 2 루미네슨스 스펙트로미터(AMINCO-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer)를 사용하였고, 사용된 기질에 대하여 여기 파장 351nm, 방출 파장 480nm를 사용하였다. 그리고 표 1에서 비구조 단백질 3-4A의 활성도를 나타내었다.

비구조 단백질 3-4A의 활성도에 대한 속도론적 데이터

	데이터	비구조 단백질 3δ-4A¹⁾	비구조 단백질 3-4A²⁾
4A/4B 기질	K_m(μM)³⁾	40.5	29.0
	K_cat(min^-1)³⁾	3.5	4.23
	K_cat/K_m(M^-1sec^-1)³⁾	1460	2430
1) 비구조 단백질 3δ-4A : 비구조 단백질 3 전효소중 1-180 아미노산으로 구성된 분해효소와 비구조 단백질 4A의 복합체를 의미하며, 데이터는 이 분해효소에 대한 보고된 갑들이며, 사용된 기질은 4A/4B 기질인 DEMEECASHLPYK인 13-머 펩티드이다(A. Urbani et al. J. Biol. Chem., 1997, 272, 9204-9209).2) 본 발명에 의하여 정제, 활성화시켜 얻은 비구조 단백질 3-4A를 가리킨다.3) 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식을 만족시키는 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk Plot)으로부터 얻은 속도론적인 값이다.

표 1에서 보는 바와 같이, 이미 보고된 비구조 단백질 3-4A에 대하여 본 발명에 의하여 정제 및 활성화된 비구조 단백질 3-4A의 효소분해능력이 탁월함을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 대장균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 형성되는, 대장균에서 발현된 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 비활성 상태의 봉지체(Inclusion body)를 수용화하는 단계, 활성화하는 단계 및 분리하는 단계로 이루어지는 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제 및 활성화 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 고순도 및 고활성도를 가지는 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A를 대량으로 얻을 수 있다. 그리하여 구조 연구나 많은 화합물의 약효 평가의 수행 등 비구조 단백질 3-4A의 저해제 개발에 필요한 비구조 단백질 3-4A를 대량으로 공급할 수 있다.

Claims

C형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제방법에 있어서,

i) 대장균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 비구조 단백질 3-4A를 포함하는 비활성 상태의 봉입체(Inclusion body)를 분리하는 단계;

ii) 상기의 비활성 상태의 봉입체를 20mM 트리스(pH 8.0) 및 8M의 우레아를 포함하는 완충용액을 사용하여 수용화하는 단계;

iii) 비활성 비구조 단백질 3-4A를 우레아를 포함하는 완충용액을 사용하여 희석시키고, 투석막을 사용하여 완충용액으로 투석시켜 리폴딩시킴으로써 활성화하는 단계; 및,

iv) 활성화된 비구조 단백질 3-4A를 Ni-킬레이팅 히스티딘 친화 젤 크로마토 그래피를 사용하여 분리한 후 이미다졸을 함유하는 완충용액을 용출용액으로 사용하여 이미다졸의 농도구배에 의하여 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 C 형 간염 바이러스의 비구조 단백질 3-4A의 대량 정제방법.