CN103305550A - 一种检测AP2α转录因子活性的报告基因载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种报告基因载体，含有AP2α特异性顺式作用元件，其特征在于所述AP2α特异性顺式作用元件是由4个串联的GCCCGCGG核苷酸序列组成，4个GCCCGCGG核苷酸序列之间由核苷酸序列TT串联连接。本发明所设计的报告基因载体易于制备，操作简单，可有效转染不同哺乳动物细胞，重复性好；在检测显性负性突变体介导转录因子的活性变化时，较EMSA更为准确可靠。适用于体外研究AP2α转录因子在各种哺乳细胞中的生物学活性的。

Description

一种检测AP2α转录因子活性的报告基因载体

  

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种携带转录因子AP2α顺式作用元件的荧光素酶报告基因逆转录病毒载体及其构建方法。 

技术背景

转录因子AP2是一个分子量为52-kDa 的转录激活因子，定位于细胞核，具有独特的蛋白质分子结构，通常以二聚体形式结合到DNA丰富GC的元件上，特异性调控基因表达，特异性调控基因表达，参与脊椎动物生长发育，细胞增殖分化，并可双向调节肿瘤的发生，而其自身也受到多种信号分子及蛋白的影响。研究发现AP2转录因子对视黄酸特别敏感，可受视黄酸信号途径的调控，在视黄酸诱导的形态发生中，AP2的mRNA水平与视黄酸敏感的发育时期呈正相关，视黄酸核受体RARs可调控AP2的表达，用拮抗剂阻止RAR功能导致胚胎小鼠眼组织中AP2阳性细胞明显减少。

现已经有5个AP2基因被确定，分别编码AP2α、AP2β、AP2γ、AP2δ和AP2??蛋白，各亚型的表达与特定的细胞类型有关。其中，AP2α与神经系统的发育密切相关。在小鼠胚胎发育中，AP2α主要表达于神经脊细胞，颅面部及脊柱的感觉神经节中，调控与周围神经系统发育相关的基因转录。AP2α敲除可导致小鼠在胚胎期死亡，并出现无脑畸形和神经管发育缺陷。AP2α还参与多种神经相关基因的调控，如：前脑啡肽原，乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱转移酶、烯醇化酶、突触蛋白、多巴胺羟化酶和儿茶酚胺合成酶等。AP2α在成年鼠脑内的表达模式提示AP2α除了在早期发育过程起重要作用外，对神经元的表型决定和功能特征的维持也有举足轻重的作用。我们的前期实验发现，全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可促进骨髓间充质干细胞向神经细胞方向，可能是通过调控AP2α的转录活性来实现的，我们希望进一步探讨AP2α的转录活性在维甲酸信号通路调控MSCs神经分化中的作用及具体的分子机制。

目前，检测AP2α的转录活性的方法是采用显性负性突变体。显性负性突变体是功能冗余的基因突变，不仅自身结构发生变化失去正常的生物学功能，还能与同一细胞内的野生型信号转导蛋白进行竞争性抑制，从而阻断野生型蛋白的生物学作用。AP2α具有特殊的蛋白结构，其N端是富含脯氨酸和谷氨酸的反式转录激活域（TAD），C端为碱性DNA结合区（basic DNA binding domain, bDBD）和碱性螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix, HLH )二聚体结构，与特异的DNA序列结合，调控下游靶基因的转录。采用缺失突变的方法分别构建缺失bHLH区域和缺失TAD区域的两个显性负性突变体腺病毒，感染MSCs，EMSA检测发现dnAP2α-△TAD对AP2α特异性顺式作用元件DNA序列的结合显著增多，由于dnAP2α-△TAD保留了DNA结合域，EMSA不能如实反映该突变体对AP2α转录活性的抑制。

发明内容

本发明的一个目的在于获得一种携带转录因子AP2α顺式作用元件的荧光素酶报告基因逆转录病毒载体，能快速、方便、准确地检测细胞中的AP2α转录因子活性。

一种报告基因载体，含有AP2α特异性顺式作用元件，其特征在于所述AP2α特异性顺式作用元件是由4个GCCCGCGGTT串联组成。

上述4个GCCCGCGG核苷酸序列的串联连接，带来对AP2α的高亲和性，但是相对的提高了产生非特异性的错误识别的几率，而影响AP2α的转录活性的检测；通过巧妙设置序列TT，使之不易在顺式作用元件内部产生错误识别。所示报告基因载体对于转录因子AP2α的特异性结合力强，且不易产生错误识别，具有高亲和力和高特异性的特点。

上述报告基因载体，含有SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5互补序列。

上述报告基因载体来源于pBGLuc逆转录病毒载体。

上述报告基因载体携带天然分泌型报告荧光素酶Gaussia luciferas，以及杀稻瘟菌素抗性基因。

上述报告基因载体，其结构如图1所示。AP2α特异性顺式作用元件插入至荧光素酶Gaussia luciferase报告基因上游、5’-LTR可启动杀稻瘟菌素抗性基因的表达，抗性筛选可用于建立稳定细胞株。

本发明的另外一个目的在于提供上述报告基因载体的制备方法，主要通过以下步骤实现：

（1）体外退火获得4个串联的所述AP2α特异性顺式作用元件的DNA双链，双链两端带有BamHⅠ和MluⅠ酶切位点；

（2）将上述DNA双链定向克隆至pBGLuc逆转录病毒载体，采用杀稻瘟菌素抗性基因序列及AP2α特异性顺式作用元件匹配的成对引物进行鉴定，测序正确后获得pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体。

具体地，上述报告基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）获取AP2α特异性顺式作用元件：设计4个串联的AP2α特异性顺式作用元件序列，上游和下游序列分别符合SEQ ID NO.1 & SEQ ID NO.2的核苷酸序列，体外退火获得DNA双链；退火后形成的双链DNA片段带有BamHⅠ及MluⅠ的酶切位点。

（2）pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体的构建：将DNA双链片段定向插入至逆转录病毒载体pBGLuc的Gaussian luciferase基因上游，采用SEQ ID NO.3 & SEQ ID NO.4分别作为上游和下游引物进行鉴定；

（3）检测MSCs中AP2α的转录活性：将pBGLuc-AP2α-RE转染大鼠MSCs，腺病毒介导显性负性突变体过表达，再加入ATRA诱导24小时后检测培养上清中分泌的荧光素酶活性。

步骤2）中的逆转录病毒载体pBGLuc，携带一种大型海洋桡脚类动物的新型荧光素酶Gaussia luciferase基因，可在哺乳动物细胞中表达。表达的Gaussia luciferase蛋白为小分子的单肽链（185aa），包含分泌性信号肽，可直接取上清检测，无须裂解细胞，与底物反应灵敏度好，发光强度高，不受ATP影响，具有很强的稳定性和重复性。pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体为逆转录病毒载体，携带的基因可插入细胞基因组DNA，BSD抗性可用于制备稳定细胞株。

步骤3）是步骤2）获得的pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体的应用，与EMSA方法获得的检测结果进行比较，报告基因检测AP2α转录活性的结果更为准确。

有益效果

1.        本发明获得的pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体带有4个串联的AP2α特异性顺式作用元件，可用于检测AP2α转录因子活性，简单方便，灵敏度高，稳定性好，重复性强。与EMSA相比较，对显性负性突变体介导的转录因子活性下调，该报告基因检测方法更为真实可靠，并且价格低廉。

2.        本发明涉及的逆转录病毒载体pBGLuc，携带分泌型的Gaussia luciferase基因，无须裂解细胞，直接取少量细胞培养上清即可进行检测，只设置一次实验，就能实现动态的检测，操作简单方便。

3.  本发明获得的pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体可作为一般的真核表达质粒，通过脂质体转染检测细胞中AP2α转录因子的活性，也可通过制备逆转录病毒，通过BSD抗性筛选获得稳定表达AP2α特异性顺式作用元件的稳定细胞株。

4. 本发明涉及的基因AP2α是重要的核转录因子，受多种信号转导途径 分子的调控，该报告基因载体是研究AP2α在胚胎发育、组织器官形成、细胞增殖分化及肿瘤发生发展中的生物学作用的一个重要分子手段。

5.  本发明所采用的载体pBGLuc是一种逆转录质粒，全长6110bp，除了在细菌中扩增的必须基因外，还有5’，3‘-LTR，可插入细胞基因组DNA，同时含有杀稻瘟菌素（Blasticidin, BSD）抗性，使细胞能在高浓度的BSD中存活，便于筛选制备稳定细胞株。该质粒含有Gaussia-luciferase基因，但是上游没有启动子，不能有效激活基因的表达。AP2α可识别特异性的高亲和力的识别SEQ ID NO.1所述序列，激活相应靶基因的转录调控，我们将SEQ ID NO.1序列插入荧光素酶报告基因上游，并将这段基因导入细胞。当细胞中的AP2α转录活性变化时，结合效应元件，调控荧光素酶基因的表达，GLuc的活性就间接反应了细胞中AP2α转录活性的高低。同时，GLuc来源于海洋桡脚类动物Gaussia princeps，是一种新型的天然分泌型报告荧光素酶，能释放到培养上清中，只需要设置一次试验，就可以进行动态的检测。该报告基因能代替EMSA进行AP2α转录活性的检测，操作简单方便，重复性高，准确性强，为探讨AP2α的生物学活性研究提供了重要的分子手段。

附图说明

图1为pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体结构的示意图。

图2是实施例2中pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体菌落PCR筛选的电泳图

图3是实施例2中pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体PCR及酶切的电泳图。(M₁. DNA marker D2000；M₂. λ-HindⅢmarker; 1. 以pBGLuc为模板的PCR产物；2. 以pBGLucpBGLuc-AP2α-RE质粒1为模板的PCR产物; 3. 以pBGLuc-AP2α-RE质粒2为模板的PCR产物; 4. pBGLuc经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后产物; 5. pBGLucpBGLuc-AP2α-RE质粒1经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后产物; 6. pBGLucpBGLuc-AP2α-RE质粒2经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后产物)。

图4是实施例3中pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体中AP2α特异性顺式作用元件序列的测序结果图。

图5是实施例3中pBGLuc-AP2α-RE报告基因检测MSCs中AP2α转录活性的结果的柱形图。

图6是EMSA检测AP2α转录活性的结果的电泳图。

图7是EMSA检测AP2α转录活性的结果的柱形图。

具体实施方式：

实施例1: 获取AP2α特异性顺式作用元件

设计由4个串联的GCCCGCGG核苷酸序列组成的AP2α特异性顺式作用元件，上游和下游序列分别符合SEQ ID NO.1 & SEQ ID NO.2的核苷酸序列，用annealing buffer（碧云天公司）体外退火成双链 (100ul 体系：上下游序列各5ug，95℃ 5 min，72℃ 2min，60℃ 2min，50℃ 2min，40℃ 2min，20℃ 2min）。

实施例2: pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体的构建及鉴定

将逆转录病毒载体pBGLuc用BamH Ⅰ和MluⅠ双酶切（40μl体系：BamH Ⅰ 2μl，MluⅠ2μl，10× buffer 4μl，DNA5μg，加灭菌水至40μl，37℃ 6~8 hr）后纯化，与实施例1中的DNA双链定向连接（连接体系20μl：DNA双链 5μl，酶切质粒 5μl，DNA连接酶 10μl，16℃ 1 hr）（图1）。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，以BSD基因序列互补的序列（SEQ ID NO.3）及AP2α顺式作用元件序列互补的序列（SEQ ID NO.4）为引物，菌落PCR筛选（touch-down PCR体系：2×PCR反应液10ul，10ng/ul的上下游引物各1ul，菌落做模板，加水至20ul；PCR参数：95℃ 5 min；93℃ 20s，65~55℃ 20s，72℃ 20s，每循环降低1℃ ，10 cycles；93℃ 20s， 55℃ 20s，72℃ 20s，30 cycles；72℃ 3min）（图2）。将阳性菌落转入含Kan抗性的LB培养基37℃，200r/min培养过夜，OMEGA小抽试剂盒提取质粒，以此质粒为模板再次进行PCR鉴定（引物及反应条件同前），1%琼脂糖凝胶电泳可见一227bp的特异性条带。EcoR Ⅰ+Not Ⅰ酶切pBGLuc基础载体能获得423bp的小片段，而正确重组的pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体因缺失Not Ⅰ酶切位点，双酶切无小片段（图3）。将该质粒用（SEQ ID NO.3）引物测序鉴定（图4），与原设计序列完全一致。获得正确重组的pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体。 

实施例3：: pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体用于检测AP2α转录因子活性

本实施案例目的在于检测实施案例2中获得的pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体作为分子工具的应用。将大鼠MSCs接种于24孔板，1×10⁵/孔，设置3复孔，培养过夜，密度为60%时，用脂质体将pBGLuc-AP2α-RE质粒转染细胞。24小时后，分别加人Ad-AP2α，Ad-dnAP2α-△bHLH,Ad-dnAP2α-△TAD腺病毒，感染48小时后倒置荧光显微镜下观察RFP阳性率达60~70%，再加入终浓度为1umol/L的ATRA诱导同时设置空白对照组（control组）和ATRA诱导对照组。ATRA诱导24小时后，取各孔培养上清20ul以检测分泌型荧光素酶的活性，加入Luciferin反应液10ul（反应缓冲液：底物=100：1新鲜配置），混合后立即置于荧光检测仪下读数。结果显示ATRA诱导可增加AP2α的转录活性，启动报告基因的表达量增多，Ad-AP2α介导的AP2α过表达组荧光素酶活性显著增高，而Ad- dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α- △TAD的荧光素酶活性显著低于ATRA对照组，提示两个显性负性突变体均能抑制ATRA诱导的AP2α转录活性增高（图5）。

EMSA检测AP2α与特异的DNA序列结合能力： 1×10⁷MSCs接种于100mm培养皿，同上设置各处理组，NEB 公司核蛋白提取试抽提核蛋白并定量。与AP2α-RE标记探针结合(同时设置标记的突变探针反应及特异性竞争反应)。经6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.5×TBE中，390mA电转印40min至PVDF膜，紫外灯下约10cm处交联10min。结合膜浸于15ml 1×封闭液中，25℃孵育30min，弃封闭液，加入15ml Streptavidin-HRP 反应液，25℃孵育20min，ECL发光显影。结果显示ATRA诱导可显著提高AP2α结合DNA的能力，Ad-AP2α腺病毒感染组更增高了60倍以上，Ad-dnAP2α-△bHLH可抑制AP2α转录因子对特异性DNA的结合，而Ad-dnAP2α-△TAD组的AP2α结合的DNA量明显高于对照组，与Ad-AP2α腺病毒感染组相当（图6和图7）。与EMSA的结果比较，报告基因的方法对显性负性突变体影响转录因子活性的检测结果是准确可靠的。

上述实施案例证实，本发明成功构建了pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体，能有效地检测AP2α转录因子活性，操作简单方便，灵敏度高，重复性好。由于EMSA不能如实反映能过表达DNA结合域的显性负性突变体对转录因子活性的影响，该方法可代替EMSA进行转录因子活性的检测。

Claims (7)

1.一种报告基因载体，含有AP2α特异性顺式作用元件，其特征在于所述AP2α特异性顺式作用元件是由4个GCCCGCGGTT串联组成。

2.如权利要求1所述的报告基因载体，含有SEQ ID NO.5所示的序列或SEQ ID NO.5互补序列。

3.如权利要求1或2所述的报告基因载体，来源于pBGLuc逆转录病毒载体。

4.如权利要求1、2或3所述的报告基因载体，携带天然分泌型报告荧光素酶Gaussia luciferas，以及杀稻瘟菌素抗性基因。

5.如权利要求1～4任一所述的报告基因载体，其结构如图1所示。

6.如权利要求1～5任一所述的报告基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）体外退火获得4个串联的所述AP2α特异性顺式作用元件的DNA双链，双链两端带有BamHⅠ和MluⅠ酶切位点；

（2）将上述DNA双链定向克隆至pBGLuc逆转录病毒载体，采用杀稻瘟菌素抗性基因序列及AP2α特异性顺式作用元件匹配的成对引物进行鉴定，测序正确后获得pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体。

7.如权利要求1～6任一所述的报告基因载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）获取AP2α特异性顺式作用元件：设计4个串联的AP2α特异性顺式作用元件序列，上游和下游序列分别符合SEQ ID NO.1 & SEQ ID NO.2的核苷酸序列，体外退火获得DNA双链；退火后形成的双链DNA片段带有BamHⅠ及MluⅠ的酶切位点;

（2）pBGLuc-AP2α-RE报告基因载体的构建：将DNA双链片段定向插入至逆转录病毒载体pBGLuc的Gaussian luciferase基因上游,采用SEQ ID NO.3 & SEQ ID NO.4分别作为上游和下游引物进行鉴定；

（3）检测MSCs中AP2α的转录活性：将pBGLuc-AP2α-RE转染大鼠MSCs，腺病毒介导显性负性突变体过表达，再加入ATRA诱导24小时后检测培养上清中分泌的荧光素酶活性。

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