JP5105864B2 - 転写量変化を検出するためのベクターおよび方法 - Google Patents
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Description
(1)上記ベクターが導入された細胞を、被験物質の存在下および非存在下で培養する工程と、(2)工程(1)で培養した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、(3)被験物質の存在下で培養した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値が、被験物質の非存在下で培養した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値より高い場合に、前記被験物質がダイオキシン様活性またはエストロジェン様活性またはアンドロジェン様活性を有すると評価する工程とを含む方法が提供される。
以下、本発明のベクターについて詳細に説明する。
上記、チロシン水酸化酵素(TH)遺伝子の転写制御領域は、たとえば配列番号1に記載の領域(2.5 kb)である。本発明において「チロシン水酸化酵素(TH)遺伝子の転写制御領域」は、任意の生物のチロシン水酸化酵素遺伝子の5’上流領域(2500 bp)であり得、たとえば、ヒト、マウス、またはラットのチロシン水酸化酵素遺伝子の5’上流領域(2500 bp)であり得る。
また、本発明のベクターは、上記「被験物質に応答して遺伝子の転写活性を増強するエンハンサー領域」に加えて、該領域の下流に機能的に連結されたプロモーターおよびレポーター遺伝子を含む。「機能的に連結された」とは、連結された領域が、その領域の機能を発揮するように連結されていることを意味する。たとえば、プロモーターまたはレポーター遺伝子が「機能的に連結された」とは、本発明のベクター内においてプロモーター活性を発揮し、レポーター遺伝子の発現を増強させるように連結されていることをいう。また、レポーター遺伝子が「機能的に連結された」とは、本発明のベクター内において、「被験物質に応答して遺伝子の転写活性を増強する領域」やプロモーターの作用によって該レポーター遺伝子が発現されるように連結されていることをいう。
本発明のレポーター遺伝子は、当該技術分野において既知の何れのレポーター遺伝子を使用することもできる。レポーター遺伝子は、その産物の活性が簡単に測定でき、測定バックグラウンドの低いものが好ましく、たとえばこのような遺伝子として、遺伝子産物を発光で検出できるルシフェラーゼ遺伝子、蛍光で検出できる緑色蛍光タンパク質遺伝子、発色で検出できるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、放射線活性で検出できるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
本発明のベクターは、上記領域の他に、種々のエレメントを含むことができる。たとえば、適切な微生物内で機能する複製起点および薬剤耐性遺伝子などを組み込むことができる。また、ベクターを細胞の染色体上に組み込んで安定に保持させるために、ベクター内に哺乳類用の薬剤体制遺伝子を組み込んでおくことができる。このような哺乳類用の薬剤耐性遺伝子には、たとえばゼオシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子などがあげられる。また、マルチクローニングサイトなどの適切な制限酵素部位を有することもできる。
上記ベクターは、当業者に既知の何れの方法を使用して作製することもできるが、例えば以下の通りに作製することができる。
TH遺伝子の転写制御領域は、その塩基配列が明らかとなっているので、たとえばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して単離することができる。PCRの鋳型として使用できる核酸には、たとえば任意の細胞から抽出したゲノムDNAを使用すればよい。たとえば、実施例に示したとおりのプライマーを使用して配列番号1に示した塩基配列を増幅することができる。
次いで、上記TH遺伝子の転写制御領域をベクターに組み込む。ベクターの作製は、(a)で作製したTH遺伝子の転写制御領域を、レポーター遺伝子が機能する形で連結することにより作製する。作製したベクターは、少なくともTH遺伝子の転写制御領域部分の塩基配列をシーケンシングし、遺伝子に変異が導入されていないことを確認することが好ましい。
次に、本発明は、上記ベクターが導入された細胞を提供する。上記ベクターが導入された形質転換細胞は、ダイオキシン様活性を有する物質、エストロジェン様活性を有する物質、アンドロジェン様活性を有する物質を検出するために使用することができる。
次に、本発明のベクターが導入された細胞を用いて、被験物質のダイオキシン様活性またはエストロジェン様活性またはアンドロジェン様活性を検出する方法について詳細に説明する。
アリルハイドロカーボン受容体を組み込んだ発現ベクターの調製
(a)SD系統ラット、およびC57/BL6マウスのAhR遺伝子の調製
SD系統のラットの脳から全RNAを抽出して、これを鋳型にオリゴ(dT)プライマーをもちいて逆転写した。この逆転写したサンプルから、Pyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を用いたPCR(変性:94℃ 1分、アニーリング:55℃ 1分、伸長:72℃ 4分を1サイクルとして25サイクルの反応)により、SD系統ラットのAhR遺伝子コーディング領域を増幅した。プライマーにはSD系統のAhR遺伝子に特異的な下記プライマーを使用した。プライマーの5’末端には、PCR産物のベクターへの組み込みを容易にするための制限酵素HindIII(フォワードプライマー)、XhoI(リバースプライマー)の認識配列を付加した。
リバースプライマー: 5’- CCGCTCGAGAGGAATCCGCTGGGTGTGATATCAG -3’(配列番号13)。
リバースプライマー:5’- CCCTCTAGATCAACTCTGCACCTTGCTTAGGAA -3’(配列番号15)。
(a)で調製したAhR遺伝子を発現させるためのベクターには、pcDNA4/V5-His B(インビトロジェン)、およびPGV-P2(TOYO B-Net)を使用した。
TH転写制御領域を組み込んだベクター(PGV-THp25)の作製
制限酵素KpnIで消化したマウスのゲノム(クロンテック)を鋳型に、チロシン水酸化酵素(TH)の転写制御領域、約2.5 kbpをPCRで増幅した(配列番号1)。PCRで使用したプライマーには、5’末端に、PCR産物のベクターへの組み込みを容易にするための制限酵素KpnI(フォワードプライマー)、NheI(リバースプライマー)の認識配列を付加した。
リバースプライマー:5’-GCAGCTAGCAAGCTGGTGGTCCCGAGTTCTGTCT-3’(配列番号17)。
PGV-THp25−導入細胞をもちいた、TCDDの転写制御に対する活性の測定(PGV-THp25−導入細胞をもちいた、TCDDの添加によるレポーター遺伝子の転写活性の測定)
実施例2で作製したPGV-THp25を使用した。細胞にはNeuro2aを使用した。
TH遺伝子の転写制御領域の同定(TCDDの結合した転写因子に応答する、TH遺伝子の転写制御領域の同定)
PGV-THp25に組み込んだ約2.5 kbpのTH転写制御領域を鋳型として、PCRで、-2.5kbp〜-500 bpまで、約500bpずつ短くした転写制御領域断片を得た。フォワードプライマーには、それぞれ異なるプライマーを使用した:
2.0 kbp用:5’-CGCGGTACCTGGGTTTGCCTCACCCTGCAATCCC-3’(配列番号18)、
1.5 kbp用:5’-CCAGGTACCGAGGTTAGGGAGTGTTCCCTTTGTA-3’(配列番号19)、
1.0 kbp 用:5’-CAGGGTACCGCTCAGCATAAGTCCCCTGTAGTAG-3’(配列番号20)、
500 bp用:5’- CGTGGTACCACATACACTGGGGCAGTGAGTAGAT-3’(配列番号21)。
300 bp用:5’-CGGGGTACCATTAGAGAGCTCTAGATGTCTCCTG-3’(配列番号23)、
200 bp用:5’-CCCGGTACCCTAATGGGACGGAGGCCTCTCTCGT-3’(配列番号24)、
100 bp用:5’-CGGGGTACCGTGGGGGACCCAGAGGGGCTTTGAC-3’(配列番号25)。
被験物質の転写制御に対する活性の測定(PGH-THp03導入細胞を用いた、被験物質の添加によるレポーター遺伝子の転写活性の測定)
実施例5では、配列番号2のTH転写制御領域を使用した。
TH転写制御領域(-300〜-200 bp)を用いた、被験物質の転写制御に対する活性の測定
実施例6では、配列番号3のTH転写制御領域(-300〜-200 bp)を使用した。TH転写制御領域の-300bp 〜-200bp領域は、500bpのTH転写制御領域を鋳型として、
フォワードプライマー:5’- CGGGGTACCATTAGAGAGCTCTAGATGTCTCCTG-3’(配列番号23)、
リバースプライマー:5’-GCCGCTAGCACGAGAGAGGCCTCCGTCCCATTAG-3’(配列番号26)、
を使用してPCRで取得した。使用したプライマーの末端には、PCR増幅断片のベクターの組み込みを容易にすることを目的に、制限酵素KpnI(フォワードプライマー)、NheI(リバースプライマー)の認識配列を付加し、Pyrobest DNA polymeraseを使用して、配列番号3に記載の領域を増幅した。増幅したDNA断片は、制限酵素KpnIとNheIで消化後、アガロースで電気泳動をおこない、対応するバンドをQIA quick Gel Extraction Kitで精製したのち、KpnIとNheIと消化したPGV-P2ベクターに組み込み、pSV40E100/Lucとした。ここで用いたベクターPGV-P2は、プロモーター領域として、SV40初期プロモーターを予め含む。
配列番号3に記載の領域を複数個組み込んだベクターの作製、および該ベクターを用いた、被験物質の転写制御に対する活性の測定
「実施例6においてPCRで増幅した配列番号3に記載の領域」の末端を、5’ポリヌクレオチドキナーゼ(タカラバイオ)でリン酸化した後、配列番号3に記載の領域を、ライゲーションキット(東洋紡)を用いてタンデムに連結した。連結したDNA断片を制限酵素KpnIとNheIで部分消化後、アガロースゲル電気泳動をおこない、配列番号3が3個あるいは5個タンデムに連結したDNA断片を、その分子量を基準にゲルから切り出し、QIA quick Gel Extraction Kitで精製した。これらのDNA断片を、KpnIとNheIで消化して配列番号3の領域を除いたpTHE100/Lucに連結して、配列番号3が3つタンデムに組み込まれたベクター;pTHE100x3/Luc、および5つタンデムに組み込まれたベクター;pTHE100x5/Lucベクターを作製した(図7A)。
AhR遺伝子の種類(SD系統ラットのAhR、ならびにC57/BL6マウスのAhR)が、転写制御に対する被験物質の活性に与える効果
実施例8では、レポーター・ベクターにはpTHE100x3/Luc(実施例7、図7(A))を、細胞にはNeuro2aを使用した。
配列番号3に記載の領域内のTCDD応答領域の更なる絞込み、ならびに該応答領域を組み込んだベクターを用いた、被験物質の転写制御に対する活性の測定
実施例9では、配列番号4に記載した領域をTH転写制御領域内のTCDD応答領域として使用した。配列番号4に記載した領域は、配列番号3に記載の領域を鋳型として、
フォワードプライマー: 5’-AGCGGTACCCTGTCTTCATGTCGTGTCTAGG -3’(配列番号29)
リバースプライマー: 5’- AGCGCTAGCTGCATCCACTGTCGCAGGCACC -3’(配列番号30)
を使用して、Pyrobest DNA polymerase を用いたPCRにより増幅した。PCRで使用したプライマーの末端には、PCR増幅断片のベクターの組み込みを容易にすることを目的に、制限酵素KpnI(フォワードプライマー)、NheI(リバースプライマー)の認識配列を付加した。PCRで増幅した配列番号4に記載の領域の末端を、5’ポリヌクレオチドキナーゼ(タカラバイオ)でリン酸化した後、ライゲーションキットを用いてタンデムに連結した。連結したDNA断片を制限酵素KpnIとNheIで部分消化した後、アガロースゲル電気泳動をおこない、配列番号4の領域が1個、あるいはタンデムに3個連結されたDNA断片を、その分子量を基準としてゲルから切り出し、QIA quick Gel Extraction Kitで精製した。これらのDNA断片を、KpnIとNheIで消化して配列番号3の領域を除いたpTHE100/Lucに連結して、配列番号4の領域が1つ組み込まれたベクター;pTHE60/Lucと、配列番号4の領域が3つタンデムに組み込まれたベクター;pTHE60x3/Lucベクターを作製した(図10A)。
Claims (9)
- チロシン水酸化酵素遺伝子の転写制御領域内の被験物質に応答して下流遺伝子の転写活性を増強するエンハンサー領域であって、配列番号3の塩基配列のタンデム繰返し配列(tandem repeat)からなるエンハンサー領域、
該エンハンサー領域の下流に機能的に連結されたプロモーター、および
該プロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子
を有することを特徴とするベクター。 - チロシン水酸化酵素遺伝子の転写制御領域内の被験物質に応答して下流遺伝子の転写活性を増強するエンハンサー領域であって、配列番号4の塩基配列のタンデム繰返し配列(tandem repeat)からなるエンハンサー領域、
該エンハンサー領域の下流に機能的に連結されたプロモーター、および
該プロモーターの下流に機能的に連結されたレポーター遺伝子
を有することを特徴とするベクター。 - 前記プロモーターが、配列番号5により示されるマウスチロシン水酸化酵素遺伝子のプロモーターである、請求項1または2に記載のベクター。
- 前記プロモーターが、配列番号6により示されるSV40初期プロモーター、配列番号7により示されるSV40後期プロモーター、配列番号8により示されるヒトヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、および配列番号9により示されるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターからなる群より選択される、請求項1または2に記載のベクター。
- 前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からなる群より選択される、請求項1〜4の何れか1項に記載のベクター。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載のベクターが、ラットのアリルハイドロカーボン受容体をコードする外来遺伝子をマウス由来の神経芽細胞腫Neuro2aに導入することにより調製された遺伝子導入細胞に導入されたことを特徴とする形質転換細胞。
- 前記遺伝子導入細胞が、ラットのアリルハイドロカーボン受容体をコードする外来遺伝子をマウス由来の神経芽細胞腫Neuro2aに導入することにより調製された遺伝子導入細胞(受託番号FERM BP-10341または受託番号FERM BP-10342)である、請求項6に記載の形質転換細胞。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載のベクターまたは請求項6または7に記載の形質転換細胞を含むことを特徴とする、被験物質のダイオキシン様活性またはエストロジェン様活性またはアンドロジェン様活性を検出するためのキット。
- 被験物質のダイオキシン様活性またはエストロジェン様活性またはアンドロジェン様活性を検出する方法であって、
(1)請求項6または7に記載の形質転換細胞を、被験物質の存在下および非存在下で培養する工程と、
(2)前記工程(1)で培養した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定する工程と、
(3)前記被験物質の存在下で培養した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値が、前記被験物質の非存在下で培養した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量の測定値より高い場合に、前記被験物質がダイオキシン様活性またはエストロジェン様活性またはアンドロジェン様活性を有すると評価する工程と、
を含む方法。
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