CN112553247A - 一种通过gus染色显示拟南芥植株不同部位转录因子abi5活力的方法 - Google Patents
一种通过gus染色显示拟南芥植株不同部位转录因子abi5活力的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112553247A CN112553247A CN202011489322.9A CN202011489322A CN112553247A CN 112553247 A CN112553247 A CN 112553247A CN 202011489322 A CN202011489322 A CN 202011489322A CN 112553247 A CN112553247 A CN 112553247A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seeds
- gus
- arabidopsis
- abi5
- light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 101150017339 ABI5 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000010186 staining Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 18
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 18
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims description 7
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 6
- 238000007447 staining method Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 4
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims description 4
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims description 3
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 claims description 2
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 claims description 2
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700037137 Arabidopsis ABI5 Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N benzopyrrole Natural products C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 indole glucuronide Chemical class 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
利用GUS染色显示拟南芥植株不同部位转录因子ABI5活力的方法，主要包括:受ABI调控的GUS表达载体的构建；GUS表达载体转化进入农杆菌；农杆菌介导的花粉管法将GUS表达载体转入拟南芥中；拟南芥转化株系的筛选和鉴定。本发明的方法可以用于研究拟南芥中与ABI5蛋白相关代谢路径的调控机制；且该构建方法具有广泛的适用性，可以普遍用于其他植株中，利用GUS染色显示不同部位转录因子的调控活力。
Description
技术领域
本发明涉及拟南芥ABI5活力显示株系的构建方法，具体涉及一种利用GUS染色方法显示拟南芥不同部位转录因子ABI5活力的方法。
背景技术
ABI5(ABA-INSENSITIVE 5)是拟南芥响应干旱/高盐胁迫下的一个重要的转录因子，属于碱性亮氨酸拉链(basic domain leucine zipper，bZlP)类转录因子。这些转录因子可以与特定的顺式作用元件相结合，从而组成特定的调控网络。在植物遭受外界胁迫条件下，他们通过调控不同基因的表达，调节拟南芥植株自身的生长发育，从而对胁迫产生耐受性。因此，阐明转录因子ABI5如何调控植物的生长发育，及其分子机理具有重要的研究价值。有利于培育新的抗旱/抗盐转基因作物。而研究拟南芥不同时空，其ABI5调控活力的变化规律，是ABI5调控植物生长代谢机制的一个关键部分，对于阐明其调控机制的作用模式具有重要价值。
GUS(b-glucuronidase)基因是一种重要的报告基因，广泛应用于植物学研究中。GUS基因来源于大肠杆菌，该基因编码一种水解酶，b-葡聚糖苷酶，可以催化底物5-溴-4-氯-3吲哚葡聚糖醛酸苷(X-Gluc)分解，产生肉眼可见的兰色化合物。因此GUS染色技术可以用于观察转基因植物的外源基因的表达情况。由于植物体内没有类似的基因存在，故GUS染色技术具有操作简单、背景低，且可以检测到具体细胞、组织部位的表达强弱情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用GUS染色方法显示拟南芥植株不同位置转录因子ABI5调控强弱的方法，通过将ABI5特异性结合的结合位点进行串联重复，并与最小CaMV35S启动子序列相结合，构建出受ABI5结合强弱调控的启动子，再将该启动子克隆到pCAMBIA1301载体的GUS基因上游，使GUS基因表达受ABI5调控活力的调控，并将该调控元件导入拟南芥野生型Col中，构建拟南芥转基因植物。该植株可以通过GUS染色检测在不同时间和空间条件下，拟南芥转录因子ABI5的调控活力的变化情况。有利于阐明转录因子ABI5的调控作用机理。
为实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
一种利用GUS染色方法显示拟南芥不同部位转录因子ABI5活力的方法，包括以下步骤：
S1：构建受拟南芥转录因子ABI5蛋白调控的GUS表达载体p5XABS-GUS；
S2：将p5XABS-GUS通过化学转化方法转化进入农杆菌中；
S3：采用农杆菌介导的花粉管导入法，将p5XABS-GUS转化进入拟南芥植株中，收集侵染后的拟南芥种子；
S4：培养步骤S3获得的种子并进行筛选和鉴定，获得拟南芥转化株系并收集种子；
S5：培养步骤S4中的种子，通过GUS染色显示拟南芥幼苗不同部位ABI5调控强弱。
进一步的，所述步骤S1包括：
S1-1：将拟南芥转录因子ABI5蛋白特异性结合的DNA序列碱基串联重复5次，获得5XABS序列；
S1-2：将5XABS序列与最小CaMV 35S启动子序列相连组成5XABS启动子序列；
S1-3：合成5XABS启动子序列，并克隆到载体pCAMBIA1301载体的EcoRI/NcoI位点，获得表达载体p5XABS-GUS。
进一步的，所述步骤S4包括：
S4-1：培养步骤S3获得的种子，通过潮霉素筛选方法筛选转化植株并收集种子；
S4-2：培养步骤S4-1获得的种子，通过GUS染色鉴定转化植株进行复筛，获得拟南芥转化株系并收集种子。
进一步的，所述步骤S4-1包括：
1)将步骤S3获得的种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次；
2)将处理后的种子用l ml无菌水重悬并均匀涂布在含有潮霉素B的MS固体筛选培养基上；
3)将MS固体筛选培养基置于光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养；两周后，得长势正常的阳性植物；
4)将长势正常的转化株，移入另一个不含潮霉素的MS固体培养平板上，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养；4天后，移入营养土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于温室培养，收集种子。
进一步的，所述步骤S4-2包括：
1)将步骤S4-1获得的种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次；
2)将处理后的种子用l ml无菌水重悬并均匀涂布在MS固体培养基表面；
3)将MS固体培养基置于光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养；一周后，将小苗分别移栽入营养土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于温室培养，2周后，用无菌剪刀分别剪下每个苗的一片莲座叶；使用GUS染色液染色；挑选染色相对较深的叶片所对应株系，培养并收集种子，得构建好的拟南芥转化株系5XABS::GUS/Col。
本发明还提供了上述方法制备的表达载体p5XABS-GUS。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的方法通过将转录因子ABI5蛋白的结合位点和最小CaMV 35S启动子融合，构建一个受ABI5蛋白调控的启动子，并使用该启动子来调控GUS蛋白的表达，再将表达载体转化进入拟南芥中，构建成转化株系。该转化株系可以通过GUS染色直接显示拟南芥株苗不同位置的ABI5调控强弱。与传统的通过目标基因表达的Q-PCR检测、荧光蛋白标记等方法相比，本发明的方法具有以下几个优点：1)可以测定ABI5蛋白表达的具体细胞和组织部位；2)检测快速、简便、灵敏度高且重现性好；3)ABI5的调控强弱可以进行定量测定；4)报告基因的表达不受细胞内其它基因表达产物的干扰。
附图说明
图1为构建的p5XABS-GUS载体图谱；
图2为拟南芥5XABS-GUS转化株系幼苗的GUS染色图片。
具体实施方式：
下面以拟南芥5XABS-GUS转化株系构建为例对本发明的技术方案进行具体进行说明，需要说明的是，实施例仅对本发明的优选实例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计思路的前提下，本领域中专业技术人员对本发明所做的改变与替换，均属于本发明的保护范围。
此外，所用试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。大肠杆菌(Escherichia coli)XL10 gold作为DNA操作时使用的宿主菌，包含50μg/mL卡纳霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。农杆菌GV3101感受态购自于上海唯地生物技术有限公司，用于侵染拟南芥，构建转化株系。GUS染色试剂盒购自北京酷来搏科技有限公司。5XABS启动子序列合成和载体构建由通用生物生物系统有限公司完成。
5XABS启动子序列如下：
序列1(SEQ ID NO:1)：GACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTT
序列2(SEQ ID NO:2)：
GACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACA
序列3(SEQ ID NO:3)：
CGTGGCAATCTTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTTGACC
序列4(SEQ ID NO:4)：
GACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGACGCTCGTCATGCGGTACACGTGGCAATCTTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTTGA。
实施例1：5XABS-GUS表达载体的设计及合成
1.5XABS启动子的设计
先将选择的含有ABI5特异性结合位点的序列(序列1)，串联重复5份为序列2。然后将序列2和CaMV35S最小启动子序列(序列3)连接，构成目标5XABS启动子序列(序列4)。
2.5XABS-GUS表达载体的构建
将序列4送通用生物系统有限公司合成，并由公司克隆进入pCAMBIA1301载体的EcoRI/NcoI位点，获得目标表达载体p5XABS-GUS(图1)。
实施例2：5XABS::GUS/Col拟南芥转化株系的构建
该实施案例中，通过使用实施例1所述的表达载体p5XABS-GUS,通过化学转化方法转化进入农杆菌GV3101细胞中。然后使用该农杆菌转化子，采用农杆菌介导的花粉管导入法转化拟南芥野生型植株(Col)。收集转化后的拟南芥种子，使用潮霉素抗性筛选方法筛选成功转化的拟南芥株系。筛选获得的株系通过GUS染色方法进一步鉴定。
具体的实施步骤为：
1.化学法转化p5XABS-GUS进入GV3101。从-80℃取出GV3101感受态细胞，冰上融化后，加入1μl(100ng)的质粒p5XABS-GUS。轻轻混匀后按照产品使用说明书转化。
2.农杆菌介导的花粉管导入法转化拟南芥(Col)野生型植株
1)培育健康的拟南芥野生(Col)植物直至开花。25℃，光照周期为16小时光照，8小时黑暗于温室培养。
2)活化农杆菌
①挑取活化的含有p5XABS-GUS质粒的单克隆阳性农杆菌GV3101菌株，至5ml新鲜的LB液体培养基(含50μg/ml kan，20μg/ml rif)28℃，200rpm过夜活化。
②次日晚将已活化的菌种按(1:50)转接至300ml的LB液体培养基(含50μg/mlkan，20μg/ml rif)中培养，28℃，300rpm。
③次日上午测OD值，用LB液体培养基(含50μg/ml kan，20μg/ml rif)作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5～3.0之内时，可收集菌体于50ml离心管中，4000g离心10min。
④用渗透缓冲液(1/2MS培养基+5％蔗糖)重悬细胞至OD600约为0.8～1.0，以渗透缓冲液为对照，加入终浓度为0.02％SilwettL-77，混匀。
4)将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有重悬菌体渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染50S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，2h后取下薄膜，于室温中继续培养。
5)每隔1天重复一次侵染，共侵染3次。
6)正常浇灌植物，用蜡纸，胶带，扭绳或其他方法捆绑松动的茎干。随着种子成熟，停止浇水。
7)约30日后收获种子，此为T0代种子，干燥1周后放到-20℃春化24h。
3.转化子的筛选
1)将收集的T0代种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次。
2)处理后的种子用l ml无菌水重悬并均匀涂布在MS固体筛选培养基(含有50mg/L潮霉素B)表面。
3)于光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。两周后，经潮霉素B抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物则不萌发或不久死亡。
4)将长势良好的转化株，移入另一个不含潮霉素的MS固体培养平板上，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。4天后，移入营养土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于温室培养，收集种子。获得T1代种子。
5)种子复筛：
①将收集的T1代种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次。
②处理后的种子用l ml无菌水重悬并均匀涂布在MS固体培养基表面。
③光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。一周后，将小苗分别移栽入营养土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于温室培养，2周后，用无菌剪刀分别剪下每个苗的一片莲座叶。使用GUS染色液染色。挑选染色相对较深的叶片所对应株系，培养并收集种子，此为T2代种子。既为构建的拟南芥转化株系5XABS::GUS/Col。
4.GUS染色分析拟南芥幼苗不同部位ABI5调控强弱。
1)将收集的T2代种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次。
2)处理后的种子用l ml无菌水重悬并均匀涂布在MS固体培养基表面。
3)光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。5天后，用镊子从MS平板上挑幼苗按照产品使用说明书进行GUS染色，分析幼苗不同部位ABI5调控强弱。如图2所示，5天的幼苗其根尖部位相对于其他部位的ABI5蛋白活力最高，受其调控的GUS蛋白表达最多，染色最深。
序列表
<110> 江苏师范大学
<120> 一种通过GUS染色显示拟南芥植株不同部位转录因子ABI5活力的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacgctcgtc atgcggtaca cgtggcaatc tt 32
<210> 2
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacgctcgtc atgcggtaca cgtggcaatc ttgacgctcg tcatgcggta cacgtggcaa 60
tcttgacgct cgtcatgcgg tacacgtggc aatcttgacg ctcgtcatgc ggtacacgtg 120
gcaatcttga cgctcgtcat gcggtaca 148
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtggcaatc ttgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagagaac 60
acgggggact cttgacc 77
<210> 4
<211> 223
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacgctcgtc atgcggtaca cgtggcaatc ttgacgctcg tcatgcggta cacgtggcaa 60
tcttgacgct cgtcatgcgg tacacgtggc aatcttgacg ctcgtcatgc ggtacacgtg 120
gcaatcttga cgctcgtcat gcggtacacg tggcaatctt gcaagaccct tcctctatat 180
aaggaagttc atttcatttg gagagaacac gggggactct tga 223
Claims (6)
1.一种利用GUS染色方法显示拟南芥不同部位转录因子ABI5活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：构建受拟南芥转录因子ABI5蛋白调控的GUS表达载体p5XABS-GUS；
S2：将p5XABS-GUS通过化学转化方法转化进入农杆菌中；
S3：采用农杆菌介导的花粉管导入法，将p5XABS-GUS转化进入拟南芥植株中，收集侵染后的拟南芥种子；
S4：培养步骤S3获得的种子并进行筛选和鉴定，获得拟南芥转化株系并收集种子；
S5：培养步骤S4中的种子，通过GUS染色显示拟南芥幼苗不同部位ABI5调控强弱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
S1-1：将拟南芥转录因子ABI5蛋白特异性结合的DNA序列碱基串联重复5次，获得5XABS序列；
S1-2：将5XABS序列与最小CaMV 35S启动子序列相连组成5XABS启动子序列；
S1-3：合成5XABS启动子序列，并克隆到载体pCAMBIA1301载体的EcoRI/NcoI位点，获得表达载体p5XABS-GUS。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4包括：
S4-1：培养步骤S3获得的种子，通过潮霉素筛选方法筛选转化植株并收集种子；
S4-2：培养步骤S4-1获得的种子，通过GUS染色鉴定转化植株进行复筛，获得拟南芥转化株系并收集种子。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S4-1包括：
1)将步骤S3获得的种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次；
2)将处理后的种子用l ml无菌水重悬并均匀涂布在含有潮霉素B的MS固体筛选培养基上；
3)将MS固体筛选培养基置于光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养；两周后，得长势正常的阳性植物；
4)将长势正常的转化株，移入另一个不含潮霉素的MS固体培养平板上，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养；4天后，移入营养土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于温室培养，收集种子。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S4-2包括：
1)将步骤S4-1获得的种子消毒：分别采用70％酒精消毒2min，无菌水冲洗3次，20％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5-6次；
2)将处理后的种子用lml无菌水重悬并均匀涂布在MS固体培养基表面；
3)将MS固体培养基置于光照培养箱中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期培养；一周后，将小苗分别移栽入营养土中，25℃，16h光照/8h黑夜光周期于温室培养，2周后，用无菌剪刀分别剪下每个苗的一片莲座叶；使用GUS染色液染色；挑选染色相对较深的叶片所对应株系，培养并收集种子，得构建好的拟南芥转化株系5XABS::GUS/Col。
6.权利要求1或2所述方法中制备的表达载体p5XABS-GUS。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011489322.9A CN112553247A (zh) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | 一种通过gus染色显示拟南芥植株不同部位转录因子abi5活力的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011489322.9A CN112553247A (zh) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | 一种通过gus染色显示拟南芥植株不同部位转录因子abi5活力的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112553247A true CN112553247A (zh) | 2021-03-26 |
Family
ID=75064877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011489322.9A Pending CN112553247A (zh) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | 一种通过gus染色显示拟南芥植株不同部位转录因子abi5活力的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112553247A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103305550A (zh) * | 2013-04-10 | 2013-09-18 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种检测AP2α转录因子活性的报告基因载体 |
| CN109750064A (zh) * | 2017-11-07 | 2019-05-14 | 中国科学院海洋研究所 | 一种检测gata-3转录因子活性的报告基因载体及其应用 |
-
2020
- 2020-12-16 CN CN202011489322.9A patent/CN112553247A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103305550A (zh) * | 2013-04-10 | 2013-09-18 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种检测AP2α转录因子活性的报告基因载体 |
| CN109750064A (zh) * | 2017-11-07 | 2019-05-14 | 中国科学院海洋研究所 | 一种检测gata-3转录因子活性的报告基因载体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CRISTEL CARLES 等: "Regulation of Arabidopsis thaliana Em genes: role of ABI5", 《PLANT J.》 * |
| 王世伟: "拟南芥ABI5亚家族基因表达特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109576282B (zh) | 月季转录因子RhMYB4及其花器官发育调控中的应用 | |
| CN102234323B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用 | |
| CN107827964A (zh) | 一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用 | |
| CN108624596B (zh) | 一种调控豆科根瘤生长的基因GmSPX5及其应用 | |
| CN114214358B (zh) | 一种诱导型表达载体及其在培育哨兵作物上的应用 | |
| CN113234131B (zh) | 一种茎瘤芥BjuA036398基因在调控植物侧根发育中的应用 | |
| CN108997487B (zh) | 抗逆相关蛋白z76在调控植物抗逆性中的应用 | |
| CN112626084B (zh) | 草莓MYB转录因子FvMYB24基因、表达蛋白及应用 | |
| CN113621643A (zh) | GhTULP34在调控植物抗非生物逆境胁迫中的应用及调控方法 | |
| CN109096380B (zh) | OsBICs基因在调控植物株高、开花时间中的应用 | |
| CN106367433B (zh) | 提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及其应用 | |
| CN101503468A (zh) | 一种与花粉萌发和/或花粉管生长相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN110684757A (zh) | 控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用 | |
| CN114703198B (zh) | 一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用 | |
| CN114014922B (zh) | 调控植物耐盐性的蛋白质及其编码基因与应用 | |
| CN110218247A (zh) | PwRBP1和PwNAC1两种蛋白互作协同提高植物耐逆性及其应用 | |
| CN112553247A (zh) | 一种通过gus染色显示拟南芥植株不同部位转录因子abi5活力的方法 | |
| CN114480447A (zh) | 红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用 | |
| Okeyo-Ikawa et al. | In planta seed transformation of Kenyan cowpeas (Vigna unguiculata) with P5CS gene via Agrobacterium tumefaciens. | |
| CN113789343A (zh) | 一种体内检测rop蛋白活性的方法 | |
| Revalska et al. | Analysing the function and the expression pattern of Auxin Response Factor B3 from Medicago truncatula in the model plant Lotus japonicus | |
| CN113493793A (zh) | 一种油菜耐旱性负调控基因及其应用 | |
| CN114573671B (zh) | 闭花授粉性状调控基因BnaC03.FBA、花器官特异性表达启动子PFBA及其应用 | |
| CN115927363B (zh) | 一种春兰CgARF8基因及其应用 | |
| CN114591971B (zh) | 一种葡萄抗旱VvCCD7基因及其氨基酸序列和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210326 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |