CN104531607A - 犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用，属于生物技术领域。所述犬原代细支气管上皮细胞，取至45日龄的清洁级雄性比格犬。分离犬气管组织，剪碎后加入胶原酶及胰酶消化，得到完整的细支气管组织后培养所获细胞进一步通过间接免疫荧光试验检测角蛋白18表达，证实成功获得犬原代细支气管上皮细胞。构建含端粒酶基因（hTERT）的真核表达载体pEGFP-hTERT，转染犬原代细支气管上皮细胞后，hTERT基因高表达，细支气管上皮细胞能够稳定传代培养至少20代。本发明制备的犬永生化细支气管上皮细胞，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。

Description

犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用

技术领域

本发明涉及犬原代细支气管上皮细胞及其在制备永生化细胞中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着人类文明程度的提高，伴侣动物如犬的疾病研究早已成为兽医学研究的一个重点。对犬而言，传染性疾病多发于消化道和呼吸道，而呼吸道疾病是一年四季的常发病，对犬的危害最大。目前多种病毒和细菌等微生物被认为是引起犬呼吸系统疾病的病原，如2004年爆发随后陆续报道的犬流感病毒。然而，相较于畜禽病原，犬类病原研究比较薄弱，特别是这些病原对犬呼吸系统疾病的发生起着怎样的作用，致病机理如何，尚不清楚。

气道上皮是气道与外界环境接触的第一道防线，不仅是各种病原体、炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放多种炎性介质和细胞因子，从而参与气道炎症及免疫反应。在研究人类以及畜禽呼吸道病原感染的致病机理方面，支气管上皮细胞等已被广泛用作细胞模型[Massin P,Kuntz-Simon G,Barbezange C,et al.Temperature sensitivity ongrowth and/or replication of H1N1,H1N2and H3N2 influenza A viruses isolated from pigs andbirds in mammalian cells.Vet Microbiol,2010,142:232–241.]，然而目前，对于犬类病原的研究还缺乏合适的细胞模型。

犬流感病毒是近年来新发现的犬类病原。有研究表明，犬感染犬流感病毒后会发生严重的气管支气管炎，受体结合试验表明犬流感病毒在犬的支气管和细支气管上皮细胞中大量发现，而在气管上皮细胞中鲜有发现[Song D,Kang B,Lee C,et al.Transmission of avianinfluenza virus(H3N2)to dogs.Emerg Infect Dis,2008,14:741-746.]。同时感染犬的病理组织学检查显示，病变在下呼吸道即细支气管和肺泡尤为严重，而在上呼吸道即气管和支气管病变则相对温和[Jung K,Lee CS,Kang BK,et al.Pathology in dogs with experimental canineH3N2 influenza virus infection.Res Vet Sci 2010,88:523-527.]，说明细支气管上皮细胞的获得将对研究犬流感病毒的致病机理具有相当大的价值。由于细支气管上皮细胞在体外培养难以长期传代生存，因此制备永生化的犬细支气管上皮细胞具有重要意义。

细胞永生化是指细胞经体外培养后自发或受外界因素的影响脱离增殖衰老的危机，最终获得无限增殖能力的过程。永生化自发生的几率极低，因此通过导入外源基因的方法，使细胞永生化几率得以提高，进而获得永生化的细胞系。一般5代左右的细胞称为原代细胞，超过20代的细胞可以称为永生化细胞系[翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学(第4版)高等教育出版社.2011]。永生化细胞的检测主要包括通过光学和电子显微镜与原代细胞进行形态学鉴定比较以及细胞表面抗原的检测。目前在细胞的永生化上应用最多的是SV40大T抗原，但由于其永生化的细胞有致癌性，会改变原代细胞原有特性，因而用此种方法得到的永生化细胞研究病毒感染细胞的致病机理不合适。

端粒是真核细胞染色体末端的特殊DNA蛋白质结构，由一简单重复的富含碱基鸟嘌呤G的高度保守的DNA序列及相关蛋白质组成。随着细胞分裂时染色体DNA复制的进行，端粒逐渐缩短，每次复制，由于“末端复制问题”的发生，DNA 5’端大概丢失50bp～200bp。由于其长度能够反映出细胞的复制史和复制潜能，从而被称为是细胞寿命的“有丝分裂钟”[Haber DA.Telomeres,cance,and immortality.N Engl J Med,1995,332(14):955-956.]。端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，也是一种专一的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成。能够以自身RNA为模板，从端粒DNA 3’-OH末端延伸或合成新的端粒DNA，从而补偿细胞分裂造成的染色体末端的缩短，使细胞不会在端粒耗尽时出现凋亡。端粒酶是一种逆转录酶，其主要作用是与自身携带的RNA模板合成端粒重复DNA序列，并加到端粒末端而维持端粒的长度，以抵消或延缓端粒随细胞分裂的不断缩短。端粒酶不但可以保持染色体完整，还是细胞生存期限的关键性调控因子，同时还可以提高细胞对毒性因子和应激原等的耐受能力，在细胞的永生化进程中起重要作用。目前研究比较透彻的人类的端粒酶是由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白以及端粒酶逆转录酶组成的[Danielle R,LiL,Stephen F,et al.Characterization of Growth and Differentiation in a Telomerase-ImmortalizedHuman Corneal Epithelial Cell Line.Investigative Ophthalmology and Visual Science,2005,46:470-478.]。在原代培养的细胞中，转入外源性的hTERT基因能够诱导端粒酶活性，稳定端粒的长度，从而使细胞寿命延长或永生化。hTERT能激活端粒酶，因此可能是新生和永生化细胞端粒酶的活化过程中的一个主要因素。

到目前为止，通过转染hTERT基因已建立了许多永生化的细胞系，如Georgios等在2005年将hTERT基因转染鸡胚成纤维细胞[Michailidis G,Saretzki G,Hall J.Endogenousand ectopic expression of telomere regulating genes in chicken embryonic fibroblasts.BiochemBiophys Res Commun.2005,335(1):240－246.]，2009年吴庆侠等导入外源hTERT进山羊子宫内膜上皮细胞等[吴庆侠,王爱华,司永嘉等.山羊子宫内膜上皮细胞转pCI-neo-hTERT质粒后的永生化.中国兽医学报,2010,30(2):228-232.]。本发明通过脂质体转染端粒酶基因获得永生化的犬细支气管上皮细胞，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于制备犬原代细支气管上皮细胞，通过转染端粒酶基因制备永生化的犬细支气管上皮细胞，使其稳定传代至20代以上，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料。

技术方案

一种犬原代细支气管上皮细胞，该细胞株CBE1于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC：C2014223，分类命名：犬原代细支气管上皮细胞。

所述的犬原代细支气管上皮细胞通过转染端粒酶真核表达载体获得永生化的犬细支气管上皮细胞。其特征在于：

1)真核表达载体重组质粒pEGFP-hTERT的构建

按照质粒DNA小提中量纯化试剂盒步骤提取质粒PCI-neo-hTERT，经质量比1％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定正确后用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒，利用小量胶回收试剂盒纯化回收3.5kb的片段，即为hTERT；

用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切荧光真核表达载体pIRES2-EGFP，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与hTERT按摩尔比4:1的比例加入目的片段和载体，然后加入1μL T4 DNALigase，配制10μL连接体系，混匀后于PCR仪16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆扩增培养，PCR、酶切鉴定正确后，送交上海Invitrogen公司测序，将含有正确连接片段的重组质粒命名为pEGFP-hTERT，进而将重组质粒pEGFP-hTERT转化感受态大肠杆菌，涂于含卡纳的固体培养基平板上培养，随机挑取白色菌落接种于含氨苄的LB液体培养基中，摇床培养16h，小量提取质粒pEGFP-hTERT；

2)重组质粒pEGFP-hTERT双酶切鉴定

所得重组质粒pEGFP-hTERT经内切酶EcoR I和BamH I双酶切得到与目的基因约3.5kb及载体约5.3kb大小一致的两个片段，得到的重组质粒pEGFP-hTERT和空白质粒pIRES2-EGFP用去内毒素质粒大提试剂盒所述的步骤大量提取重组质粒，测浓度后置于-20℃备用；

3)重组质粒pEGFP-hTERT转染获得永生化犬细支气管上皮细胞

采用LipofectaminTM转染试剂，取权利要求1所述的原代犬细支气管上皮细胞，在24孔板中以1×10⁵cell/孔的密度接种，待细胞汇合度达80％后进行转染，转染前将细胞更换新鲜的无抗生素无血清培养基。将重组质粒pEGFP-hTERT 2μg与LipofectaminTM转染试剂1μL，分别稀释至50μL opti-MEM中，然后混合，并室温静置5min。吸取混合液1滴，滴加入无抗生素无血清培养基的24孔细胞板中，37℃细胞培养箱静置培养24h，以期获得转染成功的永生化犬细支气管上皮细胞。

有益效果

本发明通过分离犬细支气管，剪碎后加入胶原酶及胰酶消化，所获细胞进一步通过间接免疫荧光试验检测角蛋白18表达，证实成功获得犬原代细支气管上皮细胞。构建人含端粒酶基因(hTERT)的真核表达载体pEGFP-hTERT，转染犬原代细支气管上皮细胞后，hTERT基因高表达，细支气管上皮细胞能够稳定传代培养至少20代。具体步骤包括：

1.手术获取犬完整的肺脏和气管；

2.去除气管周围的肺组织，制备犬原代细支气管上皮细胞并鉴定；

3.构建含端粒酶基因的真核表达载体pEGFP-hTERT；

4.脂质体转染pEGFP-hTERT至犬原代细支气管上皮细胞；

5.收集转染成功后的犬细支气管上皮细胞连续传代至20代并鉴定，获得永生化的犬细支气管上皮细胞。

本发明提供了一种通过转染端粒酶基因而获得的永生化犬细支气管上皮细胞，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的生物材料，具有潜在的应用前景。

在本发明中，术语“细胞永生化”是指细胞经体外培养后自发或受外界因素的影响脱离增殖衰老的危机，最终获得无限增殖能力的过程。永生化自发生的几率极低，因此通过导入外源基因的方法，使细胞永生化几率得以提高，进而获得永生化的细胞系。

在本发明中，术语“脂质体转染”是指利用脂质体试剂将外源基因导入细胞的一种方法，其中脂质体试剂是一种阳离子脂质体，带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到代负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。该转染方法适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞，稳定性较好，可重复性高。

本发明有以下创新点：

1.永生化的犬细支气管上皮细胞保持了原代细支气管上皮细胞的特性，为研究犬类病原感染的致病机理提供了重要的实验材料。

2.通过显微器械成功剥离得到犬细支气管，用差速贴壁及胰酶和胶原酶消化的方法获得纯度很高的原代犬细支气管上皮细胞，并成功得以传代。

3.首次将端粒酶真核表达载体转染犬细支气管上皮细胞，从而获得永生化的犬细支气管上皮细胞，克服了原代细胞增殖能力十分有限的缺点。

附图说明

图1：比格犬完整的连接肺脏的气管。

图2：去除气管周围的肺组织，胰酶和胶原酶消化得到的细支气管。

图3：贴壁后第一代聚集成团的犬原代细支气管上皮细胞形态。

图4：传至第三代的犬原代细支气管上皮细胞形态。

图5：犬原代细支气管上皮细胞经角蛋白18间接免疫荧光鉴定。一抗为抗角蛋白18的单抗，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG。采用双染法，细支气管上皮细胞染为红色，而所有细胞(包括杂细胞)的细胞核被染料染为蓝色。

图6：真核表达载体pEGFP-hTERT双酶切鉴定电泳图。左泳道为DL15000的Marker；右泳道为pEGFP-hTERT经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，上面条带为载体PIRES2-EGFP，大小为5.3kb，下面的条带为插入的人端粒酶片段，大小为3.45kb。

图7：转染真核表达载体pEGFP-hTERT后，第5代和第20代犬细支气管上皮细胞在荧光显微镜下的比较图。左图为转染后第5代犬细支气管上皮细胞，右图为转染后第20代犬细支气管上皮细胞。

生物保藏

犬原代细支气管上皮细胞株CBE1于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC：C2014223，分类命名：犬原代细支气管上皮细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，例如《分子克隆实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)(Sambrook等人)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。而犬原代细支气管组织的分离与细胞的培养，由于目前尚无犬相关组织细胞分离培养报道，故在参照人支气管上皮细胞分离方法[Vos JB,van Sterkenburg MA,Rabe KF,et al.Transcriptional response ofbronchial epithelial cells to Pseudomonas aeruginosa:identification of early mediators of hostdefense.Physiol Genomics 2005,21(3):324-336]的基础上加以改进。

(一)犬细支气管组织的分离、原代细胞培养及鉴定

1.实验动物的选择

本发明中所使用的实验动物为未经免疫的45日龄雄性比格犬，购买自南京安立默科技有限公司。

2.试验器械以及相关试剂的准备

1)试验器械的准备

①手术用器械：

准备两套手术器械(剪刀、镊子各两把，眼科剪、眼科镊各1把)，一套器械用于表皮的切开，另一套则用于细支气管的分离；显微镊子、显微剪刀各一把，用于初步获取细支气管后进一步剥离开细支气管周围的肺组织；止血钳一把，用于喉部切开后剪断上端气管前夹紧气管以隔绝外界空气流通；玻璃平皿4-6个，用于取得气管与肺组织后的组织存放；200目滤网，用于细支气管上皮细胞的过滤。上述器械75％酒精浸泡擦干后，121℃20分钟高压灭菌后待用。

②细胞培养用：

50mL离心管(Corning)一包，15mL离心管一包，0.22μm进口滤器，6cm dish(Corning)一包，10ml注射器若干，均购买自北京鼎国生物技术有限公司。

2)试验试剂的准备

麻醉剂：速眠新(购自佛山市双平宠物用品有限公司)2支，用于前肢静脉麻醉试验动物犬；组织细胞洗液：细胞培养平衡液(D-Hanks液)和1×PBS磷酸盐缓冲液(北京鼎国生物技术有限公司)，用于清洗分离出的组织细胞；细胞培养用双抗：即含有青霉素(10,000IU)和链霉素(10,000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液(Hycolne)；细胞培养用抗生素：恩诺沙星(用1mol/L氢氧化钠配成20μg/mL，购自上海阿拉丁试剂有限公司)和两性霉素(用高压过的超纯水配成5μg/mL，购自北京鼎国生物技术有限公司)，用于新分离原代细胞培养时避免污染使用；EDTA(配制0.5mol/L的母液稀释1000倍使用，购自上海阿拉丁试剂有限公司)，原代细胞制备当天和消化液同时使用，既起到促进组织消化的功能，又能螯合钙、镁等离子；消化液：胶原酶(Worthington)，原代制备当天分离细支气管上皮使用，胰酶(Gibico)用于原代细胞及初步永生化细胞培养消化；基础培养基：D/F12(Gibico)；南美胎牛血清(Gibico)；添加因子：30μg/mL BPE(牛垂体提取物，Sciencecell)，10ng/mL EGF(人上皮生长因子，Sigma)，0.5μg/mL氢化可的松(Sigma)，5μg/mL人胰岛素(Sigma)，6.7ng/mL三碘-L-甲状腺原氨酸(Sigma)，0.1ng/ml维甲酸(Sigma)，10μg/mL转铁蛋白(Sigma)。

3.犬细支气管组织的分离、原代细胞培养及鉴定

①犬细支气管组织的分离

(1)速眠新前肢静脉麻醉幼龄比格犬后，四肢固定，酒精消毒待处理表皮组织后立即用一套手术器械(剪刀、镊子各两把，眼科剪、眼科镊各一把)腹部切口放血。

(2)手术剪自喉部至胸部最后一根肋骨部位纵向剪开皮肤，沿两侧肋骨横向剪开皮肤，分离皮肤。

(3)用另一套器械分离喉部肌肉，暴露气管，用剪刀沿分离好的皮肤边缘，去除肋骨，暴露胸腔。

(4)纵向剪断气管，提起气管，自上而下，分离气管及肺组织，止血钳夹紧气管上端后剪断气管，将剩余气管连接完整肺脏置于准备好的高压完的玻璃平皿储存器中(见图1)，放入超净工作台，待进一步的细支气管分离。

(5)将获取的肺组织用平头镊子分成单个肺叶后，使用显微镊及显微剪去除气管周围的肺组织，注意勿用力撕扯，分离出来的细支气管形态见图2。

②犬原代细支气管上皮细胞的培养

(1)细支气管组织的消化

将分离好的细支气管洗净，剪碎，约1mm³大小后加入稀释1000倍的0.5mol/L的EDTA 1mL，胶原酶1mL和0.25％胰酶1mL，37℃消化作用30min。

(2)培养液和培养条件

1)基础培养基：D/F12培养基。

2)细胞培养液：初代细胞贴壁前D/F12+10％胎牛血清；贴壁后D/F12+2％胎牛血清+添加因子。

3)终止液：D/F12+10％血清。

4)胰酶：0.125％胰酶(用D-Hanks液配制)，调pH至7.5-8.0。

(3)犬原代细支气管上皮细胞的培养与传代

1)初代细支气管上皮细胞的培养

上述组织消化30min后，加入终止液终止消化。200目滤网过滤，收集滤液，1000rpm离心5min，弃上清，沉淀用D/F12+10％胎牛血清重悬后接种在4个6cm dish中，放入细胞培养箱，次日贴壁后换液为D/F12+2％胎牛血清+添加因子，以使原代细支气管上皮细胞中混杂的极少量平滑肌细胞无法生存，避免平滑肌细胞成为优势细胞。初代细胞长成后形态见图3。

2)原代细支气管上皮细胞的传代

初代细胞经6天后，每个dish细胞生长情况不一，将两个长满80％的6cm dish细胞用于一传二传代，另两个细胞较少的dish合并为一个dish。不可直接消化吹打传代，需加800μL 0.125％胰酶消化后放入37℃培养箱，每1min观察一次细胞状态，待细胞变圆，立即加入终止液，枪头轻轻吹打后移入15ml离心管，1000rpm离心后弃上清，沉淀用含2％胎牛血清和添加因子的细胞培养液一传二至6cm dish中静置培养。经传代后的第三代犬细支气管上皮细胞形态见图4。

(4)原代细支气管上皮细胞的鉴定

由于从犬活体内分离组织进行细胞培养不可避免会有一些其他组织的残留，分离的细支气管上皮细胞里混有极少量的平滑肌细胞，通过降低血清浓度及添加上皮细胞添加因子的方法传代使平滑肌细胞不能生存，为了进一步地确定原代细支气管上皮细胞的纯度，对上皮细胞进行了鉴定。

1)形态学鉴定

体外传代培养时，细胞由一个中心向外延伸突触，呈柱状上皮细胞形态。胰酶消化后，细胞变圆成一个个单独的小圆形。

2)间接免疫荧光试验鉴定

Ⅰ.间接免疫荧光试验所需试剂:

①抗体稀释液：吸取2mL FBS溶于18mL PBS中，配成含有10％FBS的PBS，备用。

②PBST：吸取50μL Tween-20溶于100mL PBS，配成0.05％Tween-20，备用。

③封闭液：1％BSA。

④通透液：吸取0.5mL Triton X-100溶于100mL PBS，配成0.5％Triton X-100溶液。

⑤抗体：一抗为抗角蛋白18的单抗，用于对上皮细胞进行鉴定。二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG(购自北京鼎国生物技术有限公司)。

Ⅱ.具体试验步骤：

传至第三代的犬原代细支气管上皮细胞，接种于24孔细胞板中。

①用PBS清洗生长良好细支气管上皮细胞3次，然后加入固定液(4％多聚甲醛)固定15min；

②吸掉固定液用PBS清洗3次，然后加入封闭液(含1％BSA的PBS)封闭2h；

③吸掉封闭液，PBST清洗3次，每次5min，按每孔加入100μL抗角蛋白18的单抗(稀释500倍)，而后4℃过夜；

④吸出一抗，PBST(含1％Tween-20的PBS)漂洗3次，每次5min，每孔加入200μL的FITC标记的羊抗鼠IgG(稀释1000倍)，于37℃避光孵育1h；

⑤最后PBST清洗，加DAPI染色15min，缓冲甘油封片，镜检。

细支气管上皮细胞间接免疫荧光双染法鉴定见图5，其中染成红色的是细支气管上皮细胞，染成蓝色的是细胞核(包括杂细胞的细胞核)，可见所获原代细支气管上皮细胞的纯度很高，达90％以上。

(二)真核表达载体重组质粒pEGFP-hTERT的构建

1.试验材料

重组质粒PCI-neo-hTERT及空白质粒pIRES2-EGFP，购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。

2.真核表达载体pEGFP-hTERT的构建

按照质粒DNA小提中量纯化试剂盒(Takara)步骤提取质粒PCI-neo-hTERT，经1％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定正确后用EcoRⅠ和SalⅠ(Takara)双酶切重组质粒，利用小量胶回收试剂盒(Takara)纯化回收3.5kb的片段，即为hTERT。

用EcoRⅠ和SalⅠ(Takara)双酶切荧光真核表达载体pIRES2-EGFP，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与hTERT按摩尔比4:1的比例加入目的片段和载体，然后加入1μLT4 DNA Ligase(Takara)，配制10μL连接体系，混匀后于PCR仪16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆扩增培养，PCR、酶切鉴定正确后，送交上海Invitrogen公司测序，将含有正确连接片段的重组质粒命名为pEGFP-hTERT，进而将重组体转化感受态大肠杆菌，涂于含卡纳的固体培养基平板上培养，随机挑取白色菌落接种于含氨苄的LB液体培养基中，摇床培养16h，小量提取质粒。

3.重组质粒pEGFP-hTERT双酶切鉴定

所得重组真核表达质粒经内切酶EcoR I和BamH I双酶切得到与目的基因约3.5kb及载体约5.3kb大小一致的两个片段，结果显示重组质粒构建正确，双酶切鉴定图谱见图6。得到的重组质粒pEGFP-hTERT和空白质粒pIRES2-EGFP用去内毒素质粒大提试剂盒(Omega)的步骤大量提取重组质粒，测浓度后置于-20℃备用。

(三)重组质粒pEGFP-hTERT转染获得永生化犬细支气管上皮细胞

1.采用LipofectaminTM转染试剂，选取生长状态良好传至第三代的原代犬细支气管上皮细胞，在24孔板中以1×10⁵cell/孔的密度接种，待细胞汇合度达80％后可进行转染，转染前将细胞更换新鲜的无抗生素无血清培养基；

2.配制如下两种溶液：

溶液A：重组质粒pEGFP-hTERT(试验组)、1μg pIRES2-EGFP(阴性对照组)以及1μL的转染试剂(空白对照组)分别稀释到50μL opti-MEM(Gibico)中；重组质粒设置5个浓度梯度，分别为0.5μg/50μL，1μg/50μL，1.5μg/50μL，2μg/50μL和2.5μg/50μL，故试验组共5个EP管，阴性对照组1个和空白对照组1个，总共7个EP管。

溶液B：另取7个EP管，各取1μL LipofectaminTM稀释到50μL opti-MEM(Gibico)中；

3.将溶液A用200μL移液枪轻轻吹打混匀后加入溶液B，使溶液A和B混合，使质粒DNA与LipofectaminTM转染试剂分别按0.5：1，1：1，1.5：1，2：1以及2.5：1比例混合，切忌震荡或剧烈晃动。室温静置5min。

4.小心吸取混合液一滴滴加入无抗生素无血清培养基的24孔细胞板中，放入37℃细胞培养箱，静置培养24h后，于荧光倒置显微镜下检查质粒表达情况。因重组质粒带有EGFP(绿色荧光蛋白)基因，可作为标签蛋白检查重组质粒是否成功转染。

结果发现利用LipofectaminTM转染试剂转染犬原代细支气管上皮细胞时pEGFP-hTERT与LipofectaminTM的最佳比例为2：1。

转染成功后的细胞，经胰酶消化后收集，继续传代培养，共获得转染成功的永生化细胞株6株，且均能稳定传代。图7显示的是转染后培养至第5代和第20代的犬细支气管上皮细胞在荧光显微镜下拍摄的图片，发现转染后随着代次的增加荧光并没有减少，荧光强度和数量均基本一致。

第20代的犬细支气管上皮细胞，参照如上方法，经间接免疫荧光试验检测角蛋白18，结果与原代细胞的结果一致。

综上所述，本发明提供了一种通过转染端粒酶基因而获得永生化的犬细支气管上皮细胞，其创新性主要体现在：1.永生化的犬细支气管上皮细胞保持了原代细支气管上皮细胞的特性，为研究犬类病原感染的致病机理提供了重要的实验材料；2.用差速贴壁及胰酶和胶原酶消化的方法获得纯度很高的原代犬细支气管上皮细胞，并成功得以传代；3.通过转染端粒酶基因获得的永生化犬细支气管上皮细胞，克服了原代细胞增殖能力十分有限的缺点，为研究犬流感病毒等犬类病原的感染机制提供了重要的实验材料，具有很好的实用价值。

Claims (5)

1.一种犬原代细支气管上皮细胞，该细胞株CBE1于2014年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC：C2014223，分类命名：犬原代细支气管上皮细胞。

2.权利要求1所述犬原代细支气管上皮细胞的应用。

3.权利要求1所述犬原代细支气管上皮细胞在制备永生化犬细支气管上皮细胞中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：权利要求1所述犬原代细支气管上皮细胞通过转染端粒酶真核表达载体获得永生化的犬细支气管上皮细胞。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

1)真核表达载体重组质粒pEGFP-hTERT的构建

按照质粒DNA小提中量纯化试剂盒步骤提取质粒PCI-neo-hTERT，经质量比1％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定正确后用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒，利用小量胶回收试剂盒纯化回收3.5kb的片段，即为hTERT；

用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切荧光真核表达载体pIRES2-EGFP，酶切片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与hTERT按摩尔比4:1的比例加入目的片段和载体，然后加入1μL T4DNALigase，配制10μL连接体系，混匀后于PCR仪16℃过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆扩增培养，PCR、酶切鉴定正确后，送交上海Invitrogen公司测序，将含有正确连接片段的重组质粒命名为pEGFP-hTERT，进而将重组质粒pEGFP-hTERT转化感受态大肠杆菌，涂于含卡那的固体培养基平板上培养，随机挑取白色菌落接种于含氨苄的LB液体培养基中，摇床培养16h，小量提取质粒pEGFP-hTERT；

2)重组质粒pEGFP-hTERT双酶切鉴定

所得重组质粒pEGFP-hTERT经内切酶EcoR I和BamH I双酶切得到与目的基因约3.5kb及载体约5.3kb大小一致的两个片段，得到的重组质粒pEGFP-hTERT和空白质粒pIRES2-EGFP用去内毒素质粒大提试剂盒所述的步骤大量提取重组质粒，测浓度后置于-20℃备用；

3)重组质粒pEGFP-hTERT转染获得永生化犬细支气管上皮细胞

采用LipofectaminTM转染试剂，取权利要求1所述的原代犬细支气管上皮细胞，在24孔板中以1×10⁵cell/孔的密度接种，待细胞汇合度达80％后进行转染，转染前将细胞更换新鲜的无抗生素无血清培养基；将重组质粒pEGFP-hTERT 2μg与LipofectaminTM转染试剂1μL，分别稀释至50μL opti-MEM中，然后混合，并室温静置5min。吸取混合液1滴，滴加入无抗生素无血清培养基的24孔细胞板中，37℃细胞培养箱静置培养24h，获得转染成功的永生化犬细支气管上皮细胞。