CN113278618B - 特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用 - Google Patents

特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体而言，提供了一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用。特异性识别猪COL1A1基因的gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示序列，本发明提供的gRNA能够识别猪COL1A1基因编码区下游如SEQ ID NO.5所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因的第51个外显子末端产生双链断裂，切割效率可达22％，进而实现对COL1A1基因进行编辑，如氨基酸的修饰、替换，或者在该位点插入外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。

Description

特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用。
背景技术
COL1A1基因编码I型胶原蛋白a1链，位于猪的12号染色体上，基因全长18094bp。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，是人体内最丰富的蛋白质，维持着组织和器官的完整结构，并与人体早期发育、器官形成、细胞间的连接、细胞趋化、血小板凝集以及膜的通透性等功能密切相关。胶原蛋白家族包括19种胶原蛋白及10种以上胶原样蛋白，由至少30种不同的基因编码。其中I型胶原在人体胶原中含量最丰富，I胶原蛋白一开始是由两个α1链-COL1A1基因编码，和一个前α2链-由COL1A2基因编码组成。I型胶原是动物身体中最丰富且表达最广泛的蛋白质。它是皮肤、骨、肌腱、韧带、血管、牙质和许多间质组织的主要组成成分。因此将外源基因定点整合到COL1A1基因第51个外显子的末端，不仅有助于深入研究COL1A1基因功能和蛋白定位，还可以在该位点形成一个友好基因座，极大的方便外源基因在多个组织的高效、稳定表达。因此，对猪COL1A1基因的高效编辑对进一步研究猪COL1A1基因，以及实现外源基因的稳定、高效表达具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA。
本发明的第二目的在于提供与gRNA相关的生物材料。
本发明的第三目的在于提供一种试剂盒。
本发明的第四目的在于提供对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法。
本发明的第五目的在于提供gRNA、生物材料、试剂盒或方法在定点整合外源基因中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种在猪基因组中定点整合外源基因的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，所述gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。
与上述gRNA相关的生物材料，包括：
(a)编码权利要求1所述的gRNA的DNA分子；
(b)表达盒，包括(a)中的DNA分子；
(c)表达载体，包括(a)中的DNA分子或(b)中的表达盒。
进一步地，所述(a)中的DNA分子序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述(b)中的表达盒还包括编码Cas9的DNA分子。
试剂盒，包括上述的gRNA或生物材料。
对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法，在猪源生物材料中，利用上述的gRNA介导Cas9对猪COL1A1基因进行基因编辑。
进一步地，所述方法包括将基因编辑元件导入猪源生物材料中，所述基因编辑元件包括如下(a)或(b)：
(a)所述gRNA或编码所述gRNA的DNA分子；和Cas9相关元件，所述Cas9相关元件包括编码Cas9的DNA、编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白分子；
(b)同时编码所述gRNA和Cas9的表达载体；
优选地，所述猪源生物材料包括猪体细胞或猪受精卵；
优选地，所述猪体细胞包括猪成纤维细胞；
优选地，采用磷酸钙法、脂质转染法、慢病毒转染法或电穿孔法将所述基因编辑元件导入猪体细胞，优选采用电穿孔法；
优选地，采用受精卵显微注射法将所述基因编辑元件导入猪受精卵。
上述的gRNA、生物材料、试剂盒或方法在定点整合外源基因中的应用。
一种在猪基因组中定点整合外源基因的方法，包括将上述的gRNA或生物材料导入猪源生物材料中。
进一步地，所述方法包括将基因编辑元件导入猪受精卵，以获得经COL1A1基因编辑的胚胎；或，
所述方法包括将基因编辑元件导入猪体细胞，筛选出COL1A1基因编辑阳性的体细胞，然后通过体细胞核移植来构建重构胚胎；所述体细胞优选地包括成纤维细胞；
优选地，所述筛选包括使用引物对对导入基因编辑元件的体细胞进行PCR鉴定；所述引物对的上游引物和下游引物分别位于整合位点的上游和下游；所述引物对扩增产物长度为247bp时无外源基因定点插入，所述引物对扩增产物长度大于247bp时为所述COL1A1基因位点定点整合外源基因的编辑阳性体细胞；
优选地，所述引物对序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，本发明提供的gRNA能够识别猪COL1A1基因编码区下游如SEQID NO.5所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因的第51个外显子末端产生双链断裂，切割效率可达22％，进而实现对COL1A1基因进行编辑，如氨基酸的修饰、替换，或者在该位点插入外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中gRNA效率检测PCR产物直接测序峰图；
图2为本发明实施例1中gRNA效率检测T7E1酶切图；
图3为本发明实施例2中利用识别猪COL1A1基因的gRNA，Cas9蛋白以及携带外源基因的Donor载体实现外源基因定点整合的示意图；
图4为本发明实施例2中对转染gRNA，Cas9蛋白以及携带外源基因的Donor载体后的PEF细胞进行流式分选，检测GFP阳性细胞的比例；
图5为本发明实施例2中对流式分选到的GFP阳性PEF细胞进行junction PCR检测。M泳道代表DNA marker；S泳道代表流式分选后的GFP阳性PEF细胞；N泳道代表野生型PEF细胞。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
gRNA为向导RNA，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。本发明提供的特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，其中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为GAAACUCCCUCCGCCCCAAUC(SEQ ID NO.1)所示序列。该gRNA能够将猪COL1A1基因编码区下游的一段序列作为靶序列，该靶序列如ACCAAGAATTCGGCATCGACCTTAGCCCTGTCTGCTTCCTGTAAACTCCCTCCGCCCCAATCTGGCTCCCTCCCACCCAACCCAATTGCCCCTGA(SEQ ID NO.5)所示。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因的第51个外显子末端产生双链断裂，切割效率可达22％，进而实现对COL1A1基因进行编辑，如氨基酸的修饰、替换，或者在该位点插入外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。
需要说明的是，本发明提供的gRNA除去含有负责识别靶片段区域的序列外，还可以含有具有其他功能的序列，包括但不限于Cas9核酸酶募集序列以及连接各功能单元的连接单元等，其他部分序列可以根据本领域常规选择进行设计，本发明对此不作限制。
本发明同时保护与上述gRNA相关的生物材料，例如编码所述gRNA的DNA分子，含有该DNA的表达盒或表达载体等等。具体地，例如DNA分子中还可以包含用于编码CRISPR/Cas9系统中其他作用元件的编码序列，例如编码Cas9蛋白的区域等，可以为正义链也可以为反义链，也可以为双链DNA分子，本发明对此不作限制；例如表达盒还可以含有具有其他功能的DNA元件，例如可以为但不限于为启动子、终止子或标记基因等；再例如表达载体，将包含编码上述gRNA的DNA分子构建于载体中，所述DNA分子包括编码gRNA的区域、启动子和终止子区域、以及作为载体部分的区域。
在一些实施方式中，DNA分子序列如GAAACTCCCTCCGCCCCAATC(SEQ ID NO.2)所示。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述gRNA或与其相关的生物材料，可以实现对猪COL1A1基因进行基因编辑。该试剂盒还可以包括其他用于基因编辑的常规试剂，例如用于筛选阳性基因编辑的配套引物等。
本发明还提供了一种对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法，在猪源生物材料中，利用本发明的gRNA介导Cas9对猪COL1A1基因进行基因编辑。优选地，将基因编辑元件导入猪源生物材料中，基因编辑元件包括如下(a)或(b)：
(a)gRNA或编码gRNA的DNA分子；和Cas9相关元件，Cas9相关元件包括编码Cas9的DNA、编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白分子；编码Cas9的DNA和编码Cas9的RNA可选的分别独立的含有功能元件，所述功能元件的实例包括但不限于启动子、终止子、增强子和标记基因等，以及用于作为载体的DNA分子部分；Cas9蛋白分子可以为天然的Cas9分子或经过分子生物学改造的Cas9蛋白或融合蛋白，Cas9相关元件只要能够实现Cas9的剪切功能即可，本发明对此不作限制。
(b)同时编码gRNA和Cas9的表达载体。该载体导入细胞中后可以转录出gRNA以及转录并表达Cas9蛋白，以实现gRNA介导Cas9蛋白对猪COL1A1基因进行编辑。
在优选地实施方式中，猪源生物材料包括猪体细胞或猪受精卵；其中，猪体细胞优选为猪成纤维细胞。采用磷酸钙法、脂质转染法、慢病毒转染法或电穿孔法将所述基因编辑元件导入猪体细胞，优选采用电穿孔法；优选采用受精卵显微注射法将所述基因编辑元件导入猪受精卵。
本发明提供的gRNA、相关生物材料、试剂盒或基因编辑方法均可用于定点整合外源基因中，实现外源基因的稳定、高效表达。
本发明最后提供一种猪基因组中定点整合外源基因的方法，包括将本发明的gRNA或生物材料导入猪源生物材料中。例如，猪源材料为猪受精卵，将基因编辑元件导入猪受精卵，以获得经COL1A1基因编辑的胚胎；猪源材料为猪体细胞，将基因编辑元件导入猪体细胞，筛选出COL1A1基因编辑阳性的体细胞，然后通过体细胞核移植来构建重构胚胎，其中体细胞优选为猪成纤维细胞。
优选地，筛选包括使用引物对对导入基因编辑元件的体细胞进行PCR鉴定，引物对的上游引物和下游引物分别位于整合位点的上游和下游，具体地，引物对扩增产物长度为247bp时无外源基因定点插入，引物对扩增产物长度大于247bp时为所述COL1A1基因位点定点整合外源基因的编辑阳性体细胞。在一些实施方式中，引物对序列如ACACCCCTCTCCCATTGTCT(SEQ ID NO.3)和TGTTTGTTTCCAGGGTCAGG(SEQ ID NO.4)所示。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例中的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，PEF)按照如下方法制备：将大白猪37日龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6h～8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。
实施例1
特异性识别COL1A1基因靶位点的Cas9/gRNA表达载体的构建，gRNA活性检测。
(1)Cas9/gRNA表达载体的构建。首先选择猪COL1A1基因第51外显子末端的一段序列为靶序列，该靶序列如SEQ ID NO.5所示，根据靶序列设计gRNA中负责识别靶片段区域的序列，设计工具网址为http://crispor.tefor.net/crispor.py，根据本研究团队的经验对其序列进行评分，选择评分最高的三个负责识别靶片段区域的gRNA，并根据其5`端序列选择添加或者不添加鸟嘌呤G，将其分别命名为gRNA-1、gRNA-2和gRNA-3，其中gRNA-1序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA-2序列如SEQ ID NO.6所示，gRNA-3序列如SEQ ID NO.7所示。
gRNA-1：GAAACUCCCUCCGCCCCAAUC(SEQ ID NO.1)；
gRNA-2：UUGGGGCGGAGGGAGUUUAC(SEQ ID NO.6)；
gRNA-3：GGGAGCCAGAUUGGGGCGGA(SEQ ID NO.7)。
(2)gRNA打靶载体构建。根据(1)中的三个gRNA序列，将其连接到BbsI酶切后的pX330载体中。
(3)将构建好的pX330-gRNA载体5μg电转染到PK15细胞中，转染48h后提取细胞DNA，使用以下的引物进行PCR反应，扩增猪COL1A1基因第51外显子末端区域。PCR引物1(扩增产物长度247bp)：
COL1A1-ex51-F：ACACCCCTCTCCCATTGTCT(SEQ ID NO.3)；
COL1A1-ex51-R：TGTTTGTTTCCAGGGTCAGG(SEQ ID NO.4)。
(4)PCR产物直接测序检测gRNA活性
将PCR扩增产物进行一代测序，检测在gRNA打靶位点处是否出现杂峰，出现杂峰表明该gRNA具有切割靶位点双链DNA的活性。结果如图1所示，gRNA-1样本的打靶位点测序峰图出现明显杂峰，gRNA-2和gRNA-3均未出现杂峰。
(5)T7E1酶切法检测gRNA活性
将PCR扩增产物变性退火后，加入T7E1酶及缓冲液进行酶切反应，将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过ImageJ软件计算切割效率。结果如图2所示，经过T7E1酶切后，gRNA-1的PCR产物出现被切割开的条带，说明sgRNA-1使打靶区域产生了序列突变，通过ImageJ软件计算条带亮度得出sgRNA-1的切割效率为22.0％左右。gRNA-2和gRNA-3未检测到发生突变。
上述可以看出，sgRNA-1介导Cas9蛋白的敲除效果最好。
实施例2
在COL1A1基因第51外显子末端定点整合GFP表达框的猪胎儿成纤维细胞系的筛选。示意图如图3所示。
转染前一天将原代猪胚胎成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70％-80％汇合度时即可进行细胞转染。细胞转染方法为基于核转仪的电转染，使用Basic PrimaryFibroblasts Nucleofector(Lonza)在Amaxa Nucleofector(Lonza)单孔核转染系统下进行电转。
具体操作流程如下：
a.收集细胞，将细胞数量调整至1×106/管，200g离心5min，将培养液尽量去除干净。
b.加入100μL电转染试剂重悬细胞，并添加5μg Cas9/gRNA2表达载体质粒和5μg线性化后的Donor质粒(含有COL1A1基因第51外显子同源臂序列以及GFP表达框)，将电转染体系(包括细胞、转染试剂、质粒)沿壁缓慢加入电转杯中，避免产生气泡而降低转染效率。PEF细胞最佳的转染程序为U-023，在此预设程序下细胞的存活率和转染效率都比其他程序高。
c.转染完成后向电转杯中加入500μL完全培养基(20％FBS+DMEM)，轻柔吹打细胞，然后转移至预热的装有5mL培养液的6cm培养皿中于37℃，5％CO2培养箱中培养。电转染72h后，将空白对照组细胞(未进行转染)和实验组细胞吸除培养基，加入PBS冲洗两次，加入适量胰蛋白酶消化2min。将消化好的细胞移入15mL离心管1000g离心6min，去除原培养基，加入500μL新培养基重悬细胞。重悬好的细胞用细胞筛去除细胞团块后，收集到流式管中，准备上机分选。准备1.5mL离心管加入500μL培养基，用作收集分选后的阳性细胞。
用流式分选技术分选GFP阳性细胞操作步骤：
1、GFP选用488nm激光激发，将空白对照组细胞上机，确定阴性细胞的所在区域。
2、实验组细胞上机分选，首先通过SSC-A和FSC-A选取活细胞区域，之后通过FSC-W和FSC-H及SSC-W和SSC-H去除黏连细胞部分，通过PerCP和FITC-A进一步去除死细胞自发荧光部分，通过FSC-A和FITC-A选取阳性细胞区域，最后进行阳性细胞分选和收集。流式检测发现，大约有5.25％的PEF细胞发生了定点整合(图4)。
3、对流式分选获得的GFP阳性细胞提取DNA进行junction PCR鉴定。使用跨左同源臂引物：P1:CCTCCTCCTCAGCCACATAG(SEQ ID NO.8)，P2:GAACTTCAGGGTCAGCTTGC(SEQ IDNO.9)(扩增产物长度1271bp)以及跨右同源臂引物：P3:CGACCACTACCAGCAGAACA(SEQ IDNO.10)，P4:GGGAAGAAGAAAGGGTGGAG(SEQ ID NO.11)(扩增产物长度1325bp)进行PCR检测，结果显示(图5)所获得的GFP阳性细胞均为定点整合细胞。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用
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<212> DNA
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<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gggaagaaga aagggtggag 20

Claims (1)

1.猪COL1A1基因第51外显子末端定点整合GFP表达框的猪胎儿成纤维细胞系的筛选方法，其特征在于，所述方法包括将基因编辑元件导入猪胎儿成纤维细胞系，转染培养后用流式分选技术分选GFP阳性细胞，并进行junction PCR鉴定；所述猪COL1A1基因第51外显子的靶序列如SEQ ID No.5所示；
所述基因编辑元件包括Cas9/gRNA1表达载体质粒和线性化后的Donor质粒；所述Donor质粒含有COL1A1基因第51外显子同源臂序列以及GFP表达框；
所述gRNA1的核苷酸序列为GAAACUCCCUCCGCCCCAAUC；
所述junction PCR鉴定使用跨左同源臂引物：P1和P2，跨右同源臂引物：P3和P4，所述P1的核苷酸序列为CCTCCTCCTCAGCCACATAG；P2的核苷酸序列为GAACTTCAGGGTCAGCTTGC，P3的核苷酸序列为CGACCACTACCAGCAGAACA，P4的核苷酸序列为GGGAAGAAGAAAGGGTGGAG。
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