KR20060013426A - Ｂｃｌ-2의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 ＲＮＡ와그것을 함유하는 의약 조성물 - Google Patents

Ｂｃｌ-2의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 ＲＮＡ와그것을 함유하는 의약 조성물 Download PDF

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카즈코 히라바야시
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니뽄 신야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 아폽토시스 억제 인자로서 알려진 Bcl-2 단백질의 발현을 억제하기 위한 올리고 이중쇄 RNA와 그것을 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 암 등의 질환에 있어서는 Bcl-2 단백질이 과잉 발현하고 있는 것이 알려져 있고, 이 과잉 발현에 의해 암세포는 증식을 계속하며, 또한, 항암제 등에 대한 약품 내성도 야기한다. 본 발명은 bcl-2 mRNA를 분해로 유도하는 높은 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA를 제공하는 동시에 이 올리고 이중쇄 RNA와 적절한 담체와의 복합체를 함유하는 Bcl-2 단백질의 과잉 발현을 억제하기 위한 의약 조성물을 제공한다.

Description

Ｂｃｌ-2의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 ＲＮＡ와 그것을 함유하는 의약 조성물 {OLIGO DOUBLE-STRANDED RNA INHIBITING THE EXPRESSION OF Bcl-2 AND MEDICINAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME}
본 발명은 아폽토시스(apoptosis)의 억제 인자로서 작용하는 Bcl-2 단백질의 발현 억제(knock down)에 이용하기 위한 올리고 이중쇄 RNA, 및 Bcl-2 단백질의 넉다운 또는 아폽토시스의 촉진이 요망되는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 올리고 이중쇄 RNA를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.
Bcl-2 단백질은 아폽토시스(프로그램 세포사)의 억제 인자로서 작용하기 때문에, 발암유전자(oncogene)로서 알려져 있다 (예컨대, 다나카 노부유키, "Molecular Medicine", 2002년, 39권, 6호, p.638-644 참조). Bcl-2 단백질의 대량 발현에 의해 아폽토시스가 억제되는 것은 예컨대 DNA에 손상을 받은 세포가 아폽토시스를 일으키지 않게 됨에 따른 악성 전이 및 혈액학적 악성질환 등의 원인이 되는 것으로 생각할 수 있다. 실제로, Bcl-2 단백질은 림프 육종, 전립선암, 유방암, 폐암, 결장암 및 직장암 등의 여러 가지 고형암의 부위에 대량으로 생성되고 있다 (예컨대, Y. Tsujimoto, "Proceedings of the National Academy of Sciences USA", 1989년 3월, 86권, 6호, p.1958-1962; T. J. McDonnell et al., "Cancer Research", 1992년 12월 15일, 52권, 24호, p.6940-6944; H. Joensuu et al., "American Journal of Pathology", 1994년 11월, 145권, 5호, p.1191-1198; N. Ikegaki et al., "Cancer Research", 1994년 1월 1일, 54권, 1호, p.6-8; 및 M. P. Bronner et al., "American Journal of Pathology", 1995년 1월, 146권, 1호, p.20-26을 참조). 또한, Bcl-2 단백질이 대량으로 생성되는 세포에 있어서는, 그 아폽토시스 억제 작용으로 인해 항암제에 의해서도 세포사가 유도되지 않기 때문에, 여러 가지 항암제에 대한 약품 내성을 일으킬 수 있다. 따라서, 고형암 및 혈액학적 악성질환 등의 아폽토시스의 촉진이 필요한 질환에 있어서 Bcl-2 단백질의 발현을 억제하는 것은 효과적인 치료 및/또는 예방이 될 수 있다.
지금까지, Bcl-2 단백질의 발현을 억제하는 방법으로서, 안티센스 기술이 연구되어 왔다 (예컨대, WO 98/56905호 팜플렛; 일본 특허 공표 평성 제11-501509호 공보; 일본 특허 공표 제2001-505401호 공보; 일본 특허 공표 제2001-502172호 공보; 및 WO 02/17852 A2호 팜플렛을 참조). 안티센스 기술은 표적 RNA의 상보쇄를 갖는 안티센스 DNA를 세포 내에 도입함으로써, 표적 RNA와 안티센스 DNA의 RNA-DNA 이중쇄를 형성시켜, RNase H의 작용에 의해 표적 RNA를 절단함으로써, 단백질의 발현을 억제하는 방법이다. 그러나, 안티센스법에 있어서 이용하는 RNase H는 핵 내에 존재하기 때문에, 안티센스 DNA를 핵 내로까지 이행시켜야만 한다. 또한, 안티센스 DNA는 일반적으로 20 염기 정도의 단일쇄 올리고 DNA이지만, 혈청을 함유하는 배지 속이나 생체 내, 특히 혈중에서는 뉴클레아제에 의해 분해된다. 따라서 DNA의 인산 결합 부위를 포스포로티오에이트형으로 치환하는 등 여러 가지 화학 수식 에 의해 뉴클레아제 저항성을 갖게 할 필요가 있는 점에서 번거롭다. 또한, 안티센스 DNA에 의한 Bcl-2 단백질의 발현 억제에 의해 세포 증식을 유효하게 억제하기 위해서는 안티센스 DNA를 수백 nM∼수십 μM의 오더로 사용해야만 한다.
RNAi(RNA interference는 이중쇄 RNA(dsRNA)를 세포에 도입함으로써, 도입한 dsRNA와 상보적인 mRNA가 특이적으로 분해되고, 따라서 이 mRNA가 코딩하는 유전자 산물의 합성이 억제되는 현상이다. RNAi는 최초에 선충(C. elegans)에 있어서 발견된 현상(예컨대, A. Fire et al., "Nature", 1998년, 391권, p.806-811 참조)이지만, 그 후, 초파리(Drosophila), 원충(트리파노소마), 히드라, 식물(A. thaliana) 및 아프리카산 발톱개구리(Xenopus), 나아가서는 포유동물 세포에서는 마우스 담성 줄기 세포(ES 세포), 알세포 및 초기 담(embryo)에 있어서도 관찰되었다(예컨대, WO 02/44321 A2호 팜플렛; WO 01/68836 A2호 팜플렛; 일본 특허 공표 제2002-516062호 공보를 참조).
한편, 분화된 포유동물 세포에 있어서는, 선충 등과 동일한 RNAi에 의한 단백질 발현 억제 효과를 얻을 목적으로 30 bp 이상의 dsRNA를 도입하여도 RNAi의 효과는 관찰되지 않았다. 이것은 30 bp 이상의 dsRNA의 침입이 바이러스 감염으로서 인식됨으로써, 인터페론 응답으로서 알려져 있는 2개의 경로가 활성화되었기 때문이다. 하나의 경로는 인터페론이 dsRNA 의존적 프로테인키나제(PKR)를 유도하고, 이 PKR이 dsRNA와 결합하여 활성화하며, 번역 개시 인자 eIF2α를 인산화함으로써 번역을 저해하는 경로이다. 다른 한쪽의 경로는 인터페론이 2'-5'-올리고아데닐산 합성 효소(2-5A 합성 효소)를 유도하고, 이것이 RNase L을 활성화함으로써 mRNA 등 의 단일쇄 RNA를 절단하는 경로이다. 이들 경로가 활성화되면, 세포 내의 모든 유전자 발현이 저하된다. 따라서, 30 bp 이상의 dsRNA의 도입은 인터페론 응답에 의해 세포 내의 모든 유전자 발현을 저하시키기 때문에, 표적 유전자에 특이적인 발현 억제(knockdown) 효과를 얻을 수 없었기 때문이다(예컨대, K. Ui-Tei et al., "FEBS Letters", 2000년, 479권, p.79-82를 참조).
Tuschl et al.의 연구 그룹이 초파리 세포 추출액을 이용한 인 비트로(in vitro)계에서, 첨가한 dsRNA가 21-23 염기쌍의 dsRNA로 분해되어 있는 것을 발견하여, 이들 분해된 RNA가 표적인 mRNA의 서열 인식의 가이드로서 작용하는 중개 물질인 것이 시사되었다(예컨대, P. D. Zamore et al., "Cell", 2000년 3월 31일, 101권, 1호, p.25-33을 참조). 그리고, 실제로 화학 합성한 21-22 염기의 이중쇄 RNA를 상기한 반응계에 첨가함으로써, 표적 mRNA가 절단되는 것이 확인되었다. Tuschl et al.의 그룹은 이러한 RNAi에 의한 단백질 발현 억제 활성을 갖는 짧은 이중쇄의 RNA를, siRNA(short interfering RNA)라 명명하였다(예컨대, S. M. Elbashir et al., "Genes & Development", 2001년 1월 15일, 15권, 2호, p.188-200을 참조). 또한 siRNA는 그것을 구성하는 각각의 RNA쇄의 3' 말단에 2∼3 염기의 단일쇄의 상태로 존재하는 부분, 즉, 소위 돌출부(overhang)를 갖는 것이 상기한 반응계에서 강한 단백질 발현 억제 활성을 갖는다고 보고되어 있다. 또한 Tuschl et al.의 그룹은 siRNA가 상기 인터페론 응답에 대한 문제없이, 분화된 포유동물 세포에 있어서도 서열 특이적인 유전자 발현 억제 활성을 나타내는 것을 보고하였다(예컨대, WO 01/75164 A2호 팜플렛 및 S. M. Elbashir 등, "Nature", 2001년 5월 24일, 411권, p.494-498을 참조). 따라서, siRNA를 이용함으로써 포유동물에 있어서도 RNAi를 이용한 표적 유전자의 발현 억제에 의한 표적 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 억제를 행하는 것이 가능해졌다.
RNAi를 이용한 단백질 발현 억제에 있어서, 표적의 mRNA를 절단하기 위해서 필요한 단백질로서 RISC(RNA-induced silencing complex; 뉴클레오티드 분해 효소 복합체)라 불리는 단백질 복합체를 생각할 수 있다. RISC는 이중쇄인 siRNA의 3'-말단의 돌출부를 인식하여 siRNA를 복합체 내에 혼입하고, 타겟의 mRNA 서열을 인식하기 위한 가이드로 하고 있다고 생각되고 있다. 즉, 이 복합체는 siRNA와 동일한 서열을 갖는 mRNA를 인식하여 결합하고, RNase III-유사 효소 활성에 의해 siRNA의 중앙부에서 mRNA를 절단하는 것으로 생각되고 있다.
RISC는 세포질에서 형성되기 때문에, RNAi를 이용하여 표적 유전자를 발현 억제하는 방법에 있어서는 siRNA를 세포질에 도입하면 좋다고 하는 즉, 핵까지 이행시키지 않아도 좋다고 하는 이점이 있다. 또한, siRNA는 천연형 뉴클레오티드의 구성으로 충분한 효과를 얻을 수 있고, 수식은 필수적이지 않다. 또한, 도입하는 RNA의 양은 안티센스법으로 도입하는 안티센스 DNA의 양과 비교하여 현격한 차이로 적더라도 충분한 효과를 갖기 때문에, 간편하고 효과적인 방법으로서 주목되고 있다. siRNA를 이용한 RNAi에 관한 총설에 대해서는 이하의 문헌을 참조해주기 바란다(예컨대, 모리타 다카시 및 요시다 카요, 「단백질 핵산 효소」, 2002년, 47권 p. 1939-1945; 우시다 치사토, 「단백질 핵산 효소」, 2001년, 46권, p.1381-1386; 다하라 히로아키, 「단백질 핵산 효소」, 2001년, 46권, p.2017-2024; 다카키 다쯔 시 및 미우라 마사유키, 「유전자 의학」, 2002년, 6권, p.455-460; 및 J. Martinez et al., "Cell", 2002년 9월 6일, 110권, 5호, p.563-574를 참조). 또한, 안티센스쇄만으로도 RNAi 효과의 발현이 확인되었다고 하는 보고도 있다(예컨대, J. Martinez et al., "Cell", 2002년 9월 6일, 110권, 5호, p.563-574를 참조).
siRNA의 세포질로의 도입 방법으로서는 양이온성 리포솜 또는 그 밖의 양이온성 담체 등의 담체를 벡터로서 이용하는 방법 및 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 또는 마이크로인젝션법 등 세포에 직접 도입하는 방법 등이 이용되고 있다. 또한, siRNA를 세포 내에서 발현하도록 siRNA를 코딩하는 서열을 삽입한 발현 벡터를 세포 내에 도입하는 방법도 연구되고 있다(예컨대, M. Miyagishi et al., "Nature Biotechnology", 2002년 5월, 20권, 5호, p.497-500; N. S. Lee et al., "Nature Biotechnology", 2002년 5월, 20권 5호, p.500-505; 및 T. R. Brummelkamp et al., "Science", 2002년 4월 19일, 296권, p.550-553을 참조).
bcl-2 mRNA에 대한 siRNA에 관해서는 몇 가지 보고(예컨대, WO 02/055692 A2호 팜플렛; WO 02/055693 A2호 팜플렛; T. Futami et al., "Nucleic Acids Research, Supplement", 2002년, 2호, p.251-252; D. P. Cioca와 Y. Aoki, "Cancer Gene Therapy", 2003년, 10호, p.125-133; 및 M. Jiang과 J. Milner, "Genes and Development", 2003년, 17호, p.832-837을 참조)가 있지만, 모두 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA와는 다른 서열을 갖고 있거나 또는 구체적인 서열이 표시되어 있지 않다.
본 발명은 아폽토시스의 억제 인자로서 작용하는 Bcl-2 단백질의 발현을 억제할 수 있는 올리고 이중쇄 RNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 암 또는 혈액학적 악성질환 등의 아폽토시스의 촉진이 요망되는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 조성물을 제공한다.
도 1은 1차 스크리닝으로 얻어진 올리고 이중쇄 RNA를 A431 세포 내에 트랜스펙션하여 24시간 배양한 후, 그 세포에 있어서의 bcl-2 mRNA량을 RT-PCR에 의해 준정량한 결과를 나타낸다. 종축은 음성 대조 GL3을 트랜스펙션했을 때의 bcl-2 mRNA량을 1로 했을 때의, 각각의 올리고 이중쇄 RNA의 트랜스펙션시의 bcl-2 mRNA량을 나타낸다. 횡축은 검토를 행한 올리고 이중쇄 RNA의 명칭을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 올리고 이중쇄 RNA로서 B717, B043 및 B533을 A431 세포 내에 트랜스펙션하여 24시간 배양한 후, 그 세포에 있어서의 bcl-2 mRNA량(도 2a) 및 구성적 발현 유전자인 GADPH의 mRNA량(도 2b)을 RT-PCR에 의해 준정량한 결과를 나타낸다. 도 2c는 B717, B043 및 B533을 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션하여 72시간 배양한 후, 그 세포에 있어서의 Bcl-2 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅에 의해 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 3 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션하여 72시간 배양한 후의 결과이다.
도 4는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 3 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션하여 72시간 배양한 후의 결과이다.
도 5는 선택한 올리고 이중쇄 RNA의 세포 증식에 대한 효과를 셀 카운팅 분석에 의해 평가한 결과를 나타낸다. 세포는 A431 세포를 이용하여 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 후, 6일간 배양한 후의 세포수를 측정하였다. 종축은 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션하지 않는 A431 세포의 세포수를 100%로 했을 때의, 각각의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션했을 때의 세포수의 비율을 나타낸다. 횡축은 트랜스펙션했을 때의 종농도를 나타낸다.
도 6은 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 올리고 이중쇄 RNA의 종농도 3 nM 및 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션하여 72시간 배양한 후의 결과이다.
도 7은 A549 세포 이식 후 100일까지의 마우스의 생존수를 나타낸다. ●는 대조군, ○는 올리고 이중쇄 RNA B717을 주 1회 투여한 군 및 ▲은 올리고 이중쇄 RNA B717을 주 3회 투여한 군의 결과이다.
도 8은 A549 세포 이식 후 100일까지의 마우스의 생존수를 나타낸다. 가는 선은 대조군, 굵은 선은 올리고 이중쇄 RNA B043을 투여한 군의 결과이다.
도 9는 A549 세포 이식 후 69일까지의 마우스의 생존수를 나타낸다. 가는 선은 대조군, 점선은 올리고 이중쇄 RNA B043을 1 ㎎/㎏ 체중으로 투여한 군, 회색선은 올리고 이중쇄 RNA B043을 3 ㎎/㎏ 체중으로 투여한 군 및 굵은 선은 올리고 이중쇄 RNA B043을 10 ㎎/㎏ 체중으로 투여한 군의 결과이다.
도 10은 A549 세포 이식 후 69일까지의 마우스의 생존수를 나타낸다. 가는 선은 대조군, 굵은 선은 올리고 이중쇄 RNA B043을 주 5회의 빈도로 모두 12회 투여한 군 및 점선은 올리고 이중쇄 RNA B043을 주 5회의 빈도로 모두 5회 투여한 군의 결과이다. 또한, 점선은 굵은 선과 겹쳐 있다.
도 11은 PC-3 세포 이식 후 36일까지의 마우스의 종양 체적을 나타낸다. ◆는 대조군, □은 올리고 이중쇄 RNA B043을 투여한 군, ▲은 올리고 이중쇄 RNA B717을 투여한 군의 결과이다.
도 12는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 100 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
도 13은 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 10 nM로, 하단은 종농도 3 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
도 14는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 100 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
도 15는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 100 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
도 16은 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 100 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
도 17은 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 10 nM로, 하단은 종농도 3 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
도 18은 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가를 웨스턴 블로팅으로 행한 결과를 나타낸다. 상단은 종농도 100 nM로, 하단은 종농도 10 nM로 A431 세포 내에 트랜스펙션한 것의 결과를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
Bcl-2의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA
본 발명의 발명자들은 bcl-2 mRNA의 서열로서, 유전자 데이터베이스에 등록되어 있는 것을 비교 검토한 결과, GenBank 등록 번호(Accession number) BC027258로서 등록되어 있는 bcl-2의 완전장 mRNA의 서열이 컨센서스인 것을 확인하였다. 이 GenBank 등록 번호 BC027258의 염기 서열(서열 번호 197)에 기초하여 1차, 2차, 3차 스크리닝을 행하고, Bcl-2 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA를 선택하였다.
본 명세서에 있어서 올리고 이중쇄 RNA란, 15~27 염기쌍의 이중쇄 형성부를 갖는 15~31 뉴클레오티드의 RNA(일부에 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드를 함유할 수 있다; 이하 이 단락에 대해서 동일함)의 쌍으로서, 이 RNA의 쌍의 세포 내로의 도입에 의해 올리고 이중쇄 RNA와 상보적인 mRNA를 절단함으로써, 그 mRNA가 코딩하는 유전자 산물의 합성이 억제되는 활성을 갖는 RNA의 쌍이라 정의된다.
또한, 본 명세서에 있어서 올리고 이중쇄 RNA는 Tuschl et al.이 보고하고 있는 siRNA에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA에서는, 3' 말단의 돌출부는 반드시 필요로 하지 않고, 한쪽 쇄의 염기수도 19∼25 염기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 15∼31 뉴클레오티드의 쌍으로서, 17-23 뉴클레오티드의 쌍이 바람직하고, 또한, 25∼27 뉴클레오티드의 쌍도 바람직하다.
또한, 본 명세서에서 이중쇄 형성부란, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA에 있어서, 이 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 쌍이 이중쇄를 형성하고 있는 부분으로서, bcl-2 mRNA에 대응하는 센스쇄 및 안티센스쇄를 포함하는 부분을 말한다. 이와 관련하여, 각각의 RNA쇄의 이중쇄 형성부에 계속되는 3'측 또는 5'측에 단일쇄가 있는 경우에는 이것을 돌출부라 부른다.
스크리닝의 상세한 내용은 실시예에 나타내지만, 간단히 설명하면: 1차 스크리닝은 bcl-2 mRNA의 ORF(Open Reading Frame) 내에서 약 9 염기마다 시작되는 19 염기의 센스쇄 RNA와 그 상보쇄 RNA를 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA로 구성되는 풀로부터 스크리닝을 행하였다. 2차 스크리닝에서는, 1차 스크리닝에서 높은 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 보인 올리고 이중쇄 RNA에 대응하는 bcl-2의 mRNA의 서열을 중심으로, 3 염기마다 어긋나게 한 서열을 갖는 올리고 이 중쇄 RNA의 스크리닝을 행하였다. 3차 스크리닝에서는, 2차 스크리닝에서 높은 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 보인 올리고 이중쇄 RNA에 대응하는 bcl-2의 mRNA의 서열을 중심으로, 1 염기마다 어긋나게 한 서열을 갖는 올리고 이중쇄 RNA의 스크리닝을 행하였다. 또한, 올리고 이중쇄 RNA에서의 여러 가지 길이의 돌출부를 갖는 서열 및 염기수가 짧은 서열에 대해서도 그 Bcl-2 발현 억제 활성을 평가하여 스크리닝을 행하였다.
선택한 서열을 포함하는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가는 후술하는 실시예에 상세한 내용을 나타내지만, 이 올리고 이중쇄 RNA를 배양계의 암세포 등에 양이온성 리포솜 등을 이용하여 트랜스펙션하고, 소정 시간 배양한 후, 이 암세포에 있어서의 Bcl-2 단백질 발현량 및 그 저하도를 웨스턴 블로팅으로 평가함으로써 행하였다. 또한, bcl-2 mRNA량을 RT-PCR에 의해 준정량하고, 및/또는 세포 증식을 억제하는 효과를 셀 카운팅 분석에 의해 평가하였다.
본 발명의 발명자들은 상기 스크리닝 결과, 서열 번호 1 내지 서열 번호 81, 서열 번호 240 내지 서열 번호 256 및 서열 번호 274 내지 서열 번호 280에서 선택되는 염기 서열을 갖는 핵산 및 이 염기 서열과 상보쇄를 형성하는 서열을 포함하는 서열 번호 82 내지 서열 번호 162, 서열 번호 257 내지 서열 번호 273 및 서열 번호 281 내지 서열 번호 287에서 선택되는 염기 서열을 갖는 핵산의 쌍으로 이루어진 올리고 이중쇄 RNA를 이용했을 때에 Bcl-2 단백질의 발현이 크게 저하되는 것을 발견하였다. 또한, 상기한 서열을 갖는 올리고 이중쇄 RNA에 있어서는, 돌출부의 유무에 상관없이 또한, 이중쇄 형성부가 짧더라도 Bcl-2 단백질의 발현을 억제 할 수 있는 것을 발견하였다.
3' 돌출부의 서열은 활성에 영향을 주지 않는 것을 본 발명자들은 밝혔기 때문에, 본 발명은 Bcl-2 단백질의 발현을 억제할 수 있는 올리고 이중쇄 RNA로서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 81, 서열 번호 240 내지 서열 번호 256 및 서열 번호 274 내지 서열 번호 280에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 센스쇄 RNA 및 그 상보쇄로서, 서열 번호 82 내지 서열 번호 162, 서열 번호 257 내지 서열 번호 273 및 서열 번호 281 내지 서열 번호 287로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 안티센스쇄 RNA의 쌍으로 형성되는 이중쇄 RNA를 구성하는 염기쌍, 또는 그 적어도 어느 한쪽 단이 모두 4 염기쌍까지 삭제되어 있을 수 있는 15∼19 염기쌍을 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA를 제공한다.
본 발명의 일 형태에 있어서, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 이중쇄 형성부의 RNA쌍 중, 한쪽 또는 양쪽 서열중의 염기의 일부에, 1 또는 그 이상의 결실(欠失), 치환, 삽입 또는 부가를 가질 수 있다. 본 발명의 다른 형태에 있어서, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 이중쇄 형성부의 RNA쌍 중, 한쪽 또는 양쪽의 리보뉴클레오티드의 일부 또는 센스쇄의 전부가 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태는 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 쌍이 서열 번호 11 및 서열 번호 92, 서열 번호 30 및 서열 번호 111, 서열 번호 36 및 서열 번호 117, 서열 번호 43 및 서열 번호 124, 서열 번호 55 및 서열 번호 136, 서열 번호 62 및 서열 번호 143 또는 서열 번호 77 및 서열 번호 158로 표시되는 염기 서열의 쌍에 있어서, 각각 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분을 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA이다.
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 적어도 한쪽 RNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 뉴클레오티드 1 내지 4 염기를 돌출부로서 가질 수 있고, 갖지 않을 수 있다. 특히, 상기 서열 번호에 따른 염기 서열의 쌍으로 표시되는 7개의 올리고 이중쇄 RNA에 관해서는 돌출부가 없어도 강한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는다.
돌출부를 갖는 경우에는 돌출부를 구성하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드일 수 있거나 또는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 특히 바람직한 형태는 돌출부로서 뉴클레오티드를 2 염기 갖는 올리고 이중쇄 RNA이다. 더욱 바람직하게는 돌출부로서 dTdT, UU, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 일치하는 서열, 또는, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열이다.
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 뉴클레아제 내성 등, 생체 내에서의 안정성을 높이기 위해서, 그 뉴클레오티드를 구성하고 있는 리보오스 또는 인산 백본(backbone) 등의 적어도 일부가 수식(modification)될 수 있다. 수식되는 경우, 바람직한 수식은 당의 2'위의 수식, 당의 기타 부분의 수식, 올리고 이중쇄 RNA의 인산 백본의 수식 등이다. 당의 2'위의 수식은 리보오스의 2' 수산기를 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 치환하는 수식이다. 여기서 R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바 람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬렌을 나타낸다. 당의 기타 부분의 수식체는 4' 티오체 등을 들 수 있다. 인산 백본의 수식체로서는, 포스포로티오에이트체, 포스포로디티오에이트체, 알킬포스포네이트체, 포스포로아미데이트체 등을 들 수 있다.
특히 바람직한 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 B043, B436, B469, B533, B614, B631 및 B717로서, 이하에 이들의 서열을 나타내었다.
B043:
센스쇄
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 11)
안티센스쇄
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 92)
B436:
센스쇄
5'-AGGAUUGUGGCCUUCUUUG-dTdT-3'(서열 번호 30)
안티센스쇄
5'-CAAAGAAGGCCACAAUCCU-dTdT-3'(서열 번호 111)
B469:
센스쇄
5'-AUGUGUGUGGAGAGCGUCA-dTdT-3'(서열 번호 36)
안티센스쇄
5'-UGACGCUCUCCACACACAU-dTdT-3'(서열 번호 117)
B533:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 43)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 124)
B614:
센스쇄
5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGA-dTdT-3'(서열 번호 55)
안티센스쇄
5'-UCAAACAGAGGCCGCAUGC-dTdT-3'(서열 번호 136)
B631:
센스쇄
5'-GAUUUCUCCUGGCUGUCUC-dTdT-3'(서열 번호 62)
안티센스쇄
5'-GAGACAGCCAGGAGAAAUC-dTdT-3'(서열 번호 143)
B717:
센스쇄
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3'(서열 번호 77)
안티센스쇄
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3'(서열 번호 158)
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 세포에 트랜스펙션했을 때, Bcl-2 단백질의 발현을 이 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 억제할 수 있다. 안티센스 DNA를 이용한 Bcl-2 단백질의 발현 억제에 있어서는 일반적으로 안티센스 DNA를 수백 nM∼수십 μM의 농도로 필요로 하는 것과 비교하여 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 수 nM∼수백 nM의 농도로도, 세포에 트랜스펙션한 후, 24시간 이상, 예컨대 72시간 배양한 단계에서 Bcl-2 단백질 발현을 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 억제할 수 있다. 바람직하게는, 올리고 이중쇄 RNA를 3∼10 nM의 농도로 A431 세포(상피암 세포)에 트랜스펙션한 후, 72시간 배양한 단계에서 Bcl-2 단백질 발현을 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 억제할 수 있다.
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄 단독 또는 안티센스쇄 단독의 단일쇄의 핵산도 본 발명의 범위내이다. 즉, 서열 번호 1 내지 서열 번호 162에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 RNA를 이중쇄 형성부로서 포함하는 핵산이다.
본 발명의 일 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이중쇄 형성부의 RNA 서열중의 염기의 일부에 1 또는 그 이상의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 가질 수 있다.
본 발명의 핵산은 이중쇄 형성부의 RNA의 3' 말단에 뉴클레오티드를 1 내지 4 염기를 돌출부로서 가질 수 있고, 갖지 않을 수 있다. 돌출부의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드일 수 있거나 또는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 특히 바람직한 형태는 돌출부로서 뉴클레오티드를 2 염기 갖는 핵산이다. 더욱 바람직하 게는, 돌출부로서 dTdT, UU, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 일치하는 서열, 또는, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열이다.
또한, 본 발명의 핵산은 서열 번호 163 내지 서열 번호 196 및 서열 번호 198 내지 서열 번호 239에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 갖는 핵산이다.
본 발명의 다른 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이중쇄 형성부의 RNA 서열의 리보뉴클레오티드의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드로 치환될 수 있다.
또한, 서열 번호 1 내지 서열 번호 162 및 서열 번호 240 내지 서열 번호 287에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열을 가지며, 또한 이 염기 서열중의 우리딘(U)이 티민(T)인 염기 서열을 데옥시리보뉴클레오티드로서 함유하는 핵산도 본 발명의 범위내이다. 이들 핵산은 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 생산하기 위한 플라스미드에 삽입될 수 있거나 또는 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 시험관 내에서의 전사 반응에 의해 얻기 위한 템플레이트 DNA로서 이용할 수 있다. 또는, 안티센스 프로브로서 이용할 수 있다. 또한, 상기한 핵산은 그의 염기 서열 중에 1 또는 그 이상의 결실, 치환, 삽입 또는 부가한 염기를 포함하고, 또한, 이 핵산이 템플레이트가 되어 전사 반응 등에 의해 생성한 RNA가 올리고 이중쇄 RNA를 구성했을 때에 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 특징으로 하는 핵산일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기한 스크리닝으로 얻어진 특히 바람직한 본 발명의 올리 고 이중쇄 RNA:B043(서열 번호 11 및 서열 번호 92), B436(서열 번호 30 및 서열 번호 111), B469(서열 번호 36 및 서열 번호 117), B533(서열 번호 43 및 서열 번호 124), B614(서열 번호 55 및 서열 번호 136), B631(서열 번호 62 및 서열 번호 143) 및 B717(서열 번호 77 및 서열 번호 158)의 올리고 이중쇄 RNA의 19 염기쌍의 이중쇄 형성부를 포함하는 25에서 27 염기쌍의 이중쇄 형성부를 갖는 올리고 이중쇄 RNA로부터, Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 B043, B436, B469, B533, B614, B631 및 B717로 이루어진 군에서 선택되는 올리고 이중쇄 RNA의 19 염기쌍의 이중쇄 형성부를 포함하는 25~27 염기쌍의 이중쇄 형성부를 갖는 올리고 이중쇄 RNA로서, Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA도 제공한다.
상기 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 측정한 결과, 서열 번호 288 및 서열 번호 295 내지 서열 번호 300에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기 및 5' 말단의 6 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 6 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 서열을 갖는 핵산 및 이 염기 서열과 상보쇄를 형성하는 서열을 포함하는 서열 번호 319 및 서열 번호 326 내지 서열 번호 331로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기 및 그것에 계속되는 6 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 6 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부에 상보적인 서열을 갖는 핵산과의 쌍으로 이루어진 이중쇄 형성 부를 포함하는 올리고 이중쇄 RNA를 이용했을 때에 Bcl-2 단백질의 발현이 크게 저하되는 것을 발견하였다.
본 발명의 바람직한 형태는 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 쌍이 서열 번호 288 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 289 및 서열 번호 320의 염기 서열, 서열 번호 290 및 서열 번호 321의 염기 서열, 서열 번호 291 및 서열 번호 322의 염기 서열, 서열 번호 292 및 서열 번호 323의 염기 서열, 서열 번호 293 및 서열 번호 324의 염기 서열, 서열 번호 294 및 서열 번호 325의 염기 서열, 서열 번호 295 및 서열 번호 326의 염기 서열, 서열 번호 296 및 서열 번호 327의 염기 서열, 서열 번호 297 및 서열 번호 328의 염기 서열, 서열 번호 298 및 서열 번호 329의 염기 서열, 서열 번호 299 및 서열 번호 330의 염기 서열, 또는 서열 번호 300 및 서열 번호 331의 염기 서열로 표시되는 염기 서열의 쌍에 있어서, 각각 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분을 이중쇄 형성부로서 포함하는 25 염기쌍의 올리고 이중쇄 RNA이다.
돌출부를 갖는 경우에는 돌출부를 구성하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드일 수 있거나 또는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 특히 바람직한 형태는 돌출부로서 뉴클레오티드를 2 염기 갖는 올리고 이중쇄 RNA이다. 더욱 바람직한 형태는 센스쇄 RNA의 3' 말단 돌출부로서 dTdT, UU 또는 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 서열을 가지며, 안티센스쇄 RNA의 3' 말단 돌출부로서 dTdT, UU 또는 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA의 일부에 상보적인 서열을 갖는 올리고 이중쇄 RNA이다.
또한, 본 발명의 일 형태에 있어서, 서열 번호 288 내지 서열 번호 300에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 2 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 염기 서열을 갖는 핵산 및 이 염기 서열과 상보쇄를 형성하는 서열을 포함한 서열 번호 319 내지 서열 번호 331에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 2 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산의 쌍으로 이루어진 이중쇄 RNA인 27 염기쌍의 올리고 이중쇄 RNA를 이용했을 때에, Bcl-2 단백질의 발현이 크게 저하되는 것을 발견하였다.
본 발명의 바람직한 형태는 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 쌍이 서열 번호 303 및 서열 번호 332의 염기 서열, 또는 서열 번호 304 및 서열 번호 334의 염기 서열로 이루어진 이중쇄 RNA로 구성되는 27 염기쌍의 올리고 이중쇄 RNA이다.
또한, 본 발명의 일 형태에 있어서, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 이중쇄 형성부의 RNA쌍 중, 한쪽 또는 양쪽의 서열중의 염기의 일부에 1 또는 그 이상의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 형태에 있어서, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 이중쇄 형성부의 RNA쌍 중, 한쪽 혹은 양쪽의 리보뉴클레오티드의 일부 또는 센스쇄의 전부가 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드로 치환될 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태는 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA의 쌍이 서열 번호 305 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 306 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 307 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 308 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 309 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 310 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 311 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 312 및 서열 번호 320의 염기 서열, 서열 번호 313 및 서열 번호 321의 염기 서열, 서열 번호 314 및 서열 번호 322의 염기 서열, 서열 번호 315 및 서열 번호 323의 염기 서열, 서열 번호 316 및 서열 번호 324의 염기 서열, 또는, 서열 번호 317 및 서열 번호 325의 염기 서열로 표시되는 염기 서열의 쌍에 있어서, 각각 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분을 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA이다.
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 뉴클레아제 내성 등, 생체 내에서의 안정성을 높이기 위해서, 그 뉴클레오티드를 구성하고 있는 리보오스 또는 인산 백본 등의 적어도 일부가 수식될 수 있다. 수식되는 경우, 바람직한 수식은 당의 2'위의 수식, 당의 기타 부분의 수식, 올리고 이중쇄 RNA의 인산 백본의 수식 등이다. 당의 2'위의 수식은 리보오스의 2' 수산기를 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 치환하는 수식이다. 여기서, R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬기를 나타내고, R'는 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬렌을 나타낸다. 당의 기타 부분의 수식체는 4' 티오체 등을 들 수 있다. 인산 백본의 수식체로서는 포스포로티오에이트체, 포스포로디티오에이트체, 알킬포스포네이트체, 포스포로아미데이트체 등을 들 수 있다.
특히 바람직한 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 B037-25, B038-25, B039-25, B-040-25, B041-25, B042-25, B043-25, B430-25, B463-25, B527-25, B608-25, B625-25 및 B711-25로서, 이하에 이들의 서열을 나타내었다.
B037-25:
센스쇄:
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 288)
안티센스쇄:
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'(서열 번호 319)
B038-25:
센스쇄:
5'-AGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUA-dTdT-3'(서열 번호 289)
안티센스쇄:
5'-UAAUGGAUGUACUUCAUCACUAUCU-dTdT-3'(서열 번호 320)
B039-25:
센스쇄:
5'-GAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAU-dTdT-3'(서열 번호 290)
안티센스쇄:
5'-AUAAUGGAUGUACUUCAUCACUAUC-dTdT-3'(서열 번호 321)
B040-25:
센스쇄:
5'-AUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAUA-dTdT-3'(서열 번호 291)
안티센스쇄:
5'-UAUAAUGGAUGUACUUCAUCACUAU-dTdT-3'(서열 번호 322)
B041-25:
센스쇄:
5'-UAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAUAA-dTdT-3'(서열 번호 292)
안티센스쇄:
5'-UUAUAAUGGAUGUACUUCAUCACUA-dTdT-3'(서열 번호 323)
B042-25:
센스쇄:
5'-AGUGAUGAAGUACAUCCAUUAUAAG-dTdT-3'(서열 번호 293)
안티센스쇄:
5'-CUUAUAAUGGAUGUACUUCAUCACU-dTdT-3'(서열 번호 324)
B043-25:
센스쇄:
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUUAUAAGC-dTdT-3'(서열 번호 294)
안티센스쇄:
5'-GCUUAUAAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 325)
B430-25:
센스쇄:
5'-UGGGGGAGGAUUGUGGCCUUCUUUG-dTdT-3'(서열 번호 295)
안티센스쇄:
5'-CAAAGAAGGCCACAAUCCUCCCCCA-dTdT-3'(서열 번호 326)
B463-25:
센스쇄:
5'-GGGGUCAUGUGUGUGGAGAGCGUCA-dTdT-3'(서열 번호 296)
안티센스쇄:
5'-UGACGCUCUCCACACACAUGACCCC-dTdT-3'(서열 번호 327)
B527-25:
센스쇄:
5'-GGAUGACUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 297)
안티센스쇄:
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAGUCAUCC-dTdT-3'(서열 번호 328)
B608-25:
센스쇄:
5'-GCCCCAGCAUGCGGCCUCUGUUUGA-dTdT-3'(서열 번호 298)
안티센스쇄:
5'-UCAAACAGAGGCCGCAUGCUGGGGC-dTdT-3'(서열 번호 329)
B625-25:
센스쇄:
5'-CUGUUUGAUUUCUCCUGGCUGUCUC-dTdT-3'(서열 번호 299)
안티센스쇄:
5'-GAGACAGCCAGGAGAAAUCAAACAG-dTdT-3'(서열 번호 330)
B711-25:
센스쇄:
5'-CCACAAGUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3'(서열 번호 300)
안티센스쇄:
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCACUUGUGG-dTdT-3'(서열 번호 331)
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 세포에 트랜스펙션했을 때, 이 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 Bcl-2 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 안티센스 DNA를 이용한 Bcl-2 단백질의 발현 억제에 있어서는 일반적으로 안티센스 DNA를 수백 nM에서 수십 μM의 농도로 필요로 하는 것과 비교하여 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 수 nM∼수백 nM의 농도로도, 세포에 트랜스펙션한 후, 24시간이상, 예컨대 72시간 배양한 단계에서 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 Bcl-2 단백질 발현을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 올리고 이중쇄 RNA를 3∼10 nM의 농도로 A431 세포(상피암 세포)에 트랜스펙션한 후, 72시간 배양한 단계에서 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 Bcl-2 단백질 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 핵산을 구성하는 센스쇄 단독 또는 안티센스쇄 단독의 단일쇄의 핵산도 본 발명의 범위내이다. 즉, 서열 번호 288 및 서열 번호 295 내지 서열 번호 300에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기 및 5' 말단의 6 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 6 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 염기 서열을 갖는 핵산, 혹은, 서열 번호 319 및 서열 번호 326 내지 서열 번호 331에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기 및 그것에 계속되는 6 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 6 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산이다.
본 발명의 일 형태에 있어서, 본 발명의 핵산은 이중쇄 형성부의 RNA 서열중인 염기의 일부에 1 또는 그 이상의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 가질 수 있다.
본 발명의 핵산은 돌출부의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드일 수 있거나 또는 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 특히 바람직한 형태는 돌출부로서 뉴클레오티드를 2 염기 갖는 핵산이다. 더욱 바람직하게는, 돌출부로서 dTdT, UU, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 일치하는 서열, 또는, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA에 상보적인 서열이다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 서열 번호 288 내지 서열 번호 300 및 서열 번호 319 내지 서열 번호 331로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 갖는 핵산이다.
또한, 본 발명의 핵산은 서열 번호 288 내지 서열 번호 300에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루 어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 2 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 염기 서열을 갖는 핵산, 혹은, 서열 번호 319 내지 서열 번호 331에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 2 염기를 함께 부가한 bcl-2 mRNA의 일부에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산이다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산은 서열 번호 303 내지 서열 번호 304 및 서열 번호 332 내지 서열 번호 334에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 갖는 핵산이다.
본 발명의 다른 형태에 있어서, 서열 번호 288 내지 서열 번호 300 및 서열 번호 319 내지 서열 번호 331에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열을 가지며, 이 염기 서열중의 리보뉴클레오티드의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드로 치환되어 있는 염기 서열을 포함하는 핵산도 본 발명의 범위내이다.
또한, 서열 번호 288 내지 서열 번호 300 및 서열 번호 319 내지 서열 번호 331에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열에 있어서의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 염기 서열을 가지며, 이 염기 서열중의 우리딘(U)이 티민(T)인 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로서 더 함유하는 핵산도 본 발명의 범위내이다. 이들 핵산은 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 생산하기 위한 플라스미드에 삽입될 수 있거나 또는 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 시험관 내에서의 전사 반응에 의해 얻기 위한 템플레이트 DNA로서 이용할 수 있다. 또는, 안티센스프로브로 서 이용할 수 있다. 또한, 상기한 핵산은 그의 염기 서열중에 1 또는 그 이상의 결실, 치환, 삽입 또는 부가한 염기를 포함하고, 또한, 이 핵산이 템플레이트가 되어 전사 반응 등에 의해 생성한 RNA가 올리고 이중쇄 RNA를 구성했을 때에 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 특징으로 하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 RNA 및 DNA는 당업자에게 기지인 포스포아미다이트법 또는 트리에스테르법에 의해 고상(固相)으로, 또는 액상(液相)으로 합성할 수 있다. 가장 일반적인 형태는 포스포아미다이트법에 의한 고상 합성법이며, 핵산 자동 합성기 또는 수동으로써 합성할 수 있다. 고상으로의 합성이 종료된 후에는 고상으로부터의 이탈, 보호기의 탈보호 및 목적물의 정제 등을 행한다. 정제에 의해 순도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 핵산을 얻는 것이 바람직하다. 올리고 이중쇄 RNA로서 이용하는 경우에는 합성 및 정제한 센스쇄, 안티센스쇄를 적당한 비율, 예컨대, 안티센스쇄 1 당량에 대하여 센스쇄 0∼10 당량, 바람직하게는 0.5∼2 당량, 더욱 바람직하게는 0.9-1.1 당량, 가장 바람직하게는 등몰량으로 혼합한 후, 어닐링하여 이용하여도 좋거나 또는 혼합한 것을 어닐링하는 공정을 생략하고 직접 이용할 수 있다. 어닐링은 전형적으로는 센스쇄, 안티센스쇄를 거의 등몰량으로 혼합한 후, 94℃ 정도로 5분 정도 가열한 후, 실온까지 서서히 냉각시킴으로써 행하지만, 당업자에게 알려진 다른 조건에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 양이온성 리포솜, 그 밖의 트랜스펙션용 벡터 등의 담체를 이용하여 세포 내에 트랜스펙션시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 형태에 있어서는 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 또는 마이크로인젝션법 등에 의해 직접 세포 내에 도입시킬 수 있다.
의약 조성물
본 발명은 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA와 이 올리고 이중쇄 RNA를 세포 내로 이행시키는 데 유효한 담체와의 복합체를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물은 Bcl-2 단백질의 과잉 발현이 원인이 되고 있는 질환, 아폽토시스의 촉진이 요망되는 질환, 또는 혈액학적 악성질환 등의 치료 및/또는 예방을 위해 이용할 수 있다. 이들 질환은 구체적으로는 림프종 및 백혈병 모두를 포함하는 혈액학적 악성질환 및 고형 종양, 예컨대, 간장암, 피부암, 유방암, 폐암, 소화기암, 전립선암, 자궁암, 방광암 등이다.
올리고 이중쇄 RNA와의 복합체를 형성하는 담체는 올리고 이중쇄 RNA를 세포 내로 이행시키는 데 유효한 양이온성 리포솜 및 양이온성 폴리머 등의 양이온성 담체 또는 바이러스엔벨로프를 이용한 담체 등을 이용할 수 있다. 양이온성 리포솜으로서 바람직한 것은 2-O-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-O-디올레오일글리세롤을 함유하는 리포솜(이하 리포솜 A라 표기함), 올리고펙토아민 (Invitrogen), 리포펙틴 (Invitrogen), 리포펙토아민 (Invitrogen), 리포펙토아민 2000 (Invitrogen), DMRIE-C (Invitrogen), GeneSilencer (Gene Therapy Systems), TransMessenger (QIAGEN), TransIT TKO (Mirus) 등이다. 양이온성 폴리머로서 바람직한 것은 JetSI (Qbiogene), Jet-PEI (폴리에틸렌이민; Qbiogene) 등이다. 바이러스엔벨로프를 이용한 담체로서 바람직한 것은 GenomeOne (HVJ-E 리포솜; 이시하라 산교) 등이다.
본 발명의 의약 조성물에 함유되는 올리고 이중쇄 RNA와 담체의 복합체는 당업자에게 공지인 방법에 의해 조제할 수 있다. 간단히 설명하면, 적당한 농도의 담체 분산액과 올리고 이중쇄 RNA 용액을 혼합하여 조제한다. 양이온성 담체를 이용하는 경우, 올리고 이중쇄 RNA는 수용액 속에서 음전하를 띠고 있기 때문에, 통상적인 방법에 의해 수용액 속에서 혼합함으로써 올리고 이중쇄 RNA와 양이온성 담체는 용이하게 복합체를 형성한다. 복합체 형성을 위해 이용하는 수성 용매로서는, 주사용수, 주사용 증류수, 생리식염수 등의 전해질액, 포도당액, 말토오스액 등의 당액 등을 이용할 수 있다. 또한, 복합체를 형성시킬 때의 pH 및 온도 등의 조건은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예컨대, 리포솜 A의 경우, 10% 말토오스 수용액 속의 16 ㎎/㎖의 리포솜 분산액에 10% 말토오스 수용액 속의 올리고 이중쇄 RNA 용액을 pH 7.4, 25℃에서 교반하면서 서서히 첨가하여 조제할 수 있다.
복합체는 필요하면 초음파 분산 장치나 고압 유화 장치 등을 이용하여 분산 처리를 행함으로써, 균일한 조성물로 제공할 수도 있다. 당업자라면, 담체와 올리고 이중쇄 RNA의 복합체의 조제에 최적의 방법 및 조건은 이용하는 담체에 의존하기 때문에, 상기한 방법에 구애되지 않고, 이용하는 담체에 최적의 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 함유되는 올리고 이중쇄 RNA와 담체의 복합체의 배합비는 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 1∼200 중량부가 적당하다. 바람직하게는, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 2.5∼100 중량부, 더욱 바람직하게는 10∼20 중량부이다.
본 발명의 의약 조성물은 올리고 이중쇄 RNA와 담체의 복합체 이외에 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어 또는 희석제 등을 함유할 수 있다. 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어 또는 희석제 등은 본질적으로 화학적으로 불활성 및 무해한 조성물로서, 본 발명의 의약 조성물의 생물학적 활성에 전혀 영향을 주지 않는 것이다. 그와 같은 캐리어 또는 희석제의 예는 염 용액, 당 용액, 글리세롤 용액, 에탄올 등이 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물은 치료 및/또는 예방에 유효량의 복합체를 함유하고, 또한, 환자에게 적절히 투여할 수 있는 형태로 제공된다. 본 발명의 의약 조성물의 제제 형태는 예컨대 주사제, 점적제 등의 액제, 예컨대 연고, 로션제 등의 외용제, 또는 동결 건조 제제라도 좋다.
액제의 경우, 본 복합체가 0.001∼25%(w/v)의 농도 범위내에서 존재하고 있는 것이 적당하며, 바람직하게는 0.01∼5%(w/v)의 농도 범위내에서 존재하고, 보다 바람직하게는 0.1∼2%(w/v)의 농도 범위내에서 존재하는 것이 적당하다. 본 발명의 의약 조성물은 의약적으로 허용되는 임의의 첨가제, 예컨대, 유화 보조제, 안정화제, 등장화제, pH 조정제를 적당량 함유할 수 있다. 구체적으로는, 탄소수6∼22의 지방산 (예컨대, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레인산, 리놀산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산)이나 그 의약적으로 허용되는 염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염); 알부민, 덱스트란 등의 유화 보조제; 콜레스테롤, 포스파티딘산 등의 안정화제; 염화나트륨, 글루코오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스 등의 등장화제; 염산, 질산, 인산, 초산, 수산 화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민 등의 pH 조정제; 등을 들 수 있다. 의약적으로 허용되는 임의의 첨가제는 본 복합체의 분산 전이라도 분산 후라도 적당한 공정에 의해 첨가할 수 있다.
동결 건조 제제는 올리고 이중쇄 RNA와 담체와의 복합체를 분산 처리한 후, 동결 건조 처리함으로써 조제할 수 있다. 동결 건조 처리는 통상적인 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, 상기한 분산 처리후의 복합체 용액을 무균 상태에서 소정량 바이알병에 분주(分注)하고, 약 140∼-20℃의 조건으로 예비 건조를 약 2시간 정도 행하며, 약 0∼10℃에서 감압 하에 1차 건조를 행하고, 계속해서, 약 15∼25℃에서 감압 하에 2차 건조하여 동결 건조할 수 있다. 그리고, 일반적으로는 바이알 내부를 질소 가스로 치환하고, 마개를 닫아 본 발명 의약 조성물의 동결 건조 제제를 얻을 수 있다.
본 발명의 동결 건조 제제는 일반적으로는 임의의 적당한 용액(재용해액)의 첨가에 의해 재용해하여 사용할 수 있다. 이러한 재용해액으로서는 주사용수, 생리식염수 등의 전해질액, 포도당액, 기타 일반 수액을 들 수 있다. 이 재용해액의 액량은 용도 등에 따라 다르며, 특별히 제한되지 않지만, 동결 건조전의 액량의 0.5∼2배량, 또는 500 ㎖ 이하가 적당하다.
본 발명의 의약 조성물은 투여 단위 형태로 투여하는 것이 바람직하며, 인간을 포함한 동물에 대하여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 경구 투여, 조직내 투여, 경피 투여, 경점막 투여 또는 경직장 투여할 수 있고, 환자의 증상에 맞춘 적절한 방법에 의해 투여하여도 좋다. 특히 정맥 투여, 경피 투여, 경점막 투여가 바람직하 다. 또한, 암내 국소 투여 등의 국소 투여할 수도 있다. 이들 투여 방법에 알맞은 제형, 예컨대 각종 주사제, 경구제, 점적제, 흡수제, 점안제, 연고제, 로션제, 좌제 등으로 투여되는 것은 물론이다.
예컨대, 본 발명의 의약 조성물의 용량은 약품, 제형, 연령이나 체중 등의 환자의 상태, 투여 경로, 병의 성질과 정도 등을 고려한 후에 결정하는 것이 바람직하지만, 통상은, 성인에 대하여 올리고 이중쇄 RNA량으로서 1일에 대해 0.1 ㎎∼10 g/1일/인간의 범위가 일반적이고, 바람직하게는 1 ㎎∼500 mg/1일/인간의 범위가 일반적이다. 경우에 따라서는 이 이하로도 충분하며, 또한 반대로 이 이상의 용량을 필요로 하는 경우도 있다. 또한 1일 1∼수회 투여, 또는 1∼수일의 간격으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 형태에 있어서는, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 생성하기 위해 이용되는 DNA를 의약적으로 허용되는 첨가제 등과 함께 의약 조성물로 할 수 있다. 여기서, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 생성하기 위해서 이용되는 DNA는 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA의 이중쇄 형성부의 염기 서열을 데옥시리보뉴클레오티드로서 갖는(여기서, 뉴클레오티드 서열중의 우리딘은 티민으로 변환됨) DNA를 함유하는 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 생산하기 위한 플라스미드 등을 의미한다. 이러한 의약 조성물은 환자에게 투여하면, 환자의 생체 내에서 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA를 생성하기 때문에, 전술한 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA와 적절한 담체를 함유하는 의약 조성물과 동일한 효과를 갖는다. 즉, Bcl-2의 과잉 발현이 원인이 되고 있는 질환 등의 치료 및/또는 예방에 유효하다. 투여 형태 및 투여 경로는 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA와 담체의 복합체를 함유하는 의약 조성물의 경우와 마찬가지로, 환자의 증상에 맞춘 적절한 방법에 의해 투여하여도 좋고, 용량도 또한 마찬가지로, 약품, 제형, 연령이나 체중 등의 환자의 상태, 투여 경로, 병의 성질과 정도 등을 고려한 후에 결정하여도 좋다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명하지만, 본 발명은 실시예에 나타내는 범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 스크리닝과 그 평가
i) 올리고 이중쇄 RNA의 조제
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 합성은 자동 핵산 합성 장치를 이용한 표준적인 포스포아미다이트법에 의한 고상 합성으로 행하였다. 합성은 Dharmacon사 (미국 콜로라도주) 또는 니혼 바이오서비스 (사이타마현)에 합성을 의뢰하거나 또는 본 발명자들이 행하였다.
본 발명자들이 행한 순서를 간단히 설명한다. 자동 DNA 합성기(어플라이드 바이오 시스템, Expedite 8909)를 이용하여 표준적인 포스포아미다이트법에 의해 원하는 염기 서열을 형성하도록 모노머를 순차적으로 축합하였다. 진한 수산화암모늄-에탄올(3:1) 혼합액을 이용하여 CPG(controlled pore glass)에 의해 뉴클레오티드쇄를 개열(開裂)시키고, 또한 이 용액 속에서 55℃, 18시간 두어 탈보호시켰다. 그 후, 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드의 테트라히드로푸란 용액을 이용하여 실온에서 20시간 처리하고, 2'위의 실릴기를 탈보호시켰다. 얻어진 올리고 리 보뉴클레오티드를 역상 크로마토그래피로써 정제하였다. 또한, 80% 초산 수용액으로써 실온에서 30분 처리하고, 5'위의 DMTr기를 탈보호시킨 후, 이온 교환 크로마토그래피로써 재차 정제하였다. 탈염 후에 얻어진 올리고뉴클레오티드는 모세관 겔 전기 영동에 의해 90% 이상이 목적으로 하는 전장 물질인 것을 확인하였다.
이렇게 해서 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 각각을 합성하고, 이중쇄 형성부가 상보적인 2개의 핵산을 후술하는 바와 같이 등몰로 혼합함으로써 올리고 이중쇄 RNA로서 이용하였다.
ii) 스크리닝에 있어서의 평가 방법
스크리닝에 있어서의 평가는 올리고 이중쇄 RNA를 담체와 함께 각종 암세포에 도입하여 단백질의 발현량을 웨스턴 블로팅으로 정량함으로써, 및 mRNA의 양을 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)에 의해 준정량함으로써 행하였다.
올리고 이중쇄 RNA와 담체 복합체의 조제
담체로서 2-O-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-O-디올레오일글리세롤과 정제 난황 레시틴을 함유하는 리포솜 A를 이용하여 올리고 이중쇄 RNA와의 복합체를 조제하였다. 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 리포솜 A 16 중량부를 혼합하여 복합체를 조제하였다. 이하에, 올리고 이중쇄 RNA의 종농도 10 μM의 복합체 용액, 2 ㎖의 조제에 대해서 나타내었다. 단, 올리고 이중쇄 RNA 복합체의 농도는 올리고 이중쇄 RNA가 완전히 이중쇄 형성되어 있다고 가정했을 때에 복합체에 함유되어 있는 올리고 이중쇄 RNA의 몰농도로 나타내고 있다.
300 μM이 되도록 주사용수에 용해한 센스쇄 및 안티센스쇄 각각 66.6 ㎕를 시험관 속에서 혼합하였다. 이것에 866.8 ㎕의 10% 말토오스를 첨가하고, 양 쇄를 각각 20 μM의 농도로 함유하는 용액 1 ㎖를 조제하였다. 이것을 올리고 이중쇄 RNA 용액으로 하였다.
16 ㎎/㎖의 리포솜 A 분산액 268 ㎕에 10% 말토오스 732 ㎕를 첨가하여 4.3 ㎎/㎖의 리포솜 A 분산액 1 ㎖를 조제하였다. 이 리포솜 분산액 1 ㎖에 상기 올리고 이중쇄 RNA 용액 1 ㎖를 교반하면서 서서히 첨가하였다. 이상의 조작에 의해 올리고 이중쇄 RNA의 종농도가 10 μM인 올리고 이중쇄 RNA-리포솜 복합체 용액을 조제하였다. 이 복합체를 600 W의 바스형(bath-type) 초음파 장치를 이용하여 2분간 분산 처리함으로써 복합체의 입자를 균일하게 하였다.
웨스턴 블로팅
상기한 올리고 이중쇄 RNA-리포솜 복합체를 이용하여 올리고 이중쇄 RNA가 세포 내에 트랜스펙션됨으로써, Bcl-2 단백질의 발현이 억제되는지 여부를 웨스턴 블로팅에 의해 Bcl-2 단백질량의 변화를 평가함으로써 평가하였다.
6 ㎝ 직경의 페트리 디쉬에 A431 세포(상피암 세포), A375 세포(멜라노머 세포), MDA-MB-231 세포(유방암 세포), 또는 A549(폐암) 세포를 2×105 cells/dish로 파종하고, 10% FBS(소 태아 혈청)를 함유하는 DMEM 배지(Sigma, D6046) 속의 37℃, 5% CO2 조건 하에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 2.7 ㎖의 10% FBS 함유 DMEM 배지(Sigma, D6046)를 첨가하여 배지를 교환하였다. 거기에, 10% 말토오스 수용액 속에서 혼합한 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체 (중량비는 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16) 용액을 0.3 ㎖ 첨가하여 종농도를 3 ㎖로 하였다. 이 때의 올리고 이중쇄 RNA의 최종 농도는 3 nM 또는 10 nM이다. 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 72시간 배양하였다. 세포를 PBS(Phosphate buffered saline)로 2회 세정하고, 셀 스크레이퍼(scraper)를 이용하여 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 1000×g으로 2분간 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 20∼100 ㎕의 용혈 버퍼(Lysis buffer) (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40)를 첨가하여 세포를 용해하였다. 얼음 위에서 30분간 방치하고, 100,000×g으로 15분간 원심 분리한 후, 상청을 새로운 튜브로 옮겨 전기영동용 샘플로 하였다.
전기 영동은 폴리아크릴아미드 겔(ATTO NPG-520L 또는 E-T520L)을 이용하여 1 레인당 총 단백질의 양을 15 ㎍으로 한 샘플을 사용하였다. 영동 종료 후, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)막에 겔 내의 단백질을 전사하고, 5% 스킴 밀크 함유 PBST(PBST-MLK; 여기서, PBST의 조성은 0.1% Tween 20 함유 PBS) 속의 실온에서 1시간 블로킹하였다. 우선, Bcl-2 단백질의 검출을 행하였다. 블로킹이 종료된 PVDF 막을 PBST-MLK에 의해 500배로 희석한 마우스 항 인간 Bcl-2 모노크로날 항체(DAKO M0887) 속에서 4℃로 밤새 흔들어 1차 항체와 결합시켰다. PVDF 막을 PBST로 세정한 후, PBST-MLK에 의해 1500배로 희석한 HRP(서양고추냉이 퍼옥시다제) 표식 항 마우스 Ig 항체(DAKO P0447) 안에서 실온으로 2시간 흔들어 1차 항체와 결합시켰다. PBST로 세정한 후, 웨스턴 라이트닝 케미루미네센스 리에젠트 플러스(Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus, Perkin Elmer)를 이용하여 발광시키고, 필름에 노광하였다.
Bcl-2 단백질의 검출을 종료한 후, 동일한 PVDF막을 증류수로 세정하여 Bcl-2와 마찬가지로 액틴(Actin) 단백질의 검출을 행하였다. 1차 항체에는 염소 항 인간 액틴 항체(Santa Cruz sc-1616)를 이용하고, 2차 항체에는 HRP 표식 항 염소 Ig 항체(DAKO P0449)를 이용하였다. 각각 PBST-MLK에 의해 2500배, 3000배로 희석하여 사용하였다.
밴드의 농도의 판단은 루시페라제의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA(GL3)를 트랜스펙션했을 때의 Bcl-2 단백질의 밴드 농도를 음성 대조로, Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 B717 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션했을 때의 Bcl-2 단백질의 밴드 농도를 양성 대조로 하여 눈으로 확인함으로써 행하였다. 눈으로 확인한 결과, 밴드의 농도가 양성 대조와 동등한 경우에는 「+」, 양성 대조보다 흐린 경우에는 「++」, 음성 대조보다 흐리지만, 양성 대조보다 진한 경우에는 「+/-」로 하였다. 또한, 이중쇄 형성부가 25 염기쌍 이상의 올리고 이중쇄 RNA의 경우에는 처리 농도가 10 nM에 있어서 음성 대조보다 충분히 흐린 경우에는 「++」, 약간 흐린 경우에는 「+」로 하고, 처리 농도가 100 nM에 있어서, 음성 대조보다 약간 흐린 경우에는「+/-」로 하였다.
본 명세서에 있어서, 「활성을 유지한다」란 상기와 같이 시험 대상인 올리고 핵산 RNA를 트랜스펙션했을 때의 Bcl-2 단백질의 밴드 농도(활성)가 「+/-」「+」「++」 이상인 것을 의미한다.
RT-PCR에 의한 mRNA량의 측정량
올리고 이중쇄 RNA의 트랜스펙션에 의한 Bcl-2 단백질 발현 억제 작용은 mRNA의 발현 억제에 기인하는지 여부를 조사하기 위해서 bcl-2의 mRNA의 발현량을 RT-PCR에 의한 준정량에 의해 평가하였다.
6 ㎝ 직경의 페트리 디쉬에 A431 세포(상피암 세포)를 2×105 cells/dish로 파종하고, 10% FBS(소 태아 혈청)를 함유하는 DMEM 배지(Sigma, D6046) 속의 37℃, 5% CO2 조건 하에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 2.7 ㎖의 10% FBS 함유 DMEM 배지(Sigma, D6046)를 첨가하여 배지를 교환하였다. 거기에 10% 말토오스 수용액 속에서 혼합한 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비는 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16) 용액을 0.3 ㎖ 첨가하여 종량(終量)을 3 ㎖로 하였다. 이 때의 올리고 이중쇄 RNA의 최종 농도는 10 nM이다. CO2 인큐베이터 내에서 24시간 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 0.5 ㎖의 Isogen (NIPPON GENE CO., LTD)을 이용하여 세포를 용해하여 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하여 수층과 유기층으로 분리하여 수층으로부터 토탈 RNA를 단리하였다.
토탈 RNA 2㎍을 주형으로, Thermoscript RT-PCR System(Gibco BRL11146-016)을 이용하여 역전사 반응을 행하여 cDNA를 작성하였다. 이 역전사 반응액 속에 함유되는 cDNA를 PCR 반응의 주형으로 이용하고, 모세관 PCR법에 의한 검출 정량 시스템 (라이트사이크라, 로슈 진단)을 이용하여 bcl-2 및 구성적 발현 유전자인 GADPH (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 특이적인 PCR 증폭을 행하여 mRNA량의 준정량을 행하였다. bcl-2의 PCR 증폭에는 100 ng의 토탈 RNA 유래의 cDNA를, GADPH의 PCR 증폭에는 0.5 ng의 토탈 RNA 유래의 cDNA를 각각 주형으로 이용하였다. 음성 대조로서는 루시페라제의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA (GL3)로 트랜스펙션한 것을 이용하였다. 샘플의 mRNA량은 음성 대조에 있어서의 bcl-2의 mRNA량 또는 GADPH의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 평가하였다.
iii) 스크리닝
Bcl-2 단백질을 코딩하는 mRNA의 서열로서, 등록되어 있는 것을 비교 검토한 결과, GenBank 등록 번호 BC027258로서 등록되어 있는 bcl-2의 완전장 mRNA의 서열이 컨센서스인 것을 확인하였다. 이 GenBank 등록 번호 BC027258의 염기 서열(이하, bcl-2 mRNA라 함: 서열 번호 197)에 기초하여 후술하는 실시예에 나타내는 1차, 2차, 3차 스크리닝에 의해 Bcl-2 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA를 탐색하였다.
스크리닝에 이용한 올리고 이중쇄 RNA는 19 염기의 센스쇄 RNA 및 이것에 상보적인 안티센스쇄 RNA를 이중쇄 형성부로서 가지며, 각각의 3' 말단에 dTdT의 돌출부를 갖도록 하였다. 또한, 스크리닝에 이용한 올리고 이중쇄 RNA는「Bxxx」로 표시하고, 여기서, 「xxx」는 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄의 5' 말단의 염기의 bcl-2 mRNA에 있어서의 번역 개시점에서부터의 위치 번호를 표시하는 것으로 하였다.
1차 스크리닝
1차 스크리닝에 있어서의 올리고 이중쇄 RNA의 풀은 bcl-2 mRNA의 ORF(Open Reading Frame) 안에서, 9 염기마다 시작되는 19 염기의 센스쇄 RNA와, 그 상보쇄인 안티센스쇄 RNA를 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA로 구성되는 것으로 하였다. 단, BLAST 서치의 결과, 이용하는 올리고 이중쇄 RNA 중에 bcl-2 mRNA 이외의 mRNA에 대한 연속 17 염기 이상의 상보 서열이 존재하는 경우에는 적절하게 1 내지 2 염기 쉬프트시켜 bcl-2 mRNA 이외의 mRNA와의 상보 서열이 16 염기 이하인 서열을 사용하였다.
1차 스크리닝 결과, B002(서열 번호 1 및 서열 번호 82), B010(서열 번호 2 및 서열 번호 83), B028(서열 번호 3 및 서열 번호 84), B037(서열 번호 6 및 서열 번호 87), B046(서열 번호 14 및 서열 번호 95), B055(서열 번호 15 및 서열 번호 96), B065(서열 번호 16 및 서열 번호 97), B073(서열 번호 17 및 서열 번호 98), B084(서열 번호 18 및 서열 번호 99), B136(서열 번호 19 및 서열 번호 100), B172(서열 번호 20 및 서열 번호 101), B199(서열 번호 21 및 서열 번호 102), B207(서열 번호 22 및 서열 번호 103), B253(서열 번호 23 및 서열 번호 104), B262(서열 번호 24 및 서열 번호 105), B280(서열 번호 25 및 서열 번호 106), B325(서열 번호 26 및 서열 번호 107), B352(서열 번호 27 및 서열 번호 108), B397(서열 번호 28 및 서열 번호 109), B433(서열 번호 29 및 서열 번호 110), B442(서열 번호 32 및 서열 번호 113), B451(서열 번호 33 및 서열 번호 114), B469(서열 번호 36 및 서열 번호 117), B478(서열 번호 39 및 서열 번호 120), B516(서열 번호 40 및 서열 번호 121), B523(서열 번호 41 및 서열 번호 122), B539(서열 번호 46 및 서열 번호 127), B558(서열 번호 49 및 서열 번호 130), B576(서열 번호 50 및 서열 번호 131), B586(서열 번호 51 및 서열 번호 132), B595(서열 번호 52 및 서열 번호 133), B604(서열 번호 53 및 서열 번호 134), B613(서열 번호 54 및 서열 번호 135), B622(서열 번호 59 및 서열 번호 140), B631(서열 번호 62 및 서열 번호 143), B642(서열 번호 65 및 서열 번호 146), B649(서열 번호 66 및 서열 번호 147), B654(서열 번호 67 및 서열 번호 148), B658(서열 번호 68 및 서열 번호 149), B667(서열 번호 69 및 서열 번호 150), B676(서열 번호 70 및 서열 번호 151), B703(서열 번호 73 및 서열 번호 154), B712(서열 번호 76 및 서열 번호 157), B717(서열 번호 77 및 서열 번호 158) 및 B721(서열 번호 79 및 서열 번호 160)의 올리고 이중쇄 RNA에 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 활성을 확인하였다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 웨스턴 블로팅에 의해 평가한 결과를 이 절의 마지막에 나타낸 표 1에 나타내었다.
1차 스크리닝으로 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 활성이 있던 올리고 이중쇄 RNA 중, 특히 활성이 높았던 이하의 9개의 올리고 이중쇄 RNA를 이하에 나타내었다.
B037:
센스쇄
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACA-dTdT-3'(서열 번호 6)
안티센스쇄
5'-UGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'(서열 번호 87)
B433:
센스쇄
5'-GGGAGGAUUGUGGCCUUCU-dTdT-3'(서열 번호 29)
안티센스쇄
5'-AGAAGGCCACAAUCCUCCC-dTdT-3'(서열 번호 110)
B469:
센스쇄
5'-AUGUGUGUGGAGAGCGUCA-dTdT-3'(서열 번호 36)
안티센스쇄
5'-UGACGCUCUCCACACACAU-dTdT-3'(서열 번호 117)
B539:
센스쇄
5'-ACCUGAACCGGCACCUGCA-dTdT-3'(서열 번호 46)
안티센스쇄
5'-UGCAGGUGCCGGUUCAGGU-dTdT-3'(서열 번호 127)
B622:
센스쇄
5'-CCUCUGUUUGAUUUCUCCU-dTdT-3'(서열 번호 59)
안티센스쇄
5'-AGGAGAAAUCAAACAGAGG-dTdT-3'(서열 번호 140)
B631:
센스쇄
5'-GAUUUCUCCUGGCUGUCUC-dTdT-3'(서열 번호 62)
안티센스쇄
5'-GAGACAGCCAGGAGAAAUC-dTdT-3'(서열 번호 143)
B703:
센스쇄
5'-UAUCUGGGCCACAAGUGAA-dTdT-3'(서열 번호 73)
안티센스쇄
5'-UUCACUUGUGGCCCAGAUA-dTdT-3'(서열 번호 154)
B717:
센스쇄
5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGC-dTdT-3'(서열 번호 77)
안티센스쇄
5'-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3'(서열 번호 158)
B721:
센스쇄
5'-AGUCAACAUGCCUGCCCCA-dTdT-3'(서열 번호 79)
안티센스쇄
5'-UGGGGCAGGCAUGUUGACU-dTdT-3'(서열 번호 160)
Bcl-2 단백질 발현 억제 활성이 높았던 9개의 올리고 이중쇄 RNA(B037, B433, B469, B539, B622, B631, B703, B717 및 B721)에 대해서 RT-PCR에 의한 bcl-2의 mRNA량을 평가하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도면 중, 종축은 음성대조로서 GL3(반딧불이 루시페라제)의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA를 A431 세포에 트랜스펙션한 후, 24시간 배양한 세포의 bcl-2 mRNA량을 1로 했을 때의, 각각의 올리고 이중쇄 RNA와 마찬가지로 트랜스펙션한 후의 bcl-2 mRNA량의 비율을 나타내었다. 1차 스크리닝으로 얻어진 9개의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 세포의 전부에 있어서, 음성 대조와 비교하여 bcl-2의 mRNA량의 감소가 관찰되었다. 또한, 이후의 실험에 있어서는 양성 대조의 올리고 이중쇄 RNA로서 B717을 이용하기로 하였다.
2차 스크리닝의 올리고 이중쇄 RNA의 풀은 1차 스크리닝에서 높은 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 보인 B717 이외의 8개의 올리고 이중쇄 RNA(B037, B433, B469, B539, B622, B631, B703 및 B721) 및 이들의 센스쇄의 5' 말단이 bcl-2 mRNA에 있어서 해당하는 염기를 중심으로 하여 각각 상류측 및 하류측에 3 염기 및 6 염기 어긋나게 한 위치에서부터 시작되는 19 염기의 센스쇄 RNA와 그 상보쇄 RNA를 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA로 구성되는 것으로 하였다. 단, BLAST 서치의 결과, 이용하는 올리고 이중쇄 RNA 중에 bcl-2 mRNA 이외의 mRNA에 대한 연속 17 염기 이상의 상보 서열이 존재하는 경우에는, 적절하게, 1 내지 2 염기 쉬프트시켜 bcl-2 mRNA 이외의 mRNA와의 상보 서열이 16 염기 이하의 서열을 사 용하였다.
2차 스크리닝 결과, B031(서열 번호 4 및 서열 번호 85), B034(서열 번호 5 및 서열 번호 86), B037(서열 번호 6 및 서열 번호 87), B040(서열 번호 8 및 서열 번호 89), B043(서열 번호 11 및 서열 번호 92), B433(서열 번호 29 및 서열 번호 110), B436(서열 번호 30 및 서열 번호 111), B439(서열 번호 31 및 서열 번호 112), B463(서열 번호 34 및 서열 번호 115), B466(서열 번호 35 및 서열 번호 116), B469(서열 번호 36 및 서열 번호 117), B472(서열 번호 37 및 서열 번호 118), B475(서열 번호 38 및 서열 번호 119), B533(서열 번호 43 및 서열 번호 124), B536(서열 번호 45 및 서열 번호 126), B539(서열 번호 46 및 서열 번호 127), B543(서열 번호 47 및 서열 번호 128), B545(서열 번호 48 및 서열 번호 129), B616(서열 번호 57 및 서열 번호 138), B619(서열 번호 58 및 서열 번호 139), B622(서열 번호 59 및 서열 번호 140), B625(서열 번호 60 및 서열 번호 141), B628(서열 번호 61 및 서열 번호 142), B631(서열 번호 62 및 서열 번호 143), B634(서열 번호 63 및 서열 번호 144), B636(서열 번호 64 및 서열 번호 145), B697(서열 번호 71 및 서열 번호 152), B700(서열 번호 72 및 서열 번호 153), B703(서열 번호 73 및 서열 번호 154), B706(서열 번호 74 및 서열 번호 155), B709(서열 번호 75 및 서열 번호 156), B719(서열 번호 78 및 서열 번호 159), B721(서열 번호 79 및 서열 번호 160), B724(서열 번호 80 및 서열 번호 161) 및 B727(서열 번호 81 및 서열 번호 162)의 올리고 이중쇄 RNA에 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 활성을 확인하였다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 웨스턴 블로팅에 의해 평가한 결과를 이 절의 마지막에 나타내 표 1에 나타내었다.
2차 스크리닝으로 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 활성이 있었던 올리고 이중쇄 RNA 중, 특히 활성이 높았던 이하의 7개의 올리고 이중쇄 RNA를 이하에 나타내었다.
B037:
센스쇄
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACA-dTdT-3'(서열 번호 6)
안티센스쇄
5'-UGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'(서열 번호 87)
B043:
센스쇄
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 11)
안티센스쇄
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 92)
B436:
센스쇄
5'-AGGAUUGUGGCCUUCUUUG-dTdT-3'(서열 번호 30)
안티센스쇄
5'-CAAAGAAGGCCACAAUCCU-dTdT-3'(서열 번호 111)
B469:
센스쇄
5'-AUGUGUGUGGAGAGCGUCA-dTdT-3'(서열 번호 36)
안티센스쇄
5'-UGACGCUCUCCACACACAU-dTdT-3'(서열 번호 117)
B533:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 43)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 124)
B616:
센스쇄
5'-AUGCGGCCUCUGUUUGAUU-dTdT-3'(서열 번호 57)
안티센스쇄
5'-AAUCAAACAGAGGCCGCAU-dTdT-3'(서열 번호 138)
B631:
센스쇄
5'-GAUUUCUCCUGGCUGUCUC-dTdT-3'(서열 번호 62)
안티센스쇄
5'-GAGACAGCCAGGAGAAAUC-dTdT-3'(서열 번호 143)
이들 중, B043 및 B533의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 세포의 bcl-2의 mRNA량을 RT-PCR에 의해 평가한 결과를 도 2a에 도시한다. 도면 중, 종축은 음성 대조로서 GL3(반딧불이 루시페라제)의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA를 A431 세포에 트랜스펙션한 후, 24시간 배양한 세포의 mRNA량을 1로 했을 때의, 각각의 올리고 이중쇄 RNA에 의해 마찬가지로 트랜스펙션했을 때의 mRNA량을 나타낸다. 어느 쪽의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 세포에 있어서나 음성 대조와 비교하여 bcl-2의 mRNA량의 감소가 관찰되었다(도 2a). 또한, 양성 대조인 B717의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션했을 때보다 bcl-2 mRNA량은 감소하고 있었다(도 2a). 한편, 하우스키핑 유전자 GAPDH의 mRNA량에는 영향이 보이지 않았다(도 2b). 또한, A431 세포에 B043 및 B533의 각각의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 후, 72시간 배양한 세포중의 Bcl-2 단백질의 발현량을 웨스턴 블로팅에 의해 평가한 결과를 나타낸 사진을 도 2c에 도시한다. 올리고 이중쇄 RNA를 10 nM로 트랜스펙션했을 때에는 선택된 올리고 이중쇄 RNA는 Bcl-2 단백질의 발현을 현저히 억제하는 것이 관찰되었다(도 2c 상단). 한편, 대조군인 액틴 단백질의 양에는 영향이 보이지 않았다(도 2c 하단).
따라서, 2차 스크리닝으로 얻어진 올리고 이중쇄 RNA는 모두 bcl-2 mRNA를 특이적으로 분해하고, 및 Bcl-2 단백질의 발현을 특이적으로 억제하고 있는 것이 표시되었다.
3차 스크리닝
3차 스크리닝의 올리고 이중쇄 RNA의 풀은 2차 스크리닝으로 높은 Bcl-2 단 백질 발현 억제 활성을 볼 수 있던 4개의 올리고 이중쇄 RNA(B037, B043, B533 및 B616) 및 그 센스쇄의 5' 말단이 bcl-2 mRNA에 있어서 해당하는 염기를 중심으로 하여 상류측, 하류측 모두 3 염기 정도의 범위에서 1 염기마다 어긋나게 한 위치에서부터 시작되는 19 염기의 센스쇄 RNA와 그 상보쇄 RNA를 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA로 구성되는 것으로 하였다. 단, 합성 수율이 저하될 것이라고 예측 가능할 정도로 GC 함량이 높은 서열은 스크리닝의 대상에서 제외하였다.
웨스턴 블로팅에 의한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가 결과를 나타내는 사진을 도 3 및 도 4에 나타내어 스크리닝 조작에 있어서의 체로 쳐서 분류하는 과정에 대해서 설명한다. 도 3에 있어서 노말(Normal)은 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션하지 않는 A431 세포를 나타내고, 도 3 및 도 4에 있어서 GL3은 음성 대조에 사용한 반딧불이 루시페라제의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 세포를 나타낸다. 각각의 사진의 하단의 액틴 단백질은 모든 레인에 있어서 같은 정도로 발색하고 있고, 전기 영동한 샘플량이 각 레인 사이에 큰 차가 없는 것을 나타낸다. 따라서, Bcl-2 단백질의 발색 정도를 직접 비교하여 Bcl-2 단백질의 밴드가 현저히 감소하고 있었던 경우에, 대응하는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성이 높다고 판단하였다.
3차 스크리닝에서는 B037(서열 번호 6 및 서열 번호 87), B039(서열 번호 7 및 서열 번호 88), B040(서열 번호 8 및 서열 번호 89), B041(서열 번호 9 및 서열 번호 90), B042(서열 번호 10 및 서열 번호 91), B043(서열 번호 11 및 서열 번호 92), B044(서열 번호 12 및 서열 번호 93), B045(서열 번호 13 및 서열 번호 94), B531(서열 번호 42 및 서열 번호 123), B533(서열 번호 43 및 서열 번호 124), B534(서열 번호 44 및 서열 번호 125), B614(서열 번호 55 및 서열 번호 136), B615(서열 번호 56 및 서열 번호 137) 및 B616(서열 번호 57 및 서열 번호 138)의 올리고 이중쇄 RNA에 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 활성을 확인하였다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 활성을 웨스턴 블로팅에 의해 평가한 결과를 이 절의 마지막에 나타낸 표 1에 나타내었다.
Bcl-2 단백질 발현 억제 활성이 특히 높았던 이하의 3개의 올리고 이중쇄 RNA를 선택하였다.
B043:
센스쇄
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 11)
안티센스쇄
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 92)
B533:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 43)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 124)
B614:
센스쇄
5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGA-dTdT-3'(서열 번호 55)
안티센스쇄
5'-UCAAACAGAGGCCGCAUGC-dTdT-3'(서열 번호 136)
이들 3개의 올리고 이중쇄 RNA(B043, B533 및 B614)는 10 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질의 발현을 거의 완전히 억제하고, 추가로 3 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 유의하게 억제하고 있는 것이 분명해졌다(도 3 및 도 4).
표 1에 1차∼3차 스크리닝 과정에서 단백질 발현 억제 활성이 확인된 올리고 이중쇄 RNA를 나열하였다.
[표 1-a]
표 1: 스크리닝에 의해 활성을 확인한 올리고 이중쇄 RNA
Figure 112005069525466-PCT00001
[표 1-b]
Figure 112005069525466-PCT00002
[표 1-c]
Figure 112005069525466-PCT00003
[표 1-d]
Figure 112005069525466-PCT00004
활성 컬럼에 있어서는 활성이 높은 쪽에서부터 차례로 「++」, 「+」, 「+-」의 기호로 표시하였다.
실시예 2: 셀 카운팅 분석에 의한 세포 증식에 대한 올리고 이중쇄 RNA의 평가
선택한 올리고 이중쇄 RNA를 암세포에 트랜스펙션한 경우의 세포 증식의 억제능을 셀 카운팅 분석을 이용하여 평가하였다.
i) 방법
96구멍 플레이트에 A431 세포(상피암 세포)를 5×102 cells/well로 파종하여 10% FBS 함유 DMEM 배지(Sigma, D6046) 속에서 24시간 배양하였다. 배양 플레이트로부터 배지를 흡인하여 135 ㎕의 10% FBS 함유 DMEM 배지를 첨가하였다. 거기에, 10% 말토오스 수용액 속에서 혼합한 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비는 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16) 용액을 15 ㎕ 첨가하여 종량을 150 ㎕로 하였다. CO2 인큐베이터 내에서 6일간 배양하였다. 셀 카운트 Kit-8 용액(DOJINDO)을 15 ㎕씩 첨가하여, CO2 인큐베이터 내에서 정색 반응을 2시간 행하였다. 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 450 ㎚(참조 파장은 595 ㎚)의 흡광도를 측정하였다. 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션하지 않는 A431 세포의 세포수를 100%로 했을 때의 상대적인 세포수의 비율을 생세포율로서 평가하였다. 음성 대조로서는, 반딧불이 루시페라제 mRNA의 올리고 이중쇄 RNA를 트랜스펙션한 세포를 이용하였다. 양성 대조로서는 Bcl-2 단백질의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA의 하나인 B717로 트랜스펙션한 세포를 이용하였다. Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA로서는 B043 및 B533에 대해서 평가하였다.
ii) 결과
결과를 도 5에 도시하였다. 어느쪽 올리고 이중쇄 RNA도 트랜스펙션시의 농도가 1 nM 정도로 세포수가 감소하기 시작하고, 10 nM이 되면 세포수가 20% 정도로 감소하였다. 따라서, 본 발명의 올리고 이중쇄 RNA는 Bcl-2 단백질의 발현을 억제한 결과, 세포 증식을 억제하는 효과를 발휘하는 것이 분명해졌다.
실시예 3: 1 염기 변이 올리고 이중쇄 RNA의 효과
i) 1 염기 변이의 효과
올리고 이중쇄 RNA의 변이가 미치는 영향을 조사하기 위해서 1 염기 변이체를 조제하여 실시예 1에 나타낸 웨스턴 블로팅에 의해 그 올리고 이중쇄 RNA로서의 활성을 평가하였다.
1 염기 변이체로서의 올리고 이중쇄 RNA로서는 이하의 3개를 조제하였다. 1 염기 변이에 의해 변화된 뉴클레오티드는 밑줄로 나타내었다.
B043-15A:
센스쇄
5'-GUGAUGAAGUACAUACAUU-dTdT-3'(서열 번호 163)
안티센스쇄
5'-AAUGUAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 164)
B533-18U:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACCGGUA-dTdT-3'(서열 번호 165)
안티센스쇄
5'-UACCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 166)
B717-10U:
센스쇄
5'-GUGAAGUCAUCAUGCCUGC-dTdT-3'(서열 번호 167)
안티센스쇄
5'-GCAGGCAUGAUGACUUCAC-dTdT-3'(서열 번호 168)
B043-15A는 B043의 센스쇄 5' 말단에서부터 15번째의 염기쌍 C-G를 A-U로, B533-18U는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 18번째의 염기쌍 C-G를 U-A로, 및 B717-10U는 B717의 센스쇄 5' 말단에서부터 10번째의 염기쌍 A-U를 U-A로 각각 변환한 1 염기 변이체이다.
B043-15A의 결과는 도 3에 B533-18U 및 B717-10U의 결과는 도 4에 나타내었다. 어느 쪽의 1 염기 변이체 올리고 이중쇄 RNA나 정상형과 비교하면 활성은 다소 저하되지만, 어느 정도의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 유지하는 것을 확인하였다.
ii) 1 염기 변이 위치의 효과
올리고 이중쇄 RNA의 변이의 위치가 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해서, B533의 올리고 이중쇄 RNA에 대해서 변이의 위치가 다른 1 염기 변이체를 7종류 조제하여 실시예 1에 그 방법을 나타낸 웨스턴 블로팅에 의해 그 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 평가하였다.
1 염기 변이체 올리고 이중쇄 RNA는 B533 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄의 5' 말단에서부터의 위치가 2, 5, 8, 10, 12, 15, 18번째에 1 염기 변이를 갖는 것을 이용하였다. 구체적으로는, B533-2A는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 2번째의 염기쌍 U-A를 A-U로, B533-5U는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 5번째의 염기쌍 G-C를 U-A로, B533-8U는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 8번째의 염기쌍 C-G를 U-A로, B533-10A는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 10번째의 염기쌍 U-A를 A-U로, B533-12U는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 12번째의 염기쌍 A-U를 U-A로, B533-15U는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 15번째의 염기쌍 C-G를 U-A로, 및 B533-18U는 B533의 센스쇄 5' 말단에서부터 18번째의 염기쌍 C-G를 U-A로 각각 변환한 1 염기 변이체이다.
이용한 B533 올리고 이중쇄 RNA 및 그 1 염기 변이체 올리고 이중쇄 RNA를 이하에 나타내었다.
B533
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 43)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 124)
B533-2A:
센스쇄
5'-CAGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 169)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCUG-dTdT-3'(서열 번호 170)
B533-5U:
센스쇄
5'-CUGAUUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 171)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGGUAAUCAG-dTdT-3'(서열 번호 172)
B533-8U:
센스쇄
5'-CUGAGUAUCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 173)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCAGAUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 174)
B533-10A:
센스쇄
5'-CUGAGUACCAGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 175)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUUCUGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 176)
B533-12U:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGUACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 177)
안티센스쇄
5'-UGCCGGUACAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 178)
B533-15U:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACUGGCA-dTdT-3'(서열 번호 179)
안티센스쇄
5'-UGCCAGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 180)
B533-18U:
센스쇄
5'-CUGAGUACCUGAACCGGUA-dTdT-3'(서열 번호 165)
안티센스쇄
5'-UACCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 166)
결과는 표 2에 나타내었다.
[표 2]
표 2: 올리고 이중쇄 RNA에 있어서의 1 염기 변이 위치의 효과
Figure 112005069525466-PCT00005
활성 컬럼의 「++」는 매우 활성이 높은 것을 나타내고, 「+」는 활성이 높은 것을 나타낸다.
이중쇄 형성부의 중심의 근처에 1 염기 변이를 갖는 올리고 이중쇄 RNA일수록 Bcl-2 단백질의 발현 억제 활성이 저하되는 경향이 있었다. 그러나, 가장 활성이 저하된 이중쇄 형성부의 센스쇄로부터의 위치가 8번째, 10번째 및 12번째로 1 염기 변이를 갖는 올리고 이중쇄 RNA(B533-8U, B533-10A, B533-12U)에 있어서도, 10 nM의 농도로 세포에 트랜스펙션한 경우에는, Bcl-2 단백질의 발현을 명백히 억제하였다. 따라서, 1 염기 변이체라도 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는 데 유효한 올리고 이중쇄 RNA인 것이 시사되었다.
실시예 4: 21 염기보다 짧은 올리고 이중쇄 RNA의 활성
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 염기수 및 3' 말단 혹은 5' 말단의 돌출부의 염기수가 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대하여 미치는 영향을 검토하였다. B533의 이중쇄 형성부의 일부를 포함한 각각 16에서 21 염기의 센스쇄 및 안티센스쇄를 이용하였다. 이들 핵산을 이하의 표 3에 나타낸 바와 같이 각각 조합하여 이중쇄 형성부가 16에서부터 19 염기쌍 및 3' 말단의 돌출부가 0 염기에서부터 3 염기 혹은 5' 말단의 돌출부가 1 염기에서 2 염기인 올리고 이중쇄 RNA를 준비하였다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 1에 그 방법을 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 3]
표 3: B533을 중심으로 한 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄의 조합과 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성
Figure 112005069525466-PCT00006
「이중쇄 길이」컬럼은 센스쇄 및 안티센스쇄가 상보쇄를 형성하는 염기쌍의 수를 나타낸다:
「돌출부 염기수」컬럼은 「(센스쇄의 돌출부의 염기수)-(안티센스쇄의 돌출부의 염기수)」를 나타낸다;
「돌출부 염기수」 중 (-)가 붙어 있는 것은 5' 말단측의 돌출을 나타낸다;
「활성」란의 「++」는 매우 활성이 높은 것을 나타내고, 「+」는 활성이 높은 것을 나타낸다:
표 3에 나타낸 모든 조합의 올리고 이중쇄 RNA에서, Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖고 있었다. 따라서, 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 길이는 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 표시되었다. 구체적으로는, 올리고 이중쇄 RNA의 이중쇄 형성부, 즉, 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄와 안티센스쇄가 상보적인 부분은 15∼19 염기쌍이라면 활성에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 표시되었다. 또한, 3' 말단 돌출부의 염기수로서는 0∼3 염기 및 5' 말단 돌출부의 염기수로서는 0∼2 염기라면 활성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 시사되었다.
또한, B533-20b, B534-20b의 올리고 이중쇄 RNA의 3' 말단 돌출부는 dTdT가 아니라, 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 일치하는 서열 및 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열이지만, 강한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 나타내었다(표 3). 따라서, 3' 말단 돌출부의 서열은 bcl-2 mRNA와 일치하는 서열 및/또는 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열일 수 있음을 의미한다. 이것은 3' 돌출부의 서열은 dTdT에 한정되지 않고, 어떠한 서열을 갖고 있어도 올리고 이중쇄 RNA로서의 활성을 유지하는 것을 나타내는 것이다.
실시예 5: 일부 DNA 치환체의 효과
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 리보뉴클레오티드의 일부 데옥시리보뉴클레오티드로의 치환이 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 영향을 주는지 여부를 일부 DNA 치환체 올리고 이중쇄 RNA를 이용하여 평가하였다.
평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산은 B043 및 B533 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 각각의 센스쇄 및 안티센스쇄에 부가하여 B043 및 B533 올리고 이중쇄 RNA의 각각의 센스쇄 및 안티센스쇄에 대해서 그 일부를 이하에 나타 낸 바와 같이 데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 핵산을 조제함으로써 얻었다. 구체적인 데옥시리보뉴클레오티드 치환 위치 및 서열을 이하에 나타내었다.
B043 센스쇄의 계통:
(1) B043 센스:
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 11)
(2) B043-4nt-D 센스:
B043 센스쇄의 3' 말단의 4 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 하였다)
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 185)
(3) B043-6nt-D 센스:
B043 센스쇄의 3' 말단의 6 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 하였다)
5'-GUGAUGAAGUACAUCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 186)
(4) B043-G-dG 센스:
B043 센스쇄의 G 염기를 전부 리보뉴클레오티드에서 데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 핵산
5'-dGUdGAUdGAAdGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 187)
(5) B043-U-dT 센스:
B043 센스쇄의 리보뉴클레오티드의 U 염기를 전부 데옥시리보뉴클레오티드의 T 염기로 치환한 핵산
5'-GdTGAdTGAAGdTACAdTCCAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 188)
B533 센스쇄의 계통:
(1) B533 센스:
5'-CUGAGUACCUGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 43)
(2) B533-4nt-D 센스:
B533센스쇄의 3' 말단의 4 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-CUGAGUACCUGAACCGGdCdA-dTdT-3'(서열 번호 189)
(3) B533-6nt-D 센스:
B533 센스쇄의 3' 말단의 6 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-CUGAGUACCUGAACCdGdGdCdA-dTdT-3'(서열 번호 190)
(4) B533-G-dG 센스:
B533 센스쇄의 G 염기를 전부 리보뉴클레오티드에서 데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 핵산
5'-CUdGAdGUACCUdGAACCdGdGCA-dTdT-3'(서열 번호 191)
(5) B533-U-dT 센스:
B533 센스쇄의 리보뉴클레오티드의 U 염기를 전부 데옥시리보뉴클레오티드의 T 염기로 치환한 핵산
5'-CdTGAGdTACCdTGAACCGGCA-dTdT-3'(서열 번호 192)
B043 안티센스쇄의 계통:
(1) B043 안티센스:
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 92)
(2) B043-4nt-D 안티센스:
B043 안티센스쇄의 3' 말단의 4 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCdAdC-dTdT-3'(서열 번호 193)
(3) B043-2nt2nt-D 안티센스:
B043 안티센스쇄의 5' 말단 및 3' 말단의 각각 2 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 핵산
5'-dAdAUGGAUGUACUUCAUCAC-dTdT-3'(서열 번호 194)
B533 안티센스쇄의 계통:
(1) B533 안티센스:
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 124)
(2) B533-4nt-D 안티센스:
B533 안티센스쇄의 3' 말단의 4 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-UGCCGGUUCAGGUACUCdAdG-dTdT-3'(서열 번호 195)
(3) B533-2nt2nt-D 안티센스:
B533 안티센스쇄의 5' 말단 및 3' 말단의 각각 2 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 핵산
5'-dTdGCCGGUUCAGGUACUCAG-dTdT-3'(서열 번호 196)
상기 B043 센스쇄의 계통에서 선택되는 센스쇄 및 B043 안티센스쇄의 계통에서 선택되는 안티센스쇄의 쌍 또는 B533 센스쇄의 계통에서 선택되는 센스쇄 및 B533 안티센스쇄의 계통에서 선택되는 안티센스쇄의 쌍을 평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA로 하였다. 이용한 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄의 조합은 표 4에 나타내었다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 1에 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 4]
일부 DNA 치환체 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄 및 안티센스쇄의 조합
Figure 112005069525466-PCT00007
표 4에 나타내는 조합의 올리고 이중쇄 RNA는 모두 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖고 있었다. 이 결과는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드라도 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에는 큰 영향은 주지 않는 것을 의미한다. 이들 일부 DNA 치환체 올리고 이중쇄 RNA도 또한 Bcl-2 단백질 발현을 억제하기 위해서 이용할 수 있는 것임이 명백해졌다.
실시예 6: 3'-말단에서 돌출부의 수식 효과
스크리닝에 있어서는 3' 돌출부로서 dTdT를 이용하였지만, 이 dTdT를 2'-메톡시에틸체로 변환했을 때, 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 미치는 영향을 검토하였다.
올리고 이중쇄 RNA는 B717에 있어서 3' 돌출부가 2'-메톡시에틸체의 TT인 B717-MOE를 이용하였다.
결과를 도 6에 나타내었다. B717-MOE 레인과 B717 레인의 Bcl-2 단백질의 밴드 농도는 같은 정도이다. 이것은 돌출부가 2'-메톡시에틸체로 변환하여도 돌출부에 dTdT를 갖는 것을 동등한 활성을 갖는 것을 나타내고 있다. 따라서, 3'-말단 돌출부의 뉴클레오티드가 수식되어 있어도 올리고 이중쇄 RNA로서의 활성을 유지하는 것을 확인하였다.
실시예7: 평활 말단형(blunt end) 올리고 이중쇄 RNA의 효과
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 3' 말단 돌출부의 유무가 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 3' 말단 돌출부를 제외한 18 염기쌍 및 19 염기쌍으로 이루어진 평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA를 이용하여 평가를 행하였다. 구체적으로 검토한 올리고 이중쇄 RNA 및 그 결과를 표 5에 나타내었다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 1에 그 방법을 적은 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 5]
표 5: 평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄의 조합과 그 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성
「이중쇄 길이」컬럼은 센스쇄 및 안티센스쇄가 상보쇄를 형성하는 염기쌍의 수를 나타낸다:
「이중쇄 형성부 염기수」컬럼은 「(센스쇄의 염기수)-(안티센스쇄의 염기수)」를 나타낸다;
「활성」컬럼의 「++」는 매우 활성이 높은 것을 나타내고, 「+」는 활성이 높은 것을 나타낸다:
표 5에 나타내는 조합의 평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA는 모두 Bcl-2 단백질 억제 활성을 나타내고 있고, 평활 말단형의 올리고 이중쇄 RNA에 있어서도 3' 말단 돌출형과 동등 정도의 활성을 유지하는 것이 시사되었다.
실시예 8: 올리고 이중쇄 RNA를 이용한 시험관 내에서의 효과 (1)
누드 마우스(BALB/c, nu/nu, 수컷, 5주령)의 비장에 A549 세포(106 세포/마우스)를 이식하고, 10분 후에 비장을 적출하였다. 이식 6일 후에서 45일 후까지, 실시예 1에서 나타낸 방법으로 조제한 bcl-2 올리고 이중쇄 RNA B717(서열 번호 77 및 158)을 포함하는 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비; 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16)를 주 1회(모두 6회) 또는 주 3회(모두 18회)의 빈도로 정맥 내에 투여하였다. 1회당 투여량은 올리고 이중쇄 RNA로서 10 ㎎/㎏ 체중으로 하였 다. 대조군에는 주 3회, 10% 말토오스 용액을 투여하였다(모두 18회). 도 7에 이식 후 100일까지의 생존수를 나타낸다.
양 약물 투여군과 대상군 사이의 카플란 마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 일반화 윌콕슨(generalized Wilcoxon's test) 검정한 결과, 통계적으로 유의차가 보였다 (P < 0.01).
실시예 9: 올리고 이중쇄 RNA를 이용한 생체 내에서의 효과 (2)
누드 마우스(BALB/c, nu/nu, 수컷, 5주령)의 비장에 A549 세포(106 세포/마우스)를 이식하고, 10분 후에 비장을 적출하였다. 이식 6일 후부터 44일 후까지, 실시예 1에서 나타낸 방법으로 조제한 bcl-2 올리고 이중쇄 RNA B043(서열 번호 11 및 92)을 포함하는 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비; 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16)를 주 2회(모두 12회)의 빈도로 정맥 내에 투여하였다. 1회당 투여량은 올리고 이중쇄 RNA로서 10 ㎎/㎏ 체중으로 하였다. 대상군에는 주 2회, 10% 말토오스 용액을 투여하였다(모두 12회). 이식한 후 100일까지의 생존수를 도 8에 도시하였다.
B043 투여군과 대상군 사이의 카플란 마이어 곡선을 일반화 윌콕슨 검정한 결과, 통계적으로 유의차가 보였다 (P < 0.01).
실시예 10: 올리고 이중쇄 RNA를 이용한 생체 내에서의 효과 (3)
- 용량 의존성 -
누드 마우스(BALB/c, nu/nu, 수컷, 5주령)의 비장에 A549 세포(106 세포/마 우스)를 이식하고, 10분 후에 비장을 적출하였다. 이식 6일 후부터 44일 후까지, 실시예 1에서 나타낸 방법으로 조제한 bcl-2 올리고 이중쇄 RNA B043(서열 번호 11 및 92)을 포함하는 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비; 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16)를 주 2회(모두 12회)의 빈도로 정맥 내에 투여하였다. 1회당 투여량은 올리고 이중쇄 RNA로서 각각 1 ㎎/㎏ 체중, 3 ㎎/㎏ 체중, 10 ㎎/㎏ 체중으로 하였다. 대상군에는 주 2회, 10% 말토오스 용액을 투여하였다 (모두 12회). 그 결과를 도 9에 나타내었다.
1 ㎎/㎏ 체중 투여군, 3 ㎎/㎏ 체중 투여군, 10 ㎎/㎏ 체중 투여군과 대상군 사이의, 암 이식 69일 후까지의 카플란 마이어 곡선을 일반화 윌콕슨 검정한 결과, 통계적으로 유의차가 보였다 (각각 P < 0.05, P < 0.01, P < 0.01).
실시예 11 : 올리고 이중쇄 RNA를 이용한 생체 내에서의 효과(4)
- 연속 투여 스케줄 검토 -
누드 마우스(BALB/c, nu/nu, 수컷, 5주령)의 비장에 A549 세포(106 세포/마우스)를 이식하고, 10분 후에 비장을 적출하였다. 이식 5일 후부터 10일 후까지, 또는 이식 5일 후부터 20일 후까지, 실시예 1에서 나타낸 방법으로 조제한 bcl-2 올리고 이중쇄 RNA B043(서열 번호 11 및 92)을 포함하는 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비; 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16)를 주 5회(모두 5회 또는 12회)의 빈도로 정맥 내에 투여하였다. 1회당 투여량은 올리고 이중쇄 RNA로서 10 ㎎/㎏ 체중으로 하였다. 대상군에는 주 5회, 10% 말토오스 용액을 투여하였다 (모두 12회). 그 결과를 도 10에 도시하였다.
암 이식 69일 후에 있어서, 5회 투여군 및 12회 투여군 모두 10마리 전부가 생존하고 있었다. 그리고, 양 약품 투여군과 대상군 사이의 암이식 69일 후까지의 카플란 마이어 곡선을 일반화 윌콕슨 검정한 결과, 통계적으로 유의차가 보였다 (P < 0.01).
실시예 12: 올리고 이중쇄 RNA를 이용한 국소 투여 효과
누드 마우스(BALB/c, nu/nu, 수컷, 5주령)의 우측 옆구리 피하에 100 ㎕의 PBS에 현탁한 2.5×106개의 PC-3 세포를 이식하였다. 이식 7일 후부터 18일 후까지, 실시예 1에서 도시한 방법으로 조제한 Bcl-2 올리고 이중쇄 RNA B043(서열 번호 11 및 92) 또는 B717(서열 번호 77 및 158)을 포함하는 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비; 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16)를 주 5회(모두 10회)의 빈도로 암 주변부의 피하에 투여하였다. 1회당 투여량은 올리고 이중쇄 RNA로서 0.1 ㎎/마우스로 하였다. 대상군에는 주 5회, 10% 말토오스 용액을 투여하였다 (모두 10회). 종양 체적은 종양을 타원체로 간주하여 「체적=짧은 직경×짧은 직경×긴 직경÷2」의 식에 의해 구하였다. 그 결과를 도 11에 도시하였다.
종양 체적의 증가는 B043 투여군, B717 투여군과 대상군 사이에서 모두 암 이식 14일 후부터 36일 후에 걸쳐 통계적으로 유의하게 감소하였다 (P < 0.01, 다넷 검정, Dunnett's test).
실시예 13 : 스크리닝으로 얻어진 bcl-2 올리고 이중쇄 RNA의 주변 서열의 Bcl-2 단백질 억제 활성의 평가
2차 스크리닝 결과, 높은 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 볼 수 있던 4개의 올리고 이중쇄 RNA(B436, B469, B533, B631)의 주변 서열 및 B717(스크리닝시, 양성 대조로서 이용한 올리고 이중쇄 RNA)의 주변 서열을 갖는 올리고 이중쇄 RNA에 대한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 실시예 1에 나타낸 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다. B436, B469, B553, B631 또는 B717의 주변 서열을 갖는 올리고 이중쇄 RNA는 B436, B469, B553 또는 B631 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄의 5' 말단이 bcl-2 mRNA에 있어서 해당하는 염기를 중심으로 하여 상류측 또는 하류측에 1 내지 3 염기 어긋나게 한 위치에서부터 시작되는 19 염기의 센스쇄 RNA와 그 상보쇄 RNA를 이중쇄 형성부로서 포함하는 올리고 이중쇄 RNA로 구성된다. B436, B469, B553, B631 및 B717의 주변 서열의 구체적인 염기 서열은 이하의 표 6에 나타내었다.
Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가의 결과는 표 6에 나타내었다.
[표 6-a]
B436 주변 서열
Figure 112005069525466-PCT00008
[표 6-b]
표 6-b: B469 주변 서열
Figure 112005069525466-PCT00009
[표 6-c]
B533 주변 서열
Figure 112005069525466-PCT00010
[표 6-d]
B631 주변 서열
Figure 112005069525466-PCT00011
[표 6-e]
B717 주변 서열
Figure 112005069525466-PCT00012
상기한 주변 서열을 갖는 올리고 이중쇄 RNA도 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 것이 명백해졌다.
실시예 14: 기타 올리고 이중쇄 RNA에 대한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가
이하의 표 7에 그 서열을 구체적으로 나타낸 올리고 이중쇄 RNA(B521, B557, B584, B635, B734, B735, B736)에 대해서 실시예 1에 나타낸 웨스턴 블로팅에 의해 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 평가하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure 112005069525466-PCT00013
실시예 15 : 올리고 이중쇄 RNA의 Blc-2 단백질 발현 억제 활성의 평가 (1)
i) 올리고 이중쇄 RNA의 평가
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 합성은 자동 핵산 합성 장치를 이용한 표준적인 포스포아미다이트법에 의한 고상 합성으로 행하였다. 합성은 Dharmacon사(미국 콜로라도주) 또는 니혼바이오서비스(사이타마현)에 합성을 의뢰하거나 또는 본 발명자가 행하였다.
본 발명자가 행한 순서를 간단히 설명한다. 자동 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템, Expedite 8909)를 이용하여 표준적인 포스포아미다이트법에 의해 원하는 염기 서열을 형성하도록 모노머를 순차적으로 축합하였다. 진한 수산화암모늄 에탄올(3:1) 혼합액을 이용하여 CPG(controlled pore glass)에 의해 뉴클레오티드쇄를 개열시키고, 또한 이 용액 속에서 55℃, 18시간 방치하여 탈보호시켰다.
그 후, 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드의 테트라히드로푸란 용액을 이용하여 실온에서 20시간 처리하고, 2'-실릴기를 탈보호시켰다. 얻어진 올리고 리보뉴클레오티드를 역상 크로마토그래피로써 정제하였다. 또한, 80% 초산 수용액으로써 실온에서 30분 처리하고, 5'-DMTr기를 탈보호한 후, 이온 교환 크로마토그래피로써 재차 정제하였다. 탈염 후에 얻어진 올리고뉴클레오티드는 모세관 겔 전기 영동에 의해 90% 이상이 목적으로 하는 전장 물질인 것을 확인하였다.
이렇게 해서 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 각각을 합성하고, 이중쇄 형성부가 상보적인 2개의 핵산을 후술하는 바와 같이 등몰로 혼합함으로써 올리고 이중쇄 RNA로서 이용하였다.
ii) Bcl-2 단밸질 발현 억제 활성의 평가 방법
Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가는 올리고 이중쇄 RNA를 담체와 함께 각종 암세포에 도입하고, 단백질의 발현량을 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
올리고 이중쇄 RNA와 담체 복합체의 조제
담체로서 2-O-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-O-디올레오일글리세롤과 정제 난황 레시틴을 함유하는 리포솜 A를 이용하여 올리고 이중쇄 RNA와의 복합체를 조제하였다. 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 리포솜 A 16 중량부를 혼합하여 복합체를 조제하였다. 이하에, 올리고 이중쇄 RNA의 종농도 10 μM의 복합체 용액, 2 ㎖의 조제에 대해서 나타내었다. 단, 올리고 이중쇄 RNA 복합체의 농도는 올리고 이중쇄 RNA가 완전히 이중쇄 형성되어 있다고 가정했을 때에 복합체에 함유되어 있는 올리고 이중쇄 RNA의 몰농도로 나타내고 있다.
300 μM이 되도록 주사용수에 용해한 센스쇄 및 안티센스쇄 각각 66.6 ㎕를 시험관 속에서 혼합하였다. 이것에 866.8 ㎕의 10% 말토오스를 첨가하고, 양 쇄를 각각 20 μM의 농도로 함유하는 용액 1 ㎖를 조제하였다. 이것을 올리고 이중쇄 RNA 용액으로 하였다.
16 ㎎/㎖의 리포솜 A 분산액 268 ㎕에 10% 말토오스 732 ㎕를 첨가하여 4.3 ㎎/㎖의 리포솜 A 분산액 1 ㎖를 조제하였다. 이 리포솜 분산액 1 ㎖에 상기 올리고 이중쇄 RNA 용액 1 ㎖를 교반하면서 서서히 첨가하였다. 이상의 조작에 의해 올리고 이중쇄 RNA의 종농도가 10 μM인 올리고 이중쇄 RNA-리포솜 복합체 용액을 조제하였다. 이 복합체를 600 W의 바스형 초음파 장치를 이용하여 2분간 분산 처리함으로써 복합체의 입자를 균일하게 하였다.
웨스턴 블로팅
상기한 올리고 이중쇄 RNA-리포솜 복합체를 이용하여 본 발명에 따른 올리고 이중쇄 RNA가 세포 내에 트랜스펙션됨으로써, Bcl-2 단백질의 발현이 억제되는지 여부를 웨스턴 블로팅에 의해 Bcl-2 단백질량의 변화를 평가함으로써 평가하였다.
6 ㎝ 직경의 페트리 디쉬에 A431 세포(상피암 세포), A375 세포(멜라노머 세포), MDA-MB-231 세포(유방암 세포), 또는 A549(폐암) 세포를 2×105 cells/dish로 파종하고, 10% FBS(소 태아 혈청)를 함유하는 DMEM 배지(Sigma, D6046) 속의 37℃, 5% CO2 조건 하에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 2.7 ㎖의 10% FBS 함유 DMEM 배지(Sigma, D6046)를 첨가하여 배지를 교환하였다. 거기에, 10% 말토오스 수용액 속에서 혼합한 올리고 이중쇄 RNA/리포솜 A 복합체(중량비는 올리고 이중쇄 RNA:리포솜 A=1:16) 용액을 0.3 ㎖ 첨가하여 종농도를 3 ㎖로 하였다. 이 때의 올리고 이중쇄 RNA의 최종 농도는 3 nM 또는 10 nM이다. 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 72시간 배양하였다. 세포를 PBS(Phosphate buffered saline)로 2회 세정하고, 셀 스크레이퍼를 이용하여 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 1000×g으로 2분간 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 20∼100 ㎕의 용혈 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40)를 첨가하여 세포를 용해하였다. 얼음 위에서 30분간 정치하고, 100,000×g으로 15분간 원심 분리한 후, 상청을 새로운 튜브로 옮겨 전기 영동용 샘플로 하였다.
전기 영동은 폴리아크릴아미드 겔(ATTO E-T520L)을 이용하여 1 레인당 총 단백질의 양을 15 ㎍으로 한 샘플을 사용하였다. 영동 종료 후, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)막에 겔 내의 단백질을 전사하고, 5% 스킴 밀크 함유 PBST(PBST-MLK; 여기서, PBST의 조성은 0.1% Tween 20 함유 PBS) 속의 실온에서 1시간 블로킹하였다. 우선, Bcl-2 단백질의 검출을 행하였다. 블로킹이 종료된 PVDF 막을 PBST- MLK에 의해 500배로 희석한 마우스 항 인간 Bcl-2 모노크로날 항체(DAKO M0887) 속에서 4℃로 밤새 흔들어 1차 항체와 결합시켰다. PVDF막을 PBST로 세정한 후, PBST-MLK에 의해 2000배로 희석한 HRP(서양고추냉이 페록시다제) 표식 항 마우스 Ig 항체(DAKO PO260) 안에서 실온으로 2시간 흔들어 1차 항체와 결합시켰다. PBST로 세정한 후, 웨스턴 라이트닝 케미루미네센스 리에젠트 플러스 (Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus, Perkin Elmer)를 이용하여 발광시키고, ChemiDoc(BioRad)에 의해 Bcl-2 단백질의 양을 검출하였다.
Bcl-2 단백질의 검출을 종료한 후, 동일한 PVDF 막을 증류수로 세정하여 Bcl-2와 마찬가지로 액틴 단백질의 검출을 행하였다. 1차 항체에는 염소 항 인간 액틴 항체(Santa Cruz SC-1616)를 이용하고, 2차 항체에는 HRP 표식 항 염소 Ig 항체 (DAKO PO449)를 이용하였다. 각각 PBST-MLK에 의해 500배, 1500배로 희석하여 사용하였다.
루시페라제의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 RNA(GL3)를 트랜스펙션했을 때의 Bcl-2 단백질의 밴드 농도를 음성 대조로 하고, 이들과 비교하여 눈으로 확인함으로써 행하였다. 이중쇄 형성부가 25 염기쌍 이상의 올리고 이중쇄 RNA의 경우에는 처리 농도가 10 nM에 있어서 음성 대조보다 충분히 흐린 경우에는 「++」, 약간 흐린 경우에는 「+」로 하고, 그리고 처리 농도가 100 nM에 있어서 음성 대조보다 약간 흐린 경우에는「+/-」로 하였다.
상보쇄 부분이 25 염기쌍인 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가
Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가에 이용한 올리고 이중쇄 RNA는 GenBank 등록 번호 BC027258의 염기 서열(이하, bcl-2 mRNA라 함: 서열 번호 197)에 기초하여 이하의 올리고 이중쇄 RNA를 준비하였다.
본 발명자는 이중쇄 형성부가 25 염기쌍인 올리고 이중쇄 RNA가 강한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는지 여부를 평가하기 위해서 B043-25 안티센스쇄 및 그 상보쇄인 B043-25 센스쇄를 준비하고, 올리고 이중쇄 RNA를 얻었다. 또한, B043-25 안티센스쇄의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 25 염기의 서열을 bcl-2 mRNA의 상보적인 서열과 일치하도록 3' 말단측에 1 내지 6 염기 쉬프트한 25 염기의 서열의 3' 말단에 2개의 dT 염기를 부가한 B042-25, B041-25, B040-25, B039-25, B038-25, B037-25 안티센스쇄 및 B043-25 센스쇄의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 25 염기의 서열을 bcl-2 mRNA의 서열과 일치하도록 5' 말단측에 1 내지 6 염기 쉬프트한 25 염기의 서열의 3' 말단에 2개의 dT 염기를 부가한 B042-25, B041-25, B040-25, B039-25, B038-25, B037-25 센스쇄를 준비하고, 각 올리고 이중쇄 RNA를 얻었다.
또한, Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가에 이용한 올리고 이중쇄 RNA는「BXXX-25」로 표시하고, 여기서, 「XXX」는 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄의 5' 말단의 염기의 bcl-2 mRNA에 있어서의 번역 개시점에서부터의 위치 번호를 나타내는 것으로 하였다. 상기 7개의 올리고 이중쇄 RNA(B037-25, B038-25, B039-25, B040-25, B041-25, B042-35 및 B043-25)의 Bcl-2 단백질 발현 억제 작용에 대해서 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
그 결과를 표 8에 나타내었다.
[표 8]
상보쇄 부분이 25 염기인 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성
Figure 112005069525466-PCT00014
표 8에 나타내는 올리고 핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 거의 완전히 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 거의 완전히 억제하는 것이 명백해졌다 (도 12, 도 13).
따라서, B043-25 올리고 이중쇄 RNA 뿐 아니라 B043-25 안티센스쇄의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 25 염기의 서열을 bcl-2 mRNA의 상보적인 서열과 일치하도록 3' 말단측에 1 내지 6 염기 쉬프트한 25 염기의 서열에, 또한 3' 말단에 2개의 dT 염기를 부가한 안티센스쇄 및 이들 안티센스쇄의 3' 말단의 2개의 dT 염기를 제외한 부분으로 이루어진 25 염기의 서열에 상보적인 서열의 3' 말단에 2개의 dT 염기를 부가한 센스쇄로 이루어진 올리고 이중쇄 RNA는 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 것이 표시되었다.
실시예 16: 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성의 평가(2)
본 발명의 발명자는 다른 부분에 있어서의 상보쇄 부분이 25 염기쌍인 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 구체적으로 검토한 올리고 이중쇄 RNA는 B430-25, B463-25, B527-25, B608-25, B625-25 및 B711-25의 올리고 이중쇄 RNA이다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 15에 그 방법을 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
그 결과를 표 9에 나타내었다.
[표 9]
상보쇄 부분이 25 염기인 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성
Figure 112005069525466-PCT00015
표 9에 나타내는 올리고핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 거의 완전히 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 거의 완전히 억제하는 것이 명백해졌다 (도 13).
따라서, 상보적인 부분이 25 염기쌍인 올리고 이중쇄 RNA는 강한 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 것이 표시되었다.
실시예 17: 상보쇄 부분이 2 염기인 올리고 이중쇄 RNA3' 말단 돌출부의 효 과
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 3' 말단 돌출부의 dTdT인 데옥시리보뉴클레오티드를 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열인 돌출부를 갖는 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 영향을 주는지 여부를 평가하였다.
평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산은 B037-25 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄에 부가하여 B037-25 올리고 이중쇄 RNA의 센스쇄 및 안티센스쇄의 3' 말단에 dTdT 대신에 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열을 돌출부로서 갖는 핵산을 조제함으로써 얻었다. 구체적인 서열을 이하에 나타내었다.
B037-25 센스쇄의 계통:
(1) B037-25 센스:
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 288)
(2) B037SSOH25 센스:
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAU-3'(서열 번호 301)
B037-25 안티센스쇄의 계통:
(1) B037-25 안티센스:
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'(서열 번호 319)
(2) B037SSOH25 안티센스:
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCACUAUCUCCC-3'(서열 번호 332)
구체적으로 검토한 올리고 이중쇄 RNA 및 그 결과를 표 10에 나타내었다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 15에 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 10]
Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대한 올리고 이중쇄 RNA의 3' 말단 돌출부의 영향
Figure 112005069525466-PCT00016
표 10에 나타내는 올리고핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 거의 완전히 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 거의 완전히 억제하는 것이 명백해졌다 (도 14).
이 결과는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 이중쇄 형성부에 계속해서 bcl-2 mRNA와 상보쇄를 형성할 수 있는 서열인 3' 말단 돌출부라도 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에는 큰 영향을 부여하지 않는 것을 의미한다. 이들 올리고 이중쇄 RNA도 또한, Bcl-2 단백질 발현을 억제하기 위해서 이용할 수 있는 것임이 명백해졌다. 이것은 3' 돌출부의 서열은 dTdT에 한정되지 않고, 어떠한 서열을 갖고 있어도 올리고 이중쇄 RNA로서 활성을 유지하는 것을 나타내는 것이다.
실시예 18: 상보쇄 부분이 25 염기쌍인 평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA의 효과
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산의 3' 말단 돌출부의 유무가 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 3' 말단 돌출부를 제외한 25 염기쌍으로 이루어진 평활 말단형 올리고 RNA를 이용하여 평가를 행하였다. 구체적으로 검토한 올리고 이중쇄 RNA 및 그 결과를 표 11에 나타내었다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 15에 그 방법을 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 11]
평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단밸질 발현 억제 활성
Figure 112005069525466-PCT00017
표 11에 나타내는 올리고핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 거의 완전히 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 거의 완전히 억제하는 것이 명백해졌다 (도 15).
이 결과에 의해 평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA는 모두 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 나타내고 있고, 평활 말단형 올리고 이중쇄 RNA에 있어서도 3' 말단 돌출형과 같은 정도의 활성을 유지하는 것이 시사되었다.
실시예 19: 센스쇄 DNA 유도체의 효과
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄의 리보뉴클레오티드 전부를 데옥시리보뉴클레오티드로 치환함으로써, 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성이 영향을 받는지 여부를 센스쇄의 전부가 DNA인 올리고 이중쇄 RNA를 이용하여 평가하였다.
평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산은 B037-25, B038-25, B039-25, B040-25, B041-25, B042-25 및 B043-25 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 각각의 센스쇄를 이하에 나타내는 바와 같이 데옥시뉴클레오티드로 치환한 핵산을 조제함으로써 얻었다.
구체적인 서열을 이하에 나타내었다.
B037-25 센스쇄의 계통:
(1) B037-25 센스:
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 288)
(2) B037DNA25 센스:
B037 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산 (U는 T로 바꿈)
5'-dGdAdGdAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 311)
B038-25 센스쇄의 계통:
(1) B038-25 센스:
5'-AGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUA-dTdT-3'(서열 번호 289)
(2) B038DNA25 센스:
B038 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dAdGdAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdTdA-dTdT-3'(서열 번호 312)
B039-25 센스쇄의 계통:
(1) B039-25 센스:
5'-GAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAU-dTdT-3'(서열 번호 290)
(2) B039DNA25 센스:
B039 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dGdAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdTdAdT-dTdT-3'(서열 번호 313)
B040-25 센스쇄의 계통:
(1) B040-25 센스:
5'-AUAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAUA-dTdT-3'(서열 번호 291)
(2) B040DNA25 센스:
B040 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdTdAdTdA-dTdT-3'(서열 번호 314)
B041-25 센스쇄의 계통:
(1) B041-25 센스:
5'-UAGUGAUGAAGUACAUCCAUUAUAA-dTdT-3'(서열 번호 292)
(2) B041DNA25 센스:
B041 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdTdAdTdAdA-dTdT-3'(서열 번호 315)
B042-25 센스쇄의 계통:
(1) B042-25 센스:
5'-AGUGAUGAAGUACAUCCAUUAUAAG-dTdT-3'(서열 번호 293)
(2) B042DNA25 센스:
B042 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdTdAdTdAdAdG-dTdT-3'(서열 번호 316)
B043-25 센스쇄의 계통:
(1) B043-25 센스:
5'-GUGAUGAAGUACAUCCAUUAUAAGC-dTdT-3'(서열 번호 294)
(2) B043DNA25 센스:
B043 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdTdAdTdAdAdGdC-dTdT-3'(서열 번호 317)
구체적으로 검토한 올리고 이중쇄 RNA 및 그 결과를 표 12에 나타내었다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 대해서 실시예 15에 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 12]
올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성, 여기서 센스쇄의 리보뉴클레오티드 전체를 데옥시리보뉴클레오티드로 대체시켰다.
Figure 112005069525466-PCT00018
표 12에 나타내는 올리고핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 약간 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 약간 억제하는 것이 명백해졌다 (도 16).
이 결과에 기초하여, 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄의 전부가 데옥시리보뉴클레오티드라도 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 갖는 것을 확인하였다. 이들 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄의 전부가 데옥시리보뉴클레오티드인 올리고 이중쇄 RNA도 또한, Bcl-2 단백질 발현을 억제하기 위해서 이용 가능한 것임을 알 수 있었다.
실시예 20: 일부 DNA-치환 센스쇄의 효과
올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄의 리보뉴클레오티드의 일부를 데옥시 리보뉴클레오티드로 치환함으로써, 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성이 영향을 받는지 여부를 일부 DNA 치환체 RNA를 이용하여 평가하였다.
평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산은 B037-25 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 각각의 센스쇄를 이하에 나타내는 바와 같이 데옥시뉴클레오티드로 치환한 핵산을 조제함으로써 얻었다. 구체적인 서열을 이하에 나타내었다.
B037-25 센스쇄의 계통:
(1) B037-25 센스:
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 288)
(2) B037DNA25 센스:
B037 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dGdAdGdAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 311)
(3) B037-25-dC-S 센스:
B037 센스쇄의 리보뉴클레오티드의 C 염기를 전부 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUAdCAUdCdCAUU-dTdT-3'(서열 번호 305)
(4) B037-25-dG-S 센스:
B037 센스쇄의 리보뉴클레오티드의 G 염기를 전부 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-dGAdGAUAdGUdGAUdGAAdGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 306)
(5) B037-25-dGC-S 센스:
B037 센스쇄의 리보뉴클레오티드의 G 염기 및 C 염기를 전부 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산
5'-dGAdGAUAdGUdGAUdGAAdGUAdCAUdCdCAUU-dTdT-3'(서열 번호 307)
(6) B037-25-10D 센스:
B037 센스쇄의 3' 말단의 10 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 308)
(7) B037-25-14D 센스:
B037 센스쇄의 3' 말단의 14 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈).
5'-GAGAUAGUGAUGAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 309)
(8) B037-25-18D 센스:
B037 센스쇄의 3' 말단의 18 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-GAGAUAGUGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 310)
B037-25 안티센스쇄의 계통:
(1) B037-25 안티센스:
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'(서열 번호 319)
상기 B037-25 센스쇄의 계통에서 선택되는 센스쇄 및 B037-25 안티센스쇄의 쌍을 평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA로 하였다.
이용한 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄의 조합은 표 13에 나타내었다.
이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 작용에 대해서는 실시예 1에 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 13]
올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성, 여기서 센스쇄의 리보뉴클레오티드 일부를 데옥시리보뉴클레오티드로 대체시켰다.
Figure 112005069525466-PCT00019
표 13에 나타내는 올리고핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 거의 완전히 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 거의 완전히 억제하는 것이 명백해졌다 (도 17).
이 결과는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드라도 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에는 큰 영향이 없는 것을 의미한다. 이들 센스쇄 일부 DNA 치환체 올리고 이중쇄 RNA도 또한, Bcl-2 단백질 발현을 억제하기 위해서 이용할 수 있는 것임이 명백해졌다.
실시예 21: 인산디에스테르 결합 부분이 전부 포스포로티오에이트인 효과
리보뉴클레오티드 전부를 데옥시리보뉴클레오티드로 치환하고, 모든 인산디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변환한 센스쇄를 갖는 올리고 이중쇄 RNA를 이용하여 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성에 부여하는 영향을 평가하였다.
평가에 이용하는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 핵산은 B037-25 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄를 구성하는 리보뉴클레오티드 전부를 데옥시뉴클레오티드로 치환하여 모든 인산디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변환함으로써 얻었다.
구체적인 서열을 이하에 나타내었다.
B037-25 센스쇄의 계통:
(1) B037-25 센스:
5'-GAGAUAGUGAUGAAGUACAUCCAUU-dTdT-3'(서열 번호 288)
(2) B037DNA25 센스:
B037 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 한 핵산(U는 T로 바 꿈)
5'-dGdAdGdAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 311)
(3) B037DNA25PS 센스:
B037 센스쇄의 모든 염기를 데옥시리보뉴클레오티드로 하고, 인산디에스테르 결합은 전부 포스포로티오에이트인 핵산(U는 T로 바꿈)
5'-dGdAdGdAdTdAdGdTdGdAdTdGdAdAdGdTdAdCdAdTdCdCdAdTdT-dTdT-3'(서열 번호 318)
B037-25 안티센스쇄의 계통:
(1) B037-25 안티센스
5'-AAUGGAUGUACUUCAUCACUAUCUC-dTdT-3'(서열 번호 319)
구체적으로 검토한 올리고 이중쇄 RNA 및 그 결과를 표 14에 나타내었다. 이들 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 작용에 대해서는 실시예 15에 기재한 웨스턴 블로팅에 의해 평가하였다.
[표 14]
염기 및 인산 결합을 변경시킨 올리고 이중쇄 RNA의 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성
Figure 112005069525466-PCT00020
*1: 인산디에스테르 결합 부분은 전부 포스포로티오에이트.
표 14에 나타내는 올리고핵산 RNA는 100 nM로 트랜스펙션했을 때에는 Bcl-2 단백질을 약간 억제하고, 또한 10 nM로 트랜스펙션하여도 Bcl-2 단백질의 발현을 약간 억제하는 것임이 명백해졌다 (도 18).
이 결과는 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄에 있어서 전부의 핵산이 데옥시리보뉴클레오티드이며, 모든 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합이라도 Bcl-2 단백질 발현 억제 활성을 볼 수 있는 것을 확인하였다. 이들 올리고 이중쇄 RNA를 구성하는 센스쇄의 전부가 데옥시리보뉴클레오티드이며, 모든 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합인 올리고 이중쇄 RNA도 또한, Bcl-2 단백질 발현을 억제하기 위해서 이용 가능한 것임을 알 수 있었다.
본 발명은 Bcl-2 단백질 발현을 억제하는, 활성이 높은 올리고 이중쇄의 제공에 공헌한다. 암 등, Bcl-2 단백질의 과잉 발현이 원인이 되고 있는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 조성물의 제공에 공헌하는 동시에 이들의 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법의 개발에 공헌한다.
SEQUENCE LISTING <110> Nippon Shinyaku Co., LTD. <120> Oligo dsRNA which repress an expression of Bcl-2, and pharmaceutical composition comprising thereof. <130> YCT-942 <150> JP 154668/03 <151> 2003-05-30 <150> JP 382639/03 <151> 2003-11-12 <150> JP 104036/04 <151> 2004-03-31 <160> 334 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B002, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 1 uggcgcacgc ugggagaact t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B010, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 2 gcugggagaa cgggguacgt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B028, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 3 gauaaccggg agauagugat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B031, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 4 aaccgggaga uagugaugat t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B034, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 5 cgggagauag ugaugaagut t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 6 gagauaguga ugaaguacat t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B039, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 7 gauagugaug aaguacauct t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B040, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 8 auagugauga aguacaucct t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B041, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 9 uagugaugaa guacauccat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B042, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 10 agugaugaag uacauccaut t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B043, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 11 gugaugaagu acauccauut t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B044, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 12 ugaugaagua cauccauuat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B045, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 13 gaugaaguac auccauuaut t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B046, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 14 augaaguaca uccauuauat t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B055, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 15 auccauuaua agcugucgct t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B065, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 16 agcugucgca gaggggcuat t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B073, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 17 cagaggggcu acgagugggt t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B084, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 18 cgagugggau gcgggagaut t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B136, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 19 ccgggcaucu ucuccuccct t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B172, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 20 cauccagccg caucccgggt t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B199, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 21 gccaggaccu cgccgcugct t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B207, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 22 cucgccgcug cagaccccgt t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B253, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 23 gcgcucagcc cggugccact t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B262, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 24 ccggugccac cuguggucct t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B280, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 25 caccugaccc uccgccaggt t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B325, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 26 cgccgcgacu ucgccgagat t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B352, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 27 cagcugcacc ugacgcccut t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B397, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 28 gugguggagg agcucuucat t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B433, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 29 gggaggauug uggccuucut t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B436, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 30 aggauugugg ccuucuuugt t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B439, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 31 auuguggccu ucuuugagut t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B442, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 32 guggccuucu uugaguucgt t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B451, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 33 uuugaguucg guggggucat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B463, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 34 ggggucaugu guguggagat t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B466, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 35 gucaugugug uggagagcgt t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B469, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 36 augugugugg agagcgucat t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B472, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 37 uguguggaga gcgucaacct t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B475, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 38 guggagagcg ucaaccgggt t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B478, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 39 gagagcguca accgggagat t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B516, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 40 caucgcccug uggaugacut t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B523, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 41 cuguggauga cugaguacct t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B531, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 42 gacugaguac cugaaccggt t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 43 cugaguaccu gaaccggcat t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B534, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 44 ugaguaccug aaccggcact t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B536, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 45 aguaccugaa ccggcaccut t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B539, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 46 accugaaccg gcaccugcat t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B543, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 47 gaaccggcac cugcacacct t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B545, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 48 accggcaccu gcacaccugt t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B558, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 49 caccuggauc caggauaact t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B576, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 50 cggaggcugg gaugccuuut t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B586, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 51 gaugccuuug uggaacugut t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B595, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 52 guggaacugu acggccccat t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B604, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 53 uacggcccca gcaugcggct t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B613, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 54 agcaugcggc cucuguuugt t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B614, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 55 gcaugcggcc ucuguuugat t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B615, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 56 caugcggccu cuguuugaut t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B616, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 57 augcggccuc uguuugauut t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B619, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 58 cggccucugu uugauuucut t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B622, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 59 ccucuguuug auuucuccut t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B625, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 60 cuguuugauu ucuccuggct t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B628, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 61 uuugauuucu ccuggcugut t 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B631, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 62 gauuucuccu ggcugucuct t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B634, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 63 uucuccuggc ugucucugat t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B636, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 64 cuccuggcug ucucugaagt t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B642, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 65 gcugucucug aagacucugt t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B649, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 66 cugaagacuc ugcucaguut t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B654, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 67 gacucugcuc aguuuggcct t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B658, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 68 cugcucaguu uggcccuggt t 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B667, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 69 uuggcccugg ugggagcuut t 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B676, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 70 gugggagcuu gcaucaccct t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B697, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 71 ggugccuauc ugggccacat t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B700, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 72 gccuaucugg gccacaagut t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B703, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 73 uaucugggcc acaagugaat t 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B706, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 74 cugggccaca agugaaguct t 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B709, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 75 ggccacaagu gaagucaact t 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B712, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 76 cacaagugaa gucaacaugt t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B717, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 77 gugaagucaa caugccugct t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B719, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 78 gaagucaaca ugccugccct t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B721, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 79 agucaacaug ccugccccat t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B724, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 80 caacaugccu gccccaaact t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B727, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 81 caugccugcc ccaaacaaat t 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B002, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 82 guucucccag cgugcgccat t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B010, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 83 cguaccccgu ucucccagct t 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B028, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 84 ucacuaucuc ccgguuauct t 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B031, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 85 ucaucacuau cucccgguut t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B034, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 86 acuucaucac uaucucccgt t 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B037, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 87 uguacuucau cacuaucuct t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B039, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 88 gauguacuuc aucacuauct t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B040, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 89 ggauguacuu caucacuaut t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B041, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 90 uggauguacu ucaucacuat t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B042, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 91 auggauguac uucaucacut t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B043, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 92 aauggaugua cuucaucact t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B044, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 93 uaauggaugu acuucaucat t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B045, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 94 auaauggaug uacuucauct t 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B046, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 95 uauaauggau guacuucaut t 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B055, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 96 gcgacagcuu auaauggaut t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B065, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 97 uagccccucu gcgacagcut t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B073, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 98 cccacucgua gccccucugt t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B084, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 99 aucucccgca ucccacucgt t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B136, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 100 gggaggagaa gaugcccggt t 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B172, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 101 cccgggaugc ggcuggaugt t 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B199, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 102 gcagcggcga gguccuggct t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B207, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 103 cggggucugc agcggcgagt t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B253, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 104 guggcaccgg gcugagcgct t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B262, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 105 ggaccacagg uggcaccggt t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B280, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 106 ccuggcggag ggucaggugt t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B325, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 107 ucucggcgaa gucgcggcgt t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B352, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 108 agggcgucag gugcagcugt t 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B397, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 109 ugaagagcuc cuccaccact t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B433, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 110 agaaggccac aauccuccct t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B436, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 111 caaagaaggc cacaauccut t 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B439, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 112 acucaaagaa ggccacaaut t 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B442, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 113 cgaacucaaa gaaggccact t 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B451, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 114 ugaccccacc gaacucaaat t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B463, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 115 ucuccacaca caugacccct t 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B466, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 116 cgcucuccac acacaugact t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B469, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 117 ugacgcucuc cacacacaut t 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B472, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 118 gguugacgcu cuccacacat t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B475, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 119 cccgguugac gcucuccact t 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B478, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 120 ucucccgguu gacgcucuct t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B516, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 121 agucauccac agggcgaugt t 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B523, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 122 gguacucagu cauccacagt t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B531, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 123 ccgguucagg uacucaguct t 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 124 ugccgguuca gguacucagt t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B534, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 125 gugccgguuc agguacucat t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B536, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 126 aggugccggu ucagguacut t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B539, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 127 ugcaggugcc gguucaggut t 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B543, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 128 ggugugcagg ugccgguuct t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B545, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 129 caggugugca ggugccggut t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B558, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 130 guuauccugg auccaggugt t 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B576, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 131 aaaggcaucc cagccuccgt t 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B586, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 132 acaguuccac aaaggcauct t 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B595, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 133 uggggccgua caguuccact t 21 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B604, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 134 gccgcaugcu ggggccguat t 21 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B613, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 135 caaacagagg ccgcaugcut t 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B614, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 136 ucaaacagag gccgcaugct t 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B615, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 137 aucaaacaga ggccgcaugt t 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B616, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 138 aaucaaacag aggccgcaut t 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B619, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 139 agaaaucaaa cagaggccgt t 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B622, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 140 aggagaaauc aaacagaggt t 21 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B625, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 141 gccaggagaa aucaaacagt t 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B628, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 142 acagccagga gaaaucaaat t 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B631, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 143 gagacagcca ggagaaauct t 21 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B634, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 144 ucagagacag ccaggagaat t 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B636, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 145 cuucagagac agccaggagt t 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B642, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 146 cagagucuuc agagacagct t 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B649, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 147 aacugagcag agucuucagt t 21 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B654, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 148 ggccaaacug agcagaguct t 21 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B658, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 149 ccagggccaa acugagcagt t 21 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B667, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 150 aagcucccac cagggccaat t 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B676, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 151 gggugaugca agcucccact t 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B697, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 152 uguggcccag auaggcacct t 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B700, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 153 acuuguggcc cagauaggct t 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B703, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 154 uucacuugug gcccagauat t 21 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B706, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 155 gacuucacuu guggcccagt t 21 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B709, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 156 guugacuuca cuuguggcct t 21 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B712, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 157 cauguugacu ucacuugugt t 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B717, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 158 gcaggcaugu ugacuucact t 21 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B719, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 159 gggcaggcau guugacuuct t 21 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B721, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 160 uggggcaggc auguugacut t 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B724, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 161 guuuggggca ggcauguugt t 21 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B727, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 162 uuuguuuggg gcaggcaugt t 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B043-15A, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 163 gugaugaagu acauacauut t 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B043-15A, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 164 aauguaugua cuucaucact t 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-18U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 165 cugaguaccu gaaccgguat t 21 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-18U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 166 uaccgguuca gguacucagt t 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B717-10U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 167 gugaagucau caugccugct t 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B717-10U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 168 gcaggcauga ugacuucact t 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-2A, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 169 cagaguaccu gaaccggcat t 21 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-2A, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 170 ugccgguuca gguacucugt t 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-5U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 171 cugauuaccu gaaccggcat t 21 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-5U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 172 ugccgguuca gguaaucagt t 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-8U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 173 cugaguaucu gaaccggcat t 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-8U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 174 ugccgguuca gauacucagt t 21 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-10A, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 175 cugaguacca gaaccggcat t 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-10A, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 176 ugccgguucu gguacucagt t 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-12U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 177 cugaguaccu guaccggcat t 21 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-12U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 178 ugccgguaca gguacucagt t 21 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-15U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 179 cugaguaccu gaacuggcat t 21 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-15U, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 180 ugccaguuca gguacucagt t 21 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-20b, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 181 cugaguaccu gaaccggcac 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B534-20b, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 182 ugaguaccug aaccggcacc 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-20b, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 183 gccgguucag guacucagtc 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B534-20b, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 184 ugccgguuca gguacucagt 20 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B043-4nt-D, wherein 4 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 185 gugaugaagu acauccattt t 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B043-6nt-D sense strand, wherein 6 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 186 gugaugaagu acauccattt t 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B043-G-dG sense strand, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus and G nucleotides are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 187 gugaugaagu acauccauut t 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B043-U-dU sense strand, wherein T nucleotides are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 188 gtgatgaagt acatccattt t 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B533-4nt-D, wherein 4 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 189 cugaguaccu gaaccggcat t 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B533-6nt-D sense strand, wherein 6 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 190 cugaguaccu gaaccggcat t 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B533-G-dG sense strand, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus and G nucleotides are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 191 cugaguaccu gaaccggcat t 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B533-U-dT sense strand, wherein T nucleotides are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 192 ctgagtacct gaaccggcat t 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B043-4nt-D, wherein 4 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 193 aauggaugua cuucaucact t 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B043-2nt2nt-D anti-sense strand, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus and 2 nucleotides of 5'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 194 aauggaugua cuucaucact t 21 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B533-4nt-D, wherein 4 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 195 ugccgguuca gguacucagt t 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; DNA/RNA of B533-4nt-D anti-sense strand, wherein 4 nucleotides of 3'-terminus and 2 nucleotides of 5'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 196 tgccgguuca gguacucagt t 21 <210> 197 <211> 2704 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> source <222> 1..2704 <223> /organism="Homo sapiens" /db_xref="LocusID:596" /db_xref="taxon:9606" /clone="MGC:21366 IMAGE:4511027" /tissue_type="Testis, embryonal carcinoma" /clone_lib="NIH_MGC_92" /lab_host="DH10B" /note="Vector: pCMV-SPORT6" <220> <221> CDS <222> 390..1109 <223> /product="B-cell CLL/lymphoma 2" /protein_id="AAH27258.1" /db_xref="GI:20072668" /translation="MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAP APGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSPVPPVVHLTLRQAGD DFSRRYRRDFAEMSSQLHLTPFTARGRFATVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVE SVNREMSPLVDNIALWMTEYLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLK TLLSLALVGACITLGAYLGHK" <400> 197 ctggagagtg ctgaagattg atgggatcgt tgccttatgc atttgttttg gttttacaaa 60 aaggaaactt gacagaggat catgctgtac ttaaaaaata caacatcaca gaggaagtag 120 actgatatta acaatactta ctaataataa cgtgcctcat gaaataaaga tccgaaagga 180 attggaataa aaatttcctg catctcatgc caagggggaa acaccagaat caagtgttcc 240 gcgtgattga agacaccccc tcgtccaaga atgcaaagca catccaataa aatagctgga 300 ttataactcc tcttctttct ctgggggccg tggggtggga gctggggcga gaggtgccgt 360 tggcccccgt tgcttttcct ctgggaagga tggcgcacgc tgggagaacg gggtacgata 420 accgggagat agtgatgaag tacatccatt ataagctgtc gcagaggggc tacgagtggg 480 atgcgggaga tgtgggcgcc gcgcccccgg gggccgcccc cgcaccgggc atcttctcct 540 cccagcccgg gcacacgccc catccagccg catcccggga cccggtcgcc aggacctcgc 600 cgctgcagac cccggctgcc cccggcgccg ccgcggggcc tgcgctcagc ccggtgccac 660 ctgtggtcca cctgaccctc cgccaggccg gcgacgactt ctcccgccgc taccgccgcg 720 acttcgccga gatgtccagc cagctgcacc tgacgccctt caccgcgcgg ggacgctttg 780 ccacggtggt ggaggagctc ttcagggacg gggtgaactg ggggaggatt gtggccttct 840 ttgagttcgg tggggtcatg tgtgtggaga gcgtcaaccg ggagatgtcg cccctggtgg 900 acaacatcgc cctgtggatg actgagtacc tgaaccggca cctgcacacc tggatccagg 960 ataacggagg ctgggatgcc tttgtggaac tgtacggccc cagcatgcgg cctctgtttg 1020 atttctcctg gctgtctctg aagactctgc tcagtttggc cctggtggga gcttgcatca 1080 ccctgggtgc ctatctgggc cacaagtgaa gtcaacatgc ctgccccaaa caaatatgca 1140 aaaggttcac taaagcagta gaaataatat gcattgtcag tgatgtacca tgaaacaaag 1200 ctgcaggctg tttaagaaaa aataacacac atataaacat cacacacaca gacagacaca 1260 cacacacaca acaattaaca gtcttcaggc aaaacgtcga atcagctatt tactgccaaa 1320 gggaaatatc atttattttt tacattatta agaaaaaaag atttatttat ttaagacagt 1380 cccatcaaaa ctcctgtctt tggaaatccg accactaatt gccaagcacc gcttcgtgtg 1440 gctccacctg gatgttctgt gcctgtaaac atagattcgc tttccatgtt gttggccgga 1500 tcaccatctg aagagcagac ggatggaaaa aggacctgat cattggggaa gctggctttc 1560 tggctgctgg aggctgggga gaaggtgttc attcacttgc atttctttgc cctgggggct 1620 gtgatattaa cagagggagg gttcctgtgg ggggaagtcc atgcctccct ggcctgaaga 1680 agagactctt tgcatatgac tcacatgatg catacctggt gggaggaaaa gagttgggaa 1740 cttcagatgg acctagtacc cactgagatt tccacgccga aggacagcga tgggaaaaat 1800 gcccttaaat cataggaaag tattttttta agctaccaat tgtgccgaga aaagcatttt 1860 agcaatttat acaatatcat ccagtacctt aagccctgat tgtgtatatt catatatttt 1920 ggatacgcac cccccaactc ccaatactgg ctctgtctga gtaagaaaca gaatcctctg 1980 gaacttgagg aagtgaacat ttcggtgact tccgcatcag gaaggctaga gttacccaga 2040 gcatcaggcc gccacaagtg cctgctttta ggagaccgaa gtccgcagaa cctgcctgtg 2100 tcccagcttg gaggcctggt cctggaactg agccggggcc ctcactggcc tcctccaggg 2160 atgatcaaca gggcagtgtg gtctccgaat gtctggaagc tgatggagct cagaattcca 2220 ctgtcaagaa agagcagtag aggggtgtgg ctgggcctgt caccctgggg ccctccaggt 2280 aggcccgttt tcacgtggag catgggagcc acgacccttc ttaagacatg tatcactgta 2340 gagggaagga acagaggccc tgggcccttc ctatcagaag gacatggtga aggctgggaa 2400 cgtgaggaga ggcaatggcc acggcccatt ttggctgtag cacatggcac gttggctgtg 2460 tggccttggc ccacctgtga gtttaaagca aggctttaaa tgactttgga gagggtcaca 2520 aatcctaaaa gaagcattga agtgaggtgt catggattaa ttgacccctg tctatggaat 2580 tacatgtaaa acattatctt gtcactgtag tttggtttta tttgaaaacc tgacaaaaaa 2640 aaagttccag gtgtggaata tgggggttat ctgtacatcc tggggcatta aaaaaaaaaa 2700 aaaa 2704 <210> 198 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; 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sense strand of B044bl-18b. <400> 219 ugaugaagua cauccauu 18 <210> 220 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B469bl-18b. <400> 220 augugugugg agagcguc 18 <210> 221 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B470bl-18b. <400> 221 ugugugugga gagcguca 18 <210> 222 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B534bl-18b. <400> 222 ugaguaccug aaccggca 18 <210> 223 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B718bl-18b. <400> 223 ugaagucaac augccugc 18 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B043bl-19b. <400> 224 aauggaugua cuucaucac 19 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B436bl-19b. <400> 225 caaagaaggc cacaauccu 19 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B439bl-19b. <400> 226 acucaaagaa ggccacaau 19 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B469bl-19b. <400> 227 ugacgcucuc cacacacau 19 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B533bl-19b. <400> 228 ugccgguuca gguacucag 19 <210> 229 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B614bl-19b. <400> 229 ucaaacagag gccgcaugc 19 <210> 230 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B625bl-19b. <400> 230 gccaggagaa aucaaacag 19 <210> 231 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B631bl-19b. <400> 231 gagacagcca ggagaaauc 19 <210> 232 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B634bl-19b. <400> 232 ucagagacag ccaggagaa 19 <210> 233 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B717bl-19b. <400> 233 gcaggcaugu ugacuucac 19 <210> 234 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B043bl-18b. <400> 234 auggauguac uucaucac 18 <210> 235 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B044bl-18b. <400> 235 aauggaugua cuucauca 18 <210> 236 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B469bl-18b. <400> 236 gacgcucucc acacacau 18 <210> 237 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B470bl-18b. <400> 237 ugacgcucuc cacacaca 18 <210> 238 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B534bl-18b. <400> 238 ugccgguuca gguacuca 18 <210> 239 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B718bl-18b. <400> 239 gcaggcaugu ugacuuca 18 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B434, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 240 ggaggauugu ggccuucuut t 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B435, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 241 gaggauugug gccuucuuut t 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B437, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 242 ggauuguggc cuucuuugat t 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B438, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 243 gauuguggcc uucuuugagt t 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B467, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 244 ucaugugugu ggagagcgut t 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B468, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 245 caugugugug gagagcguct t 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B470, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 246 ugugugugga gagcgucaat t 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B471, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 247 gcguguggag agcgucaact t 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B535, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 248 gaguaccuga accggcacct t 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B629, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 249 uugauuucuc cuggcuguct t 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B630, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 250 ugauuucucc uggcugucut t 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B632, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 251 auuucuccug gcugucucut t 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B633, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 252 uuucuccugg cugucucugt t 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B714, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 253 caagugaagu caacaugcct t 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B715, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 254 aagugaaguc aacaugccut t 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B716, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 255 agugaaguca acaugccugt t 21 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B718, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 256 ugaagucaac augccugcct t 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B434, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 257 aagaaggcca caauccucct t 21 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B435, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 258 aaagaaggcc acaauccuct t 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B437, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 259 ucaaagaagg ccacaaucct t 21 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B438, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 260 cucaaagaag gccacaauct t 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B467, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 261 acgcucucca cacacaugat t 21 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B468, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 262 gacgcucucc acacacaugt t 21 <210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B470, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 263 uugacgcucu ccacacacat t 21 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B471, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 264 guugacgcuc uccacacact t 21 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B535, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 265 ggugccgguu cagguacuct t 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B629, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 266 gacagccagg agaaaucaat t 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B630, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 267 agacagccag gagaaaucat t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B632, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 268 agagacagcc aggagaaaut t 21 <210> 269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B633, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 269 cagagacagc caggagaaat t 21 <210> 270 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B714, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 270 ggcauguuga cuucacuugt t 21 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B715, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 271 aggcauguug acuucacuut t 21 <210> 272 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B716, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 272 caggcauguu gacuucacut t 21 <210> 273 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B718, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 273 ggcaggcaug uugacuucat t 21 <210> 274 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B521, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 274 cccuguggau gacugaguat t 21 <210> 275 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B557, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 275 acaccuggau ccaggauaat t 21 <210> 276 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B584, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 276 gggaugccuu uguggaacut t 21 <210> 277 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B635, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 277 ucuccuggcu gucucugaat t 21 <210> 278 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B734, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 278 gccccaaaca aauaugcaat t 21 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B735, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 279 ccccaaacaa auaugcaaat t 21 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B736, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 280 cccaaacaaa uaugcaaaat t 21 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B521, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 281 uacucaguca uccacagggt t 21 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B557, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 282 uuauccugga uccaggugut t 21 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B584, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 283 aguuccacaa aggcauccct t 21 <210> 284 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B635, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 284 uucagagaca gccaggagat t 21 <210> 285 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B734, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 285 uugcauauuu guuugggct t 21 <210> 286 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B735, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 286 uuugcauauu uguuuggggt t 21 <210> 287 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B736, wherein 2 nucleotides of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 287 uuuugcauau uuguuugggt t 21 <210> 288 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 288 gagauaguga ugaaguacau ccauutt 27 <210> 289 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B038-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 289 agauagugau gaaguacauc cauuatt 27 <210> 290 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B039-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 290 gauagugaug aaguacaucc auuautt 27 <210> 291 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B040-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 291 auagugauga aguacaucca uuauatt 27 <210> 292 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B041-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 292 uagugaugaa guacauccau uauaatt 27 <210> 293 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B042-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 293 agugaugaag uacauccauu auaagtt 27 <210> 294 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B043-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 294 gugaugaagu acauccauua uaagctt 27 <210> 295 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B430-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 295 ugggggagga uuguggccuu cuuugtt 27 <210> 296 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B463-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 296 ggggucaugu guguggagag cgucatt 27 <210> 297 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B527-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 297 ggaugacuga guaccugaac cggcatt 27 <210> 298 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B608-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 298 gccccagcau gcggccucug uuugatt 27 <210> 299 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B625-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 299 cuguuugauu ucuccuggcu gucuctt 27 <210> 300 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B711-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 300 ccacaaguga agucaacaug ccugctt 27 <210> 301 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B037SSOH25. <400> 301 gagauaguga ugaaguacau ccauuau 27 <210> 302 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B037bl25. <400> 302 gagauaguga ugaaguacau ccauu 25 <210> 303 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B035bl27. <400> 303 gggagauagu gaugaaguac auccauu 27 <210> 304 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; sense strand of B039bl27. <400> 304 gauagugaug aaguacaucc auuauaa 27 <210> 305 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25-dC-S, wherein C nucleotides and 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 305 gagauaguga ugaaguacau ccauutt 27 <210> 306 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25-dG-S, wherein G nucleotides and 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 306 gagauaguga ugaaguacau ccauutt 27 <210> 307 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25-dGC-S, wherein G nucleotides, C nucleotides and 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 307 gagauaguga ugaaguacau ccauutt 27 <210> 308 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25-10D, wherein 10 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 308 gagauaguga ugaaguacat ccatttt 27 <210> 309 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25-14D, wherein 14 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 309 gagauaguga ugaagtacat ccatttt 27 <210> 310 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; sense strand of B037-25-18D, wherein 18 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 310 gagauaguga tgaagtacat ccatttt 27 <210> 311 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B037DNA25. <400> 311 gagatagtga tgaagtacat ccatttt 27 <210> 312 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B038DNA25. <400> 312 agatagtgat gaagtacatc cattatt 27 <210> 313 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B039DNA25. <400> 313 gatagtgatg aagtacatcc attattt 27 <210> 314 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B040DNA25. <400> 314 atagtgatga agtacatcca ttatatt 27 <210> 315 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B041DNA25. <400> 315 tagtgatgaa gtacatccat tataatt 27 <210> 316 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B042DNA25. <400> 316 agtgatgaag tacatccatt ataagtt 27 <210> 317 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B043DNA25. <400> 317 gtgatgaagt acatccatta taagctt 27 <210> 318 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA; sense strand of B037DNA25PS, wherein all phosphodiester bonds are changed into phosphorothioate bonds. <400> 318 gagatagtga tgaagtacat ccatttt 27 <210> 319 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B037-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 319 aauggaugua cuucaucacu aucuctt 27 <210> 320 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B038-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 320 uaauggaugu acuucaucac uaucutt 27 <210> 321 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B039-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 321 auaauggaug uacuucauca cuauctt 27 <210> 322 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B040-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 322 uauaauggau guacuucauc acuautt 27 <210> 323 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B041-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 323 uuauaaugga uguacuucau cacuatt 27 <210> 324 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B042-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 324 cuuauaaugg auguacuuca ucacutt 27 <210> 325 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B043-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 325 gcuuauaaug gauguacuuc aucactt 27 <210> 326 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B430-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 326 caaagaaggc cacaauccuc ccccatt 27 <210> 327 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B463-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 327 ugacgcucuc cacacacaug acccctt 27 <210> 328 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B527-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 328 ugccgguuca gguacucagu caucctt 27 <210> 329 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B608-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 329 ucaaacagag gccgcaugcu ggggctt 27 <210> 330 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized DNA/RNA; anti-sense strand of B625-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 330 gagacagcca ggagaaauca aacagtt 27 <210> 331 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthsized DNA/RNA;anti-sense strand of B711-25, wherein 2 nucleotide of 3'-terminus are constructed with DNA, and the rest are RNA. <400> 331 gcaggcaugu ugacuucacu uguggtt 27 <210> 332 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B037SSOH25. <400> 332 aauggaugua cuucaucacu aucuccc 27 <210> 333 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B037bl25. <400> 333 aauggaugua cuucaucacu aucuc 25 <210> 334 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthesized RNA; anti-sense strand of B039bl27. <400> 334 uuauaaugga uguacuucau cacuauc 27 ?? ?? ?? ?? 1 1 / 99

Claims (71)

  1. 서열 번호 1 내지 서열 번호 81, 서열 번호 240 내지 서열 번호 256 및 서열 번호 274 내지 서열 번호 280으로부터 선택되는 하나의 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거한 센스쇄 RNA와, 서열 번호 82 내지 서열 번호 162, 서열 번호 257 내지 서열 번호 273 및 서열 번호 281 내지 서열 번호 287로부터 선택되는 하나의 염기 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거한 상보성 안티센스쇄 RNA의 쌍으로 형성되는, 15∼19 염기쌍의 이중쇄 형성부를 포함하는 올리고 이중쇄 RNA로서, 하나의 말단 또는 양 말단으로부터 모두 4 염기쌍까지 추가로 삭제될 수 있어 이중쇄를 형성하게 되는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  2. 제1항에 있어서, 이중쇄 형성부의 하나 또는 양쪽 쇄가 Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 유지하면서, 1 또는 그 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입, 또는 부가를 포함하는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  3. 제1항에 있어서, 이중쇄 형성부의 하나 또는 양쪽 쇄 또는 센스쇄 RNA의 전부로부터 리보뉴클레오티드의 일부가 Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 유지하면서, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식(modified) 뉴클레오티드로 치환되어 있는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 형성부가 서열 번호 11 및 서열 번호 92, 서열 번호 30 및 서열 번호 111, 서열 번호 36 및 서열 번호 117, 서열 번호 43 및 서열 번호 124, 서열 번호 55 및 서열 번호 136, 서열 번호 62 및 서열 번호 143, 또는 서열 번호 77 및 서열 번호 158의 RNA 쌍으로서, 각 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거한 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 형성부의 하나 또는 양쪽 쇄의 3'-말단 또는 5'-말단에 돌출부(overhang)로서 1 내지 4개의 뉴클레오티드 염기를 부가한 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  6. 제5항에 있어서, 3'-말단 또는 5'-말단에 돌출부로서 부가한 1 내지 4개의 뉴클레오티드 염기가 데옥시리보뉴클레오티드인 올리고 이중쇄 RNA.
  7. 제5항에 있어서, 3'-말단에 돌출부로서 부가한 뉴클레오티드가 dTdT인 올리고 이중쇄 RNA.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 양쪽 RNA쇄로부터 뉴클레오티드의 리보오스 또는 인산 백본의 적어도 일부가 수식되어 있는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  9. 제8항에 있어서, 리보오스 또는 인산 백본의 수식이 리보오스의 2'-수산기를 H, OR, R, R', OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br 및 I로부터 선택되는 치환기로 치환하는 수식 (여기서 R은 알킬 또는 아릴을 나타내고, R'는 알킬렌을 나타냄), 리보오스를 4'-티오 유도체로 하는 수식, 및 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포로아미데이트로 하는 수식으로부터 선택되는 단일 수식 또는 수식의 조합을 포함하는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내에 이행시켰을 때, 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 Bcl-2 단백질의 발현을 억제할 수 있는 올리고 이중쇄 RNA.
  11. 서열 번호 1 내지 서열 번호 162 및 서열 번호 240 내지 서열 번호 287로부터 선택되는 서열로서 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거한 RNA를 포함하는 핵산.
  12. 제11항에 있어서, RNA 서열이 1 또는 그 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하고, 올리고 이중쇄 RNA를 구성했을 때에 Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 유지하는 것인 핵산.
  13. 제11항에 있어서, RNA를 구성하는 리보뉴클레오티드의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드로 치환되어 있는 것인 핵산.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 3'-말단 또는 5'-말단에 1 내지 4개의 뉴클레오티드를 염기를 부가한 것인 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 3'-말단 또는 5'-말단에 부가한 1 내지 4개의 뉴클레오티드 염기가 데옥시리보뉴클레오티드인 핵산.
  16. 제14항에 있어서, 3'-말단에 부가한 뉴클레오티드가 dTdT인 핵산.
  17. 서열 번호 163 내지 서열 번호 196 및 서열 번호 198 내지 서열 번호 239로부터 선택되는 서열의 핵산.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드쇄를 구성하는 리보오스 또는 인산 백본의 일부 또는 전체가 수식되어 있는 것인 핵산.
  19. 서열 번호 1 내지 서열 번호 162로부터 선택되는 서열로서 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거하고, 그리고 데옥시리보뉴클레오티드로서 우리딘(U) 대신에 티민(T)을 포함하는 것인 핵산.
  20. 제19항에 있어서, 1 또는 그 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 핵산으로서, 템플레이트(template)로서 작동하여 올리고 이중쇄 RNA를 구성했을 때에 Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 갖는 RNA를 발현하는 것인 핵산.
  21. 올리고 이중쇄 RNA를 세포 내에 이행시키는데 효과적인 담체와 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재한 올리고 이중쇄 RNA를 포함하는 복합체(complex)를 함유하는 의약 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA를 세포 내에 이행시키는데 효과적인 담체가 양이온성 담체인 의약 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 1∼200 중량부를 함유하는 의약 조성물.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 2.5∼100 중량부를 함유하는 의약 조성물.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 10∼20 중량부를 함유하는 의약 조성물.
  26. 제19항 또는 제20항의 핵산을 함유하고, 올리고 이중쇄 RNA를 생성하게 되는 핵산을 함유하는 의약 조성물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Bcl-2 단백질의 발현 억제가 요망되는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 아폽토시스(apoptosis)의 촉진이 요망되는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 암의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 혈액학적 악성질환(hematological malignant diseases)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  31. 서열 번호 288 및 서열 번호 295 내지 서열 번호 300으로부터 선택되는 서열로서 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기 및 5'-말단으로부터 6 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 6 염기를 부가한 서열로부터 유도된 bcl-2 mRNA의 일부에 대응하는 센스쇄 RNA; 및 그것의 안티센스쇄 RNA로서, 서열 번호 319 및 서열 번호 326 내지 서열 번호 331로부터 선택되는 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기 및 연속하는 6 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 6 염기를 부가한 서열로부터 유도된 bcl-2 mRNA의 일부에 상보적인 안티센스쇄 RNA의 쌍으로 형성되는 이중쇄 형성부를 포함하는 올리고 이중쇄 RNA.
  32. 서열 번호 288 내지 서열 번호 300으로부터 선택되는 서열로서 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 2 염기를 부가한 서열로부터 유도된 bcl-2 mRNA의 일부에 대응하는 센스쇄 RNA; 및 그것의 안티센스쇄 RNA로서, 서열 번호 319 내지 서열 번호 331로부터 선택되는 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 2 염기를 부가한 서열로부터 유도된 bcl-2 mRNA의 일부에 상보적인 안티센스쇄 RNA의 쌍으로 형성되는 이중쇄 형성부를 포함하는 올리고 이중쇄 RNA.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 이중쇄 형성부의 적어도 한쪽 RNA 서열이 1 또는 그 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입, 또는 부가를 포함하고, Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 유지하는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 형성부가 서열 번호 302 및 서열 번호 333의 서열, 서열 번호 303 및 서열 번호 332의 서열, 또는 서열 번호 304 및 서열 번호 334의 서열로 이루어진 RNA의 쌍인 올리고 이중쇄 RNA.
  35. 제31항에 있어서, 이중쇄 형성부의 한쪽 또는 양쪽 쇄 또는 센스쇄 RNA의 전부로부터 리보뉴클레오티드의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식 뉴클레오티드로 치환되어 있고, Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 유지하는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 형성부가 서열 번호 288 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 289 및 서열 번호 320의 염기 서열, 서열 번호 290 및 서열 번호 321의 염기 서열, 서열 번호 291 및 서열 번호 322의 염기 서열, 서열 번호 292 및 서열 번호 323의 염기 서열, 서열 번호 293 및 서열 번호 324의 염기 서열, 서열 번호 294 및 서열 번호 325의 염기 서열, 서열 번호 295 및 서열 번호 326의 염기 서열, 서열 번호 296 및 서열 번호 327의 염기 서열, 서열 번호 297 및 서열 번호 328의 염기 서열, 서열 번호 298 및 서열 번호 329의 염기 서열, 서열 번호 299 및 서열 번호 330의 염기 서열, 서열 번호 300 및 서열 번호 331의 염기 서열, 서열 번호 305 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 306 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 307 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 308 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 309 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 310 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 311 및 서열 번호 319의 염기 서열, 서열 번호 312 및 서열 번호 320의 염기 서열, 서열 번호 313 및 서열 번호 321의 염기 서열, 서열 번호 314 및 서열 번호 322의 염기 서열, 서열 번호 315 및 서열 번호 323의 염기 서열, 서열 번호 316 및 서열 번호 324의 염기 서열, 또는 서열 번호 317 및 서열 번호 325의 서열로서, 각 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거한 서열로 이루어진 RNA의 쌍인 올리고 이중쇄 RNA.
  37. 제31항 또는 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 센스쇄 RNA 및 안티센스쇄 RNA로 이루어진 이중쇄 형성부의 적어도 한쪽 RNA의 3'-말단 또는 적어도 한쪽 RNA의 5'-말단에 돌출부로서 1 내지 4개의 뉴클레오티드를 부가한 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  38. 제37항에 있어서, 3'-말단 또는 5'-말단에 돌출부로서 부가한 1 내지 4 염기 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드인 올리고 이중쇄 RNA.
  39. 제37항에 있어서, 3'-말단에 돌출부로서 부가한 뉴클레오티드가 dTdT인 올리고 이중쇄 RNA.
  40. 제37항에 있어서, 센스쇄 RNA의 3'-말단에 돌출부로서 부가한 뉴클레오티드가 이중쇄 형성부에 이어서 그리고 bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 1 내지 4 염기의 서열이며, 그리고 안티센스쇄 RNA의 3'-말단에 돌출부로서 부가한 뉴클레오티드가 이중쇄 형성부에 이어서 그리고 bcl-2 mRNA에 상보적인 1 내지 4 염기의 서열인 올리고 이중쇄 RNA.
  41. 제40항에 있어서, 서열 번호 301 및 서열 번호 332의 서열로 이루어진 RNA의 쌍인 올리고 이중쇄 RNA.
  42. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, RNA쇄 중 적어도 한쪽의 리보오스 또는 인산 백본이 적어도 일부 또는 전부가 수식되어 있는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  43. 제42항에 있어서, 리보오스 또는 인산 백본의 수식이 리보오스의 2'-수산기를 H, OR, R, R', OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br 및 I로부터 선택되는 치환기로 치환하는 수식 (여기서 R은 알킬 또는 아릴을 나타내고, R'는 알킬렌을 나타냄), 리보오스를 4'-티오 유도체로 하는 수식, 및 인산 백본을 포스포로티오에이트체, 포스포로디티오에이트체, 알킬포스포네이트체, 또는 포스포로아미데이트체로 하는 수식으로부터 선택되는 단일 수식 또는 수식의 조합을 포함하는 것인 올리고 이중쇄 RNA.
  44. 제43항에 있어서, 이중쇄 형성부가 서열 번호 318 및 서열 번호 319의 서열로 이루어진 한쌍의 RNA인 올리고 이중쇄 RNA.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 이행시켰을 때, 올리고 이중쇄 RNA가 존재하지 않는 경우에 비하여 Bcl-2 단백질의 발현을 억제할 수 있는 이중쇄 RNA.
  46. 서열 번호 288 및 서열 번호 295 내지 서열 번호 300으로부터 선택되는 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기 및 5'-말단으로부터 6 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 6 염기를 부가한 서열로부터 유도되고, bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 서열을 갖는 핵산.
  47. 서열 번호 319 및 서열 번호 326 내지 서열 번호 331로부터 선택되는 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기 및 연속하는 6 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 6 염기를 부가한 서열로부터 유도되고, bcl-2 mRNA의 일부와 상보적인 서열을 갖는 핵산.
  48. 서열 번호 288 내지 서열 번호 300으로부터 선택되는 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 2 염기를 부가한 서열로부터 유도되고, bcl-2 mRNA의 일부와 일치하는 서열을 갖는 핵산.
  49. 서열 번호 319 내지 서열 번호 331으로부터 선택되는 서열에 있어서의 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거하고 이어서 3'-말단 및/또는 5'-말단에 총 2 염 기를 부가한 서열로부터 유도되고, bcl-2 mRNA의 일부와 상보적인 서열을 갖는 핵산.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 서열이 1 또는 그 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하고, 올리고 이중쇄 RNA를 구성했을 때에 Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 유지하는 것인 핵산.
  51. 제46항에 있어서, RNA의 리보뉴클레오티드의 일부가 데옥시리보뉴클레오티드 내지 수식 뉴클레오티드로 치환되어 있는 것인 핵산.
  52. 제51항에 있어서, 서열 번호 305 내지 서열 번호 317로부터 선택되는 서열을 갖는 핵산.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-말단 또는 5'-말단에 1 내지 4 뉴클레오티드를 부가한 핵산.
  54. 제53항에 있어서, 3'-말단 또는 5'-말단에 부가한 1 내지 4 뉴클레오티드 염기가 데옥시리보뉴클레오티드인 핵산.
  55. 제53항에 있어서, RNA의 3'-말단에 부가한 뉴클레오티드가 dTdT인 핵산.
  56. 제53항에 있어서, RNA의 3'-말단에 부가한 뉴클레오티드가 이중쇄 형성부에 이어지고 그리고 bcl-2 mRNA와 일치하는 서열, 또는 이중쇄 형성부에 이어지고 그리고 bcl-2 mRNA에 상보적인 서열인 핵산.
  57. 제56항에 있어서, 서열 번호 301 또는 서열 번호 332의 서열을 갖는 핵산.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드쇄를 구성하는 리보오스 또는 인산 백본의 일부 또는 전체가 수식되어 있는 것인 핵산.
  59. 서열 번호 288 내지 서열 번호 300 및 서열 번호 319 내지 서열 번호 331로서 3'-말단으로부터 2개의 dT 염기를 제거한 서열로부터 선택한 서열로서, 우리딘(U) 대신 티민(T)을 데옥시리보뉴클레오티드로서 함유하는 핵산.
  60. 제59항에 있어서, 1 또는 그 이상의 염기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하고, 템플레이트로서 작용하여 올리고 이중쇄 RNA를 구성했을 때에 Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 갖는 RNA를 발현하는 것인 핵산.
  61. 올리고 이중쇄 RNA를 세포 내에 이행시키는데 효과적인 담체와 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 기재한 올리고 이중쇄 RNA를 포함하는 복합체를 함유하는 의약 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA를 세포 내에 이행시키는데 효과적인 담체가 양이온성 담체인 의약 조성물.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 1∼200 중량부를 함유하는 의약 조성물.
  64. 제61항 또는 제62항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 2.5∼100 중량부를 함유하는 의약 조성물.
  65. 제61항 또는 제62항에 있어서, 올리고 이중쇄 RNA 1 중량부에 대하여 담체 10∼20 중량부를 함유하는 의약 조성물.
  66. 제59항 또는 제60항의 핵산을 함유하고, 올리고 이중쇄 RNA를 생성하게 되는 핵산을 함유하는 의약 조성물.
  67. 제63항 또는 제64항에 있어서, Bcl-2 단백질의 발현 억제가 요망되는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 아폽토시스의 촉진이 요망되는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  69. 제67항에 있어서, 암의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  70. 제67항에 있어서, 혈액학적 악성질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약 조성물.
  71. Bcl-2 단백질 발현에 대한 억제 활성을 갖는 올리고 이중쇄 RNA를 스크리닝하는 방법으로서,
    1) 서열 번호 11 및 서열 번호 92, 서열 번호 30 및 서열 번호 111, 서열 번호 36 및 서열 번호 117, 서열 번호 43 및 서열 번호 124, 서열 번호 55 및 서열 번호 136, 서열 번호 62 및 서열 번호 143, 또는 서열 번호 77 및 서열 번호 158로 구성되는 올리고 이중쇄 RNA의 19 염기쌍의 이중쇄 형성부를 포함하는 25~27 염기쌍의 이중쇄 형성부를 각각 포함하는 올리고 이중쇄 RNA 그룹을 스크리닝 대상으로서 이용하며; 그리고
    2) 1)에서 얻은 올리고 이중쇄 RNA를 세포에 트랜스펙션시킨 이후, bcl-2 mRNA 량의 감소 또는 Bcl-2 단백질 발현의 억제를 평가하는 것을 포함하는 방법.
KR1020057022831A 2003-05-30 2004-05-28 Ｂｃｌ-2의 발현을 억제하는 올리고 이중쇄 ＲＮＡ와그것을 함유하는 의약 조성물 KR20060013426A (ko)

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