DE69634567T2

DE69634567T2 - Ein medikament,das hgf gen enthält

Info

Publication number: DE69634567T2
Application number: DE69634567T
Authority: DE
Inventors: Ryuichi Morishita; Toshio Ogihara; Toshikazu Nakamura; Tetsuya Tomita; Takahiro Ochi
Original assignee: Anges MG Inc
Current assignee: Anges Inc
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 1996-08-22
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2016-08-23
Also published as: CA2230819A1; CN100478033C; WO1997007824A1; DE69634567D1; CA2230819C; US20090004260A1; JP3431633B2; NZ315769A; ATE292476T1; EP0847757A4; EP0847757B1; KR19990044279A; US7285540B2; EP0847757A1; US6248722B1; KR100725199B1; KR20040097246A; CN1198675A; US20040105882A1; ES2240999T3

Description

Die gegenwärtige Erfindung betrifft ein Medikament zur Verwendung bei der Gentherapie. Insbesondere betrifft die gegenwärtige Erfindung ein Medikament, umfassend ein Hepatozyten-Wachstumsfaktor(HGF)-Gen, ein Liposom, enthaltend das HGF-Gen, die Verwendung eines Liposoms, enthaltend ein HGF-Gen in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie und die Verwendung eines HGF-Gens bei einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
HGF ist ein physiologisch aktives Peptid, das verschiedene pharmakologische Aktivitäten ausübt. Die pharmakologischen Aktivitäten von HGF werden z.B. in JIKKEN-IGAKU (Experimental Medicine), Band 10, Nr. 3 (zusätzliche Ausgabe), 330–339 (1992) beschrieben. Im Hinblick auf seine pharmakologischen Aktivitäten wird erwartet, dass HGF als Arzneimittel für die Behandlung der Leberzirrhose oder Nierenerkrankungen nützlich ist; wie auch als Epithelzell-Wachstumsbeschleuniger; Antikrebsmittel; Mittel zur Verhinderung der Nebenwirkungen bei einer Krebstherapie; Mittel für die Behandlung von Lungenstörungen, Schäden am Gastrointestinaltrakt oder Störungen des Kranialnervs; Mittel für die Verhinderung von Nebenwirkungen einer Immunsuppression; Beschleunigungsmittel beim Collagenabbau; Mittel für die Behandlung von Knorpelstörungen, Arterienerkrankungen, Pulmonarfibrose, Lebererkrankungen, Blutkoagulopathie, Plasma-Hypoproteinose oder Wunden; Mittel für die Verbesserung nervöser Störungen; Verstärkungsmittel für hämatopoetische Stammzellen und Unterstützungsmittel für das Haarwachstum (japanische Patente KOKAI (offengelegt) Nrn. 4-18028 und 4-49246, EP 492619 , japanisches Patent KOKAI (offengelegt) Nr. 6-25010, WO 93/8821, japanische Patente KOKAI (offengelegt) Nrn. 6-172207, 7-89869 und 6-40934, WO 94/2165, japanische Patente KOKAI (offengelegt) Nrn. 6-40935, 6-56692 und 7-41429, WO 93/3061, japanisches Patent KOKAI (offengelegt) Nr. 5-213721, etc.).
Saki et al. (Biochemical and Biophysical Research Communication), Band 172, Nr. 1 321–327 (1990) beschreiben die Isolierung einer deletierten Form eines cDNA-Klons für HGF von einer menschlichen Leukozyten-cDNA-Bibliothek und diskutieren alternatives Splicing für das menschliche HGF-Gen.
EP-A-0 461 560 offenbart rekombinante menschliche Leukozyten-abgeleiteten Hepatozyten-Wachstumsfaktor und ein Verfahren für seine Herstellung.
Umfassende Studien und Untersuchungen im Hinblick auf eine Gentherapie werden in der ganzen Welt für Adenosindeaminase-Defizienz, AIDS, Krebs, pustulöse Fibrose oder Hämophilie etc. durchgeführt.
Im Hinblick auf die Gentherapie unter Verwendung der HGF-Gene ist diese jedoch unbekannt. Es ist sogar unklar, ob eine solche Gentherapie in der Praxis effektiv ist.
Von HGF ist bekannt, dass es eines der Arzneimittel ist, die eine kurze Halbwertszeit im Blut aufweisen. Als natürliche Konsequenz war eine persistente topische Verabreichung für HGF wünschenswert.
Im Hinblick auf die diversen pharmakologischen Aktivitäten von HGF wird erwartet, dass HGF als Arzneimittel mit ausgedehnten Anwendungen für verschiedene Erkrankungen entwickelt werden kann. Andererseits könnten, wenn HGF systemisch verabreicht wird, Nebenwirkungen aufgrund der unterschiedlichen pharmakologischen Aktivitäten von HGF ausgelöst werden. Zusätzlich, wenn HGF selbst intravenös verabreicht wird, gibt es den Nachteil, dass eine beträchtliche Menge HGF in der Leber zurückgehalten wird, was zu einer Reduktion der HGF-Menge beim Erreichen des Zielorgans führt.
Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, um die vorstehenden Probleme zu lösen. Zusammengefasst betrifft die vorliegende Erfindung:

(1) Die Verwendung eines HGF-Gens;
(2) Die Verwendung eines Liposoms, enthaltend das HGF-Gen;
(3) Ein Liposom, enthaltend das HGF-Gen, wobei es sich um ein Membran-Fusionsliposom handelt, fusioniert mit dem Sendai-Virus und dessen Verwendung;
(4) Eine Zusammensetzung, umfassend das Liposom gemäß (3) oder ein HGF-Gen;
(5) Verwendung eines Liposoms, enthaltend das HGF-Gen oder Verwendung eines Liposoms gemäß (3) bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von arteriellen Störungen und
(6) Verwendung eines Liposoms, enthaltend das HGF-Gen oder Verwendung eines Liposoms gemäß (3) für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Knorpelverletzungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Expression von HGF in Ratten Koronar-Endothelzellen, sensibilisiert mit dem japanischen hämagglutinierenden Virus (HVJ)-Liposomen-DNA in Testbeispiel 1.
In 2 zeigt die (Linien)-Grafik eine Zellwachstumsrate in Gegenwart oder Abwesenheit von HGF von den HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Endothelzellen in Testbeispiel 2, worin "DSF" eine Gruppe von Endothelzellen bezeichnet, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-cont und "HGF" eine Gruppe bezeichnet, inkubiert in Gegenwart von rekombinantem menschlichem HGF in einer bestimmten Konzentration. Die Säule in 2 zeigt eine Zellwachstumsrate der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen im Testbeispiel 2, worin "DSF" eine Gruppe von denjenigen Endothelzellen bezeichnet, die mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisiert wurden und "HGF-Vektor" bezeichnet eine Gruppe der Endothelzellen, die mit HVJ-Liposomen-DNA sensibilisiert wurden.
3 zeigt eine Zellwachstumsrate von Endothelzellen sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-DNA in Gegenwart oder Abwesenheit des Anti-HGF-Antikörpers in Testbeispiel 2, worin "Kontrolle" eine Gruppe der HVJ-Liposomencont-sensibilisierten Endothelzellen repräsentiert, inkubiert in Gegenwart der IgG Kontrolle; "HGF" repräsentiert eine Gruppe der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen, inkubiert in Gegenwart der IgG-Kontrolle und "HGFab" repräsentiert eine Gruppe der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen, inkubiert in Gegenwart eines Kaninchen-anti-humanen HGF-Antikörpers. Die Zellwachstumsrate (%) wird unter Bezugnahme auf relative % ausgedrückt, wenn die Wachstumsrate in der Kontrollegruppe als 100 angesetzt wird.
4 ist eine Grafik, die die Zellwachstumswirkung des Kulturüberstandes der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-vaskulären glatten Muskelzellen (hiernach oft abgekürzt als VSMCs) auf Ratten-Koronar-Endothelzellen in Testbeispiel 3 zeigt, worin "Kontrolle" eine Gruppe bezeichnet, die mit dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten VSMCs versetzt wurde und "HGF" bezeichnet eine Gruppe, versetzt mit dem Kulturüberstand von den HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs.
5 ist eine Grafik, die die Ergebnisse im Testbeispiel 3 darstellt, worin die Konzentration von HGF im Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs unter Verwendung des anti-humanen HGF-Antikörpers bestimmt wurde. In der Figur bedeutet "ohne Behand lung" eine Gruppe des Kulturüberstandes von nicht sensibilisierten VSMCs; "Kontrolle" bedeutet eine Gruppe des Überstands von den inkubierten HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten VSMCs und "HGF" bedeutet eine Gruppe des Überstandes von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs.
6 ist eine Grafik, die die Ergebnisse im Testbeispiel 3 darstellt, worin die Konzentration von HGF im Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs unter Verwendung des Anti-Ratten-HGF-Antikörpers bestimmt wurde. In der Figur bedeutet "keine Behandlung" eine Gruppe des Kulturüberstands von nicht-sensibilisierten VSMCs; "Kontrolle" bezeichnet eine Gruppe des Überstands von den inkubierten HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten VSMCs und "HGF" bedeutet eine Gruppe des Überstands von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs.
7 ist eine Grafik, die die Zellwachstumswirkung des Überstandes der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen auf Ratten-Koronar-Endothelzellen in Testbeispiel 4 darstellt, worin A, B und C jeweils eine Gruppe darstellen, versetzt mit dem Überstand der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen, eine Gruppe, versetzt mit dem Überstand der inkubierten HVJ-Liposomencont-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen und eine Gruppe von nicht behandelten Tieren.
8 zeigt die Zellwachstumswirkung von HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen auf Ratten-Koronar-Endothelzellen in Gegenwart eines anti-HGF-Antikörpers im Testbeispiel 4. In der Figur bedeutet A eine Gruppe, versetzt mit dem Überstand der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen; B bedeutet eine Gruppe, versetzt mit dem Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen; C bedeutet eine Gruppe, versetzt mit dem Anti-HGF-Antikörper zu dem Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen und D bedeutet eine Gruppe, versetzt mit dem Kontroll-Antikörper zu dem Überstand der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen.
9 ist eine Zeichnung, die das Zellwachstum von Endothelzellen im Testbeispiel 5 darstellt, wobei HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierte menschliche VSMCs mit nicht-sensibilisierten menschlichen Endothelzellen gleichzeitig inkubiert wurden. In der Figur bedeutet "Kontrolle" eine Gruppe, co-in kubiert mit HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten VSMCs und "HGF" bedeutet eine Gruppe des Überstandes von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten VSMCs.
10 zeigt das Zellwachstum von Endothelzellen im Testbeispiel 6 an, wobei HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierte Ratten-VSMCs mit nicht-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen co-inkubiert wurden. In der Figur bedeutet "Kontrolle" eine Gruppe, co-inkubiert mit den HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten VSMCs und "HGF" bedeutet eine Gruppe des Kulturüberstandes der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten VSMCs.
11 zeigt einen Anstieg der Zahl von kleinen Blutgefäßen in dem Ratten-Herzmuskel, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-DNA in Testbeispiel 8, worin "HGF" die Zahl der kleinen Blutgefäße im Ratten-Herzmuskel, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-DNA bezeichnet und "Kontrolle" bezeichnet die Zahl von kleinen Blutgefäßen im Ratten-Herzmuskel, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-cont.
12 ist eine Zeichnung, die zeigt, dass 3 Wochen nach der Verabreichung von HVJ-Liposomen-DNA in das Gelenk eine Entwicklung von knorpelähnlichen Zellen in Testbeispiel 9 festgestellt wurde, worin die Synthese von Toluidin-blaugefärbtem Proteoglycan beobachtet wurde.
13 ist eine Zeichnung, die zeigt, dass 4 Wochen nach der Verabreichung von HVJ-Liposomen-DNA in das Gelenk die Entwicklung von knorpelähnlichen Zellen in Testbeispiel 9 festgestellt wurde, worin die Synthese von Toluidin-blaugefärbtem Proteoglycan beobachtet wurde.
14 ist eine Zeichnung, die zeigt, dass selbst 4 Wochen nach Verabreichung von HVJ-Liposomen-DNA (TGF-β), hergestellt in Vergleichsbeispiel 2, in das Gelenk, solch eine Entwicklung von knorpelähnlichen Zellen, beobachtend eine Toluidin-Blau-gefärbte Proteoglycansynthese, in Testbeispiel 9 nicht bemerkt wurde.
15 ist eine Zeichnung, die zeigt, dass selbst 4 Wochen nach einer Verabreichung von HVJ-Liposomen-cont, hergestellt in Vergleichsbeispiel 1, in das Gelenk, keine solche Entwicklung von knorpelähnlichen Zellen, beobachtend Toluidin-Blau-gefärbte Proteoglycansynthese, in Testbeispiel 9 bemerkt wurde.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Das in der gegenwärtigen Erfindung verwendete "HGF-Gen" zeigt ein Gen an, das HGF exprimieren kann. Solange also das exprimierte Polypeptid im wesentlichen dieselbe Wirkung wie HGF aufweist, kann das HGF-Gen eine teilweise Deletion, Substitution oder Insertion der Nukleotidsequenz aufweisen oder kann daran ligiert am 5'-Terminus und/oder am 3'-Terminus eine andere Nukleotidsequenz aufweisen. Typische Beispiele solcher HGF-Gene beinhalten HGF-Gene, wie beschrieben in Nature, 342, 440 (1989), japanisches Patent KOKAI (offengelegt) Nr. 5-111383, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989) usw. Diese Gene können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das HGF-Gen wird in einen geeigneten Vektor inkorporiert und der HGF-Gen tragende Vektor wird für die Verwendung bereitgestellt. Das HGF-Gen kann z.B. in Form eines viralen Vektors verwendet werden, der das HGF-Gen, wie hiernach beschrieben aufweist, oder in Form eines geeigneten Expressionsvektors mit dem HGF-Gen.
Die "pharmazeutische Zusammensetzung", die in der gegenwärtigen Erfindung verwendet wird, gibt ein Medikament für die Behandlung oder Verhinderung menschlicher Erkrankungen an, wobei diese Behandlung oder Verhinderung den pharmakologischen Aktivitäten von HGF zuzuschreiben ist. Beispielhaft werden z.B. Medikamente für die Behandlung oder Verhinderung der oben erwähnten Erkrankungen genannt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das HGF-Gen in Zellen eingeführt, worin HGF in denjenigen Zellen exprimiert wird, um die pharmakologischen Wirkungen zu zeigen. So ist das Medikament der gegenwärtigen Erfindung effektiv auf Erkrankungen anwendbar, für die HGF selbst effektiv ist.
Wenn das HGF-Gen z.B. in Zellen eingeführt wird, wird das Wachstum der vaskulären Endothelzellen beschleunigt, während das unerwünschte Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen nicht beschleunigt wird, wie in den Beispielen hiernach demonstriert. Weiterhin, wie demonstriert in Beispiel 8, worin das HGF-Gen in das Herz bei einem In-vivo-Tiertest unter Verwendung von Ratten eingeführt wird, wird eine Angiogenese beobachtet. Daher ist das HGF-Gen für die Behandlung und Verhinderung arterieller Störungen effektiv, insbesondere verschiedener Erkrankungen, die durch eine Störung ausgelöst werden, die im wesentlichen eine abnorme Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen involviert (z.B. eine Restenose nach einer percutanen transluminalen Koronar-Angioplastie (PTCA), Arteriosklerose, unzureichende periphere Zirkulation usw.) und für die Behandlung und Verhinderung von Erkrankungen wie z.B. Myokardinfarkt, Myocardie, peripherer Angiostenose, Herzinsuffizienz usw. HGF ist selbst auch für die Behandlung und Verhinderung der oben beschriebenen Erkrankungen nützlich, da HGF die Proliferation vaskulärer Endothelzellen unterstützt, jedoch das Wachstum vaskulärer glatter Muskelzellen nicht unterstützt. Die pharmakologischen Wirkungen des HGF-Gens werden denjenigen von HGF selbst zugeschrieben.
Wie in den Beispielen hiernach demonstriert, führt die Einführung des HGF-Gens in das Gelenk zu einer Unterstützung der Reparatur artikulärer Knorpelzellen und unterstützt dadurch die Proliferation der Proteoglycan synthetisierenden Zellen. Daher ist das HGF-Gen für die Verhinderung und Behandlung verschiedener Knorpelverletzungen effektiv, wie z.B. einer osteogenen Abnormalität, einer Arthritis deformans, einer Discopathie deformans, einer Bruchreparatur und einer Wiederherstellungs-Insuffizienz, einem durch Sport ausgelösten Trauma, der Key-Puncher-Erkrankung usw. HGF selbst ist für die Behandlung und Verhinderung der oben beschriebenen Erkrankungen nützlich, da HGF die Reparatur und das Wachstum von Knorpelzellen unterstützt. Die Wirkungen des HGF-Gens basieren auf denjenigen von HGF selbst.
"Liposom" ist ein geschlossenes Vesikel einer Lipid-Doppelschicht, das darin ein wässriges Kompartiment verkapselt. Es ist bekannt, dass die Lipid-Doppelschicht-Membranstruktur derjenigen von biologischen Membranen extrem ähnlich ist. Um die Liposomen der vorliegenden Erfindung herzustellen, werden Phospholipide verwendet. Typische Beispiele für Phospholipide sind Phosphatidylcholine, wie z.B. Lecithin, Lysolecithin usw.; saure Phospholipide, wie z.B. Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinosit, Phosphatidylsäure usw. oder Phospholipide, erhalten durch Ersatz einer Acylgruppe (mehrerer Acylgruppen) dieser sauren Phospholipide mit Lauroyl, Myristoyl, Oleoyl usw.; wie auch Sphingophospholipide, wie z.B. Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin usw. Neutrale Lipide, wie z.B. Cholesterin, können diesen Phospholipiden ebenfalls zugefügt werden. Die Liposomen können auf konventionelle Weise aus natürlich auftretenden Materialien, wie z.B. Lipiden in normalen Zellmembranen hergestellt werden. Die Liposomen, die das HGF-Gen der vorliegenden Erfindung enthalten, können z.B. durch Suspendieren einer dünnen Schicht gereinigter Phospholipide in einer Lösung, enthaltend das HGF-Gen und dann Behandlung der Suspension auf konventionelle Weise mit einer Ultraschallbeschallung, hergestellt werden.
Die Liposomen enthaltend das HGF-Gen der vorliegenden Erfindung, können in geeigneter Weise mit Viren usw. zur Bildung von Membranfusionsliposomen fusioniert werden. In diesem Fall wird es bevorzugt, die Viren z.B. durch Ultraviolettbestrahlung usw. zu inaktivieren. Ein besonders bevorzugtes Beispiel der Membranfusionsliposomen ist ein Mambranfusionsliposom, das mit dem Sendai-Virus fusioniert ist (japanisches hämagglutinierendes Virus: HVJ). Das Membranfusionsliposom kann durch die in NIKKEI Science, April, 1994, Seiten 32–38; J. Biol. Chem., 266 (6), 3361–3364 (1991), usw. beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Im Detail kann das HVJ-fusionierte Liposom (HVJ-Liposom) z.B. durch Vermischen von gereinigtem HVJ, inaktiviert durch ultraviolette Bestrahlung usw. mit einer Liposomensuspension, enthaltend den HGF-Genvektor, leichtes Bewegen der Mischung und dann Entfernung von nicht gebundenem HVJ durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation hergestellt werden. Die Liposomen können an Substanzen mit einer Affinität für Zielzellen gebunden werden, wodurch die Effizienz der Geneinführung in die Zielzellen erhöht wird. Beispiele für die Substanzen mit einer Affinität für Zielzellen beinhalten Liganden, wie z.B. einen Antikörper, einen Rezeptor usw.
Für die Einführung des HGF-Gens in Zellen werden konventionelle Verfahren verwendet, die grob in eine Einführung über virale Vektoren und andere Strategien klassifiziert sind (NIKKEI Science, April, 1994, Seiten 20–45; GEKKAN YAKUJI, 36 (1), 23–48 (1994) und die darin zitierten Referenzen). Beide Verfahren stehen für die Herstellung des Medikaments der gegenwärtigen Erfindung zur Verfügung.
Das erstere Verfahren unter Verwendung viraler Vektoren umfasst den Schritt der Einführung des HGF-Gens in z.B. ein Retrovirus, ein Adenovirus, ein adenoverwandtes Virus, ein Herpesvirus, ein Vacciniavirus, ein Poliovirus, ein Sidbisvirus oder andere RNA-Viren. Von diesen Viren wird das Retrovirus, das Adenovirus und das adenoverwandte Virus besonders vorzugsweise für die Einführung verwendet.
Beispiele für andere Verfahren beinhalten das Liposomenverfahren, das Lipofektinverfahren, das Mikroinjektionsverfahren, das Calciumphosphatverfahren und das Elektroporationsverfahren. Von diesen Verfahren wird das Liposomenverfahren besonders bevorzugt.
Für die praktische Verwendung des HGF-Gens als Medikament ist es vorteilhaft, das HGF direkt in den Körper einzuführen (In-vivo-Verfahren). Alternativ werden bestimmte Zellen von einem Menschen gesammelt, das HGF-Gen wird dann in die Zellen außerhalb des Körpers eingeführt und die mit dem HGF-Gen versehenen Zellen werden zum Körper zurückgeführt (Ex-vivo-Verfahren). Diese Verfahren werden in NIKKEI Science, April, 1994, Seiten 20–45; GEKKAN-YAKUJI, 36 (1), 23–48 (1994) und den darin zitierten Referenzen beschrieben. Alle diese Verfahren sind geeignet und werden abhängig von der zu behandelnden Erkrankung, den Zielorganen usw. gewählt und auf die Medikamentenzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung angewandt.
Das In-vivo-Verfahren ist preisgünstiger, weniger arbeitsaufwendig und daher geeigneter als das Ex-vivo-Verfahren, jedoch stellt das letztere Verfahren eine höhere Einführungseffizienz des HGF-Gens in die Zellen bereit.
Wenn das Medikament der gegenwärtigen Erfindung durch das In-vivo-Verfahren verabreicht wird, kann das Medikament auf jedem Weg verabreicht werden, der für die behandelte Erkrankung, die Zielorgane usw. geeignet ist. Das Medikament kann intravenös, intraarteriell, subcutan, intramuskulär usw. oder direkt zu dem objektiven Organ der Erkrankung, z.B. Niere, Leber, Lunge, Gehirn, Nerven usw. verabreicht werden. Eine direkte Verabreichung zu der objektiven Stelle kann das Zielorgan selektiv behandeln. Bei einer Gentherapie unter Verwendung eines Gens für die Restenose nach PTCA kann die Zusammensetzung z.B. intraarteriell verabreicht werden (JIKKEN-IGAKU, 12 (zusätzliche Ausgabe 15), 1298–1933 (1994). Vorzugsweise wird das Medikament der vorliegenden Erfindung an die Spitze eines Ballons, der für die PTCA verwendet wird, aufgebracht und die Spitze wird gegen das Blutgefäß gerieben, wodurch das Medikament direkt in die vaskulären Endothelzellen und die vaskulären glatten Muskelzellen eingeführt werden kann.
Wenn das oben beschriebene Ex-vivo-Verfahren verwendet wird, um das HGF-Gen einzuführen, werden menschliche Zellen (z.B. Lymphozyten oder hämatopoetische Stammzellen) auf konventionelle Weise geerntet und die geernteten Zellen werden mit dem Medikament der gegenwärtigen Erfindung für eine Geneinführung sensibilisiert. Daraufhin werden die HGF erzeugenden Zellen zurück in den Menschen eingeführt.
Wenn das Medikament durch das In-vivo-Verfahren verabreicht wird, kann das Medikament verschiedene Präparationsformen annehmen, einschließlich einer flüssigen Präparation. Im allgemeinen kann das Medikament vorzugsweise in eine Injektion präpariert werden, umfassend das HGF-Gen als aktiven Bestandteil. Falls nötig und gewünscht, können konventionelle Träger der Zusammensetzung zugefügt werden. Die Injektion kann auf konventionelle Weise hergestellt werden, z.B. durch Lösen des HGF-Gens in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. sterilisiertem Wasser, einer gepufferten Lösung, einer physiologischen Salzlösung usw.), Filtern der Lösung durch einen Filter usw. für die Sterilisierung, Auffüllen der Lösung in einen sterilen Behälter. Das Medikament kann unter Verwendung des mit dem HGF-Gen versehenen viralen Vektors anstelle des HGF-Gens selbst hergestellt werden. Wenn die Liposomen, enthaltend das HGF-Gen darin eingebettet (oder HVJ-Liposomen) verwendet werden, kann das Medikament in Form von Liposomenpräpa rationen, wie z.B. als Suspension, gefrorene Präparation, zentrifugal konzentrierte gefrorene Präparation usw. vorliegen.
Der Gehalt des HGF-Gens in dem Medikament kann in geeigneter Weise abhängig von den zu behandelnden Erkrankungen, den Zielorganen, dem Alter und Körpergewicht des Patienten usw. variiert werden. Es ist jedoch geeignet, eine Dosis von 0,0001 mg bis 100 mg, vorzugsweise 0,001 mg bis 10 mg, berechnet als HGF-Gen, zu verabreichen. Die Dosis kann auf etliche Tage oder einige Monate verteilt werden.
Beispiele
Hiernach wird die vorliegende Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben. Die verwendeten Materialien und Methoden in den folgenden Beispielen sind unten angegeben.
Materialien und Methoden
(1) HGF-Expressionsvektor
Der HGF-Expressionsvektor wurde durch Insertion menschlicher HGF-cDNA (2,2 kb, Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321–327 (1990); japanisches Patent KOKAI (Offengelegt) Nr. 5-111383) zwischen den EcoRI- und NotI-Stellen des pUC-SR-α-Expressionsvektors (FEBS, 333, 61–66 (1993)) hergestellt. Bei diesem Plasmidvektor wird die Transkription der HGF-cDNA durch den SRa-Promotor (Nature, 342, 490–443 (1989)) reguliert.
(2) Zellkultur
Ratten-Koronar-Endothelzellen wurden von dem enzymatisch verdauten Herz von 8 Wochen alten Sprague-Dawley(SD)-Ratten durch Dichtegradientenzentrifugation (Transplantation, 57, 1653–1660 (1994)) isoliert. Die Ratten-Aorta-vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) wurden von 12 Wochen alten SD-Ratten durch enzymatische Behandlung erhalten (J. Clin. Invest., 93, 355–360 (1994)). Diese Zellen wurden in DMEM-Medium, supplementiert mit 10%igem (V/V) fötalem Kälberserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) erhalten. Die Zellen wurden in einer angefeuchteten 95% Luft-5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C inkubiert. Das Kulturmedium wurde routinemäßig in Intervallen von 2 Tagen geändert. Sowohl eine immunopathologische als auch morphologische Beobachtung ergab, dass diese Zellen Endothelzellen bzw. glatte Muskelzellen waren.
Menschliche Aorta-Endothelzellen (fünf Passagen) und menschliche VSMCs (fünf Passagen) wurden von Kurabo Co. erhalten. Die Endothelzellen wurden auf ähnliche Weise wie bei dem obigen Verfahren in MCDB131-Medium, supplementiert mit 5% fötalem Kälberserum, Epidermis-Wachstumsfaktor (10 ng/ml), basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (2 ng/ml) und Dexamethason (1 μM) inkubiert.
Endothelzellen im stationären Zustand wurden gemäß dem in J. Clin. Invest., 86, 1690–1697 (1990), ibid., 94, 824–829 (1994) beschriebenen Verfahren hergestellt.
(3) Transfektion des HGF-Gens in HVJ-Liposomen in vitro
Endothelzellen oder VSMCs wurden für eine Sensibilisierung auf eine Platte mit 6 Vertiefungen mit einer Zellzahl von 10⁶ inokuliert und man ließ sie proliferieren, um 80% Konfluenz zu erreichen. Die Zellen wurden dreimal mit einer balancierten Salzlösung (137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6; hiernach abgekürzt als "BSS") gewaschen, supplementiert mit 2 mM Calciumchlorid. Zu den Zellen wurde 1 ml einer Lösung der HVJ-Liposomen-DNA (enthaltend 2,5 mg Lipide und 10 mg der einbetteten DNA), erhalten in Beispiel 1 hiernach oder 1 ml einer Lösung von HVJ-Liposom-cont. erhalten in Vergleichsbeispiel 1 hiernach, zugefügt. Die resultierende Mischung wurde bei 4°C 5 Minuten und bei 37°C für weitere 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in einem frischen Medium, enthaltend 10%iges Rinderserum in einem CO₂-Inkubator erhalten.
(4) Assay auf die HGF-Konzentrationen in Endothelzellen und VSMCs
Die von den sensibilisierten Endothelzellen und VSMCs erzeugte HGF-Konzentration wurde durch ELISA überprüft. Das heißt, Ratten oder menschliche Endothelzellen oder VSMCs wurden auf eine Platte mit 6 Vertiefungen (hergestellt von Corning) mit einer Zelldichte von 5 × 10⁴ Zellen/cm² inokuliert, gefolgt von einer 24stündigen Inkubation. Das Medium wurde 24 Stunden nach der Sensibilisierung wieder aufgefüllt und die Inkubation für weitere 48 Stunden fortgesetzt. Um zu untersuchen, ob HGF freigegeben worden war, wurden die sensibilisierten Zellen (48 Stunden nach der Sensibilisierung) gewaschen und zu 1 ml eines serumfreien Mediums, enthaltend 5 × 10^–7 M Insulin, 5 μg/ml Transferrin und 0,2 mM Ascorbat zugefügt. Nach 24 Stunden wurden die Kulturmedien gesammelt, bei 600 g 10 Minuten zentrifugiert und dann bei –20°C gelagert.
Die HGF-Konzentration in den Medien wurden durch einen Enzym-Immunoassay unter Verwendung eines Anti-Ratten-HGF-Antikörpers oder eines Antihuman-HGF-Antikörpers (Exp. Cell Res., 210, 326–335 (1994); Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262–1266 (1992)) bestimmt. Ein Kaninchen-anti-Ratten- oder ein anti-humanes HGF-IgG wurde auf eine Platte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Corning) 15 Stunden bei 4°C geschichtet. Nach einem Blockieren mit 3%igem bovinen Serumalbumin-haltigen PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) wurde das Kulturmedium zu jeder Vertiefung zugefügt und die Inkubation wurde 2 Stunden bei 25°C durchgeführt. Nach dem Waschen jeder Vertiefung dreimal mit PBS, enthaltend 0,025% Tween (PBS-Tween) wurde ein biotinyliertes Kaninchen-anti-Ratten-HGF-IgG oder ein anti-humanes HGF-IgG zu jeder Vertiefung zugefügt, gefolgt von einer Inkubation für 2 Stunden bei 25°C. Nach einem Waschen mit PBS-Tween wurde jede Vertiefung zusammen mit einem Meerrettich-Peroxidase-gebundenen Streptavidin-Biotinkomplex (PBS-Tween-Lösung) inkubiert. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe einer Substratlösung, (enthaltend 2,5 mM o-Phenylendiamin, 100 mM Natriumphosphat, 50 mM Citrat und 0,015% Wasserstoffperoxid) initiiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 M Schwefelsäure zum System beendet. Die Absorption wurde bei 490 nm gemessen. Der anti-humane HGF-Antikörper ist nur mit humanem HGF aber nicht mit Ratten-HGF kreuzreaktiv. Der Anti-Ratten-HGF-Antikörper ist nur mit Ratten-HGF aber nicht mit humanem HGF kreuzreaktiv.
(5) HGF
Die verwendeten menschlichen und Ratten-rekombinanten HGFs wurden aus der Kulturlösung von CHO-Zellen oder C-127-Zellen, transfiziert mit einem Expressionsplasmid, das humane oder Ratten-HGF-cDNA trug (Cell, 77, 261–271 (1994); J. Clin. Invest., 93, 355–360 (1994)), gereinigt.
(6) Statistische Analyse
Alle Durchläufe wurden mindestens dreimal wiederholt. Die gemessenen Daten sind als Mittel ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse der gemessenen Daten wurde gemäß dem Duncan-Test durchgeführt.
(7) Hämatoxylin-Eosin(HE)-Färbung und Azan-Färbung
10 Tage nach der Einführung des Gens wurden die mit einem Gen versehenen Ratten durch Perfusion mit Heparin-versetzter physiologischer Salzlösung geopfert. Die Fixierung wurde dann über Nacht mit einer 4%igen Paraformaldehyd-PBS-Lösung durchgeführt. Nach der Fixierung wurde das Gewebe in Paraffin eingebettet. Träger wurden hergestellt und mit HE und Azan auf konventionelle Weise gefärbt. Die Objektträger wurden auf einem Mikroskop zur Auszählung der Zahl der Mikrogefäße überprüft.
Beispiel 1
Herstellung von HVJ-Liposomen, enthaltend den HGF-Expressionsvektor
Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin und Cholesterin wurden mit Tetrahydrofuran in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 4,8 : 2 vermischt. Durch Abdestillation von Tetrahydrofuran durch einen Rotationsevaporator wurde die Lipidmischung (10 mg) auf die Behälterwand präzipitiert. Nachdem 96 μg der hochmobilen Gruppe (HMG) 1 nukleärem Protein, gereinigt aus Rinderthy mus, mit einer BBS(200 μl)-Lösung von Plasmid-DNA (300 μg) bei 20°C für eine Stunde gemischt wurden, wurde die Mischung zu der oben erhaltenen Lipidmischung zugesetzt. Die resultierende Liposomen-DNA-HMG 1-Komplexsuspension wurde mit einem Vortex gemischt, 3 Sekunden mit einem Ultraschall beschallt und dann 30 Minuten bewegt.
Das gereinigte HVJ (Stamm Z) wurde durch UV-Bestrahlung (110 erg/mm²·sek) für 3 Minuten direkt vor der Verwendung inaktiviert. BSS wurde zu der Liposomensuspension (0,5 ml, enthaltend 10 mg der Lipide) wie oben erhalten und HVJ (20.000 hämagglutinierende Einheiten) zugefügt und damit vermischt, um ein Gesamtvolumen von 4 ml zu erhalten. Die Mischung wurde 10 Minuten bei 4°C inkubiert und für weitere 30 Minuten bei 37°C leicht bewegt. Nicht umgesetztes HVJ wurde von den HVJ-Liposomen durch eine Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation entfernt. Das heißt, die oberen Schichten in dem Saccharose-Dichtegradienten wurden gesammelt, um die HVJ-Liposomenen, enthaltend den HGF-Expressionsvektor (enthaltend 10 μg/ml des HGF-Expressionsvektors) zu ergeben. Die HVJ-Liposomen, enthaltend den HGF-Expressionsvektor, werden hiernach häufig als HVJ-Liposomen-DNA bezeichnet.
Beispiel 2
Verabreichung des HVJ-Liposomen, enthaltend den HGF-Expressionsvektor an Ratten
Die den HGF-Expressionsvektor enthaltenden HVJ-Liposomen wurden durch das im obigen Beispiel beschriebene Verfahren unter Verwendung von 64 μg HMG 1 nukleärem Protein und 200 μg Plasmid-DNA hergestellt. BSS wurde der Liposomensuspension (0,5 ml, enthaltend 10 mg der Lipide) und HVJ (35.000 hämagglutinierende Einheiten) zugefügt und damit vermischt, um ein Gesamtvolumen von 2 ml zu ergeben.
SD-Ratten (Gewicht 400 bis 500 g; käuflich erworben von Japan Charles River) wurden mit intraperitonealer Verabreichung von Natriumpentobarbital (0,1 ml/100 mg) anästhesiert, erwärmt und durch eine automatische Beatmungsvorrichtung am Atmen gehalten. Die Ratten wurden einer Thorakotomie auf der linken Seite unterzogen. Die HVJ-Liposomen-DNA oder HVJ-Liposomencont (20 μl) wurden vorsichtig direkt durch den Herzapex unter Verwendung einer 30-G-Spritze injiziert.
Vergleichsbeispiel 1
Herstellung von HVJ-Liposomen, die keinen HGF-Expressionsvektor enthielten
Ein Vektor, der kein HGF-Gen enthielt, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, um die HVJ-Liposomen, die keinen HGF- Expressionsvektor enthielten, herzustellen. Die HGF-Expressionsvektorfreien HVJ-Liposomen werden hiernach als HVJ-Liposomen-cont bezeichnet.
Vergleichsbeispiel 2
Herstellung von HVJ-Liposomen, die den menschlichen TGF-β-Expressionsvektor enthalten
HVJ-Liposomen, die den menschlichen TGF-β-Expressionsvektor enthalten, wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, außer dass der menschliche TGF-β-Expressionsvektor verwendet wurde.
Die den menschlichen TGF-Expressionsvektor enthaltenden HVJ-Liposomen werden hiernach als HVJ-Liposomen-DNA (TGF-β) bezeichnet.
Testbeispiel 1
Expression von HGF in Ratten-Koronar-Endothelzellen, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-DNA
HVJ-Liposomen-DNA (Konzentration des HGF-Expressionsvektors in Liposomen: 10 μg/ml) wurden gegenüber Ratten-Koronar-Endothelzellen (Zellzahl: 106) sensibilisiert. Die HGF-Produktion wurde durch ELISA bestimmt. Für die Kontrolle wurde ein ähnlicher Test unter Verwendung von HVJ-Liposomen-cont durchgeführt. Die HGF-Produktion wurde auch an den nicht-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen (Gruppe ohne Behandlung) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 (n = 6) dargestellt, worin "HGF" die Gruppe von Ratten-Koronar-Endothelzellen repräsentiert, die mit HVJ-Liposomen-DNA sensibilisiert wurden.
Wie in 1 dargestellt, erzeugten die Ratten-Koronar-Endothelzellen, die mit HVJ-Liposomen-DNA sensibilisiert wurden, HGF auf hohem Niveau und sezernierten dieses. Andererseits wurde im wesentlichen keine HGF-Produktion in der intakten Gruppe oder der Gruppe der Ratten-Koronar-Endothelzellen, die mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisiert wurden, beobachtet.
Eine Zellzählung in den getesteten Gruppen ergibt, dass die HGF-Expressionsgruppe signifikant hohe Zellzahlen zeigt.
Testbeispiel 2
Wirkungen des sensibilisierten HGF-Expressionsvektors auf die Proliferation von Endothelzellen
Menschliche Endothelzellen wurden mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisiert. Die sensibilisierten Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von zugesetztem exogenem rekombinantem menschlichem HGF (1, 10 und 100 ng/ml) inkubiert und die Zellwachstumsrate (%) wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 ((Linien) Grafik, n = 6) dargestellt, worin "DSF" die Gruppe der Endothelzellen repräsentiert, die mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisiert wurden und "HGF" repräsentiert die Gruppe, inkubiert in Gegenwart von rekombinantem humanem HGF in definierter Konzentration (*: P < 0,05, **: P < 0,01 für DSF).
Die (Linien) Grafik, wie dargestellt in 2 zeigt, dass das Wachstum von Endothelzellen durch exogen zugefügtes HGF unterstützt wird.
Die mit HVJ-Liposomen-DNA (Konzentration: 10 μg/ml) sensibilisierten Endothelzellen wurden ähnlich inkubiert und die vermehrten Zellen wurden gezählt, um eine Zellwachstumsrate (%) zu bestimmen. Zur Kontrolle wurden die mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisierten Endothelzellen ebenfalls inkubiert und die vermehrten Zellen wurden zur Bestimmung einer Zellwachstumsrate (%) gezählt. Die Ergebnisse sind in 2 (Säule, n = 6) dargestellt, worin "DSF" die Gruppe der Endothelzellen bezeichnet, die mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisiert wurde und "HGF" die Gruppe von Endothelzellen bezeichnet, die mit HVJ-Liposomen-DNA sensibilisiert wurde (**: P < 0,01 für DSF, #: P < 0,05 für HGF, 100 ng/ml).
Wie aus der in 2 dargestellten Säule ablesbar ist, zeigen die Ergebnisse, dass die Zellwachstumsrate von HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen deutlich höher ist als die der Kontrollgruppe und signifikant hoch selbst im Vergleich mit der von exogen zugeführtem HGF.
Die vorher erwähnten Endothelzellen, die mit HVJ-Liposomen-DNA sensibilisiert wurden, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit eines Kaninchen-anti-humanen HGF-Antikörpers inkubiert. Die vermehrten Zellen wurden gezählt, um eine Zellwachstumsrate zu bestimmen. Zur Kontrolle wurden die mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisierten Endothelzellen inkubiert und die vermehrten Zellen auf ähnliche Weise gezählt, um eine Zellwachstumsrate zu bestimmen. Der Kaninchen-anti-humane HGF-Antikörper (10 μg/ml) wurde durch das in Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262–1266 (1992) beschriebene Verfahren gereinigt. Dieser Antikörper kann die biologische Aktivität von 10 ng/ml in einer Konzentration von 10 μg/ml neutralisieren. Der anti-humane HGF-Antikörper ist nur mit humanem HGF aber nicht mit Ratten-HGF kreuzreaktiv, während der Anti-Ratten-HGF-Antikörper nur mit Ratten-HGF aber nicht mit humanem HGF kreuzreaktiv ist. Normales Kaninchenserum-IgG (10 μg/ml) wurde als Kontrolle verwendet.
Die Ergebnisse sind in 3 (n = 6) dargestellt, worin "Kontrolle" die Gruppe der mit HVJ-Liposomen-cont sensibilisierten Endothelzellen bezeichnet, die in Gegenwart der IgG-Kontrolle inkubiert wurden; "HGF" bezeichnet die Gruppe der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen, die in Gegenwart der IgG-Kontrolle inkubiert wurden und "HGFab" bezeichnet die Gruppe von HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen, die in Gegenwart des Kaninchen-anti-humanen HGF-Antikörpers inkubiert wurden. Die Zellwachstumsrate (%) wird unter Bezugnahme auf relative % ausgedrückt, wenn die Wachstumsrate in der Kontrollgruppe auf 100 angesetzt wird (*: P < 0,01 für die Kontrollegruppe, #: P < 0,05 für HGF). Wie in 3 dargestellt, wurde das Wachstum von HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Endothelzellen in Gegenwart des anti-humanen HGF-Antikörpers angehalten und die Zellwachstumsrate war so im wesentlichen dieselbe wie die der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass HGF der Wachstumsfaktor der Endothelzellen ist.
Testbeispiel 3
Wirkungen des Überstands der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs auf Ratten-Koronar-Endothelzellen
Der Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs wurde zu dem Ratten-Koronar-Endothelzellkultursystem (Zellzahl: 105) während der stationären Phase zugefügt. Nach der Durchführung einer Inkubation für 3 Tage wurde die Zahl der vermehrten Endothelzellen überprüft. Zur Kontrolle wurde der Überstand der inkubierten HVJ-Liposomencont-sensibilisierten Ratten VSMCs auf ähnliche Weise wie oben beschrieben, behandelt und die vermehrten Endothelzellen wurden wie oben beschrieben gezählt. Die Ergebnisse sind in 4 (n = 6) dargestellt, worin "Kontrolle" die Gruppe angibt, versetzt mit dem Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten VSMCs und "HGF" die Gruppe angibt, versetzt mit dem Überstand der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs.
Wie in 4 dargestellt, wurde ein signifikanter Anstieg der Zahl der Endothelzellen in der Gruppe beobachtet, die mit dem Überstand der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs versetzt worden war.
Die HGF-Konzentration im Kulturüberstand der Ratten-VSMCs, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-DNA oder HVJ-Liposomen-cont, wie oben beschrieben, wurde durch ELISA unter Verwendung eines anti-humanen HGF-Antikörpers und eines anti-Ratten-HGF-Antikörpers überprüft. Die HGF-Konzentration im Kulturüberstand von nicht-sensibilisierten VSMCs wurde ebenfalls überprüft (Gruppe ohne Behandlung).
Die unter Verwendung des anti-humanen HGF-Antikörpers und des Anti-Ratten-HGF-Antikörpers erhaltenen Ergebnisse sind in den 5 bzw. 6 dargestellt (in beiden Tests n = 6). In der Figur bezeichnet "Kontrolle" die Gruppe des Überstands von den inkubierten HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten VSMCs und "HGF" bezeichnet die Gruppe des Überstands von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs.
Wie in 5 dargestellt, wurde HGF im Überstand der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs nachgewiesen und die HGF-Konzentration war signifikant höher als diejenige der Kontrollgruppe.
6 zeigt auch, dass Ratten-HGF weiter im Überstand von den HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs nachgewiesen wurde und dass die HGF-Konzentration signifikant höher war als diejenige der Kontrollgruppe.
Wie in 5 und 6 beobachtet, lag kein HGF in einer durch ELISA nachweisbaren Menge sowohl im Überstand der intakten Gruppe als auch der Kontrollgruppe vor.
Testbeispiel 4
Wirkungen des Überstands der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen auf Ratten-Koronar-Endothelzellen
Der Überstand der inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen wurde dem Ratten-Koronar-Endothelzellkultursystem (Zellzahl: 10⁵) während der stationären Phase zugesetzt. Nach 3tägiger Inkubation wurde die Zahl der vermehrten Endothelzellen überprüft. Zur Kontrolle wurden die Endothelzellen auf ähnliche Weise unter Verwendung des Kulturüberstands der HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen inkubiert und die vermehrten Endothelzellen wurden gezählt. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt, worin A, B und C jeweils die Gruppe darstellen, versetzt mit dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen (n = 8), der Gruppe, versetzt mit dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomencont-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen (n = 8) und der Nicht-Behandlungsgruppe (n = 15).
Wie in 7 dargestellt, wurde ein signifikanter Anstieg der Zahl der Endothelzellen in der Gruppe beobachtet, die mit dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen versetzt worden war, während die Zellzahl der Kontrollgruppe fast dieselbe war wie die der Nicht-Behandlungsgruppe (Kontrollgruppe: 0,117 ± 0,002, Gruppe A: 0,148 ± 0,03, P < 0,01).
Als nächstes wurde ein Anti-HGF-Antikörper dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen zugesetzt. Die Zahl der vermehrten Endothelzellen wurde wie oben beschrieben überprüft. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt (n = 8), worin A die Grup pe bedeutet, versetzt mit dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen; B bedeutet die Gruppe, versetzt mit dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen; C bedeutet die Gruppe, versetzt mit dem Anti-HGF-Antikörper zu dem Kulturüberstand der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen und D repräsentiert die Gruppe, versetzt mit einem Kontrollantikörper zu dem Überstand von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen.
Wie in 8, A und C dargestellt, verschwand die das Zellwachstum unterstützende Aktivität des Kulturüberstands der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen vollständig durch Zugabe des anti-HGF-Antikörpers. Die Ergebnisse zeigen, dass die das Zellwachstum unterstützende Aktivität des Kulturüberstands der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten-Koronar-Endothelzellen dem HGF zuzuschreiben ist.
Testbeispiel 5
Wirkungen von HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten humanen VSMCs auf humane Endothelzellen
Humane VSMCs wurden auf einen Zellkulturinsert (hergestellt von Coaster, Porendurchmesser 0,45 μm) inokuliert, und wurden dann in DMEM-Medium, supplementiert mit 10% bovinem Serum gezüchtet. Andererseits wurden menschliche Endothelzellen auf eine Platte mit 6 Vertiefungen inokuliert und in DMEM-Medium, supplementiert mit 10%igem bovinem Serum erhalten. Wenn VSMCs proliferiert wurden, um eine 80%ige Konfluenz zu erreichen, wurden VSMCs bei 4°C 5 Minuten und bei 37°C für 30 Minuten zusammen mit HVJ-Liposomen-DNA (DNA-Gehalt in den Liposomen: 10 μg) oder mit HVJ-Liposomen-cont inkubiert. Nach der Sensibilisierung wurde das Insert, enthaltend die sensibilisierten VSMCs zu jeder Vertiefung, enthaltend humane Endothelzellen in der stationären Phase, zugefügt. VSMCs und die Endothelzellen wurden 3 Tage in DMEM-Medium, supplementiert mit 0,5% bovinem Serum co-inkubiert. Danach wurde die Zellzahl mit einem WST-Zellcounterkit (hergestellt von Wako Co.) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt (n = 6). In der Figur bedeutet "Kontrolle" die Gruppe, co-inkubiert mit den HVJ-Liposomencont-sensibilisierten VSMCs und "HGF" bedeutet die Gruppe des Überstands von den inkubierten HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten VSMCs.
Die in 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass humane VSMCs, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-DNA, das Wachstum nicht-sensibilisierter humaner Endothelzellen in der stationären Phase signifikant verstärken können.
Testbeispiel 6
Wirkungen der HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs auf Ratten-Koronar-Endothelzellen
Die HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs (Zellzahl: 10⁶) wurden 3 Tage mit Ratten-Koronar-Endothelzellen (Zellzahl: 10⁵) in der stationären Phase co-inkubiert. Danach wurde die Zahl der vermehrten Endothelzellen geprüft. Zur Kontrolle wurden Endothelzellen auf ähnliche Weise unter Verwendung der HVJ-Liposomen-cont-sensibilisierten Ratten VSMCs co-inkubiert und die vermehrten Endothelzellen wurden gezählt. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt (n = 6), worin "Kontrolle" die Ratten-VSMC-Gruppe repräsentiert, sensibilisiert mit der HVJ-Liposomen-DNA und "HGF" die Ratten-VSMC-Gruppe repräsentiert, sensibilisiert mit HVJ-Liposomencont.
Wie in 10 dargestellt, wurde das Wachstum der Endothelzellen durch HGF, freigesetzt aus den HVJ-Liposomen-DNA-sensibilisierten Ratten VSMCs stimuliert und die vermehrte Zellzahl wurde beobachtet (Kontrollgruppe: 0,126 ± 0,006, HGF-Gruppe: 0,156 ± 0,01, P < 0,05).
Testbeispiel 7
Wachstum von Ratten-VSMCs, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-DNA
Ratten-VSMCs, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-DNA und Ratten-VSMCs, sensibilisiert mit HVJ-Liposomen-cont wurden jeweils inkubiert, um einen Vergleich der erhöhten Zellzahl dazwischen möglich zu machen. Eine Sensibilisierung mit HVJ-Liposomen-DNA beeinflusste das Zellwachstum gar nicht. Die Ergebnisse zeigen, dass HGF keine das Zellwachstum unterstützende Wirkung auf VSMCs ausübt.
Testbeispiel 8
Induktion einer Angiogenese im Ratten-Herzmuskel, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-DNA
Ein Ratten-Herzmuskel, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-DNA, ein Ratten-Herzmuskel, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-cont und ein Ratten-Herzmuskel ohne Behandlung wurden mit HE bzw. Azan gefärbt und in einem Mikroskop zur Zählung der Zahl der Mikrogefäße überprüft. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt, worin "HGF" die Zahl der Mikrogefäße im Ratten-Herzmuskel bezeichnet, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-DNA und "Kontrolle" die Zahl der Mikrogefäße in dem Ratten-Herzmuskel bezeichnet, direkt injiziert mit HVJ-Liposomen-cont.
Wie in 11 festgehalten, stieg die Zahl der kleinen Blutgefäße im Ratten-Herzmuskel, injiziert mit HVJ-Liposomen-DNA signifikant an im Ver gleich mit. derjenigen des Ratten-Herzmuskels, injiziert mit HVJ-Liposomencont und dem Ratten-Herzmuskel ohne Behandlung. Diese Ergebnisse zeigen, dass HGF mit einer Aktivität eines Wachstums von Endothelzellen eine In-vivo-Angiogeneseaktivität ausübt.
Testbeispiel 9
Reparatur von artikulärem Knorpel durch direkte Einführung von HVJ-Liposomen-DNA in das Gelenk
10 Wochen alte Fischer-Ratten wurden in der Femoralis intercondylaris durch den Subknorpel unter Verwendung von Kirschner-Drähten mit einem Durchmesser von 1,8 mm verletzt. Eine Woche nach der Operation wurde die HVJ-Liposomen-DNA (100 μl/Knie), hergestellt in Beispiel 1, direkt in das Gelenk eingeführt. Zur Kontrolle wurden HVJ-Liposomen-cont, hergestellt in Vergleichsbeispiel 1 und HVJ-Liposomen-DNA (TGF-β), hergestellt in Vergleichsbeispiel 2, direkt in derselben Menge in das Gelenk verabreicht. Die Ratten wurden 1, 3 und 4 Wochen nach Einführung dieser Gene usw. geopfert und die reparierten Stellen wurden histologisch überprüft.
Wie in 12 dargestellt, zeigen die Ergebnisse, dass die Synthese von Proteoglycan, gefärbt mit Toluidin-Blau, 3 Wochen nach Verabreichung der HVJ-Liposomen-DNA in das Gelenk beobachtet wurde, was die Entwicklung von knorpelähnlichen Zellen anzeigt. Weiterhin, wie dargestellt in 13, wurde 4 Wochen nach Verabreichung von HVJ-Liposomen-DNA in das Gelenk eine Tendenz zum weiteren Ausdehnen des Bereichs von sich entwickelnden knorpelähnlichen Zellen beobachtet, worin eine Synthese von Proteoglycan erkannt wurde.
Wie in 14 dargestellt, worin die HVJ-Liposomen-DNA (TGF-β), hergestellt in Vergleichsbeispiel 2, in das Gelenk injiziert worden war, wurde selbst 4 Wochen nach der Verabreichung keine Entwicklung solcher knorpelähnlichen Zellen beobachtet. Weiterhin, wie dargestellt in 15, wobei HVJ-Liposomen-cont, hergestellt in Vergleichsbeispiel 1, in das Gelenk injiziert wurde, wurde selbst nach 4 Wochen nach der Verabreichung keine Entwicklung solcher knorpelähnlicher Zellen beobachtet.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das Medikament der vorliegenden Erfindung stellt persistente therapeutische Wirkungen im Vergleich mit HGF selbst bereit. Weiterhin kann das Medikament der vorliegenden Erfindung topisch auf die Zielorgane angewandt werden, so dass die Wirkungen selektiv ausgeübt werden können, was zu einer Minimierung der Nebenwirkungen von HGF führt.

Claims

Gen eines Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF) zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
HGF-Gen wie in Anspruch 1 beansprucht zur Verwendung bei der Behandlung einer arteriellen Erkrankung oder Knorpelverletzung.
Liposom, das ein HGF-Gen enthält und das ein Membranfusionsliposom ist, das an den Sendai-Virus gebunden ist.
Liposom nach Anspruch 3 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
Liposom, das ein HGV-Gen enthält, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
Liposom nach Anspruch 5 zur Verwendung bei der Behandlung einer arteriellen Erkrankung oder Knorpelverletzung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Träger oder ein Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein Liposom, wie es in Anspruch 3 definiert ist, oder ein HGF-Gen.
Verwendung eines HGF-Gens zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer arteriellen Erkrankung oder Knorpelverletzung.
Verwendung eines Liposoms, das ein HGF-Gen enthält, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer arteriellen Erkrankung oder Knorpelverletzung.
Verwendung eines Liposoms, wie es in Anspruch 3 beansprucht ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer arteriellen Erkrankung oder Knorpelverletzung.