ES2298538T3 - Gen del factor de crecimiento hepatocitario hibrido que tiene una eficacia de expresion elevada de dos heterotipos del factor de crecimiento hepatocitario. - Google Patents
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Abstract
Gen del Factor de Crecimiento Hepatocitario (HGF) híbrido que comprende los exones 1-18 de HGF, o formas degeneradas de los mismos que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada, y que comprende además un intrón inherente entre los exones 4 y 5, donde el gen de HGF híbrido comprende una secuencia de nucleótidos idéntica en no menos de un 80% con la SEC ID No: 2.
Description
Gen del factor de crecimiento hepatocitario
híbrido que tiene una eficacia de expresión elevada de dos
heterotipos del factor de crecimiento hepatocitario.
La presente invención se refiere a un gen del
Factor de Crecimiento Hepatocitario (HGF) híbrido de alta eficacia
que expresa simultáneamente dos heterotipos de HGF.
La presente invención se refiere a un gen de HGF
híbrido preparado mediante la inserción de un intrón inherente o
foráneo entre los exones 4 y 5 en ADNc de HGF, que tiene una
eficacia de expresión superior que el ADNc de HGF y expresa
simultáneamente dos heterotipos de HGF y dHGF (variante eliminada de
HGF).
HGF es una glicoproteína de unión a heparina
denominado factor de dispersión. Un gen que codifica HGF se
localiza en el cromosoma 721.1 y comprende 18 exones y 17 intrones,
que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID No: 1 (Seki T et
al., Gene 102:213-219, 1991). Se
transcribe un transcrito de aproximadamente 6 kb desde el gen de
HGF y, a continuación, a partir del mismo se sintetiza un
polipéptido precursor de HGF que consistía en 728 aminoácidos.
Simultáneamente, también se sintetiza un polipéptido precursor de
dHGF que consistía en 723 aminoácidos mediante "splicing"
(corte y empalme) alternativo del gen de HGF. Los precursores
biológicamente inactivos se pueden convertir en formas activas de
heterodímero unidos por puentes disulfuro mediante proteasa en
suero. En los heterodímeros, la cadena alfa que tiene un peso
molecular elevado forma cuatro dominios kringle y un bucle de
horquilla N-terminal como una región peptídica
preactivada de plasminógeno. Los dominios kringle de una triple
estructura en bucle unida por puentes disulfuro que consiste en
aproximadamente 80 aminoácidos pueden jugar un papel importante en
la interacción proteína-proteína. La cadena beta de
peso molecular bajo forma un dominio de tipo serina proteasa.
d-HGF que consiste en 723 aminoácidos es un
polipéptido con una deleción de cinco aminoácidos en el primer
dominio kringle de la cadena alfa, es decir, F, L, P, S y S.
Recientemente se ha descrito que tanto HGF como
dHGF tienen varias funciones biológicas, por ejemplo, promover el
crecimiento y la morfogénesis de células epiteliales, melanocitos y
células endoteliales. Sin embargo, son diferentes en términos de
propiedades inmunológicas o biológicas.
Por ejemplo, HGF muestra aproximadamente 20
veces, 10 veces y 2 veces de mayor actividad que dHGF en la
promoción de la síntesis de ADN en células endoteliales venosas de
cordón umbilical humano, células musculares lisas arteriales y
NSF-60 (células de mieloblasto murino),
respectivamente. dHGF muestra aproximadamente 3 veces y 2 veces de
mayor actividad que HGF en la promoción de la síntesis de ADN de
LLC-PK1 (células endoteliales de riñón de cerdo) y
OK (células epiteliales de riñón de zarigüeya americana) y células
intersticiales de ratón, respectivamente. HGF tiene 70 veces más
solubilidad en PBS que dHGF. Varios anticuerpos monoclonales
anti-dHGF reconocen sólo dHGF, pero no HGF o una
forma reducida de dHGF, lo que implica que las estructuras de HGF y
dHGF son diferentes. Por consiguiente, la síntesis simultánea de HGF
y dHGF in vivo sugiere que interaccionan biológicamente
entre sí (Shima, N. et al., Biochemical and Biophysical
Research Communications 200:808-815, 1994).
El HGF secretado de células derivadas de
mesodermo tiene varias funciones biológicas, por ejemplo, 1)
inducir células epiteliales en una estructura tubular; 2) estimular
la vascularización de células endoteliales in vitro e in
vivo; 3) regeneración de hígado y riñón, debido a si actividad
anti-apoptosis; 4) organogénesis de riñón, ovario y
testículos; 5) controlar la osteogénesis; 6) estimular el
crecimiento y la diferenciación de células precursoras
hematopoyéticas eritroides; y 7) crecimiento de axones de neuronas
(Stella, M. C. y Comoglio, P.M. The Internacional Journal of
Biochemistry & Cell Biology 31: 1357-1362,
1999). Basado en estas diversas funciones, se puede desarrollar un
HGF o un gen que codifica HGF como agente terapéutico para tratar
enfermedades isquémicas o del hígado. En realidad, in vivo,
el HGF puede existir como HGF o dHGF y, por lo tanto, la
coexpresión de HGF y dHGF es importante para maximizar el efecto
terapéutico. Por consiguiente, los presentes inventores han
intentado desarrollar un gen de HGF híbrido que puede expresar
simultáneamente HGF y dHGF con una eficacia elevada para terapia
génica.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un gen de HGF híbrido que expresa simultáneamente dos
heterotipos de HGF tal y como se establece en las reivindicaciones,
y más particularmente a un gen de HGF híbrido que tiene un intrón
inherente o foráneo que se inserta entre los exones 4 y 5 de ADNc de
HGF.
La presente invención también proporciona
vectores que comprende el gen de HGF híbrido y células huésped
transformadas con el vector anterior.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica para tratar o prevenir enfermedades
isquémicas o de hígado, que comprende el gen de HGF híbrido.
Los objetos anteriores y otros objetos y
características de la presente invención serán evidentes a partir
de la descripción de la presente invención, cuando se toma en
conjunto con los dibujos que se acompañan que muestran
respectivamente:
Figura 1: diagrama esquemático de prototipo de
HGF-X que ilustra las posiciones de los fragmentos
de gen,
Figura 2: proceso para clonar fragmentos de gen
a partir de ADN genómico de HepG2,
Figura 3: proceso para clonar fragmentos de gen
a partir de ADNc de placenta humana,
Figuras 4A y 4B: procesos para preparar vectores
de expresión pCK-HGF-X,
Figura 5: proceso para preparar vectores de
expresión pCK-cHGF y pCK-dHGF,
Figura 6: proceso para preparar vectores de
expresión de pCP-familia HGF-X,
Figura 7: proceso para preparar vectores de
expresión pCP-cHGF y pCP-dHGF,
Figura 8: niveles de expresión del gen de
pCP-cHGF, pCP-dHGF y
pCP-HGF-X.
Figura 9: patrones de expresión del gen de
pCP-cHGF, pCP-dHGF y
pCP-HGF-X observados mediante
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12%,
Figura 10: niveles de expresión del gen de
pCP-cHGF, pCP-dHGF y
pCP-HGF-X7, in vivo,
Figura 11: angiogénesis cerebral de dos grupos
de conejos que se sometieron a la administración de pCP y
pCP-HGF-X7, respectivamente.
El gen del Factor de Crecimiento Hepatocitario
(HGF) híbrido de la presente invención comprende ADNc
correspondiente a los exones 1 a 18, y un intrón inherente o foráneo
insertado entre los exones 4 y 5 del ADNc. El intrón comprende un
fragmento del intrón inherente o una secuencia recombinante.
Una realización del gen del HGF híbrido de la
presente invención que comprende el intrón inherente tiene 7112 pb
de longitud y tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID No: 2. El
gen de HGF híbrido expresa simultáneamente tanto HGF como dHGF, y
tiene una eficacia de expresión más elevada que el ADNc de HGF.
La degeneración de codones permite que el gen de
HGF híbrido de la presente invención se modifique o cambie en la
región codificante y/o no codificante sin alterar la secuencia de
aminoácidos de la proteína y la expresión del gen. Por
consiguiente, los polinucleótidos que son sustancialmente idénticos
al gen de HGF híbrido de SEC ID No: 2, y los fragmentos de los
mismos caen dentro del alcance de la presente invención.
"Sustancialmente idénticos" significa que la homología en la
secuencia no es inferior al 80%, preferiblemente no es inferior al
90% y más preferiblemente no inferior al 95%.
Un gen de HGF híbrido puede comprende un
fragmento de intrón inherente que tiene opcionalmente una pequeña
secuencia recombinante insertada en el mismo entre los exones 4 y 5
de ADNc de HGF. En el presente documento, dicho gen de HGF híbrido
que comprende un fragmento de intrón inherente se designa como
"HGF-X". Se prefieren HGFX-6,
HGF-X7 y HGF-X8 que tienen la
secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 19 a 21,
respectivamente.
respectivamente.
El gen de HGF híbrido de la presente invención
se sintetiza e inserta en un vector de expresión, según los
procedimientos de diseño genético conocidos. A continuación, el
vector se puede introducir en células huésped adecuadas, tales como
E. coli y levadura. Por ejemplo, Top 10F' de Escherichia
coli se puede transfectar con el gen de HGF-X7
de la presente invención. El Top 10F'pCK-HGFX7 de
Escherichia coli y Top 10F'pCP-HGFX7 de
Escherichia coli obtenidos a continuación se depositaron con
los números de acceso KCCM-10361 y
KCCM-10362, respectivamente, el 12 de marzo del
2002.
Mediante la utilización de células
transformadas, el gen de la presente invención y la proteína
codificada se pueden producir de este modo a gran escala.
El vector de la presente invención puede
comprender selectivamente una secuencia o secuencias para regular
la expresión génica, tal como un promotor o un terminador, una
secuencia de autorreplicación y una señal secretora, dependiendo de
las células huésped.
\newpage
Además, la presente invención comprende una
composición farmacéutica para tratar o prevenir enfermedades
isquémicas y del hígado, que comprende el gen de HGF híbrido o el
vector que comprende el gen como principio activo. Preferiblemente,
la composición se formula para inyección.
La composición de la presente invención puede
comprender además portadores farmacéuticamente aceptables. Se
pueden utilizar cualquiera de los procedimientos convencionales del
sector farmacéutico para prepara formulaciones orales, tales como
comprimidos, cápsulas, pastillas, gránulos, suspensiones y
soluciones; formulaciones de inyección, tales como soluciones,
suspensiones o polvos secos que se pueden mezclar con agua destilada
antes de la inyección; formulaciones aplicables de manera local,
tales como ungüentos, cremas y lociones; y otras formulaciones.
Los portadores utilizados generalmente en el
sector farmacéutico se pueden utilizar en la composición de la
presente invención. Por ejemplo, las formulaciones administradas
oralmente pueden incluir aglutinantes, emulsionantes, agentes
desintegrantes, excipientes, agentes solubilizantes, agentes de
dispersión, agentes estabilizantes, agentes de suspensión, agentes
de coloración o especias. Las formulaciones de inyección pueden
comprender conservantes, agentes contra el dolor agudo
("unagonizing agents"), agentes solubilizantes o agentes
estabilizantes. La preparación para la administración local puede
contener bases, excipientes, lubricantes o conservantes. Cualquiera
de las formulaciones adecuadas conocidas en la técnica (Remington's
Pharmaceutical Science [la nueva edición], Mack Publishing Company,
Eaton, PA) se pueden utilizar en la presente invención.
La composición de la invención se puede
administrar clínicamente como varias formulaciones orales y
parenterales. Se puede preparar una formulación adecuada utilizando
excipientes tales como aditivos, potenciadotes, aglutinantes,
agentes humectantes, agentes disgregantes o tensoactivos o
diluyentes. Entre las formulaciones sólidas para la administración
oral se incluyen pastillas, comprimidos, polvos sueltos, gránulos y
cápsulas. Las formulaciones sólidas se pueden preparar mediante el
mezclado de uno o más excipientes, por ejemplo, almidón, carbonato
cálcico, sacarosa, lactosa, y gelatina con derivados de
dibencilbutillactona lignano. Además, se pueden incluir en la
presente formulación lubricantes, tales como estearato magnésico y
talco. Las formulaciones líquidas para la administración oral
incluyen suspensiones, soluciones, emulsiones y jarabes. Las
formulaciones que contienen agentes humectantes, edulcorantes,
aromatizantes y conservantes, además de diluyentes simples
generales, tales como agua y parafina líquida. Las formulaciones
para la administración parenteral incluyen una solución acuosa
esterilizada, una suspensión, una emulsión, un tratamiento
alternativo liofilizado y supositorios. Los excipientes insolubles
en agua y los agentes en suspensión comprenden grasa vegetales,
tales como propilenglicol, polietilenglicol y aceite de oliva y
ésteres inyectables, tales como oleato de etilo. Como bases de
supositorios se pueden utilizar Witepsol®, Macrogol®, Tween® 61,
grasas de cacao, laurin grasas y glicerogelatinas.
La composición de la presente invención se puede
administrar oralmente o a través de rutas parenterales, tales como
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraabdominal, esternal e
inyección arterial o infusión, o tópicamente a través de la
administración rectal, intranasal, por inhalación o intraocular.
Debería entenderse que la dosis diaria habitual
de la composición de la presente invención debe determinarse en
función de diversos factores pertinentes incluyendo las condiciones
a tratar, la ruta de administración escogida, la edad, el sexo, el
peso corporal del paciente individual, y la gravedad de los síntomas
del paciente, y se puede administrar en una dosis única o en dosis
divididas. Por lo tanto, la dosis diaria no debería interpretarse
en ningún caso como una limitación para el alcance de la presente
invención.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan
únicamente a modo de ilustración y no pretenden limitar el alcance
de la presente invención.
Se suspendieron células HepG2 humanas (ATCC No.
de Acceso: HB-8065) en tampón TES (10 mM de
Tris-HCl; 1 mM de EDTa, SDs al 0,7%) y se trataron
con 400 \mug/ml de proteinasa K a 50ºC durante 1 hora.
Posteriormente, el ADN genómico se extrajo de la suspensión celular
mediante extracción fenol/cloroformo y precipitación con etanol
según el procedimiento convencional en la técnica.
En la amplificación por PCR, el ADN genómico
extraído se utilizó como ADN plantilla. Como parejas de cebadores,
los nucleótidos sintéticos de SEC ID Nos. 3 y 4 se utilizaron para
obtener fragmentos de ADN que contenían: fragmento del gen de HGF 2
(HGF-F2), SEC ID Nos: 3 y 5; HGF-F3,
SEC ID Nos: 6 y 7; HGF-F5, SEC ID Nos. 8 y 7;
HGF-F7, SEC ID Nos. 9 y 7; HGF-F8,
SEC ID Nos. 10 y 7; HGF-F6, respectivamente (Figura
1). La mezcla de la amplificación por PCR se preparó mezclando 1
\mul de ADN plantilla, 1 \mul de cada cebador (10 pmol/\mul),
10 \mul de dNTP (10 mM), 3,5 unidades de enzima Expand High
Fidelity (Gibco BRL, Estados Unidos) y 10 \mul de solución tampón
enzimática y se ajustó hasta un volumen final de 100 \mul con agua
destilada. Se llevaron a cabo 30 ciclos de la amplificación por
PCR, cada ciclo consistía en 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC y 30
s a 72ºC. Los cebadores utilizados en la presente invención y los
fragmentos de genes amplificados obtenidos a partir de los mismos
se muestran en la Tabla 1.
El HGF-F2 amplificado comprendía
la secuencia que variaba desde 392 hasta 2247 del prototipo de ADNc
de HGF humano (HGF-X1; compuesto de exones 1 a
4-intrón 4-exones
5-18) de la SEC Id No: 2; HGF-F3, la
secuencia que variaba desde 392 hasta 727; HGF-F5,
la secuencia que variaba desde 2229 hasta 5471;
HGF-F6, la secuencia que variaba desde 5117 hasta
5471; HGF-F7, la secuencia que variaba desde 3167
hasta 5471; y HGF-F8, la secuencia que variaba
desde 4167 hasta 5471.
Los fragmentos del gen de HGF amplificados se
insertaron cada uno en un sitio de clonación múltiple del vector
pGEM-T Easy (Promega, WI, Estados Unidos) para
obtener pGEM-T
easy-HGF-F2, pGEM-T
easy-HGF-F3, pGEM-T
easy-HGF-F5, pGEM-T
easy-HGF-F6, pGEM-T
easy-HGF-F7 y pGEM-T
easy-HGF-F8, respectivamente (figura
2). Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos del gen de HGF
amplificados se confirmaron mediante el análisis de secuencia.
En la amplificación por PCR, se utilizó el ADNc
de placenta humana (Clontech, CA, Estados Unidos) como ADN
plantilla en las mismas condiciones que las descritas para el
ejemplo 1. Como parejas de cebadores, se utilizaron los
oligonucleótidos sintéticos de SEC ID Nos. 11 y 12, y las SEC ID
Nos. 13 y 14 para obtener fragmentos de ADN que contenían
HGF-F1 y HGF-F4, respectivamente.
Además, los fragmentos de ADN que contenían ADNcs del gen de HGF
(cHGF) y el gen de HGF eliminado (dHGF) se amplificaron mediante PCR
utilizando oligonucleótidos sintéticos de SEC ID Nos: 15 y 16 como
pareja de cebadores, respectivamente. dHGF es un gen de HGF con una
deleción de 5 secuencias de bases.
Los cebadores utilizados en la presente
invención y los fragmentos de gen amplificados obtenidos de los
mismos se muestran en la Tabla 2
Los HGF-F1 y
HGF-F4 amplificados comprendían las secuencias de
nucleótidos que variaban desde 1 a 402 y desde 6533 hasta 7113 de
la SEC ID No. 2 del prototipo de ADNc de HGF humano,
respectivamente. El ADNc del gen de HGF comprendía la secuencia de
nucleótidos que variaba desde 1 hasta 2184 de la SEC ID No. 1 del
gen de HGF humano, y el ADNc del gen de dHGF tenía la misma
secuencia que el ADNc del gen de HGF a excepción de la deleción de
la secuencia que variaba desde 483 hasta 495.
Los fragmentos amplificados del gen de HGF se
insertaron cada uno en el sitio de clonación múltiple del vector
pGEM-T Easy (Promega, WI, Estados Unidos) para
obtener pGEM-T
easy-HGF-F1, pGEM-T
easy-HGF-F4, pGEM-T
easy-cHGF y pGEM-T
easy-dHGF, respectivamente (figura 3). Las
secuencias de nucleótidos de los fragmentos del gen de HGF, ADNc
del gen HGF y ADNc del gen de dHGF se confirmaron mediante el
análisis de secuencia.
Las construcciones de genes de HGF híbridos de
ADN genómico y ADNc se prepararon mediante la combinación de los
fragmentos del gen de HGF clonados en las etapas (1) y (2) tal como
se indica a continuación (figuras 4A y 4B).
El plásmido
pGEM-T-easy-HGF-F1
se trató con HindIII/BamHI para obtener
HGF-F1. El plásmido pCK (ver la Publicación
Internacional de PCT NO: WO/0040737) se trató con
HindIII/BamHI, y HGF-F1 se insertó en
el mismo para obtener pCK-F1. A continuación, los
plásmidos
pGEM-T-easy-HGF-F2
y
pGEM-T-easy-HGF-F3
se trataron con MluI/BamHI para obtener
HGF-F2 y HGF-F3, respectivamente.
pCK-1 se trató con MluI/BamHI, y a
continuación HGF-F2 y HGF-F3 se
insertaron en el mismo para obtener pCK-F12M y
pCKF13M. El sitio de restricción MluI de los vectores
pCK-F12M y pCK-F13M se sustituyó por
un sitio de restricción HgaI mediante la utilización de un
kit de mutagénesis dirigida de sitio (Stratagene, CA, Estados
Unidos) para obtener pCK-F12 y
pCK-F13, respectivamente.
Además, el plásmido
pGEM-T-easy-HGF-F4
se trató con BamHI/XbaI para obtener
HGF-F4. pCK-F12 y
pCK-F13 se trataron con BamHI/XbaI, y
la HGF-F4 se insertó en los mismos para obtener
pCK-F124 y pCK-F134,
respectivamente. A continuación, los plásmidos
pGEM-T-easy-HGF-F5,
pGEM-T-easy-HGF-F6,
pGEM-T-easy-HGF-F7
y pGEM-T-easy-HGFF8
se trataron con BamHI/XhoI para obtener
HGF-F5, HGF-F6,
HGF-F7 y HGF-F8, respectivamente.
pCK-F124 y pCKF-134 se trataron con
BamHI/XhoI, y a continuación HGF-F5,
HGF-F6, HGF-F7 y
HGF-F8 se insertaron en los mismos para obtener
pCK-F1254 y pCK-F1264,
pCK-F1274, pCK-F1284,
pCK-F1354, pCK-F1364,
pCK-F1374 y pCK-F1384,
respectivamente.
A continuación, pGEM-T
easy-cHGF se trató con XhoI para obtener un
fragmento de ADNc de gen de HGF (HGF-XhoI) de
aproximadamente 1100 pb. A continuación, HGF XhoI se insertó
en pCK-F1254, pCK-F1264,
pCK-F1274, pCK-F1284,
pCK-F1354, pCK-F1364,
pCK-F1374 y pCK-F1384 para obtener
pCK-HGF-X1,
pCK-HGF-X2,
pCK-HGF-X3,
pCK-HGF-X4,
pCK-HGF-X5,
pCK-HGF-X6,
pCK-HGF-X7 y
pCK-HGF-X8, respectivamente. Por
otro lado, pGEM-T easy-cHGF y
pGEM-T easy-dHGF se trataron con
BamHI para obtener ADNc del gen de HGF y el ADNc del gen de
dHGF. A continuación, se insertaron el ADNc del gen HGF y el ADNc
del gen de dHGF en el sitio de restricción BamHI de pCK para
obtener pCK-cHGF y pCK-dHGF,
respectivamente (Figura 5).
El plásmido pCDNA3.1 (Invitrogen, Estados
Unidos) se digirió con NdeI, se trató con el fragmento
Klenow fragmento para construir extremos romos, y a continuación se
digirió con NheI para obtener un fragmento de ADN que
contenía el promotor de citomegalovirus humano. Los plásmidos
pCK-HGF-X1,
pCK-HGF-X2,
pCK-HGF-X3,
pCK-HGF-X4,
pCK-HGF-X5,
pCK-HGF-X6,
pCK-HGF-X7 y
pCK-HGF-X8 se digirieron con
SnaBI, se trataron con el fragmento Klenow para fabricar
extremos romos y se digirieron con NheI, y a continuación el
fragmento de ADN anterior que contenía el promotor de
citomegalovirus humano se insertó en los mismos para obtener
pCP-HGF-X1,
pCP-HGF-X2,
pCP-HGF-X3,
pCP-HGF-X4,
pCP-HGF-X5,
pCP-HGF-X6,
pCP-HGF-X7 y
pCP-HGF-X8, respectivamente (Figura
6).
El plásmido pCDNA3.1 (Invitrogen, Estados
Unidos) se digirió con NheI, se trató con el fragmento
Klenow fragmento para construir extremos romos y se digirió con
NdeI para obtener el fragmento de ADN que contenía el
promotor de citomegalovirus humano. PCK-cHGF y
pCK-dHGF se digirieron con MluI, se trataron
con el fragmento Klenow fragmento para construir extremos romos y se
digirieron con NdeI y a continuación, el fragmento de ADN
anterior que contenía el promotor de citomegalovirus humano se
insertó en los mismos para obtener pCP-cHGF y
pCP-dHGF, respectivamente.
Se realizaron estudios para examinar si las
construcciones de genes de HGF híbridos (HGF-X1 a
HGF-X8) obtenidas en el Ejemplo 1 pueden expresar
simultáneamente HGF y dHGF y si existe alguna diferencia en el nivel
de expresión génica entre las construcciones de genes de HGF
híbridos y el ADNc de HGF.
En primer lugar, se transfectaron 5 \mug de
pCP-HGF-X2,
pCP-HGF-X3,
pCP-HGF-X6,
pCP-HGF-X7 y
pCP-HGF-X8 en 5 x 10^{6} células
de células 293 (ATCC CRL 1573) junto con 0,5 \mug de ADN de
DONAI-LacZ (TAKARA SHUZO, Japón) utilizando FuGENE6
(Gibco BRL, MD, Estados Unidos), según las instrucciones del
fabricante. En este momento, se utilizaron controles 5 \mug de
pCP-cHGF y pCP-dHGF, y se utilizó
ADN de DONAI-LacZ para calibrar la eficacia de la
infección. 3 horas después de la transfección, las células se
realimentaron con medio nuevo y se cultivaron adicionalmente
durante 48 horas. La solución de cultivo obtenida de esta manera se
dividió en dos partes. Una parte de la solución de cultivo de
células 293 se sometió a una extracción de ARN y la otra, a la
medición de la actividad de LacZ. La actividad de LacZ se midió
utilizando un kit de medición de la actividad (Stratagene, Ca,
Estados Unidos) según las instrucciones del fabricante.
Con el fin de comparar los niveles de expresión
de los genes, se midió la cantidad de HGF en el cultivo celular
mediante un kit de ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA,
R&D System, MN, Estados Unidos). Después de calibrar la
eficacia de la infección mediante la actividad de LacZ medida, el
nivel de expresión del gen de HGF-X se halló que
era de 20 a 150 veces más elevada que el ADNc de HGF y el ADNc de
dHGF (figura 8). HGF-X7, en particular, mostró el
nivel de expresión de genes más elevado.
Con el fin de examinar la coexpresión de HGF y
dHGF a partir de construcciones de genes de HGF híbridos, se
extrajo el ARN celular total de las células 293 transfectadas
utilizando el método de Trizol (Trizol; Gibco BRL, Estados Unidos)
y se sometió a RT-PCR para obtener ADNc. A
continuación, utilizando el ADNc como ADN plantilla, se llevó a
cabo la amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos sintéticos
de SEC ID NOs: 17 y 18 como pareja de cebadores. La mezcla de la
amplificación por PCR se preparó mezclando 1 \mul de ADN
plantilla, 1 \mul de cada cebador (10 pmol/\mul), 10 \mul de
dNTP (10 mM), 3,5 unidades de Taq polimerasa (TAKARA SHUZO, Japón)
y 10 \mul solución de tampón enzimático y se ajustó hasta un
volumen final de 100 \mul con agua destilada. Se realizaron 30
ciclos de amplificación por PCR, cada ciclo consistía en 1 min a
94ºC, 1 min a 55ºC, y 90 s a 72ºC.
Los productos de PCR amplificados
correspondieron a las regiones limítrofes entre los exones 4 y 5
del gen de HGF; el ADNc del gen de HFG de 142 pb y el ADNc del gen
de dHGF de 127 pb, respectivamente. Sin "splicing", se
amplificó el producto de PCR de al menos 1 kb de longitud; y si
tenía lugar "splicing" alternativo, el ADNc del gen de HGF de
142 pb y el ADNc del gen de dHGF de 127 pb se sintetizaron
simultáneamente y se amplificaron. Los productos de PCR
amplificados se diferenciaron mediante electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 12%.
Tal como se muestra en la figura 9, mientras que
las bandas de 142 pb y 127 pb se detectaron en los carriles que
cargaban ADNc del gen de HGF y ADNc del gen de dHGF,
respectivamente, ambas bandas de 142 pb y 127 pb se detectaron en
los carriles que cargaban HGF-X. Los resultados
anteriores sugieren que HGF y dHGF se expresan simultáneamente a
partir de las construcciones de genes de HGF-X
híbridos de la presente invención.
Se inyectaron 100 \mug de cada uno de
pCP-HGF-X7, pCP-cHGF
y pCP-dHGF en el músculo tibial anterior de la pata
trasera de ratones con una jeringa de insulina. Después de 5 días,
los ratones se sacrificaron y los músculos alrededor del punto de
inyección se extrajeron y se despedazaron en un tampón de extracción
de proteínas (25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl,
desoxicolato de Na al 0,5%, NP-40 al 2%, SDS al
0,2%) para separara las proteínas totales. La cantidad de proteínas
totales se midió con un kit de análisis de proteínas DC
(Bio-Rad Laboratories, CA, Estados Unidos) y la
cantidad de HGF expresado se determinó con un kit de ELISA (R&D
System) según las instrucciones del fabricante.
Tal y como se puede observar a partir del
resultado mostrado en la figura 10, la cantidad de HGF expresado a
partir de HGF-X7 es 250 veces superior a la cantidad
a partir de ADNc del gen de HGF o ADNc del gen de dHGF.
Junto con el resultado del experimento del
Ejemplo 2 (in vivo), este resultado demuestra que la
eficacia de la expresión del gen de HGF-X es muy
superior a la del ADNc del gen de HGF o ADNc del gen de dHGF.
Con el fin de examinar si el gen de
HGF-X7 es eficaz en el tratamiento de la enfermedad
isquémica de patas traseras, se llevó a cabo terapia génica en un
modelo de pata trasera isquémica de conejo tal y como se indica a
continuación.
Se preparó un modelo de pata trasera isquémica
de conejo, que es un modelo de animal estándar para la enfermedad
isquémica de patas, mediante el método descrito por Takeshita et
al., Journal of Clinical Investigation, 93: 662 (1994). El día
antes de la operación (día 0), cada uno de los 30 conejos blancos de
Nueva Zelanda (machos, de 3,8 a 4,2 kg) se les inyectó
intramuscularmente 5 mg/kg de xilacina y, a continuación, se
anestesiaron mediante una inyección intramuscular de 50 mg/kg de
quetamina. Posteriormente, se hizo una incisión en la región
femoral izquierda del conejo y todas las ramificaciones de la
arteria femoral se separaron y se unieron. Se hizo una incisión en
la región de la parte proximal al punto de ramificación de las
arterias safena y poplítea para preparar el modelo. Después de la
operación, se inyectaron intramuscularmente 15 mg/kg/día de
cefazolina durante 5 días y 0,3 mg/día de morfina, durante 10 días.
10 días después de la operación (día 10), se llevó a cabo una
angiografía para la pata trasera izquierda donde se indujo la
isquemia, y el grado de arteriogénesis se registró como nivel basal.
Los conejos se dividieron al azar en dos grupos y se inyectaron en
cuatro sitios en el músculo femoral con 500 \mug de plásmido
pCP-HGF-X7 (grupo experimental) o
500 \mug de plásmido pCP (control), respectivamente. 40 días
después de la operación (día 40), se llevó a cabo otra angiografía
para la pata trasera izquierda y se determinó y se comparó el grado
de arteriogénesis a nivel de arteriola con el del día 10.
Tal y como se puede observar del resultado en la
figura 11, el grado de angiogénesis fue significativamente superior
en el grupo experimental administrado con
pCP-HGF-X7 en comparación con el
grupo de control administrado con pCP.
Este resultado demuestra que el gen de
HGF-X7 se puede utilizar de manera eficaz en la
terapia génica de una enfermedad isquémica.
Aunque la invención se ha descrito con respecto
a las realizaciones específicas anteriores, debería entenderse que
los expertos en la materia pueden realizar varias modificaciones y
cambios en la invención que también están dentro del alcance de la
presente invención tal y como se define en las reivindicaciones
adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se
pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes
declina cualquier responsabilidad al respecto.
\bullet WO 0040737 A [0034]
\bullet EP 03744561 A [0054]
\bullet KR 0300548 W [0054]
\bullet KR 1020020015074 [0054]
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<110> VIROMED LIMITED
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GEN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO
HEPATOCITARIO HÍBRIDO QUE TIENE UNA EFICACIA DE EXPRESIÓN ELEVADA Y
EXPRESA DOS HETEROTIPOS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO HEPATOCITARIO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCA30320/VML
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2187
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Factor de crecimiento
hepatocitario
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Factor de crecimiento hepatocitario
híbrido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> cebador gHGF3
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaggacg cgtctacaag ggaacagtat ctat
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador gHGF4
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipactggatcct ctcggccata aacatct
\hfill27
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador gHGF 10
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagcttagc accatgtggg tgaccaaact cctg
\hfill34
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador gHGF5
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggccgagag gatccagtat attaata
\hfill27
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<210> 7
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador gHGF7
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccctcgagg atttcgacag tagtttt
\hfill27
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> cebador gHGF12
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatccctt cctttctacc tgtatttg
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador gHGF 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatcctgg gtaaacacat ttgaa
\hfill25
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador gHGF6
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatcctta tgtttcagac aacttcga
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador gHGF1
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagcttgcc accatgtggg tgaccaaact cctg v
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador gHGF2
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatccaga acgcgtcctt taccgatgat gcag
\hfill34
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador gHGF8
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatccctt ctcgagactt gaaagattat gaagc
\hfill35
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<210> 14
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador gHGF9
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipgtctagagcg gccgctatga ctgtggtacc tt
\hfill32
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<210> 15
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador cHGF5
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<210> 16
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador cHGF3
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcta gattacttca gctatgactg tggtac
\hfill36
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<210> 17
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador GHGF5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaatgtcag ccctggagtt ccatga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador GHGF3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggattgct tgtgaaacag ggt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen de HGF-X6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen de HGF-X7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen de HGF-X8
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> VIROMED CO., Ltd
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> GEN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO
HEPATOCITARIO HÍBRIDO QUE TIENE UNA EFICACIA DE EXPRESIÓN ELEVADA DE
DOS HETEROTIPOS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO HEPATOCITARIO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SJFC/FP6253967
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 03744561.6
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<141>
2003-03-20
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/KR03/00548
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<151>
2003-03-20
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR
10-2002-0015074
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<151>
2002-03-20
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<160> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.71
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<210> 1
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<211> 2187
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Factor de Crecimiento
Hepatocitario
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 7112
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: factor de crecimiento hepatocitario
híbrido"
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<221> fuente
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secuencia artificial: cebador gHGF3"
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\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaggacg cgtctacaag ggaacagtat ctat
\hfill34
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<210> 4
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF4"
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\hskip-.1em\dddseqskipactggatcct ctcggccata aacatct
\hfill27
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF10"
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagcttagc accatgtggg tgaccaaact cctg
\hfill34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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secuencia artificial: cebador gHGF5"
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\hfill27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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secuencia artificial: cebador gHGF7"
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\hskip-.1em\dddseqskipcccctcgagg atttcgacag tagtttt
\hfill27
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<210> 8
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF12"
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatccctt cctttctacc tgtatttg
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<210> 9
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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secuencia artificial: cebador gHGF13"
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatcctgg gtaaacacat ttgaa
\hfill25
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<210> 10
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF6"
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\hfill28
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<210> 11
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<211> 34
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF1"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagcttgcc accatgtggg tgaccaaact cctg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatccaga acgcgtcctt taccgatgat gcag
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF8"
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgggatccctt ctcgagactt gaaagattat gaagc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador gHGF9"
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctagagcg gccgctatga ctgtggtacc tt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador cHGF5"
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipggatccacgc gtagcagcac catgtgggtg accaaa
\hfill36
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador cHGF3"
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcta gattacttca gctatgactg tggtac
\hfill36
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador GHGF5'"
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipcaaatgtcag ccctggagtt ccatga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: cebador GHGF3'"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggattgct tgtgaaacag ggt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: gen de HGF-X6"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3679
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: gen de HGF-X7"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: gen de HGF-X8"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Gen del Factor de Crecimiento Hepatocitario
(HGF) híbrido que comprende los exones 1-18 de HGF,
o formas degeneradas de los mismos que no alteran la secuencia de
aminoácidos codificada, y que comprende además un intrón inherente
entre los exones 4 y 5, donde el gen de HGF híbrido comprende una
secuencia de nucleótidos idéntica en no menos de un 80% con la SEC
ID No: 2.
2. Gen del HGF híbrido según la reivindicación
1, en el que dicho intrón es un fragmento de un intrón
inherente.
3. Gen del HGF híbrido según la reivindicación
1, en el que dicha secuencia de nucleótidos es idéntica en no menos
de un 90% con la SEC ID No: 2.
4. Gen del HGF híbrido según la reivindicación
1, en el que dicha secuencia de nucleótidos es idéntica en no menos
de un 95% con la SEC ID No: 2.
5. Gen del HGF híbrido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho gen del HGF híbrido
comprende la SEC ID No: 2.
6. Gen del HGF híbrido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho gen del HGF híbrido
comprende la SEC ID No: 19, o la SEC ID No: 20 o la SEC ID No:
21.
7. Vector que comprende el gen del HGF híbrido
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Vector según la reivindicación 7, en el que
dicho vector comprende además una o más secuencias para regular la
expresión génica, una secuencia de autorreplicación o una señal
secretora.
9. Célula huésped que contiene el vector según
la reivindicación 7 o la reivindicación 8.
10. Célula huésped según la reivindicación 9, en
la que dicha célula es una célula de levadura o una célula de E.
coli.
11. Célula huésped según la reivindicación 10,
en la que dicha célula es una célula Top 10F'
pCK-HGF-X7 de E. coli
(Depósito No. KCCM-10361) o Top 10F'
pGP-HGF-X7 de E. coli
(Depósito No. KCCM-10362).
12. Composición farmacéutica que comprende el
gen del HGF híbrido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
y un portador.
13. Gen del HGF híbrido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 para su uso en terapia.
14. Utilización de un gen del HGF híbrido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un
medicamento para prevenir o tratar enfermedades isquémicas o del
hígado.
15. Utilización según la reivindicación 14, en
la que dicho gen del HGF híbrido está en un vector.
16. Utilización según la reivindicación 14, en
la que el gen del HGF híbrido se formula en una composición
farmacéutica adecuada para la inyección directa.
17. Procedimiento para producir una proteína de
HGF híbrido que comprende el cultivo de la célula huésped según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en un medio adecuado y la
recogida de la proteína de HGF híbrido.
Applications Claiming Priority (2)
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