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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein hochgradig wirksames Hybrid-Hepatozyten-Wachstumsfaktor-(HGF-)Gen,
das gleichzeitig zwei Heterotypen von HGF exprimiert.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Hybrid-HGF-Gen, das durch Insertieren
eines inhärenten
oder fremden Introns zwischen die Exons 4 und 5 in HGF-cDNA hergestellt
wird, das eine höhere
Expressionswirksamkeit als HGF-cDNA aufweist und gleichzeitig zwei
Heterotypen von HGF und dHGF (deletierte HGF-Variante) exprimiert.
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HGF
ist ein heparinbindendes Glykoprotein, das als Streufaktor bezeichnet
wird. Ein Gen, das für
HGF kodiert, befindet sich bei Chromosom 721.1 und umfasst 18 Exons
und 17 Introns und weist die Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1
auf (T. Seki et al., Gene 102, 213–219 (1991)). Ein Transkript
von etwa 6 kb wird aus dem HGF-Gen transkribiert, und anschließend wird
ein Polypeptid-HGF-Vorläufer,
der aus 728 Aminosäuren besteht,
daraus synthetisiert. Gleichzeitig wird ein Polypeptid des dHGF-Vorläufers, das
aus 723 Aminosäuren besteht,
ebenfalls durch alternatives Spleißen des HGF-Gens synthetisiert.
Die biologisch inaktiven Vorläufer können durch
Protease in Serum zu aktiven Formen von disulfidgebundenem Heterodimer
umgewandelt werden. In den Heterodimeren bildet die α-Kette mit
einem hohen Molekulargewicht vier Kringel-Domänen und eine N-terminale Haarnadel-Schleife
wie eine voraktivierte Peptidregion von Plasminogen. Die Kringel-Domänen einer
dreifachen disulfidgebundenen Schleifenstruktur, die aus etwa 80
Aminosäuren
besteht, können
eine wichtige Rolle in der Protein-Protein-Wechselwirkung spielen.
Die β-Kette
mit niedrigem Molekulargewicht bildet eine inaktive Serin-Protease-artige
Domäne.
dHGF, der aus 723 Aminosäuren
besteht, ist ein Polypeptid mit Deletion von fünf Aminosäuren in der 1. Kringel-Domäne der α-Kette, d.
h. F, L, P, S und S.
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Es
wurde vor kurzem berichtet, dass sowohl HGF als auch dHGF mehrere
biologische Funktionen aufweisen, z. B. das Fördern des Wachstums und der
Morphogenese von Epithelzellen, Melanozyten und Endothelzellen.
Sie unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der immunologischen oder
biologischen Eigenschaften.
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HGF
zeigt z. B. etwa 20fach, 10fach und 2fach höhere Aktivitäten als
dHGF bezüglich
der Förderung der
DNA-Synthese in menschlichen venösen
Nabelschnur-Endothelzellen, arteriellen Glattmuskelzellen bzw. NSF-60
(murinen Myeloblastenzellen). dHGF zeigt etwa 3fach und 2fach höhere Aktivitäten als
HGF bezüglich der
Förderung
der DNA-Synthese von LLC-PK1-(Schweinenieren-Epithelzellen) und
OK-(Nierenepithelzellen des Amerikanischen Opossums) bzw. interstitiellen
Maus-Zellen. HGF besitzt eine 70fach höhere Löslichkeit in PBS als dHGF.
Mehrere monoklonale Anti-dHGF-Antikörper erkennen nur dHGF, jedoch
nicht HGF oder eine reduzierte Form von dHGF, was unterschiedliche
Strukturen von HGF und dHGF impliziert. Dementsprechend zeigt die
gleichzeitige Synthese von HGF und dHGF in vivo, dass diese biologisch
miteinander in Wechselwirkung stehen (N. Shima et al., Biochemical
and Biophysical Research Communications 200, 808–815 (1994)).
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HGF,
der aus vom Mesoderm abstammenden Zellen sekretiert wird, besitzt
verschiedene biologische Funktionen, z. B. 1) das Induzieren von
Endothelzellen in eine Röhrenstruktur;
2) das Stimulieren der Gefäßbildung
aus Endothelzellen in vitro und in vivo; 3) die Regeneration von
Leber und Nieren aufgrund seiner Anti-Apoptose-Aktivität; 4) die Organogenese von
Nieren, Eierstöcken
und Hoden; 5) die Steuerung der Osteogenese; 6) die Stimulierung
des Wachstums und der Differenzierung von erythroiden hämatopoetischen
Vorläuferzellen;
sowie 7) die Axon-Bildung von Neuronen (M. C. Stella und P. M. Comoglio,
The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31, 1357–1362 (1999)).
Basierend auf diesen verschiedenen Funktionen kann HGF oder ein
für HGF
kodierendes Gen als therapeutisches Mittel zur Behandlung von ischämischen
Erkrankungen oder Lebererkrankungen entwickelt werden. Tatsächlich kann
der HGF in vivo entweder als HGF oder als dHGF existieren, und daher
ist die Co-Expression von HGF und dHGF für die Maximierung der therapeutischen
Wirkung von Bedeutung. Dementsprechend haben die vorliegenden Erfinder danach
gestrebt, ein Hybrid-HGF-Gen, das gleichzeitig HGF und dHGF exprimieren
kann, mit hoher Wirksamkeit für
die Gentherapie zu entwickeln.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Dementsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung ein Hybrid-HGF-Gen, das gleichzeitig
zwei Heterotypen von HGF exprimiert, wie in den Ansprüchen dargelegt,
und insbesondere ein Hybrid-HGF-Gen mit einem inhärenten oder
fremden Intron, das zwischen die Exons 4 und 5 von HGF-cDNA insertiert
ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die das Hybrid-HGF-Gen
umfassen, sowie Wirtszellen, die mit dem oben genannten Vektor transformiert
sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Behandlung oder Prävention
von ischämischen
Erkrankungen oder Lebererkrankungen bereit, die das Hybrid-HGF-Gen
umfasst.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Die
oben genannten sowie die anderen Ziele und Merkmale der vorliegenden
Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich,
wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gesehen werden,
die jeweils Folgendes zeigen:
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1:
ein schematisches Diagramm des HGF-X-Prototyps zeigt die Positionen
der Gen-Fragmente,
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2:
ein Verfahren zum Klonieren von Gen-Fragmenten aus genomischer HepG2-DNA,
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3:
ein Verfahren zum Klonieren von Gen-Fragmenten aus menschlicher
Plazenta-cDNA,
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4A und 4B:
Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren pCK-HGF-X,
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5:
ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren pCK-cHGF und
pCK-dHGF,
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6:
ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren der pCP-HGF-X-Familie,
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7:
ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren pCP-cHGF und
pCP-HGF,
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8:
Gen-Expressionsspiegel von pCP-cHGF, pCP-dHGF und pCP-HGF-X,
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9:
Gen-Expressionsmuster von pCP-cHGF, pCP-dHGF und pCP-HGF-X, mittels
Elektrophorese auf 12-%-Polyacrylamidgel beobachtet,
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10:
Gen-Expressionsspiegel von pCP-cHGF, pCP-dHGF und pCP-HGF-X7 in
vivo,
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11:
zerebrale Angiogenese bei zwei Gruppen von Kaninchen, die einer
Verabreichung von pCP bzw. pCP-HGF-X7 unterzogen wurden.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Das
Hybrid-Hepatozyten-Wachstumsfaktor-(HGF-)Gen der vorliegenden Erfindung
umfasst cDNA, die den Exons 1 bis 18 entspricht, sowie ein inhärentes oder
fremdes Intron, das zwischen die Exons 4 und 5 der cDNA insertiert
ist. Das Intron umfasst ein Fragment der inhärenten Intron- oder einer rekombinanten
Sequenz.
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Eine
Ausführungsform
des Hybrid-HGF-Gens der vorliegenden Erfindung, umfassend das inhärente Intron,
ist 7112 bp lang und besitzt die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr.
2. Das Hybrid-HGF-Gen exprimiert gleichzeitig sowohl HGF als auch
dHGF und besitzt eine höhere
Expressionswirksamkeit als HGF-cDNA.
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Die
Codon-Degeneration ermöglicht
eine Modifikation oder eine Veränderung
in der kodierenden und/oder nicht kodierenden Region des Hybrid-HGF-Gens
der vorliegenden Erfindung ohne Veränderung der Aminosäuresequenz
des Proteins und der Expression des Gens. Dementsprechend fallen
Polynucleotide, die im Wesentlichen identisch mit dem Hybrid-HGF-Gen
aus Seq.-ID Nr. 2 sind, sowie die Fragmente davon in den Umfang
der Erfindung. „Im
Wesentlichen identisch" bedeutet,
dass die Sequenzhomologie nicht geringer als 80%, vorzugsweise nicht
geringer als 90% und insbesondere nicht geringer als 95% ist.
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Ein
Hybrid-HGF-Gen kann ein Fragment eines inhärenten Introns umfassen, das
gegebenenfalls eine kleine rekombinante Sequenz umfasst, die darin
zwischen die Exons 4 und 5 von HGF-cDNA insertiert ist. Hierin wird
solch ein Hybrid-HGF-Gen, das ein Fragment eines inhärenten Introns
umfasst, „HGF-X" genannt. HGFX-6,
HGF-X7 bzw. HGF-X8 mit der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 19 bis
21 werden bevorzugt.
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Das
Hybrid-HGF-Gen der vorliegenden Erfindung wird gemäß den bekannten
Verfahren der Gentechnologie synthetisiert und in einen Expressionsvektor
insertiert. Anschließend
kann der Vektor in geeignete Wirtszellen, wie z. B. E. coli und
Hefe, eingeführt
werden. Escherichia-coli-Top10F' kann
z. B. mit HGF-X7-Gen der vorliegenden Erfindung transfiziert werden.
Die so erhaltenen Escherichia-coli-Top10F'-pCK-HGFX7
und Escherichia-coli-Top10F'-pCP-HGFX7
wurden am 12. März
2002 unter den Zugriffsnummern KCCM-10361 bzw. KCCM-10362 hinterlegt.
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Durch
die Verwendung der transformierten Zellen können das Gen der vorliegenden
Erfindung und das dadurch kodierte Protein in großem Maßstab produziert
werden.
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Der
Vektor der vorliegenden Erfindung kann selektiv (eine) Sequenz(en)
zur Regulierung der Genexpression, wie z. B. einen Promotor oder
Terminator, eine Selbstrepli kationssequenz und ein Sekretionssignal umfassen,
je nach Abhängigkeit
von den Wirtszellen.
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Weiters
umfasst die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung
für Behandlung oder
Prävention
von ischämischen
Erkrankungen oder Lebererkrankungen, die das Hybrid-HGF-Gen oder
den Vektor, der das Gen umfasst, als Wirkstoff umfasst. Die Zusammensetzung
wird vorzugsweise zur Injektion formuliert.
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Die
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann weiters pharmazeutisch
annehmbare Träger umfassen.
Es können
beliebige der herkömmlichen
Verfahren auf dem Gebiet der Pharmazeutik verwendet werden, um orale
Formulierungen, wie z. B. Tabletten, Kapseln, Pillen, Granulat,
Suspensionen und Lösungen; Injektionsformulierungen,
wie z. B. Lösungen,
Suspensionen oder getrocknete Pulver, die vor der Injektion mit destilliertem
Wasser gemischt werden können;
lokal anwendbare Formulierungen, wie z. B. Salben, Cremen und Lotionen;
sowie andere Formulierungen herzustellen.
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Auf
dem Gebiet der Pharmazeutik allgemein verwendete Träger können in
der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Oral verabreichte Formulierungen können z. B. Bindemittel, Emulgatoren,
Aufschlussmittel, Exzipienten, lösende
Mittel, Dispersionsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsmittel, Farbstoffe
oder Gewürze
umfassen. Injektionsformulierungen können Konservierungsstoffe,
antagonisierende Mittel, lösende
Mittel oder Stabilisatoren umfassen. Das Präparat zur lokalen Verabreichung
kann Basen, Exzipienten, Gleitmittel oder Konservierungsstoffe umfassen.
Es kann in der vorliegenden Erfindung jede der geeigneten Formulierungen
verwendet werden, die nach dem Stand der Technik bekannt ist (Remington's Pharmaceutical
Science [die neue Auflage], Mack Publishing Company, Eaton, PA).
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Die
Zusammensetzung der Erfindung kann als verschiedene orale und parenterale
Formulierungen klinisch verabreicht werden. Eine geeignete Formulierung
kann unter Verwendung solcher Exzipienten, wie z. B. Additive, Verstärker, Bindemittel,
Netzmit tel, Aufschlussmittel und Tenside, oder Verdünnungsmittel
hergestellt werden. Feste Formulierungen zur oralen Verabreichung
umfassen Pillen, Tabletten, Puder, Granulat und Kapseln. Diese festen
Formulierungen können
durch Mischen eines oder mehrerer Exzipienten, wie z. B. Stärke, Calciumcarbonat,
Saccharose, Lactose und Gelatine, mit Dibenzylbuthyllacton-Lignan-Derivaten
hergestellt werden. Es können
ebenfalls Gleitmittel, wie z. B. Magnesiumstearat und Talk, in die
vorliegende Formulierung inkludiert werden. Flüssige Formulierungen zur oralen
Verabreichung umfassen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen und Sirup.
Diese Formulierungen können
Netzmittel, Süßstoffe,
Gewürzstoffe
und Konservierungsstoffe zusätzlich
zu allgemeinen einfachen Verdünnungsmitteln,
wie z. B. Wasser und flüssigem
Paraffin, enthalten. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung
umfassen sterilisierte wässrige
Lösungen, Suspensionen,
Emulsionen, gefriergetrocknete Alternativbehandlungen und Suppositorien.
Wasserunlösliche Exzipienten
und Suspensionsmittel umfassen Pflanzenfette, wie z. B. Propylenglykol,
Polyethylenglykol und Olivenöl,
sowie injizierbare Ester, wie z. B. Ethyloleat. Witepsol®,
Macrogol®,
Tween® 61,
Kakaofette, Laurinfette und Glycerogelatine können als Basis für Suppositorien
verwendet werden.
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Die
Zusammensetzung der Erfindung kann oral oder auf parenteralem Wege
verabreicht werden, und zwar als intravenöse, intramuskuläre, subkutane,
intraabdominale, sternale und arterielle Injektion oder Infusion,
oder topisch durch rektale Verabreichung, intranasale Verabreichung,
durch Inhalation oder durch intraokulare Verabreichung.
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Es
ist anzumerken, dass die typische tägliche Dosis der Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung im Lichte verschiedener relevanter Faktoren
bestimmt werden sollte, welche die zu behandelnden Erkrankungen,
den gewählten
Verabreichungsweg, Alter, Geschlecht und Körpergewicht des einzelnen Patienten
sowie den Schweregrad des Symptoms des Patienten umfassen, sowie
dass diese in einer Einzeldosis oder in geteilten Dosen verabreicht
werden kann. Daher sollte die tägliche
Dosis nicht als eine Einschränkung des
Umfangs der Erfindung in irgendeiner Art und Weise angesehen werden.
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Die
folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und nicht
der Einschränkung
des Umfangs der Erfindung.
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Beispiel 1: Herstellung von Hybrid-Genkonstrukten,
die für
menschlichen HGF kodieren
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(1) Klonieren von HGF-Gen-Fragmenten,
die aus genomischer DNA erhalten wurden
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Menschliche
HepG2-Zellen (ATCC-Zugriffsnr.: HB-8065) wurden in TES-Puffer (10
mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; 0,7% SDS) suspendiert und mit 400 μg/ml Proteinkinase
K bei 50°C
1 Stunde lang behandelt. Anschließend wurde genomische DNA aus
der Zellsuspension mittels Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation
gemäß dem herkömmlichen
Verfahren, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, extrahiert.
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In
der PCR-Amplifikation wurde die extrahierte genomische DNA als Matrizen-DNA
verwendet. Als Primer-Paare wurden die synthetischen Nucleotide
der Seq.-ID Nr. 3 und 4 verwendet, um DNA-Fragmente zu erhalten,
die Folgendes enthielten: HGF-Gen-Fragment
2 (HGF-F2), Seq.-ID Nr. 3 und 5; HGF-F3, Seq.-ID Nr. 6 und 7; HGF-F5, Seq.-ID Nr. 8
und 7; HGF-F7, Seq.-ID Nr. 9 und 7; HGF-F8, Seq.-ID Nr. 10 und 7;
HGF-F6 (
1). Das PCR-Amplifikationsgemisch
wurde durch Mischen von 1 μl
Matrizen-DNA, 1 μl
eines jeden Primers (10 pmol/μl),
10 μl dNTP
(10 mM), 3,5 Einheiten Expand-High-Fidelity-Enzym (Gibco BRL, USA)
und 10 μl
Enzympuffer-Lösung hergestellt
und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 μl angepasst.
30 Zyklen der PCR-Amplifikation wurden durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus
1 Minute bei 94°C,
1 Minute bei 55°C
und 30 Sekunden bei 72°C
besteht. Die hierin verwendeten Primer und die amplifizierten Gen-Fragmente,
die daraus erhalten werden, sind in Tabelle 1 angeführt. Tabelle
1
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Der
amplifizierte HGF-F2 umfasst die Sequenz, die sich von 392 bis 2247
des menschlichen HGF-cDNA-Prototyps (HGF-X1; zusammengesetzt aus
den Exons 1 bis 4 – Intron
4 – Exons
5 bis 18) aus Seq.-ID Nr. 2 erstreckte; HGF-F3, wobei sich die Sequenz
von 392 bis 727 erstreckte; HGF-5, wobei sich die Sequenz von 2229
bis 5471 erstreckte; HGF-F6, wobei sich die Sequenz von 5117 bis
5471 erstreckte; HGF-F7, wobei sich die Sequenz von 3167 bis 5471
erstreckte; sowie HGF-F8, wobei sich die Sequenz von 4167 bis 5471
erstreckte.
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Die
amplifizierten HGF-Gen-Fragmente wurden jeweils in die mehrfache
Klonierungsstelle des pGEM-T-Leicht-Vektors insertiert (Promega,
WI, USA), um den pGEM-T-Leicht-HGF-F2, den pGEM-T-Leicht-HGF-F3,
den pGEM-T-Leicht-HGF-F5, den pGEM-T-Leicht-HGF-F6, den pGEM-T-Leicht-HGF-F7
bzw. den pGEM-T-Leicht-HGF-F8
zu erhalten (2). Die Nucleotidsequenzen der amplifizierten
HGF-Gen-Fragmente
wurden durch eine Sequenzanalyse bestätigt.
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(2) Klonieren von HGF-Gen-Fragmenten,
die aus cDNA erhalten wurden
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In
der PCR-Amplifikation wurde menschliche Plazenta-cDNA (Clontech,
CA, USA) als Matrizen-DNA unter derselben Bedingung verwendet, wie
in Beispiel 1 beschrieben. Als Primer-Paare wurden die synthetischen
Oligonucleotide aus Seq.-ID Nr. 11 und 12 sowie aus Seq.-ID Nr.
13 und 14 verwendet, um DNA-Fragmente zu erhalten, die HGF-F1 bzw.
HGF-F4 enthielten. Weiters wurden DNA-Fragmente, die cDNAs des HGF-Gens
(cHGF) sowie deletierten HGF-Gens (dHGF) enthielten, mittels PCR
unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide aus Seq.-ID Nr. 15
bzw. 16 amplifiziert. dHGF ist ein HGF-Gen mit einer Deletion von
5 Basensequenzen.
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Die
hierin verwendeten Primer und die amplifizierten Gen-Fragmente,
die daraus erhalten werden, sind in Tabelle 2 angeführt. Tabelle
2
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Der
amplifizierte HGF-F1 und HGF-F4 umfasste die Nucleotid-Sequenzen,
die sich von 1 bis 402 bzw. von 6533 bis 7113 aus Seq.-ID Nr. 2
des menschlichen HGF-cDNA-Prototyps
erstreckten. HGF-Gen-cDNA umfasste die Nucleotidsequenz, die sich
von 1 bis 2184 aus Seq.-ID Nr. 1 des menschlichen HGF-Gens erstreckte,
und dHGF-Gen-cDNA besitzt dieselbe Sequenz wie HGF-Gen-cDNA mit
Ausnahme der Deletion jener Sequenz, die sich von 483 bis 495 erstreckt.
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Die
amplifizierten HGF-Gen-Fragmente wurden jeweils in die mehrfache
Klonierungsstelle des pGEM-T-Leicht-Vektors (Promega, WI, USA) insertiert,
um den pGEM-T-Leicht-HGF-F1, den pGEM-T-Leicht-HGF-F4, den pGEM-T-Leicht-cHGF
bzw. den pGEM-T-Leicht-dHGF zu erhalten (3). Die Nucleotidsequenzen
der menschlichen HGF-Gen-Fragmente, HGF-Gen-cDNA und dHGF-Gen-cDNA
wurden durch Sequenzanalysen bestätigt.
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(3) Herstellung von Hybrid-HGF-Gen-Konstrukten
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Hybrid-HGF-Gen-Konstrukte
genomischer DNA sowie von cDNA wurden durch Kombination der Fragmente
des HGF-Gens, das in den Schritten (1) und (2) kloniert wurden,
folgendermaßen
herstellt (4A und 4B).
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Das
Plasmid pGEM-T-Leicht-HGF-F1 wurde mit HindIII/BamHI behandelt,
um HGF-F1 zu erhalten. Plasmid
pCK (siehe internationale PCT-Veröffentlichung mit der Nr.
WO/0040737 ) wurde mit HindIII/BamHI
behandelt, und HGF-F1 wurde darin insertiert, um pCK-F1 zu erhalten.
Anschließend
wurden das Plasmid pGEM-T-Leicht-HGF-F2
und das Plasmid pGEM-T-Leicht-HGF-F3 mit MluI/BamHI behandelt, um
HGF-F2 bzw. HGF-F3 zu erhalten. pCK-1 wurde mit MluI/BamHI behandelt,
und anschließend
wurden HGF-F2 und HGF-F3 darin insertiert, um pCK-F12M und pCKF13M
zu erhalten. Die MluI-Restriktionsstelle der Vektoren pCK-F12M und
pCK-F13M wurde mit
einer HgaI-Restriktionsstelle durch Verwendung eines Sets zur ortsspezifischen
Mutagenese (Stratagene, CA, USA) substituiert, um pCK-F12 bzw. pCK-F13
zu erhalten.
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Weiters
wurde das Plasmid pGEM-T-Leicht-HGF-F4 mit BamHI/XbaI behandelt,
um HGF-F4 zu erhalten. pCK-F12 und pCK-F13 wurden mit BamHI/XbaI
behandelt, und HGF-F4 wurde darin insertiert, um pCK-F124 bzw. pCK-F134
zu erhalten. Anschließend
wurden die Plasmide pGEM-T-Leicht-HGF-F5, pGEM-T-Leicht-HGF-F6,
pGEM-T-Leicht-HGF-F7 und pGEM-T-Leicht-HGF-F8 mit BamHI/XhoI behandelt,
um HGF-F5, HGF-F6, HGF-F7 bzw. HGF-F8 zu erhalten. pCK-F124 und
pCK-F134 wurden mit BamHI/XhoI behandelt, und anschließend wurden
HGF-F5, HGF-F6, HGF-F7
und HGF-F8 darin insertiert, um pCK-F1254 und pCK-F1264, pCK-F1274,
pCK-F1284, pCK-F1354,
pCK-F1364, pCK-F1374 bzw. pCK-F1384 zu erhalten.
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Anschließend wurde
pGEM-T-Leicht-cHGF mit XhoI behandelt, um ein cDNA-Fragment des HGF-Gens
(HGF-XhoI) von etwa 1100 bp zu erhalten. Anschließend wurde
HGF-XhoI in pCK-F1254, pCK-F1264, pCK-F1274, pCK-F1284, pCK-F1354,
pCK-F1364, pCK-F1374 und pCK-F1384 insertiert, um pCK-HGF-X1, pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3,
pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5, pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7 bzw. pCK-HGF-X8 zu erhalten.
Auf der anderen Seite wurden pGEM-T-Leicht-cHGF und pGEM-T-Leicht-dHGF
mit BamHI behandelt, um HGF-Gen-cDNA und dHGF-Gen-cDNA zu erhalten.
Anschließend
wurden HGF-Gen-cDNA und dHGF-Gen-cDNA in die BamHI-Restriktionsstelle
von pCK insertiert, um pCK-cHGF bzw. pCK-dHGF zu erhalten (5).
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(4) Herstellung eines Expressionsvektors,
enthaltend ein Hybrid-HGF-Gen-Konstrukt
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Plasmid
pCDNA3.1 (Invitrogen, USA) wurde mit NdeI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, um
stumpfe Enden zu erzeugen, und anschließend mit NheI verdaut, um ein
DNA-Fragment zu erhalten, das einen menschlichen Zytomegalie-Virus-Promotor enthält. Die
Plasmide pCK-HGF-X1, pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5,
pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7 und pCK-HGF-X8 wurden mit SnaBI verdaut,
mit dem Klenow-Fragment behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen,
und mit NheI verdaut, und das oben genannte DNA-Fragment, das den
menschlichen Zytomegalie-Virus-Promotor enthielt, wurde anschließend darin
insertiert, um pCP-HGF-X1, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X4, pCP-HGF-X5, pCP-HGF-X6,
pCP-HGF-X7 bzw. pCP-HGF-X8 zu erhalten.
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Plasmid
pCDNA3.1 (Invitrogen, USA) wurde mit NheI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, um
stumpfe Enden zu erzeugen, und anschließend mit NdeI verdaut, um das
DNA-Fragment zu erhalten, das einen menschlichen Zytomegalie-Virus-Promotor enthält. pCK-cHGF
und pCK-dHGF wurden mit MluI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt,
um stumpfe Enden zu erzeugen, und anschließend mit NdeI verdaut, und
das oben genannte DNA-Fragment, das den menschlichen Zytomegalie-Virus-Promotor
enthielt, wurde darin insertiert, um pCP-cHGF. bzw. pCP-dHGF zu erhalten
(7).
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Beispiel 2: Untersuchung der Expressionswirksamkeit
des Hybrid-HGF-Gen-Konstrukts und der Co-Expression von HGF/dHGF
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Es
wurden Studien durchgeführt,
um zu untersuchen, ob die in Beispiel 1 erhaltenen Hybrid-HGF-Gen-Konstrukte
(HGF-X1- bis HGF-X8) HGF und dHGF gleichzeitig exprimieren konnten
und ob es einen Unterschied im Ausmaß der Gen-Expression zwischen
Hybrid-HGF-Gen-Konstrukten und HGF-cDNA gab.
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(1) Gen-Expressionswirksamkeit
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Zuerst
wurden 5 μg
pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X6, pCP-HGF-X7 und pCP-HGF-X8 in
5 × 106 Zellen von 293-Zellen (ATCC CRL 1537) zusammen
mit 0,5 μg
DONAI-LacZ-DNA (TAKARA SHUZO, Japan) unter Verwendung von FuGENE6
(Gibco BRL, MD, USA) gemäß den Anweisungen
des Herstellers transfiziert. Zu dieser Zeit wurden jeweils 5 μg pCP-cHGF
und pCP-dHGF als Kontrollen verwendet, und DONAI-LacZ-DNA wurde
verwendet, um die Infektionswirksamkeit zu kalibrieren. 3 Stunden
nach der Transfektion wurden die Zellen erneut mit einem frischen
Medium gefüttert
und weitere 48 Stunden lang gezüchtet.
Die so erhaltene Kulturlösung
wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil der 293-Zellkultur-Lösung wurde
einer RNA-Extraktion
unterzogen, und der andere Teil wurde einer Messung der LacZ-Aktivität unterzogen.
Die LacZ-Aktivität
wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers unter Verwendung eines Sets zur Messung der Aktivität gemessen
(Stratagene, CA, USA).
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Um
das Ausmaß der
Gen-Expression zu vergleichen, wurde die Menge an HGF in der Zellkultur
mittels eines enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmungstest-Sets (ELISA, R & D System, MN,
USA) gemessen. Nach der Kalibrierung der Infektionswirksamkeit durch
die gemessene LacZ-Aktivität
wurde herausgefunden, dass die Menge der Expression des HGF-X-Gens
um das 20- bis 150fache höher
war als jene von HGF-cDNA und dHGF-cDNA (8). Insbesondere
HGF-X7 zeigte das höchste
Ausmaß der
Gen-Expression.
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(2) Co-Expression von HGF und dHGF
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Um
die Co-Expression von HGF und dHGF aus Hybrid-HGF-Gen-Konstrukten
zu untersuchen, wurden vollständige
zelluläre
RNAs aus den transfizierten 293-Zellen unter Verwendung des Trizol-Verfahrens
extrahiert (Trizol; Gibco BRL, USA) und einer RT-PCR unterzogen,
um cDNA zu erhalten. Anschließend
wurde die PCR-Amplifikation
unter Verwendung von cDNA als Matrizen-DNA durchgeführt, wobei
synthetische Oligonucleotide aus Seq.-ID Nr. 17 und 18 als Primer-Paar
verwendet wurden. Das PCR-Amplifikationsgemisch wurde durch Mischen
von 1 μl
Matrizen-DNA, 1 μl jedes Primers
(10 pmol/μl),
10 μl dNTP
(10 mM), 3,5 Einheiten Taq-Polymerase
(TAKARA SHUZO, Japan) und 10 μl
Enzympuffer-Lösung
hergestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von
100 μl angepasst.
Es wurden 30 Zyklen PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus
1 Minute bei 94°C,
1 Minute bei 55°C
und 90 Sekunden bei 72°C
bestand.
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Die
amplifizierten PCR-Produkte entsprachen der Grenzregion zwischen
den Exons 4 und 5 des HGF-Gens; HGF-Gen-cDNA mit 142 bp bzw. dHGF-Gen-cDNA
mit 127 bp. Ohne Spleißen
wurde das PCR-Produkt mit einer Länge von zumindest 1 kb amplifiziert;
und falls es zu alternativem Spleißen kam, wurden HGF-Gen-cDNA
mit 142 bp und dHGF-Gen-cDNA mit 127 bp gleichzeitig synthetisiert
und amplifiziert. Die amplifizierten PCR-Produkte waren mittels
Elektrophorese auf einem 12-%-Polyacrylamidgel
zu unterscheiden.
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Wie
in 9 dargestellt, wurden, während die Banden mit 142 bp
und 127 bp in den Spuren detektiert wurden, die mit HGF-Gen-cDNA
bzw. dHGF-Gen-cDNA beladen waren, beide Banden mit 142 bp und 127
bp in jenen Spuren detektiert, die mit HGF X beladen waren. Die
oben stehenden Resultate zeigen, dass HGF und dHGF gleichzeitig
aus Hybrid-HGF-X-Gen-Konstrukten der vorliegenden Erfindung exprimiert
werden.
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Beispiel 3: Vergleich der Expressionsausmaße von HGF-X7,
HGF-Gen-cDNA und dHGF-Gen-cDNA (in vivo)
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Jeweils
100 μg pCP-HGF-X7,
pCP-cHGF und pCP-dHGF wurden mit einer Insulinspritze in den vorderen
Tibiamuskel der Hinterextremität
von Mäusen
injiziert. Nach 5 Tagen wurden die Mäuse getötet, und die Muskeln um die
Injektionsstelle wurden entfernt und in einem Proteinextraktionspuffer
(25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,5% Na-Desoxycholat, 2% NP-40,
0,2% SDS) zerschmettert, um Gesamt-Proteine zu trennen. Die Menge der Gesamt-Proteine
wurde mit einem DC-Protein-Analyse-Set
(Bio-Rad Laborstories, CA, USA) gemessen, und die Menge an exprimiertem
HGF wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers mit einem ELISA-Set (R & D System) bestimmt.
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Wie
aus dem in 10 dargestellten Resultat hervorgeht,
ist die Menge an HGF, die aus HGF-X7 exprimiert wird, 250fach größer als
jene aus HGF-Gen-cDNA oder dHGF-Gen-cDNA.
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Zusammen
mit dem Resultat des Experiments aus Beispiel 2 (in vivo) zeigt
dieses Resultat, dass die Expressionswirksamkeit von HGF-X-Gen jener
von HGF-Gen-cDNA
oder dHGF-Gen-cDNA weit überlegen
ist.
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Beispiel 4: Gentherapie unter Verwendung
von HGF-X7 bei einem ischämischen
Kaninchen-Hinterextremitäten-Modell
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Um
zu bestimmen, ob HGF-X7-Gen in der Behandlung ischämischer
Erkrankungen der Hinterextremitäten
wirksam ist, wurde folgendermaßen
eine Gentherapie auf eifern ischämischen
Kaninchen-Hinterextremitäten-Modell
durchgeführt.
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Ein
ischämisches
Kaninchen-Hinterextremitäten-Modell,
bei dem es sich um ein Standard-Tiermodell für die ischämische Extremitätenerkrankung
handelt, wurde durch das von Takeshita et al., Journal of Clinical Investigation
93, 662 (1994), beschriebene Verfahren hergestellt. Am Tag vor der
Operation (Tag 0) erhielt jedes der 30 weißen Kaninchen aus Neuseeland
(männlich,
zwischen 3,8 und 4,2 kg) eine intramuskuläre Injektion mit 5 mg/kg Xylazin
und wurde anschließend
durch eine intramuskuläre
Injektion mit 50 mg/kg Ketamin anästhetisiert. Anschließend wurde
ein Einschnitt in der linken Oberschenkelregion des Kaninchens durchgeführt, und
alle Verzweigungen der Oberschenkelarterie wurden getrennt und abgebunden.
Die Region vom proximalen Abschnitt bis zum Verzweigungspunkt der
Saphenus- und der Poplitealarterien wurde eingeschnitten, um das
Modell herzustellen. Nach der Operation wurden 15 mg/kg/Tag Cefazolin
intramuskulär
5 Tage lang injiziert sowie auch 0,3 mg/Tag Morphin für eine Zeitspanne
von 10 Tagen. 10 Tage nach der Operation (Tag 10) wurde eine Angiographie
für die
linke Hinterextremität
durchgeführt,
wo die Ischämie
induziert wurde, und das Ausmaß der
Arteriogenese wurde als Basiswert aufgenommen. Die Kaninchen wurden
nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen geteilt und erhielten an
vier Stellen eine Injektion mit 500 μg des Plasmids pCP-HGF-X7 (experimentelle
Gruppe) bzw. 500 μg
des Plasmids pCP (Kontrolle) in den Oberschenkelmuskel. 40 Tage
nach der Operation (Tag 40) wurde erneut eine Angiographie für die linke
Hinterextremität
durchgeführt,
und das Ausmaß der
Arteriogenese auf der Arteriolenebene wurde bestimmt und mit jenem
von Tag 10 verglichen.
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Wie
aus dem Resultat in 11 hervorgeht, wurde das Ausmaß der Angiogenese
in der experimentellen Gruppe, die pCP-HGF-X7 erhielt, im Vergleich
zu der Kontrollgruppe, der pCP verabreicht wurde, signifikant verstärkt.
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Dieses
Resultat zeigt, dass HGF-X7-Gen wirksam in der Gentherapie einer
ischämischen
Erkrankung verwendet werden kann.
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Während die
Erfindung im Hinblick auf die oben stehend beschriebenen, spezifischen
Ausführungsformen
beschrieben wurde, sollte jedoch bedacht werden, dass bei der Erfindung
verschiedene Modifikationen und Veränderungen durch den Fachmann
erfolgen können,
die ebenso in den Umfang der Erfindung fallen, wie er in den im
Anhang befindlichen Ansprüchen
definiert wird.
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