BRPI0303570B1 - "construção de hgf, microrganismo transgênico, vetor e composição farmacêutico" - Google Patents

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Park Eun-Jin
Hahn Woong
Yu Seung-Shin
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Abstract

"gene de fator de crescimento de hepatócito híbrido tendo eficiência de expressão elevada de dois heterotipos de fator de crescimento de hepatócito". a presente invenção refere-se a um gene de fator de crescimento de hepatócito (hgf) híbrido que é preparado iserindo-se um intron inerente ou estrangeiro entre os exons 4 e 5 no cdna de hgf, que tenha uma seqüência de base da seq id no: 2. o gene tem eficiência de expressão elevada e simultaneamente expressa dois heterotipos de hgf e dhgf (hgf de variante deletada). além disso o gene pode ser empregado para tratar ou prevenir doenças do fígado ou isquêmicas.

Description

(54) Título: CONSTRUÇÃO DE HGF, MICRORGANISMO TRANSGÊNICO, VETOR E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICO (51) Int.CI.: C12N 15/19; A61K 48/00 (30) Prioridade Unionista: 20/03/2002 KR 10-2002-0015074 (73) Titular(es): VIROMED CO., LTD.
(72) Inventor(es): JONG-MOOK KIM; EUN-JIN PARK; WOONG HAHN; SEUNG-SHIN YU; SUNYOUNG KIM
1/16 “CONSTRUÇÃO DE HGF, MICRORGANISMO TRANSGÊNICO, VETOR E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”
CAMPO DA INVENÇÃO [001]A presente invenção refere-se a um gene de Fator de Crescimento de Hepatócito híbrido altamente eficiente (HGF) que simultaneamente expressa dois heterotipos de HGF.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO [002]A presente invenção refere-se a um gene de HGF híbrido preparado por inserção de um íntron inerente ou estrangeiro entre os éxons 4 e 5 no cDNA do HGF, que tem eficiência de expressão mais elevada do que o cDNA de HGF e simultaneamente expressa dois heterotipos de HGF e dHGF (HGF de variante deletada).
[003]O HGF é uma glicoproteína de aglutinação de heparina chamada de um fator de dispersão. Um gene codificando HGF está localizado no cromossomo 721,1 e compreende 18 éxons e 17 intros, tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No: ID NO: 1 (Seki e outros, Gene 102:213-219, 1991). Uma transcrição de cerca de 6 kb é transcrita do gene de HGF, e então, um precursor de HGF de polipeptídeo consistindo de 728 aminoácidos é sintetizado a partir daí. Simultaneamente, um polipeptídeo de precursor de HGF consistindo de 723 aminoácidos é também sintetizado por uma junção do gene de HGF. Os precursores biologicamente inativos podem ser convertidos em formas ativas de heterodímero ligado por disulfeto por protease no soro. Nos heterodímeros, a cadeia alfa tendo um peso molecular elevado forma quatro domínios kringle e uma alça hairpin N-terminal tipo uma região de peptídeo pré-ativada de plasminogênio. Os domínios kringle de uma estrutura de alça ligada por disulfeto triplo consistindo de cerca de 80 aminoácidos pode desempenhar uma importante função na interação da proteína-proteína. A cadeia beta de peso molecular baixo forma um domínio tipo protease de serina inativa.
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2/16 dHGF consistindo de 723 aminoácidos é um polipeptídeo com deleção de cinco aminoácidos no 1o domínio kringle da cadeia alfa, isto é, F, L, P, S e S.
[004]Foi recentemente reportado que ambos HGf e dHGF têm várias funções biológicas, por exemplo, promover o crescimento e morfogênese da célula epitelial, célula endotelial e melanócito. Entretanto, eles são diferentes em termos de propriedades biológicas e imunológicas.
[005]Por exemplo, HGF mostra atividades cerca de 20 vezes, 10 vezes e 2 vezes mais elevadas do que dHGF na promoção de síntese de DNA na célula endotelial venosa do cordão umbilical humano, célula do músculo liso arterial e NSF60 (célula do mioblasto de camundongo), respectivamente. dHGF mostra atividade cerca de 3 vezes e 2 vezes mais elevada do que HGF na promoção de síntese de DNA de LLC-PK1 (célula epitelial do rim do porco), e OK (célula epitelial do rim do gambá americano) e célula intersticial do camundongo, respectivamente. HGF tem uma solubilidade 70 vezes mais elevada em PBS do que dHGF. Vários anticorpos monoclonais anti-dHGF reconhecem somente dHGF, porém não HGF ou uma forma reduzida de dHGF, o que indica que as estruturas de HGF e dHGF são diferentes. Consequentemente, a síntese simultânea de HGF e dHGF in vivo sugere que eles biologicamente interagem com cada outro (Shima, N. e outros, Biochemical and Biophysical Research Communications 200:808-815, 1994).
[006]HGF secretado de células derivadas de mesoderma tem várias funções biológicas, por exemplo (1) induzir as células epiteliais em uma estrutura tubular; (2) estimular a vascularização das células endoteliais in vitro e in vivo; (3) regeneração do fígado e rim, devido a sua atividade anti-apoptose; (4) organogênese do rim, ovário e testículos; (5) controlar a osteogênese; (6) estimular o crescimento e diferenciação das células precursoras hematopoiéticas eritróide; e (7) fazer brotar os axônios dos neurônios (Stella, M.C. e Comoglio, P.M. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31:357-1362, 1999). Com base nessas várias funções,
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3/16
HGF ou um gene codificando HGF pode ser desenvolvido como um agente terapêutico para o tratamento de isquemia ou doenças do fígado. Atualmente, in vivo, o HGF pode existir ou como HGF ou dHGF, e portanto, a co-expressão de HGF e dHGF é importante para maximizar o efeito terapêutico. Consequentemente, os presentes inventores têm se esforçado para desenvolver um gene de HGF híbrido que possa simultaneamente expressar HGF e dHGF com uma eficiência elevada para terapia de gene.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007]Consequentemente, é um objetivo principal da presente invenção fornecer um gene de HGF híbrido que simultaneamente expresse dois heterotipos de HGF.
[008]De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido o gene de HGF híbrido tendo um íntron inerente ou íntron 4 que é inserido entre os éxons 4 e 5 do cDNA de HGF.
[009]É um objetivo da presente invenção fornecer um vetor recombinante compreendendo o gene de HGF híbrido e um microorganismo transformado com o vetor acima.
[010]É ainda um outro objetivo da presente invenção fornecer uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir doenças do fígado ou isquêmicas, que compreendem o gene de HGF.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [011]Os acima e outros objetivos e características da presente invenção tornarão claros a partir da seguinte descrição da invenção, quando tomado em conjunto com os desenhos acompanhantes que respectivamente mostram:
[012]Figura 1: um diagrama esquemático do protótipo de HGF-X ilustrando as posições dos fragmentos do gene, [013]Figura 2: um processo para clonar fragmentos de gene do DNA
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4/16 genômico de HepG2, [014]Figura 3: um processo para clonar fragmentos de gene do cDNA da placenta humana, [015]Figura 4Ae 4B: processo para preparar os vetores de expressão pCKHGF-X, [016]Figura 5: um processo para preparar os vetores de expressão pCKcHGF e pCK-dHGF, [017]Figura 6: um processo para preparar os vetores de expressão da família pCP-HGF-X, [018]Figura 7: um processo para preparar os vetores de expressão pCPcHGF e pCP-dHGF, [019]Figura 8: os níveis de expressão de gene de pCP-cHGF-, pCP-dHGF e pCP-HGF-X, [020]Figura 9: padrões de expressão de gene de pCP-cHGF, pCP-dHGF e pCP-HGF-X observados por eletroforese em 12% de gel de poliacrilamida, [021]Figura 10: níveis de expressão de gene de pCP-cHGF, pCP-dHGF pCP-HGF-X7, in vivo, [022]Figura 11: angiogênese cerebral de dois grupos de coelho que foram submetidos à administração de pCP e pCP-HGF-X7 respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [023]O gene de Fator de Crescimento de Hepatócito híbrido (HGF) da presente invenção compreende cDNA correspondendo aos éxons 1 a 18, e um íntron inerente ou íntron 4 inserido entre os éxons 4 e 5 do cDNA. O íntron compreende um fragmento do inerente ou uma sequência recombinate.
[024]Uma modalidade do gene de HGF híbrido da presente invenção compreendendo o íntron inerente tem 7112 pb e tem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID No: 2. O gene de HGF híbrido simultaneamente expressa ambos HGF e
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5/16 dHGF, e tem eficiência de expressão mais elevada do que cDNA de HGF.
[025]A degeneração do códon permite que o gene de HGF híbrido da presente invenção seja modificado ou alterado na região de codificação e/ou não codificação sem alterar a sequência de aminoácido da proteína e a expressão do gene. Consequentemente, os polinucleotídeos que são substancialmente idênticos ao gene de HGF híbrido da SEQ ID No: 2, e os fragmentos deste incluem-se no escopo da invenção. “Substancialmente idêntico” significa que a homologia da sequência não é menos do que 80%, preferivelmente não menos do que 90%, e mais preferivelmente não menos do que 95%.
[026]Um gene de HGF híbrido pode compreender um fragmento de íntron inerente opcionalmente tendo uma pequena sequência recombinante inserida entre os éxons 4 e 5 do cDNA de HGF. Aqui, um tal gene de HGF híbrido compreendendo um fragmento de intons inerentes designa “HGF-X”. HGFX-6, HGFX-7 e HGFX-8 tendo a sequência de nucleotídeo das SEQ ID Nos: 19 a 21, respectivamente, são preferidos.
[027]O gene de HGF híbrido da presente invenção é sintetizado e inserido em um vetor de expressão, de acordo com os métodos de engenharia genética conhecidos. Desse modo, o vetor pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada tal como E.coli e Levedura. Por exemplo, Escherichia coli Top10F' pode ser transfectada com gene HGF-X7 da presente invenção. Escherichia coli Top10F' pCK-HGFX7 e Escherichia coli Top10F' pCP-HGFX7 então obtido, foram depositados com os números de acessão KCCM-10361 e KCCM-10362, respectivamente, em 12 de março, de 2002.
[028]Empregando-se as células transformadas, o gene da presente invenção e a proteína codificada por meio da qual podem ser produzidos em uma ampla escala.
[029]O vetor da presente invenção pode seletivamente compreender a
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6/16 sequência(s) para regular a expressão de gene tal como promotor ou terminador, sequência de auto-replicação e sinal secretor, dependendo das células hospedeiras.
[030]Além disso, a presente invenção compreende uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir doenças do fígado ou isquêmicas, que compreendem o gene de HGF híbrido ou o vetor compreendendo o gene como um ingrediente ativo. Preferivelmente, a composição é formulada para injeção.
[031]A composição da presente invenção pode ainda compreender veículos farmaceuticamente aceitáveis. Quaisquer dos procedimentos convencionais no campo farmacêutico pode ser empregado para preparar as formulações orais tal como comprimidos, pílulas, grânulos, suspensões e soluções; formulações líquidas, tal como soluções, suspensões, ou pós secos que podem ser misturados com água destilada antes da injeção; as formulações localmente aplicáveis tal como unguentos, cremes e loções; e outras formulações.
[032]Os veículos geralmente empregados no campo farmacêutico podem ser empregados na composição da presente invenção. Por exemplo, as formulações oralmente administradas podem incluir aglutinadores, emulsificadores, agentes de desintegração, excipientes, agentes de solubilização, agentes de dispersão, agentes de estabilização, agentes de suspensão, agentes corantes ou temperos ou aromáticos. As formulações de injeção podem compreender preservativos, agentes antagonistas, agentes de solubilização ou agentes estabilizantes. A preparação para administração local pode conter bases, excipientes, lubrificantes ou preservativos. Quaisquer das formulações adequadas conhecidas na técnica (Remington's Pharmaceutical science [a nova edição], Mack Publishing Company, Eaton PA) pode ser empregada na presente invenção.
[033]A composição inventiva pode ser clinicamente administrada como varias formulações parenterais e orais. Uma formulação adequada pode ser preparada empregando tais excipientes como aditivos, realçadores, aglutinadores,
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7/16 agentes umectantes, agentes de desintegração e tensoativos, ou diluentes. As formulações sólidas para administração oral incluem pílulas, comprimidos, pós polvilhantes, grânulos e cápsulas. Essas formulações sólidas podem ser preparadas misturando-se um ou mais excipientes, por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose e gelatina com derivados de lignano de dibenzilbutilactona. Também, lubrificantes, tal como estearato de magnésio e talco, podem ser incluídos na presente formulação. As formulações líquidas para administração oral incluem suspensões, soluções, emulsões e xarope. Essas formulações podem conter agentes umectantes, adoçantes, aromáticos e preservativos, além dos diluentes simples gerais tal como água e parafina líquida. As formulações para administração parenteral incluem solução aquosa esterilizada, suspensão, emulsão, tratamento alternativo secado por congelamento e supositórios. Os agentes de suspensão e excipientes insolúveis em água compreendem gorduras vegetais tal como propileno glicol, polietileno glicol e óleo de oliva, e ésteres injetáveis tal como oleato de etila. Witepsol®, Macrogol®, Tween® 61, gordura de cacau, gordura de laurina e glicerogelationas podem ser empregados como bases de supositórios.
[034]A composição inventiva pode ser administrada oralmente ou através de rota parenteral, tal como, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-abdominal, injeção arterial e esternal ou infusão, ou topicamente atreves de administração retal, intranasal, inalação ou intraocular.
[035]Seria entendido que a dose diária típica da composição da presente invenção devesse ser determinada levando em consideração vários fatores relevantes incluindo as condições a ser tratadas, a escolha da rota de administração, a idade, sexo, e peso do corpo do paciente individual, e a gravidade do sintoma do paciente, e pode ser administrada em uma única dose ou em doses divididas. Portanto, a dose diária não deveria ser construída como uma limitação ao escopo da invenção de modo algum.
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8/16 [036]Os seguintes Exemplos são dados para o propósito da ilustração somente, e não são para serem pretendidos limitar o escopo da invenção.
Exemplo 1: Preparação de construções de gene híbrido codificando HGF humano.
(1) Clonagem de fragmentos do gene de HGF obtidos do DNA genômico.
[037]Células HepG2 humanas (No de acessão ATCC: HB-8065) foram suspensas em tampões TES (10 MM de Tris-HCl; 1 mM de EDTA; 0,7% de SDS) e tratadas com 400 pl/ml de proteínas K em 50oC durante 1 hora. Subsequentemente, o DNA genômico foi extraído da suspensão de célula por extração de fenol/ clorofórmio e precipitação de etanol de acordo com o método convencional na técnica.
[038]Na amplificação por PCR, o DNA genômico extraído foi empregado como um DNA modelo. Como par de iniciadores, os nucleotídeos sintéticos das SEQ ID Nos: 3 e 4 foram empregados para obter fragmentos de DNa contendo: fragmento do gene HGF 2 (HGF-F2), SEQ ID Nos: 3 e 5; HGF-F3, SEQ ID Nos: 6 e 7; HGF-F5, SEQ ID Nos: 8 e 7; HGF-F7, SEQ ID Nos: 9 e 7, HGF-F8, SEQ ID Nos: 10 e 7; HGFF6, respectivamente (Fig. 1). A mistura da amplificação por PCR foi preparada misturando-se 1 pl de DNA modelo, 1 pl de cada dos iniciadores (10 pmol/pl), 10 pl de dNTP (10 mM), 3,5 unidades de enzima Expand High Fidelity (Gibco BRL, USA) e 10 pl de solução de tampão de enzima e ajustada para um volume final de 100 pl com água destilada. 130 ciclos da amplificação por PCR foram realizados, cada ciclo consistindo de 1 minuto em 94oC, 1 minuto em 55oC e 30 segundos em 72oC. Os iniciadores empregados aqui e os fragmentos de gene amplificado obtidos disso são mostrados na Tabela 1.
TABELA 1
Iniciador 5' Iniciador 3' Fragmento Amplificado
gHGF3 (SEQ ID gHGF3 (SEQ ID Fragmento do gene HGF
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No: 3) No: 3) 2(HGF-F2)
gHGF3 (SEQ ID No: 3) gHGF10 (SEQ ID No: 3) Fragmento do gene HGF 3(HGF-F3)
gHGF5 (SEQ ID No: 6) gHGF7 (SEQ ID No: 7) Fragmento do gene HGF 5(HGF-F5)
gHGF12 (SEQ ID No: 8) gHGF7 (SEQ ID No: 7) Fragmento do gene HGF 7(HGF-F7)
gHGF13 (SEQ ID No: 9) gHGF7 (SEQ ID No: 7) Fragmento do gene HGF 8(HGF-F8)
gHGF6 (SEQ ID No: 10) gHGF7 (SEQ ID No: 7) Fragmento do gene HGF 6(HGF-F6)
[039]O HGF-F2 amplificado compreendeu a sequência variando de 392 a 2247 de protótipo de cDNA de HGF humano (HGF-X1; composto dos éxons de 1- 4íntron 4- éxons 5 a 18) da SEQ ID No: 2; HGF-F3, a sequência variando de 392 a 727; HGF-5, a sequência variando de 2229 a 5471; HGF-F6, a sequência variando de 5117 a 5471; HGF-F7, a sequência variando e 3167 a 5471; e HGF-F8, a sequência variando de 4167 a 5471.
[040]Os fragmentos de gene de HGF amplificados foram cada inseridos no sitio de clonagem múltiplo do vetor easy pGEM-T (Promega, WI, USA) para obter pGEM-T easy -HGF-F2, pGEM-T easy-HGF-F3, pGEM-T easy-HGF-F5, pGEM-T easy-HGF-F6, pGEM-T easy-HGF-F7 e pGEM-T easy-HGF-F8, respectivamente (Fig. 2). As sequências de nucleotídeo dos fragmentos de gene de HGF amplificados foram confirmadas por uma analise de sequência.
(2) Clonagem dos fragmentos de gene de HGF obtidos de cDNA [041]Na amplificação por PCR, o cDNA da placenta humana (Clontech, CA, USA) foi empregado como um DNA modelo sob as mesmas condições como descrito no Exemplo 1. Como pares de iniciadores, os oligonucleotídeos sintéticos da SEQ ID Nos: e 12, SEQ ID Nos: 13 e 14 foram empregados para obter os fragmentos de DNA contendo HGF-F1 e HGF-F4, respectivamente. Além disso, os fragmentos de DNA contendo cDNAs do gene de HGF (cHGF) e gene de HGF deletado (dHGF)foram amplificados por PCR empregando oligonucleotídeos
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10/16 sintéticos da SEQ ID Nos: e como um par de iniciador, respectivamente. dHGF é um gene de HGF com deleção de 5 sequências de base.
[042]Os iniciadores empregados aqui e os fragmentos de gene amplificados obtidos a partir disto são mostrados na Tabela 2.
TABELA 2.
Iniciador 5' Iniciador 3' Produto Amplificado
gHGF1 (SEQ ID No:11) gHGF2 (SEQ ID No:12) Fragmento do gene HGF 1(HGF-F1)
gHGF8 (SEQ ID No:13) gHGF9 (SEQ ID No:14) Fragmento do gene HGF 4(HGF-F4)
gHGF5 (SEQ ID No:15) cHGF3 (SEQ ID No:16) cDNA de gene HGF 5(HGF-F5) cDNA de gene de dHGF (dHGF)
[043]O HGF-F1 e HGF-F1 amplificados compreenderam as sequências de nucleotídeo variando de 1 a 402 e de 6533 a 7113 da SEQ ID No: 2 o protótipo de cDNA de HGF humano, respectivamente. O cDNA de gene de HGF compreendeu a sequência de nucleotídeo variando de 1 a 2184 da SEQ ID No: 1 de gene de HGF humano, e cDNA de gene de dHGF tem a mesma sequência como cDNA de gene de HGF exceto para a deleção da sequência variando de 483 a 495.
[044]Os fragmentos amplificados de gene de HGF foram cada inseridos no sítio de clonagem múltiplo de vetor easy pGEM-T (Promega, WI, USA) para obter pGEM-T easy-HGF-F1, pGEM-T easy-HGF-F4, pGEM-T easy-cHGF e pGEM-T easy-dHGF, respectivamente (Fig. 3). As sequências de nucleotídeo dos fragmentos de gene de HGF humano, cDNA de gene de HGF e cDNA de gene de dHGF foram confirmadas pela análise de sequência.
(3) Preparação das construções de gene de HGF híbrido.
[045]As construções de gene de HGF híbrido do cDNA e DNA genômico foram preparadas combinando-se os fragmentos do gene de HGF clonados nas etapas (1) e (2) como segue (Figs. 4A e 4B).
[046]O plasmídeo pGEM-T-easy-HGF-F1 foi tratado com HindIII/BamHI para
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11/16 obter HGF-F1. O plasmídeo pCK (observe Publicação Internacional PCT No: WO/0040737) foi tratado com HindIII/BamHI, e HGF-F1 foi inserido neste para obter pCK-G1. E em seguida, os plasmideos pGEM-T-easy-HGF-F2 e pGEM-T-easy-HGFF3 foram tratados com MIuI/BamHI para obter HGF-F2 e HGF-F3, respectivamente. pCK-1 foi tratado com MIuI/BamHI, e em seguida HGF-F2 e HGF-F3 foram inseridos neste para obter pCK-F12M e pCVKF13M. O sítio de restrição Mlul dos vetores pCKF12M e pCK-F13M foi substituído por um sítio de restrição Hgal empregando-se um kit de mutagenese de sítio direcionado (Stratagene, CA, USA) para obter pCK-F12 e pCK-F13, respectivamente.
[047]Além disso, o plasmídeo pGEM-T-easy-HGF-F4 foi tratado com BamHI/XbaI para obter HGF-F4. pCK-F12 e pCK-F13 foram tratados com BamHI/XbaI, e HGF-F4 foi inserido neste para obter pCK-F124 e pCK-F134, respectivamente. E em seguida, os plasmídeos pGEM-T-easy-HGF-F5, pGEM-Teasy-HGF-F6, pGEM-T-easy-HGF-F7 e pGEM-T-easy-HGF-F8 foram tratados com BamHI/XbaI para obter HGF-F5, HGF-F6, HGF-F7 e HGF-F8, respectivamente. pCK-F124 e pCK-F134 foram tratados com BamHI/XbaI, e em seguida HGF-F5, HGF-F6, HGF-F7 e HGF-F8, foram inseridos nesta para obter pCK-F1254 e pCKF1264, pCK-F1274, pCK-F1284, pCK-F1354, pCK-F1364 pCK-F1374 e pCK-F1384, respectivamente.
[048]E em seguida, pGEM-T easy-cHGF foi tratado com Xhol para obter fragmento de cDNA do gene de HGF (HGF-Xhol) de cerca de 1100bp. Em seguida, HGF-Xhol foi inserido em pCK-F1254 e pCK-F1264, pCK-F1274, pCK-F1284, pCKF1354, pCK-F1364 pCK-F1374 e pCK-F1384 para obter pCK-HGF-X1, pCK-HGFX2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5 pCK-HGF-X6 pCK-HGF-X7 e pCKHGF-X8, respectivamente. Por outro lado, pGEM-T easy-cHGF e pGEM-T easydHGF foram tratados com BamHI para obter cDNA de gene de HGF e cDNA de gene de dHGF. Em seguida, o cDNA de gene de HGF e o cDNA de gene de dHGF
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12/16 foram inseridos no sítio de restrição de SamHI e pCK para obter pCK-cHGF e pCKdHGF, respectivamente (Fig. 5).
(4) Preparação de um vetor de expressão contendo uma construção de gene de HGF híbrido [049]O plasmídeo pCDNA3,1 (Invitrogen, USA) foi digerido com NdeI, tratado com o fragmento Klenow para construir terminações grosseiras, e então digerido com NheI para obter um fragmento de DNA contendo promotor de citomegalovírus humano. Os plasmídeos pCK-HGF-X1, pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5 pCK-HGF-X6 pCK-HGF-X7 e pCK-HGF-X8 foram digeridos com SnaBI, tratados com fragmento Klenow para fazer terminações grosseiras e digeridos com NheI, e em seguida o fragmento de DNA acima contendo promotor de citomegalovírus humano foi inserido neste para obter pCP-HGF-X1, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X4, pCP-HGF-X5 pCP-HGF-X6 pCP-HGFX7 e pCP-HGF-X8, respectivamente.
[050]O plasmídeo pCDNA3,1 (Invitrogen, USA) foi digerido com NheI, tratado com fragmento Klenow para fazer terminações grosseiras e digerido com NdeI para obter o fragmento de DNA contendo promotor de citomegalovírus humano. pCK-cHGF e pCK-dHGF foram digeridos com MluI, tratados com fragmento Klenow para fazer terminações grosseiras e digeridos com NdeI, e em seguida o fragmento de DNA acima contendo promotor de citomegalovírus humano foi inserido neste para obter pCP-HGF-X1, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-cHGF e pCPdHGF, respectivamente (Fig. 7).
Exemplo 2: Exame da eficiência da expressão da construção de gene de HGF híbrido e a co-expressão de HGF/dHGF.
[051]O estudo foi conduzido para examinar se as construções de gene de HGF híbrido (HGF-X1 a HGF-X8) obtidos no Exemplo 1 podem simultaneamente expressar HGF e dHGF e se existe qualquer diferença no nível de expressão de
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13/16 gene entre as construções de gene de HGF híbrido e cDNA de HGF.
(1) Eficiência da expressão de gene [052]Primeiro, 5 ,ug de pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X6, pCPHGF-X7 e pCP-HGF-X8 foram transferidos em 5 x 106 células de célula 293 (ATTCC CRL 1573) junto com 0,5 ,ug de DNA DONAI-Lacz (TAKARA SHUZO, Japão) empregando FuGENE6 (Gibco BRL, MD, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Ao mesmo tempo, 5 ,ug de cada dos pCP-cHGF e pCP-dHGF foram empregados como controle, e DNA DONAI-LacZ foi empregado para calibrar a eficiência da infecção. 3 horas após a infecção, as células foram novamente alimentadas com um veículo fresco e ainda cultivadas durante 48 horas. A solução de cultura desse modo obtida foi dividida em duas partes. Uma parte da solução de cultura de célula 293 foi submetida à extração de RNA, e a outra, a medição da atividade de LacZ. A atividade de LacZ foi medida empregando um kit de medição de atividade (Stratagene, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.
[053]A fim de comparar os níveis de expressão e gene, a quantidade de HGF na cultura de célula foi medida por um kit de ensaio de imunosorvente ligado por enzima (ELISA, R&D System, MN, USA). Após a calibragem da eficiência da infecção pela atividade de LacZ medida, o nível de expressão do gene de HGF-X foi constatado ser de 20 a 150 vexes mais elevado do que aqueles de cDNA de HGF e cDNA de dHGF (Fig. 8). HGF-X7, em particular, mostrou o nível de expressão de gene superior.
(2) Co-expressão do HGF e dHGF.
[054]A fim de examinar a co-expressão de HGF e dHGF das construções de gene de GFD híbrido, os RNAs celulares totais foram extraídos a partir de células 293 transfectadas empregando o método Trizol (Trizol; Gibci BRL, USA) e submetidos a PCR em temperatura ambiente para obter cDNA. Em seguida, empregando cDNA como um DNA modelo, a amplificação por PCR foi realizada
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14/16 empregando oligonucleotídeos sintéticos, da SEQ ID Nos: 17 e 18 como um par de iniciador. A mistura da amplificação por PCR foi preparada misturando-se 1 pl do DNA modelo, 1 pl de cada dos iniciadores (10 pmol/pl), 10 pl de dNTP (10 mM), 3,5 unidades de polimerase Taq (TAKARA SHUZO, Japão)e 10 pl de solução de tampão de enzima e ajustada para um volume final de 100 pl com água destilada. 30 ciclos da amplificação por PCR foram conduzidos, cada ciclo consistindo de 1 minuto em 94oC, 1 minuto em 55oC, e 90 segundos em 72oC.
[055]Os produtos da amplificados por PCR corresponderam á região limite entre os éxons 4 e 5 do gene de HGF; o cDNA do gene de HGF de 142 bp e o cDNA do gene de dHGF de 127 bp, respectivamente. Com nenhuma junção, o produto de PCR de pelo menos 1 kb em comprimento foi amplificado; e se a junção alternativa ocorreu, o cDNA de gene de HGF de 142 bp e cDNA de gene de dHGF de 127 bp foram simultaneamente sintetizados e amplificados. Os produtos amplificados por PCR foram distinguidos por eletroforese em um gel de poliacrilamida a 12%.
[056]Como mostrado na Fig. 9, ao mesmo tempo em que as bandas de 142 bp e 127 pb foram detectadas nas rotas carregando o cDNA de gene de HGF d cDNA de gene de dHGF, respectivamente, ambas bandas de 142 bp e 127 bp foram detectadas nas rotas carregando HGF-X. Os resultados acima sugerem que HGF e dHGF sejam simultaneamente expressados a partir das construções de gene de HGF-X híbrido da presente invenção.
Exemplo 3: Comparação dos níveis de expressão de HGF-X7, cDNA de gene de HGF e cDNA de gene de dHGF (in vivo).
[057]100 ,ug de cada dos pCP-HGF-X7, pCP-cHGF e pCP-dHGF foram injetados no interior do músculo tibial do membro traseiro dos camundongos com uma seringa de insulina. Após 5 dias, os camundongos foram sacrificados e os músculos ao redor do lugar da injeção foram removidos e despedaçados em uma extração de proteína, tampão (25 mM de Tris-HCl (pH7,4), 50 mM de NaCl, 0,5% de
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Na-deoxicolato, 2% NP-40, 0,2% SDS) para preparar as proteínas totais. A quantidade das proteínas totais foi medida com um kit de análise de proteína DC (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) e a quantidade de HGF expressado foi determinada com um kit ELISA (R&D System) de acordo com a instrução do fabricante.
[058]Como pôde ser observada a partir do resultado mostrado na Fig. 10, a quantidade de HGF expressada a partir de HGF-X7 é 250 vezes mais elevada do que aquela do cDNA de gene de HGF ou cDNA de gene de dHGF.
[059]Junto com o resultado da experiência do Exemplo 2 (in vivo), este resultado demonstra que a eficiência da expressão do gene de HGF-X é muito superior àquela do cDNA de gene de HGF ou cDNA de gene de dHGF.
Exemplo 4: Terapia de gene empregando HGF-X7 em um modelo de membro traseiro isquêmico de coelho.
[060]A fim de examinar de o gene de HGF-X7 é eficaz no tratamento de doença do membro traseiro isquêmico, a terapia de gene foi realizada em um modelo de membro traseiro isquêmico de coelho como segue.
[061]Um modelo de membro traseiro isquêmico de coelho, que é um modelo de animal padrão para a doença o membro isquêmico, foi preparado pelo método descrito por Takeshita e outros, Journal of Clinicai Investigation, 93: 662(1994). No dia antes da operação (dia 0), cada dos 30 coelhos brancos da Nova Zelândia (machos de 3,8 a 4,2 kg) foi intramuscularmente injetado com 5 mg/kg de xilazina, e em seguida, anestesiados por uma injeção intramuscular de 50 mg/kg de cetamina. Subsequentemente, a região femoral esquerda do coelho foi incisada e todas as ramificações da artéria femoral foram separadas e atadas. A região da parte próxima ao ponto ramificado das artérias poplíteas e safena, foi incisada para preparar o modelo. Após a operação, 15 mg/kg/dia da cefazolina foram injetados intramuscularmente durante 5 dias e 0,3 mg/dia de morfina, durante 10 dias. 10 dias
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16/16 após a operação (dia 10), a angiografia foi realizada para o membro traseiro esquerdo onde a isquemia foi induzida, e o grau de arteriogênese foi registrado como um nível basal. Os coelhos foram aleatoriamente divididos em dois grupos e injetados em quatro sítios no músculo femoral com 500 ,ug de plasmídeo pCP-HGFX7 (grupo experimental) ou 500 ,ug de plasmídeo pCP (controle), respectivamente. 40 dias após a operação (dia 40), a angiografia foi realizada novamente para o membro traseiro esquerdo e o grau de arteriogênese no nível arterial foi determinado e comparado com aquele do dia 10.
[062]Como pode ser observado a partir do resultado na Fig.11, o grau de angiogênese foi significantemente realçado no grupo experimental administrado com pCP-HGF-X7 quando comparado com o grupo de controle administrado por pCP.
[063]Este resultado demonstra que o gene de HGF-X7 pode ser eficazmente empregado na terapia de gene de uma doença isquêmica.
[064]Ao mesmo tempo em que a invenção tem sido descrita com respeito às modalidades específicas acima, deveria ser reconhecido que várias modificações e alterações possam ser feitas à invenção por aqueles versados na técnica que também incluem-se no escopo da invenção como definido pelas reivindicações anexas.
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Claims (7)

REIVINDICAÇÕES
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1. Construção de HGF, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 2.
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2/2 compreende a construção de HGF, conforme definida nas reivindicações 1 a 4, e um veículo.
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2. Construção de HGF, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 19.
3/12
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3. Construção de HGF, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 20.
4/12
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4. Construção de HGF, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 21.
5/12
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5. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que contém as construções conforme definidas nas reivindicações 1 a 4.
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6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor ainda compreende uma ou mais sequências para regular a expressão de gene, uma sequência de auto-replicação ou um sinal secretório.
7. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo que consiste em: pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7, pCK-HGF-X8, pCP-HGF-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGFX6, pCP-HGF-X7 e pCP-HGF-X8.
8. Microrganismo transgênico CARACTERIZADO pelo fato de que contém o vetor conforme definido na reivindicação 5.
9. Microrganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo é uma levedura ou uma E. coli.
10. Microrganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo é uma E. coli TOP10F' pCKHGF-X7 (Depósito N° KCCM-10361) ou E. Coli TOP10F' pCP-HGF-X7 (Depósito N° KCCM-10362).
11. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que
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7/12
X OI X co X xr X OI X vo X O- X oo X ti ti ti ei ti ti ti ti Ü o O O O O Ü o w K w w ffi w w X X X X X X X X o u u u u u o tj o. co tx tx & co tx tx
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