CN116637172A

CN116637172A - p75细胞外结构域在新生儿缺氧缺血性脑病治疗和/或预防中的应用

Info

Publication number: CN116637172A
Application number: CN202210141850.8A
Authority: CN
Inventors: 熊柳林; 周新富
Original assignee: Suzhou Auzone Biological Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Auzone Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-08-25

Abstract

本发明属于制药领域，具体涉及p75细胞外结构域(p75ECD)在治疗和/或预防新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)中的应用。

Description

p75细胞外结构域在新生儿缺氧缺血性脑病治疗和/或预防中的应用

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种p75细胞外结构域(p75ECD)的新用途，尤其涉及p75细胞外结构域(p75ECD)在制备用于治疗和/或预防新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)的药物中的应用。

背景技术

新生儿缺氧缺血性脑病(neonatal hypoxic ischemic encephalopathy，NHIE)是指围产期新生儿由于脑部缺氧缺血造成的脑部损伤，主要表现为兴奋激惹、昏迷等，严重者会出现惊厥、抽搐、呼吸暂停等，极易引发急性死亡或慢性神经系统损伤。有数据显示，围产期NHIE与大约25％的新生儿死亡相关^[1]，幸存者仍存在相当高的终生神经功能障碍风险，包括脑瘫、智力迟钝、智力受损等，不仅极大地影响着患儿的健康和生活治疗，而且给患儿家庭和社会带来沉重的负担。

NHIE是世界范围内新生儿死亡率和发病率较高的疾病之一，在发达国家，其发病率为2‰-3‰。

虽然现代技术有了很大的进步，增加了对新生儿病理的认识，但NHIE仍然是一个尚未解决的难题，临床尚无特效的治疗方法。目前临床上标准治疗方案是为72h的低温治疗(33-34℃)，研究表明低温治疗可以减少脑血流灌注并减慢脑部新陈代谢，减少自由基产生，抑制促炎反应从而减轻缺血再灌注损伤。但低温治疗时需考虑潜在的凝血功能障碍、免疫抑制、低血压、肾损伤等风险。此外，近年来低温治疗的疗效也受到了质疑。其他非特异性基础治疗主要注重维持体液平衡、改善神经元功能、控制惊厥、控制脑水肿、改善脑血流以及脑细胞代谢等^[2]，通常治疗效果欠佳。

NHIE的病因复杂，其发病机制是多种联合作用的一系列生化连锁反应或缺氧缺血级联反应的结果，主要表现为各种形式的神经细胞死亡包括坏死、自噬、兴奋性毒性、氧化应激以及神经炎症等，其中神经细胞凋亡是NHIE的主要病理特征，可在早起发生并在NHIE后持续数周。因此，减轻NHIE后炎症反应，促进神经细胞存活对NHIE脑损伤的恢复具有重要意义。

CN 102233128 B公开了p75NTR-ECD在制备防治阿尔茨海默病的药物中的应用。CN106794222 B公开了p75细胞外结构域(p75ECD)在制备用于治疗和/或预防脑淀粉样血管病(CAA)的药物中的用途。CN 107303389 A公开了外周脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)或其信号传递分子中具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于缓解、抑制或治疗疼痛的药物中的应用。CN 112472796 A公开了p75细胞外结构域(p75ECD)或其功能性片段、变体、类似物或衍生物在制备用于治疗和/或预防额颞叶痴呆的药物中的用途。CN113456799A公开了一种p75ECD在制备用于调节疼痛的药物中的应用，其中所述疼痛包括炎性疼痛或手术疼痛。CN 104302326A(PCT/GB2013/050632)公开了p75NTR神经营养因子结合蛋白的治疗性用途，具体教导了p75NTR(NBP)用于治疗疼痛和/或疼痛症状。CN 105873943A(PCT/GB2014/052833)公开了一种融合蛋白，即p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，用于治疗疼痛或疼痛症状。

WO 2020/051624(PCT/AU2019/050015)公开了一种包括改善脑损伤后神经损伤恢复的方法，包括降低p75神经营养因子受体活性从而提高脑损伤的恢复，其中权利要求2限定脑损伤包括缺血性损伤、创伤性损伤、出血性损伤和癫痫性损伤。

然而，p75神经营养因子细胞外结构域(p75ECD)在新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)预防和/或治疗中的作用在全世界范围内未见报道，发明人首次发现p75ECD可作为预防和治疗类NHIE的药物。

发明内容

本发明涉及p75神经营养因子受体细胞外结构域(p75NTR-ECD，又称p75ECD)预防和/或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)的方法，包括给需要的患者施用p75ECD，或者涉及p75ECD在制备用于预防和/或治疗新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)的药物中的用途。

本发明出人意料地发现p75ECD可以明显减轻HI(hypoxicischemic，缺氧缺血)模型大鼠因缺氧缺血造成的脑损伤以及急性和长期神经功能障碍，可以促进HI模型大鼠神经元存活和再生，抑制脑皮层和海马体星形细胞增多和小胶质细胞激活，优于目前的标准疗法--低温治疗(TH，Therapeutic Hypothermia)。

在本文中使用时，术语“治疗”意欲是指p75ECD的给药减轻或改善了NHIE的至少某些迹象或症状。

在本文中使用时，术语“预防”意欲是指p75ECD的给药发生在NHIE的诊断之前，并减轻、改善NHIE的至少某些迹象或症状或者延迟其发作；或者是指p75ECD的给药阻止了NHIE的迹象或症状的恶化。因此，术语“预防”意欲包括预防性治疗。

给药的p75ECD可以来自于任何目标物种(例如人类、小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、奶牛、马、非人类灵长动物等)。然而，在一个实施方式中，所述p75ECD是人类p75ECD。在一个实施方式中，所述p75ECD具有编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列：

aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac

ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg

gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag

tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgccg tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc

tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc

gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag

tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc

gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc

gaggagatcc ctggccgttg gattacagac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa(SEQ ID NO:1)

Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys

Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln

Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val

Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln

Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys

Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys

Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys

Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu

Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr

Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu

Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser

Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln

Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly

Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn(SEQ ID NO:2)。

在替代实施方式中，所述p75ECD可以是该序列的功能性片段、变体、类似物或衍生物。例如，p75ECD(或其功能性片段)的变体、类似物或衍生物由不同于p75ECD(或其功能性片段)，但在生物活性、特别是与促神经营养因子结合的能力上保留了与p75ECD的相似性的分子构成。p75ECD(或其功能性片段)的变体、类似物或衍生物可以与p75ECD(或其功能性片段)具有显著的总体结构相似性，或者仅仅与p75ECD(或其功能性片段)的负责所述生物活性的一个或多个区域具有结构相似性。通常，变体、类似物或衍生物由相关氨基酸序列的一个或多个氨基酸的修饰提供，或者是所述修饰的结果。例如，包含SEQ ID NO:2所示序列的功能性片段、变体、类似物或衍生物通过向该氨基酸序列添加一个或多个氨基酸、从该氨基酸序列缺失一个或多个氨基酸和/或从该氨基酸序列置换一个或多个氨基酸来提供，或者是上述修饰的结果。也涵盖了氨基酸的反转和引起氨基酸序列改变的其他突变变化。这种类似物或衍生物可以通过在多核苷酸分子中引入核苷酸变化使得在诱变的多核苷酸分子表达后获得所需氨基酸变化或通过以其他方式合成掺有所需氨基酸变化的氨基酸序列来制备。氨基酸的置换可以包括保守或非保守氨基酸置换。保守氨基酸置换意味着将氨基酸残基用具有相似特性并且不显著改变所述肽或多肽的生物活性的另一个氨基酸替换。示例性的保守氨基酸置换被提供在下面的表1中。设想的具体保守氨基酸是：G，A，V，I，L，M；D，E；N，Q；S，T；K，R，H；F，Y，W，H；以及P，Nα-烷基氨基酸，其可能在序列上具有少量变化，但是不引起生物活性的任何显著降低或变化。这些变化可以包括保守氨基酸置换例如Gly，Ala，Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu，Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg，His；Phe，Tyr，Trp，His；和Pro，Nα-烷基氨基酸；以及非保守氨基酸置换。

表1 示例性的保守氨基酸置换

*指示优选的保守置换

当通过合成制备类似物或衍生物时，所述类似物或衍生物可能包括不由遗传密码编码的一个或多个氨基酸例如羧基谷氨酸和羟脯氨酸，或者可能包括D-氨基酸代替L-氨基酸。因此，所述类似物或衍生物可以是p75ECD(或其功能性片段)的模拟物例如肽模拟物。然而，p75ECD(或其功能性片段)的类似物或衍生物不必定具有氨基酸序列同一性和/或相似性，并且事实上，类似物或衍生物可能完全不是蛋白质。

应该理解，与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有少量改变的氨基酸序列的肽(例如通过一个或多个，例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个等保守氨基酸置换产生的变体)，仍落于本发明的范围之内，只要所述肽能够结合p75并阻止通过p75的信号转导即可。具体来说，p75ECD的天然变体(或同工型)或源自于非人类物种的p75ECD肽被认为是落于所公开的方法的p75ECD或p75ECD-Fc融合肽的范围之内。

在一个实施方式中，p75ECD包含p75ECD融合体，其中p75ECD被融合到融合配偶体。所述融合配偶体可以是本领域技术人员已知的任何适合的融合配偶体，例如免疫球蛋白的Fc区、人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)等，只要所述p75ECD保留至少一些它的生物活性即可。融合产物可以通过从编码所述融合产物的适合的构建物表达所述产物，或通过以其他方式将p75ECD化学连接到融合配偶体来生产。所述融合配偶体应该提高所述p75ECD在体内的稳定性和血清半衰期。在一个实施方式中，将p75ECD融合到免疫球蛋白的Fc结构域，以形成p75ECD-Fc融合体。所述Fc结构域可以是来自于任何适合的免疫球蛋白的任何适合的Fc结构域。然而，在优选实施方式中，所述Fc结构域来自于人类IgG。

在一个实施方式中，所述Fc区能够二聚化以产生p75ECD的二聚体形式。然而，其他融合配偶体可能能够形成其他类型的寡聚体，例如三聚体、四聚体、五聚体等。因此，p75ECD可能是寡聚体例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。在一个实施方式中，所述p75ECD可以是二聚体。在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc融合体可以是p75ECD-Fc二聚体。p75ECD和p75ECD-Fc融合体的寡聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体和五聚体等)包括在本发明p75ECD的衍生物中。

在一个实施方式中，所述p75ECD-Fc融合体包含连接到人类IgG1的Fc部分的人类p75ECD分子。本领域技术人员将会认识到，取决于例如所使用的连接物，融合体可能具有大量不同的核苷酸和氨基酸序列。然而，在一个实施方式中，SEQ ID NO:3为人类p75ECD-人类IgG1Fc结构域融合体(人类p75ECD-Fc)的核苷酸序列。基于简并性，其他编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体的核苷酸序列也是容易想到的，并落入本发明保护范围。

aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac

ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg

gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag

tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgccg tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc

tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc

gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag

tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc

gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc

gaggagatcc ctggccgttg gattacagac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa(SEQ ID NO:3)

类似地，在一个实施方式中，人类p75ECD-Fc融合体的氨基酸序列被提供在SEQ IDNO:4中。在一个实施方式中，SEQ ID NO:4包含在SEQ ID NO:4的第1-169位氨基酸处的p75ECD肽，随后是在第170至179位残基处的连接物“DKTHTCPPCP”，随后是在第180至396位残基处的Fc结构域。然而，应该认识到，p75ECD-Fc融合体可以是由SEQ ID NO:4所示序列的功能性片段、变体、类似物或衍生物。本文中别处描述了功能性片段、变体、类似物或衍生物。

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp

Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys

Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys(SEQ ID NO:4)

在一个实施方式中，将p75ECD或p75ECD融合体作为核苷酸分子给药到所述对象。这种核苷酸分子可以由例如表达载体或表达盒构成。优选的表达载体包括能够实现所需宿主细胞类型的转导的病毒载体，例如反转录病毒载体、腺病毒载体和源自于腺相关病毒(AAV)的载体，例如本领域技术人员公知的那些。包含编码本公开的p75ECD或p75ECD融合体的核苷酸序列的病毒载体可用于在所需位点处提供p75ECD或p75ECD融合体的体内来源，用于NHIE的治疗或预防。

在优选实施方式中，将p75ECD或p75ECD融合体通过病毒载体给药，已知所述病毒载体提供以适合于基因疗法的方式将核苷酸递送到细胞内的工具。正如本领域技术人员将会理解的，腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯性疱疹病毒载体可以用作病毒载体，因为它们都能将核苷酸递送到细胞用于基因治疗的目的。通过病毒载体递送p75ECD或p75ECD融合体可以介导药剂在体内长期表达，并且由于NHIE的慢性本质，p75ECD或p75ECD融合体的持续分泌是合乎需要的。在一个实施方式中，AAV载体的使用是有利的，这是因为所述载体可以作为单次注射给药，可以提供药剂的长期分泌，并且此外也被认为是非常安全的，在动物或人类中尚未报道过病理事件。AAV载体已知是用于基因疗法递送的工具。因此，在一个实施方式中，病毒载体可以是AAV载体。所述AAV载体可以是本领域技术人员已知的任何适合的腺相关病毒载体，例如AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12等。在一个实施方式中，所述AAV载体是AAV8。

将p75ECD-Fc插入到AAV8载体(由Virovek提供)中，所述载体含有AAV2磷脂酶结构域的AAV8衣壳序列，以提高AAV8的效能。具有AAV2磷脂酶结构域的AAV8衣壳序列的序列如SEQ ID NO:5所示，其中所述AAV2磷脂酶结构域序列包含第26至431位核苷酸。

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac

gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac

aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac

cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt

caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag

gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg

ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc

ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca

gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga

cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac

ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc

atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa

atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc

ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag

cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcagcttcaa gctcttcaac

atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taacctcacc

agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc cgtacgttct cggctctgcc

caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca tgattcccca gtacggctac

ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct ccttctactg cctggaatac

tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt ttacttacac cttcgaggac

gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg accggctgat gaatcctctg

attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa caggaggcac ggcaaatacg

cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg ccaatcaggc aaagaactgg

ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga caaccgggca aaacaacaat

agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga atggaagaaa ttcattggct

aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg agcgtttttt tcccagtaac

gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc

atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg tggctacaga ggaatacggt

atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc aaattggaac tgtcaacagc

cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc

tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt

ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct

ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca cgcaatacag caccggacag

gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaaccccgag

atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa

ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa(SEQ IDNO:5)

“治疗有效量”是在对象中引发有益或治疗效果的任何量。在一个实施方式中，用于任何适合的对象的AAV载体的剂量在1×10⁶至11×10¹³个病毒基因组/kg对象体重之间。在一个实施方式中，用于任何适合的对象的AAV载体的剂量在1×10⁸至11×10¹³个病毒基因组/kg对象体重之间。

正如本领域技术人员充分认识到的，给药的腺相关病毒载体的剂量可以变化。例如，对于人类对象来说，在美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)的机构的临床试验中，患者中使用的“安全”剂量为6×10¹²个病毒基因组(vg)/kg体重。然而，对于本文中描述的方法来说，给药到人类对象的腺病毒载体的剂量可以在1×10⁶至6×10¹³vg/kg体重的范围内。在一个实施方式中，给药到人类对象的腺病毒载体的剂量在1×10¹⁰至6×10¹²vg/kg体重之间。在一个实施方式中，给药到人类对象的腺病毒载体的剂量在1×10¹¹至3×10¹²vg/kg体重之间。在一个实施方式中，腺病毒的剂量可以更高，例如1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷、1×10¹⁸、1×10¹⁹、1×10²⁰等，只要这些剂量被认为是安全的即可。

可以使用用于在物种间转换药物等价剂量的美国食品和药物监督管理局(USFood and Drug Administration)(FDA)标准，在身体表面积的基础上将人类对象中使用的AAV载体的剂量转换成适合用于其他动物的剂量[以mg/kg为单位的人类等价剂量＝以mg/kg为单位的动物剂量×(以kg为单位的动物体重/以kg为单位的人类体重)0.33](食品和药物监督管理局，2003)。因此，在小鼠中的“安全”剂量可以是8×10¹⁰个病毒基因组。然而，本领域技术人员将会认识到，给药到小鼠对象的腺相关病毒载体的剂量可以在1×10⁵至1×10¹³个病毒基因组的范围内。在一个实施方式中，给药到小鼠对象的腺相关病毒载体的剂量可以在1×10⁸至1×10¹²个病毒基因组的范围内。在一个实施方式中，给药到小鼠对象的腺相关病毒载体的剂量可以在1×10⁹至1×10¹¹个病毒基因组的范围内。

在本发明的这一方面的一个实施方式中，p75ECD或p75ECD-Fc融合体是重组肽。重组p75ECD或p75ECD-Fc融合肽可以使用本领域技术人员已知的任何适合的技术来生产，例如通过在培养的细菌系统(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母表达系统、昆虫表达系统、病毒表达系统或在真核细胞表达系统中表达，或者所述肽可以人工合成等，所有这些都为本领域技术人员所知。

在一个实施方式中，给药的重组p75ECD或p75ECD-Fc融合肽的剂量可以是在对象中引发有益或治疗效果的任何适合的量，并且可能随着给药途径而变。在一个实施方式中，所述剂量为每天约0.01至约500mg/kg对象体重，其可以在单剂或多剂中给药。优选地，所述剂量为每天约0.1至约250mg/kg，更优选为每天约0.5至约20mg/kg。

在一个实施方式中，本公开的这一方面的p75ECD、p75ECD融合体、p75ECD-Fc或AAV-p75ECD-Fc与可药用载体、赋形剂和/或稀释剂相组合提供。适合的可药用载体、赋形剂和/或稀释剂对于本领域技术人员来说是公知的。

本公开的这一方面的p75ECD、p75ECD融合体、p75ECD-Fc或AAV-p75ECD-Fc可以通过任何适合的途径给药到所述对象，例如口服、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、颅内、鞘内或脑室内途径。然而，优选地，所述p75ECD或p75ECD-Fc被静脉内、腹膜内、肌内、鞘内或脑室内给药。

另一方面，提供了一种通过阻断经过p75的信号转导来治疗和/或预防NHIE的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的p75ECD或其类似物。在一个实施方式中，所述p75ECD或其类似物阻止选自proBDNF和proNT3的神经毒性分子与p75的结合。这一方面的方法使用上面描述的实施方式。

根据本发明，它包括p75NTR受体的胞外段p75ECD，其中所述p75ECD由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列或其变体(例如一个或多个保守氨基酸置换后的变体)组成。

根据本发明，它包括p75ECD被融合到免疫球蛋白的Fc结构域，以形成p75ECD-Fc融合体，其中所述p75ECD-Fc由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体(例如一个或多个保守氨基酸置换后的变体)组成。

根据本发明，p75ECD-Fc融合蛋白的日给药剂量在0.1mg/kg对象体重至250mg/kg对象体重之间。其中对治疗而言，日剂量优选为0.1-100mg/kg对象体重，例如0.1mg/kg，0.5mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，3.0mg/kg,5.0mg/kg，10.0mg/kg，15mg/kg，20mg/kg，30mg/kg,40mg/kg,50mg/kg,60mg/kg,70mg/kg,80mg/kg或90mg/Kg等，更优选以0.5-20mg/kg对象体重的剂量给药。

根据本发明，p75ECD-Fc融合蛋白的AAV载体的日给药剂量在1×10⁶至11×10¹³个病毒基因组/kg对象体重之间。其中对治疗而言，日剂量优选为1×10⁸至11×10¹³个病毒基因组/kg对象体重之间，例如5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、5×10¹¹、1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²、9×10¹²、1×10¹³、5×10¹³等。

本发明制剂给药的剂量和频率可以根据患者病情而变化，有时需要以相对短的间隔、相对高剂量，直至减轻或终止疾病的进展，优选直至患者表现出疾病症状的部分或完全改善。本发明的药物可以通过静脉内、腹膜内、脑室内、鞘内或肌内注射来给药。

附图简述

图1示出氧-糖剥夺(OGD)实验方案；

图2示出p75ECD-Fc预处理对OGD神经元细胞神经突长度和神经细胞凋亡的影响；

图3示出p75ECD-Fc后处理对OGD神经元细胞神经突长度和神经细胞凋亡的影响；

图4示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠Zea-longa评分结果；

图5示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠脑梗死体积结果；

图6示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠脑梗死率结果；

图7示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠翻正实验结果；

图8示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠负趋地性测试结果；

图9示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠爬坡测试结果；

图10示出不同剂量p75ECD-Fc干预NHIE大鼠Y-迷宫结果；

图11示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠旷场行走距离结果；

图12示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠旷场梳毛次数结果；

图13示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠旷场梳毛时间结果；

图14示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠旷场后肢直立次数结果；

图15示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠旷场后肢直立时间结果；

图16示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠转棒测试结果；

图17示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠Morris水迷宫潜伏期结果；

图18示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠Morris水迷宫总游行距离结果；

图19示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠Morris水迷宫穿越平台次数结果；

图20示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠NSS评分结果；

图21示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠大脑皮层及海马Nissl染色情况；

图22示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠大脑皮层中存活神经元数量；

图23示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠大脑皮层中死亡神经元数量；

图24示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠海马中存活神经元数量；

图25示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠海马中死亡神经元数量；

图26示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠大脑萎缩面积情况；

图27示出不同剂量p75ECD-Fc治疗HI模型大鼠大脑皮层及海马HE染色情况；

图28示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠Zea-longa评分结果；

图29示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠脑水肿结果；

图30示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠脑梗死面积结果；

图31示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠脑梗死比例结果；

图32示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠翻正反应结果；

图33示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠负趋地性实结果；以及

图34示出p75ECD-Fc与低温治疗HI模型大鼠爬坡实验结果。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明的技术方案的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。

实施例1

p75ECD对氧-糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)大鼠大脑皮层神经元细胞存活的影响

实验方法：参考L-L Xiong等的文献^[3]。具体地说，取新生大鼠(1日龄)的皮层神经元，修剪成小块，然后用0.25％胰蛋白酶在37℃培养箱中消化10min，用2mL 10％胎牛血清(FBS)终止消化。离心5min(15000转/分，室温)，丢弃上清，微球重新悬浮于完全培养基中(DMEM/高糖，含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)。约4h后，培养期替换成Gibco B-27Plus神经元培养体系，24h后全量换液，以后每隔3天更换半量换液。

p75ECD-Fc干预：通过两种方式对皮层神经元细胞进行干预(详见图1)：第一种(a)：原代皮质神经元接种在96孔板内，每孔约9×10⁴个细胞，第3天加入浓度为1μM的p75ECD-Fc，预处理24h后在第4天开始OGD，换无糖培养基后在1％氧气(另含94％的氮气和5％的二氧化碳)的三气培养箱培养1h后，换添加p75ECD的培养基在正常培养箱继续培养24h后取材分析；第二种(b)：原代皮质神经元接种在96孔板内，每孔约9×10⁴个细胞，第4天开始OGD，即换无糖培养基在1％氧气(另含94％的氮气和5％的二氧化碳)三气培养箱培养1h后，再换含p75ECD的培养基继续培养24h后取材分析。对照组使用生理盐水。

细胞生存能力：用Cell-Counting-Kit 8Test(CCK8)法检测细胞活力，以验证p75ECD-Fc能否减轻OGD损伤。简单地说，在OGD后24小时，每孔加入10μL CCK8试剂，CO₂孵育2小时，在450nm波长下测量光密度(Optical density,OD)值，观察细胞活力。重复三次。细胞活性(％对照)＝给药OD值/对照OD值)*100％。

结果：OGD后，大鼠大脑皮层神经元表现出明显的损伤，表现为神经元突的损伤和细胞凋亡，而无论是在OGT前(图2)还是OGT后(图3)用1μM p75ECD-Fc干预，神经元突长度明显增加，神经元凋亡明显减少。

实施例2

侧脑注射不同剂量p75ECD-Fc融合蛋白HI模型大鼠的治疗作用

实验动物及造模：选择7日龄新生SD大鼠(14-16g)，采用异氟醚吸入麻醉(诱导4％，持续吸入2％)。切开颈部腹侧皮肤的中线，然后钝性剥离实质，暴露右侧颈总动脉。随后，使用单极显微外科电凝器结扎右侧颈总动脉，缝合皮下组织和皮肤，返回母鼠1小时后自行移至含8％O₂和92％N₂(空气流速维持在1L/min)的低氧室2小时。假手术组大鼠行相同操作，不结扎右侧颈动脉。

分组及给药(表2)：将50只大鼠，随机分成5组(对照组(HI)，假手术组(sham),10μg/3μl p75ECD-Fc组、30μg/3μl p75ECD-Fc和78.6μg/3μl p75ECD-Fc组。每组10只，治疗组大鼠侧脑室注射(坐标：以前囟点为中心，旁开1.5mm，向后囟方向1.1mm，深4mm)浓度分别为10、30和78.6μg/3μl的p75ECD-Fc，对照组(HI)和假手术组(Sham)注射等量生理盐水。

表2

组别	动物数量(n)	给药剂量/给药方式
			对照组(HI)	10	3μL生理盐水，侧脑注射
假手术组(Sham)	10	3μL生理盐水，侧脑注射
			低剂量组(10μg)	10	10μg/3μL p75ECD-Fc，侧脑注射
中剂量组(30μg)	10	30μg/3μL p75ECD-Fc，侧脑注射
			高剂量组(78.6μg)	10	78.6μg/3μL p75ECD-Fc，侧脑注射

备注1：p75ECD-Fc蛋白可以参考本领域常规方法制备得到，特别参考CN102233128B公开的方法制备。

实验结果：

1、Zea-longa评分

Zea-longa量表评分按照先前报道的方法进行评估^[4]，在造模给药后1h、6h、12h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d进行评分。

结果(图4)表明，与假手术组(sham)比较，各模型组第1天和第一周的Zea-longa评分显著升高；与对照组(HI)比较，78.6μgp75ECD-Fc组评分显著降低(p＜0.05)，表明p75ECD-Fc可以剂量依赖性地降低缺氧缺血诱导的脑梗死面积。

2、梗死体积

给药7天后，将大鼠麻醉并实施安乐死。在大鼠大脑基质中快速采集大脑，并将其切成2毫米的冠状切片，然后浸入2％的2,3,5三苯基四唑氯溶液。将所有切片置于37℃的孵育室中30分钟，用多聚甲醛固定后，通过Image J Software计算梗死比:(对侧面积-同侧非梗死面积)/对侧面积×100％。

结果(图5、6)显示，与对照组(HI)比较，p75ECD-Fc各剂量组梗死体积和梗死率呈剂量依赖性减少(p＝0.005,p＝0.000,p＝0.001)。

3、翻正实验(Righting test)

翻正实验在给药后第7天进行，指的是幼鼠从仰卧位翻身的运动能力。首先，将幼鼠仰卧在一张棉床单或长凳垫子上，保持姿势5秒。释放幼崽后，记录幼崽转向的方向(向左或向右)和回到俯卧位的时间。每次试验1分钟，共3次试验。

结果(图7)显示，与假手术组(sham)比较，各模型组动物翻正时间显著延长，与对照组(HI)比较，p75ECD-Fc各剂量组动物翻正时间显著降低(p＝0.001,p＝0.000)，与低剂量组(10μg)比较，高剂量组(78.6μg)组动物翻正时间显著缩短(p＝0.029)。

4、负趋地性测试(Negative Geotaxis test)

负趋地性测试在给药后第7天进行，负趋地法评价幼龄大鼠运动协调能力。研究人员将幼犬的头朝下放置在一个45°的斜坡上，并保持5秒。随后，在释放幼鼠后，我们记录了它们转身朝上所花的时间以及方向(向左或向右)。每次试验时间约为2分钟，共进行3次重复试验，对从斜坡上掉下来且没有转弯的幼犬可以重新测试、淘汰或给予零分。

结果(图8)显示，与假手术组(sham)比较，对照组(HI)大鼠转身朝上所花时间明显增加(p＝0.000)；与对照组(HI)和低剂量组(10μg)组比较，高剂量组(78.6μg)大鼠转身朝上时间显著缩短(p＝0.010,p＝0.011)。

5、爬坡测试(Climbing Test)

爬坡测试在给药后第7天进行。幼崽被放置在一个45度倾斜的垫子上，垫子上设置一条线。研究人员记录了老鼠头朝下爬过一条线的时间。每只幼犬都重复进行三次实验。

结果(图9)显示，与对照组(HI)比较，随着浓度的增加，p75ECD-Fc各剂量组爬坡时间显著缩短(p＝0.005,p＝0.001,p＝0.000)。

6、Y迷宫实验(Y maze)

Y迷宫实验主要用于研究啮齿类动物空间记忆能力，在给药后第28天进行测试。在HI损伤后2个月进行Y迷宫试验。禁食1～2天后，大鼠体重降至原来体重的85％。在摄取食物的驱动下，他们被放置在仪器的中间，并允许他们在迷宫中移动10分钟。观察并记录每只老鼠进入各臂情况。每次5分钟，每天10分钟，连续3天。最后，我们同时打开Y-迷宫的三个臂的门，不放置食物，将老鼠放置在启动臂上，记录老鼠在5分钟内进入每个臂的次数和停留时间。

结果(图10)显示，与假手术组(sham)比较，对照组(HI)动物在食物臂的时间明显缩短(p＝0.000)，p75ECD-Fc各剂量组在食物臂的时间显著延长(p＝0.004,p＝0.002,p＝0.005)。

7、旷场实验(Open field)

在给药后第31天采用开放式测试对大鼠的运动活动、自主行为、探究行为和对新环境的适应能力进行评价。实验在自由探测野外设备上进行，长100cm×宽100cm×高40cm，平均分成25个正方形(4cm×4cm)。在正式试验前，允许每只大鼠连续3天每天在10分钟内适应新环境。此后，第4天连续试验5min。在紧张的环境下，幼崽可能会表现出奇怪的行为，毛发和羽毛会重新排列，并伴有皮肤的感官刺激。相反，梳毛行为是用来表示幼崽处于放松的状态。用摄像机记录正规实验中大鼠行走的总距离、梳毛次数、梳毛时间、运动轨迹、饲养次数和饲养时间，并采用SuperMaze V2.0软件进行分析。

结果显示，与假手术组(sham)相比，对照组(HI)大鼠在旷场的总行走缩短(图11，p＝0.014)，而中剂量(30μg)组大鼠总行走距离明显增加(图11，p＝0.026)。HI损伤后，大鼠的梳毛次数和梳毛时间显著增加，高剂量组(78.6μg)的梳毛次数(图12，p＝0.001)和梳毛时间(图13)显著减少(p＝0.001,p＝0.005)；此外，与对照组(HI)相比，p75ECD-Fc各剂量组尤其是高剂量组(78.6μg)大鼠后肢站立次数(图14)和站立时间(图15)明显增加(p＝0.002,p＝0.000,p＝0.014,p＝0.011,p＝0.008)。

8、旋转棒实验(Rotarod)

旋转棒试验在给药后第33天进行。在实验前3天，我们对每组大鼠进行适应性训练，然后将大鼠放置在旋转杆上，以适应杆上的运动。杆的转速设置为30-35rpm/min。每天训练5～10分钟，连续3天。然后在正式实验中，我们设置旋转杆在3分钟内从4rpm/min加速到40rpm/min，并记录大鼠在旋转杆上停留的时间。试验每天连续进行3次，记录最长时间。

结果(图16)显示，与假手术组(sham)相比，HI损伤大鼠在棒上的停留时间明显缩短(p＝0.000)，而中剂量组(30μg)的停留时间增加(p＝0.015)。

9、Morris水迷宫实验(Morris water maze)

Morris水迷宫用于检测大鼠空间记忆能力，在给药后第40天进行测试。水池被平均划分为四个象限，平台放置在其中一个象限的中心。在水池中加入墨水是为了隐藏小圆桌在水池中。老鼠被放置在四个象限的中点。每只老鼠连续5天，每天4个象限训练90秒。在训练过程中，如果大鼠在90秒内没有找到平台，则由实验室工作人员进行指导。实验第六天，平台被拆除，90秒探索训练开始。老鼠被放置在原平台象限相反一边的水中。记录在目标象限(平台最初放置的象限)所花费的时间。大鼠进入象限的次数和大鼠穿过平台的次数被用来测量空间记忆。最后，每次实验结束后，老鼠都被晾干，然后回到家中的笼子里。训练间隔为15-20分钟。

结果显示：中剂量组(30μg)组和高剂量(78.6μg)组5天内的潜伏期明显降低(图17,p<0.05)。在训练最后一天，HI大鼠的总行走距离明显长于假手术大鼠(p＝0.010)，高剂量组(78.6μg)的总行走距离明显短于对照组(HI)(图18,p＝0.021)。与HI组相比，p75ECD-Fc各剂量组穿越平台次数显著增加(图19,p＝0.040,p＝0000)。

10、神经损伤严重缺损评分(Neurological Severity Scores,NSS)

在给药后第46天根据文献^[5]方法采用NSS系统评估神经功能缺损的严重程度。评估包括感官(视觉、触觉、本体感觉)、运动(肌肉状态、异常运动)、平衡测试和放松0-18分(0，正常分；18，最大缺陷评分)。

结果(图20)显示，与假手术组(sham)相比，对照组(HI)NSS评分明显升高；与对照组(HI)相比，p75ECD-Fc各剂量组NSS评分明显降低(p＝0.000,p＝0.021,p＝0.005,p＝0.011,p＝0.000)。

11、Nissl染色、HE染色

在给药后第48天用3％异氟醚(吸入麻醉)麻醉大鼠。用0.9％生理盐水灌注后用4％多聚甲醛固定。老鼠被处死后，收集大脑组织置于4％多聚甲醛超过72h。石蜡包埋,制备大脑切片(5μm)用于HE染色、Nisssl染色。

Nissl染色结果(图21-26)：与假手术组(sham)比较，对照组(HI)组大鼠的大脑皮层和海马神经元数量显著降低(p＝0.026,p＝0.000)，而死亡神经元数量显著增加(p＝0.005,p＝0.000)，不同剂量的p75ECD-Fc促进了神经元的存活,其数量在大脑皮层显著升高(p＝0.018,p＝0.015,p＝0.045)和海马(p＝0.008,p＝0.001,p＝0.002),而中剂量自(30μg)和高剂量组(78.6μg)大脑皮层(p＝0.016,p＝0.008)和海马(p＝0.018,p＝0.000)神经元死亡明显减少。海马中，中剂量组(30μg)组和高剂量组(78.6μg)组死亡神经元数量明显少于低剂量组(10μg)组(p＝0.025,p＝0.000)，并且高剂量组(78.6μg)神经元数量少于中剂量组(30μg)(p＝0.019)。

HE染色结果(图27)：假手术组(sham)大鼠细胞形态呈卵圆形，在大脑皮层和海马区分布较均匀，而对照组(HI)细胞胞体明显收缩，核凝结或碎裂，与周围细胞连接疏松。中剂量组(30μg)和高剂量组(78.6μg)正常细胞数量增加，高剂量组效果更明显。此外，在对照组(HI)中，海马丢失的比例很大，可见海马区出现大空洞，右皮层厚度也显著降低。相反，在所有p75ECD-Fc治疗组中，海马和皮质体积都受到剂量依赖的保护和保存。

以上结果表明：不同剂量的p75ECD-Fc可以明显减轻HI诱导脑损伤及急性和长期神经功能障碍，对大鼠神经元存活和再生具有促进作用，

实施例3

78.6μg p75ECD-Fc与低温治疗对HI大鼠神经保护作用的比较动物造模同实施例2。

分组及给药：将50只大鼠，随机分成5组，假手术组(sham),对照组(HI)、p75ECD-Fc组(HI+p75ECD-Fc)、低温治疗组(HI+TH)和联合治疗组(HI+p75ECD-Fc+TH)，每组10只。对照组(HI)和假手术组(Sham)注射3μL生理盐水，p75ECD-Fc组侧脑注射78.6μg/3μLp75ECD-Fc，低温治疗组(TH)将造模后大鼠放入32℃保温箱中治疗5h，联合治疗组(p75ECD-Fc+TH)在造模后先侧脑注射78.6μg/3μLp75ECD-Fc，随后迅速放入32℃保温箱治疗5h。

TTC染色、Zea-longa评分、翻正测试(Righting test)、负趋地性测试(Negativegeotaxis test)、爬坡测试(Climbing test)实验方法同实施例2。

结果：与假手术组(sham)相比，对照组(HI)大鼠Zea-longa评分(图28)显著升高(p<0.05)，而p75ECD-Fc大鼠在治疗48h后明显低于HI大鼠(p<0.05)。与对照组(HI)相比，HI+TH组、HI+p75ECD-Fc组和HI+TH+p75ECD-Fc组水肿(图29)、梗死面积(图30、31)显著下降(p＝0.000)。同时，在翻正试验(图32)、负趋地性试验(图33)和爬坡试验(图34)中，HI大鼠得分均较假手术大鼠升高(p＝0.000)，而HI+TH组、HI+p75ECD-Fc组和HI+TH+p75ECD-Fc组得分明显降低。在爬坡实验中，p75ECD-Fc治疗组(HI+p75ECD-Fc)得分显著低于低温治疗组(HI+TH)(p＝0.000)。上述结果表明，78.6μg p75ECD-Fc对HI模型大鼠的治疗作用优于低温治疗。

以上具体实施方式的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明的技术方案进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入本发明权利要求请求保护的范围内。

参考文献

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序列表

<110> 苏州澳宗生物科技有限公司

<120> p75细胞外结构域在新生儿缺氧缺血性脑病治疗和/或预防中的应用

<130> SPI220558-73

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60

ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg 120

gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag 180

tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgccg tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc 240

tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc 300

gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag 360

tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc 420

gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc 480

gaggagatcc ctggccgttg gattacagac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 540

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 600

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 660

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 720

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 780

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 840

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 900

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 960

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1020

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1080

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1140

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1188

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys

1 5 10 15

Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln

20 25 30

Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val

35 40 45

Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln

50 55 60

Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys

85 90 95

Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys

100 105 110

Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu

115 120 125

Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr

130 135 140

Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu

145 150 155 160

Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser

165 170 175

Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln

180 185 190

Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly

195 200 205

Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn

210 215 220

<210> 3

<211> 1188

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human p75ECD - linker - human Fc fusion

<400> 3

aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60

ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg 120

gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag 180

tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgccg tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc 240

tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc 300

gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag 360

tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc 420

gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc 480

gaggagatcc ctggccgttg gattacagac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 540

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 600

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 660

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 720

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 780

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 840

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 900

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 960

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1020

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1080

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1140

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1188

<210> 4

<211> 396

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human p75ECD - linker - human Fc fusion

<400> 4

Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys

1 5 10 15

Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn

20 25 30

Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val

35 40 45

Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu

50 55 60

Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg

65 70 75 80

Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp

100 105 110

Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp

115 120 125

Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp

130 135 140

Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys

145 150 155 160

Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

165 170 175

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

180 185 190

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

195 200 205

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

210 215 220

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

225 230 235 240

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

245 250 255

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

260 265 270

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

275 280 285

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

290 295 300

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

325 330 335

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

340 345 350

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

355 360 365

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

370 375 380

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385 390 395

<210> 5

<211> 2217

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Adeno-associated virus (AAV)8 capsid sequence with an AAV2

phospholipase domain

<400> 5

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240

cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300

caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360

gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420

ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480

ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540

gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600

cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660

ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720

atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780

atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840

ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900

cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcagcttcaa gctcttcaac 960

atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taacctcacc 1020

agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc cgtacgttct cggctctgcc 1080

caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca tgattcccca gtacggctac 1140

ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct ccttctactg cctggaatac 1200

tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt ttacttacac cttcgaggac 1260

gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg accggctgat gaatcctctg 1320

attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa caggaggcac ggcaaatacg 1380

cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg ccaatcaggc aaagaactgg 1440

ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga caaccgggca aaacaacaat 1500

agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga atggaagaaa ttcattggct 1560

aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg agcgtttttt tcccagtaac 1620

gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc 1680

atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg tggctacaga ggaatacggt 1740

atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc aaattggaac tgtcaacagc 1800

cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860

tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt 1920

ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct 1980

ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca cgcaatacag caccggacag 2040

gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaaccccgag 2100

atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa 2160

ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217

Claims

1.p75细胞外结构域(p75ECD)或其功能性片段、变体、类似物或衍生物在制备用于治疗和/或预防新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)的药物中的用途。

2.权利要求1所述的用途，其中所述p75ECD包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体，或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其变体组成。

3.权利要求1所述的用途，其中所述p75ECD被融合到免疫球蛋白的Fc结构域，以形成p75ECD-Fc融合体，其中所述p75ECD-Fc包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体，或由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其变体组成。

4.权利要求3所述的用途，其中所述p75ECD-Fc融合体以p75ECD-Fc融合体腺相关病毒(AAV)载体的形式给药，例如以SEQ ID NO:5的形式给药。

5.权利要求3所述的用途，其中所述p75ECD-Fc融合体是重组肽。

6.权利要求1-5任一项所述的用途，其中所述p75ECD通过静脉内、腹膜内、脑室内、鞘内或肌内注射来给药。

7.权利要求4所述的用途，其中所述p75ECD-Fc融合体AAV载体以1×10⁶-11×10¹³个病毒基因组/kg对象体重的剂量给药，优选以1×10⁸-11×10¹³个病毒基因组/kg对象体重的剂量给药。

8.权利要求5所述的用途，其中所述p75ECD-Fc融合体重组肽每天以0.1-250mg/kg对象体重的剂量给药，优选每天以0.5-20mg/kg对象体重的剂量给药。

9.权利要求1所述的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防NHIE的对象是人类。