ES2216134T3 - Utilizaciones del factor de crecimiento de los queratinocitos 2)(kgf-2). - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE LA PROTEINA KGF-2 COMO AGENTE TERAPEUTICO, ADECUADAMENTE FORMULADA EN UNA COMPOSICION FARMACEUTICA, PARA EL TRATAMIENTO ESPECIFICO DE ESTADOS PATOLOGICOS Y CONDICIONES MEDICAS QUE AFECTAN A TEJIDOS Y ORGANOS TALES COMO EL OJO, EL OIDO, LAS ENCIAS, EL PANCREAS, LA VEJIGA URINARIA, EL HIGADO Y EL TRACTO GASTROINTESTINAL.

Description

Utilizaciones del factor de crecimiento de los queratinocitos 2(KGF-2).

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de los productos proteicos del factor de crecimiento de los queratinocitos 2 (KGF-2) para estimular la proliferación, el crecimiento y la diferenciación de una variedad de células epiteliales.

Antecedentes de la invención

El complejo procedimiento de generación y regeneración de tejidos está mediado por numerosos factores proteicos referidos a veces como factores de crecimiento de tejido blando. Estas moléculas son liberadas generalmente por un tipo de célula y actúan influyendo en la proliferación de otros tipos de células (Rubin y col. (1.989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806). También existen algunos factores de crecimiento liberados de células que tienen a su vez la capacidad de responder a tales factores de crecimiento. Algunos factores de crecimiento de tejidos blandos son secretados por tipos de células concretos e influyen en la proliferación, la diferenciación, y/o la maduración de células sensibles en el desarrollo de organismos multicelulares (Finch y col. (1.989), Science, 245:752-755). Además de sus papeles en el desarrollo de organismos, algunos factores de crecimiento de tejidos blandos son significativos en la salud y el mantenimiento continuos de sistemas más maduros. Por ejemplo, en mamíferos existen muchos sistemas en los que se produce un rápido recambio celular. Entre tales sistemas se incluyen la piel y el tracto gastrointestinal, ambos los cuales están formados por células epiteliales. En este grupo de factores de crecimiento de tejidos blandos se encuentra incluida la familia de proteínas de los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF).

Se sabe ahora que la familia de los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF) consta de al menos catorce miembros, esto es FGF-1 a FGF-10 y los factores homólogos FHF-1 a FHF-4, que comparten una relación entre estructuras primarias: el factor de crecimiento de los fibroblastos básico, bFGF (Abraham y col. (1.986), EMBO J., 5:2523-2528), el factor de crecimiento de los fibroblastos ácido aFGF (Jaye y col. (1.986), Science, 233:541-545); el producto del gen int-2, int-2 (Dickson & Peters (1.987), Nature, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi y col. (1.987), Cell, 50:729-737 y Yoshida y col. (1.987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan y col. (1.988), Mol. Cell. Biol., 8:3487-3495); FGF-6 (Marics y col. (1.989), Oncogene, 4:335-340); el factor de crecimiento de queratinocitos, KGF (Finch y col. (1.989), Science, 24:752-755); la hisactofilina (Habazzettl y col. (1.992), Nature, 359:855-858); FGF-9 (Miyamoto y col. (1.993), Mol. Cell Biol., 13(7):4251-4259); y el factor de crecimiento de fibroblastos-10, también conocido como factor de crecimiento de queratinocitos-2, KGF-2 (solicitud de patente PCT WO 96/25422). Más recientemente, se identificaron cuatro factores homólogos (o "FHF") a partir de la retina humana mediante una combinación de secuenciación de ADN al azar, investigaciones de bases de datos de secuencias existentes y reacciones en cadena de la polimerasa basadas en la homología (Smallwood y col. (1.996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9850-9857). Se ha propuesto que FHF-1, FHF-2, FHF-3 y FHF-4 deberían ser designados FGF-11, FGF-12, FGF-13 y FGF-14, respectivamente, según la recomendación del Nomenclature Committee (Coulier y col. (1.977), Journal of Molecular Evolution, 44:43-56).

En WO 96/25422 se describe la clonación, expresión y purificación de KGF-2 en toda su longitud (con la secuencia señal, restos Met^{1} a Thr^{36} de la SEC ID NUM: 2) y maduro (sin secuencia señal, restos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2) en un sistema de expresión bacteriano (v.g., E. coli) y en sistemas de expresión eucariotas (v.g., baculovirus y células COS). En esta referencia se ilustra adicionalmente que KGF-2 podría ser útil para estimular el crecimiento y la proliferación celular para el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos o angiogénesis, la prevención de la pérdida del cabello, la curación de heridas dérmicas y la diferenciación de células musculares, tejido nervioso, células de la próstata y células de pulmón.

Aunque KGF-2 es un miembro de la familia de FGF, los efectos físicos e in vivo entre los miembros de la familia no son los mismos. Por ejemplo, es bien sabido que aFGF, bFGF y KGF responden a la heparina de diferentes maneras. La actividad mitogénica de aFGF es sustancialmente incrementada en presencia de heparina, pero la actividad mitogénica de bFGF en presencia de heparina sólo se incrementa mínimamente, a pesar del hecho de que la heparina se une íntimamente a bFGF. En contraste, la incorporación de timidina por células BALB/MK es inhibida cuando la heparina es incluida con KGF en el medio de cultivo (Ron y col. (1.993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Por otra parte, se sabe que aFGF y bFGF se unen al mismo receptor, pero KGF también tiene diferentes receptores sobre los fibroblastos NIH/3T3 de los receptores de aFGF y bFGF sobre los fibroblastos NIH/3T3, que fracasan al interaccionar con KGF (Bottaro, y col. (1.990), J. Biol. Chem., 265, 12767-12770). Adicionalmente, KGF es distinto de aFGF y bFGF ya que no es mitógeno para los fibroblastos o las células endoteliales (Rubin y col. (1.989), Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806).

De hecho, el perfil de expresión de KGF-2 es bastante diferente de los de los otros miembros de la familia de FGF (Yamasaki y col. (1.996), J. Biol. Chem., 271:15918-15921). KGF-2 tiene presumiblemente un único papel fisiológico, no habiéndose elucidado su actividad biológica (Emoto y col. (1.997), J. Biol. Chem., 272(37):23191-23194).

Por lo tanto, queda mucho por aprender referente a KGF-2 como factor de crecimiento, incluyendo las células epiteliales en tipos adicionales de órganos y tejidos a los cuales KGF-2 puede ser dirigido y el efecto de KGF-2 sobre tales células.

Compendio de la invención

Esta invención se refiere al uso in vitro del producto o los productos proteicos de KGF-2, definidos más abajo, para inducir la estimulación (incluyendo citoprotección, proliferación y/o diferenciación) de las células epiteliales del ojo, el oído, las encías, el páncreas (exocrino y endocrino), el timo, el tiroides, la vejiga urinaria, el hígado y/o el tracto gastrointestinal incluyendo células de la cavidad oral, el estómago glandular y el intestino delgado, el colon y otras células de la mucosa intestinal. Adicionalmente se refiere al uso de una o varias proteínas de KGF-2 para la producción de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un estado en un paciente que padece un estado seleccionado entre abrasión de la córnea o ulceraciones de la córnea, enfermedades de las encías, lesión del tímpano, gastritis erosiva, esofagitis o reflujo esofágico, o ulceración o estados inflamatorios de la vejiga urinaria.

Breve descripción de los dibujos

Numerosos aspectos y ventajas de la presente invención se harán evidentes tras la revisión de las Figuras, en las que:

La Figura 1 representa una secuencia de ADNc (SEC ID NUM: 1) que codifica el KGF-2 humano recombinante en toda su longitud. Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NUM: 2) del KGF-2 humano recombinante en toda su longitud. Los 36 restos aminoácido iniciales (Met^{1} a Thr^{36}) representan la supuesta secuencia líder de KGF-2 en toda su longitud y los restos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 representan el KGF-2 maduro. Las formas en toda su longitud y madura se denominan colectivamente "KGF-2".

La Figura 2 representa una secuencia de ADN (SEC ID NUM: 3) que codifica His rFGF10. Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NUM: 4) de His rFGF10.

La Figura 3 representa una secuencia de ADNc (SEC ID NUM: 5) que codifica hFGF10. Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NUM: 6) de hFGF10.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, el producto o los productos de la proteína KGF-2, como se describirá más cuidadosamente más abajo, pueden ser utilizados in vitro para inducir la estimulación (incluyendo citoprotección, proliferación y/o diferenciación) de las células epiteliales del ojo, el oído, las encías, la vejiga urinaria y las células de la cavidad oral.

Esta invención tiene por tanto implicaciones significativas en términos de capacitación de la aplicación del producto o los productos de la proteína KGF-2 específicamente caracterizadas por el uso profiláctico y terapéutico de KGF-2 para reducir, retrasar y/o bloquear el comienzo de la lesión o las deficiencias en estos tipos concretos de células. Lo siguiente es una descripción de las enfermedades y los estados médicos que pueden ser tratados con el producto o los productos de la proteína KGF-2 según la invención.

Las células de la córnea pueden ser dañadas por abrasión de la córnea y/o ulceraciones corneales debidas a agentes químicos, bacterias o virus. El producto o los productos de la proteína KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la degeneración de la córnea. Se conocen modelos normalizados in vivo de regeneración de la células de la córnea (Inatomi y col. (1.994), Investigative Ophtalmology and Visual Science, 35(4):1318, Abstract 299; Sotozono y col. (1.994), Investigative Ophtalmology and Visual Science, 35(4):1941, Abstract 317; Wilson y col. (1.994), Investigative Ophtalmology and Visual Science, 35(4):1319, Abstract 301; Wilson y col. (1.993), The FASEB Journal, 7(3):A493, Abstract 2857; Inatomi y col. (1.994), Investigative Ophtalmology & Visual Science, 35(4):1318; Wilson y col. (1994), Experimental Eye Research, 59(6):665-678; y Sotozono y col. (1.995), Investigative Ophtalmology & Visual Science, 36(8):1524-1529.

El producto o los productos de la proteína KGF-2 son útiles para prevenir y/o tratar enfermedades de la encía. Se conocen modelos in vivo normalizados de enfermedades de las encías.

El producto o los productos de la proteína KGF-2 son útiles para prevenir y/o tratar la ulceración y/o los estados inflamatorios, incluyendo estados relacionados con la quimioterapia (como los tratados antes) y/o las infecciones. Se conocen modelos in vivo normalizados de lesión de la vejiga urinaria (Ford y Hess (1.976), Arch. Intern. Med., 136:616-619 y Droller, y col. (1.982), Urol., 20:256-258.

El producto o los productos de la proteína KGF-2 son útiles para prevenir y/o tratar la lesión del tímpano. Se conocen modelos in vivo normalizados de perforaciones de la membrana timpánica (Clymer y col. (1.996), Laryngoscope (USA), 106(3):280-285.

Proteína o proteínas de KGF-2

Según los términos de esta invención, por el término "proteína o proteínas de KGF-2" se quiere significar la proteína definida por los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 (KGF-2 maduro) y las proteínas variantes de la misma. En el término "proteína o proteínas de KGF-2" se incluye por tanto una proteína en la cual uno o más restos aminoácido han sido suprimidos ("variante o variantes por deleción"), insertado ("variante o variantes por adición"), y/o sustituido ("variante o variantes por sustitución") de los restos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NUM: 2 y que conserva actividad biológica. Por tanto, si bien las descripciones de más abajo de las modificaciones de la proteína hacen referencia al KGF-2 maduro, no excluyen modificaciones adicionales para ésta.

El término "actividad biológica" utilizado aquí significa que una o varias proteínas de KGF-2 poseen algunas pero no necesariamente las mismas propiedades (y no necesariamente en el mismo grado) que el KGF-2 maduro. La selección de las propiedades de interés concretas depende del uso deseado de la proteína o las proteínas de KGF-2 deseadas.

La variante o las variantes específicas del KGF-2 maduro se describen en la Solicitud de Patente PCT Núm. US 97/18607, presentada en la misma fecha que la presente, por Nahri y Osslund, titulada en la carta de transmisión de la Solicitud de Patente "VARIANTS OF KERATINOCYTE GROWTH FACTOR-2".

Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar muchas combinaciones de deleciones, inserciones, y sustituciones, siempre que la proteína final sea biológicamente activa. Existen dos variables principales en la construcción de variantes de la secuencia de aminoácidos: la localización del sitio de la mutación y la naturaleza de la mutación. Al diseñar la variante o las variantes, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la característica o las características bioquímicas que se vayan a modificar. Los sitios de mutación pueden ser modificados individualmente o en serie, v.g., (1) suprimiendo el resto aminoácido diana, (2) insertando los restos aminoácido adyacentes al sitio localizado o (3) sustituyendo primero con elecciones de aminoácidos conservativos y, dependiendo de los resultados logrados, después con selecciones más radicales.

Las deleciones de la secuencia de aminoácidos oscilan generalmente de aproximadamente 40 restos aminoácido, de aproximadamente 30 aminoácidos, de aproximadamente 20 aminoácidos, y típicamente de aproximadamente 1 a 10 restos. Las deleciones en la secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro se pueden realizar, por ejemplo, en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia de FGF. Las deleciones en la secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro en áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia de FGF modificarán más probablemente de forma sustancial la actividad biológica. El número de deleciones totales y/o deleciones consecutivas se seleccionará preferiblemente con el fin de conservar la estructura terciaria del KGF-2 maduro en el dominio afectado, v.g., entrecruzamiento con cisteína.

Entre las adiciones en la secuencia de aminoácidos se pueden incluir fusiones amino- y/o carboxi- terminales que oscilan en longitud desde un resto a cien o más restos, así como inserciones intra-secuencia internas de restos aminoácido individuales o múltiples. Las adiciones internas pueden oscilar preferiblemente de aproximadamente 1 a 10 restos aminoácido, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 5 restos aminoácido, y muy preferiblemente de aproximadamente 1 a 3 restos aminoácido. Las adiciones en la secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro se pueden realizar en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia de FGF. Las adiciones en la secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro en áreas de homología sustancial con las secuencias de la familia de FGF modificarán más probablemente de manera significativa la actividad biológica. Entre las inserciones o adiciones se incluyen preferiblemente secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias de otros miembros de la familia de FGF.

Se contempla que una adición en el extremo amino incluya la adición de una metionina (por ejemplo, como artefacto de la expresión directa en un cultivo de células recombinantes bacterianas) o un resto aminoácido o secuencia de KGF-2 maduro. En un ejemplo adicional de una adición N-terminal incluye la fusión de una secuencia señal en el extremo N del KGF-2 maduro con el fin de facilitar la secreción de proteína desde las células huésped recombinantes. Tales secuencias señal se obtendrán generalmente a partir de, y por tanto serán homólogas a, la especie de la célula huésped pretendida. Dentro del alcance de esta invención está incluida la secuencia señal nativa, por ejemplo, la secuencia señal nativa de la proteína definida por los aminoácidos Met^{1} a Thr^{36} de la SEC ID NUM: 2 o una secuencia señal heteróloga. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y transformada (v.g., escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y transforman la secuencia señal nativa, se puede sustituir la secuencia señal por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa o la enterotoxina II térmicamente estable. Para la secreción en levadura, la secuencia señal puede ser seleccionada, por ejemplo, del grupo de las secuencias líder de la invertasa de levadura, el factor alfa o la fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamíferos específicamente, pueden ser adecuadas las secuencias señal de KGF-2 en toda su longitud o de otros miembros de la familia de FGF (v.g., KGF).

En un ejemplo de una adición en el extremo carboxi se incluyen proteínas quiméricas que comprenden la fusión de KGF-2 con todo o parte del dominio constante de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana. Se prefieren semejantes polipéptidos quiméricos en los que la porción de inmunoglobulina comprende todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana tal como IgG, IgA, IgM o IgE, especialmente IgG, v.g., IgG1 o IgG3. Un artesano experto apreciará que cualquier aminoácido de la porción de inmunoglobulina puede ser suprimido o sustituido por uno o más aminoácidos, o uno o más aminoácidos pueden ser añadidos con tal que la porción de KGF-2 estimule todavía las células epiteliales y la porción de inmunoglobulina muestre una o más de sus propiedades características.

Otro grupo de variantes es la variante por sustitución de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de KGF-2 maduro. Estas variantes tienen al menos un resto aminoácido en la secuencia de Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 separado y un resto diferente insertado en su lugar. Entre las variantes por sustitución se incluyen las variantes alélicas, que se caracterizan por cambios en la secuencia de nucleótidos de origen natural en la población de la especie que pueden producir o no un cambio de aminoácido. Un experto en la técnica puede utilizar cualquier información conocida sobre la unión o el sitio activo del polipéptido en la selección de posibles sitios de mutación.

Un método para identificar restos aminoácido o las regiones para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", como describen Cunningham y Wells (1.989), Science, 244:1081-1085, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. En este método, un resto aminoácido o grupo de restos diana es identificado (v.g., restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) y remplazado por un aminoácido neutro o cargado negativamente (muy preferiblemente alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso circundante dentro o fuera de la célula. Estos dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones son refinados después introduciendo restos adicionales o alternativos en los sitios de sustitución. De este modo, se determina previamente el sitio para introducir una modificación en la secuencia de aminoácidos y, para optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar el barrido de alanina o la mutagénesis al azar y las variantes pueden ser rastreadas en cuanto a la combinación óptima de actividad deseada y al grado de actividad.

Entre los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución se incluyen lo sitios en los que los restos concretos en los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 son sustancialmente diferentes entre las diversas especies u otros miembros de la familia de FGF en términos del grueso de la cadena lateral, carga, y/o carácter hidrófobo. Entre otros sitios de interés se incluyen aquellos en los que los restos concretos en los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2, son idénticos entre las diversas especies u otros miembros de la familia de FGF. Tales posiciones son generalmente importantes para la actividad biológica de una proteína. Por consiguiente, un artesano experto apreciará que inicialmente estos sitios deben ser modificados por sustitución de una manera relativamente conservativa.

Tales sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento "Sustituciones Preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, se pueden introducir más cambios sustanciales (Sustituciones Ejemplares) y/o se pueden realizar otras adiciones/deleciones y rastrear los productos resultantes.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos

1

Al realizar semejantes cambios de una naturaleza equivalente, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. Generalmente se conoce en la técnica la importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir una función biológica interactiva a la proteína, Kyte y Doolittle (1.982), J. Mol. Biol., 157:105-131. Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático o puntuación similar y todavía conserven una actividad biológica similar.

Asimismo se sabe en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede ser realizada eficazmente basándose en el carácter hidrófilo, concretamente cuando la proteína o el péptido con una función biológica equivalente creado de ese modo está destinado al uso en realizaciones inmunológicas, como en el presente caso. En la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, cuya descripción se incorpora aquí como referencia, se establece que el mayor carácter hidrófilo medio de una proteína, gobernado por el carácter hidrófilo de sus aminoácidos adyacentes, se corresponde con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

En la Patente de los Estados Unidos 4.554.101 también se ilustra la identificación y preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos primarias basándose en su carácter hidrófilo. Por medio de los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos 4.554.101 un artesano experto sería capaz de identificar epítopos, por ejemplo, dentro de la secuencia de aminoácidos de KGF-2. Estas regiones también son referidas como "regiones de núcleo epitópico". Numerosas publicaciones científicas han sido dedicadas a la predicción de la estructura secundaria, y a la identificación de epítopos, a partir de análisis de las secuencias de aminoácidos (Chou y Fassman (1.974), Biochemistry, 13(2):222-245; Chou y Fassman (1.974), Biochemistry, 13(2):211-222; Chou y Fassman (1.978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Chou y Fasman (1.978), Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou y Fasman (1.979), Biophys. J., 26:367-384. Por otra parte, se encuentran disponibles actualmente programas de ordenador para ayudar a predecir las porciones antigénicas y las regiones del núcleo epitópico de las proteínas. Entre los ejemplos se incluyen aquellos programas basados en el análisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf (1.988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 y Wolf y col. (1.988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia); el programa PepPlot® (Brutlag y col. (1.990), CABS, 6:237-245 y Weinberger y col. (1.985), Science, 228:740-742; y otros programas nuevos para la predicción de la estructura terciaria de las proteínas (Fetrow y Bryant (1.993), BIOTECHNOLOGY, 11:479-483).

En contraste, se pueden lograr modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga relativa o el carácter hidrófobo de la proteína en el sitio diana o (c) el grueso de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basados en las propiedades de la cadena lateral común.

1)

hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2)

hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;

3)

ácidos: Asp, Glu;

4)

alcalinos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

5)

restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6)

aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de estos grupos por otro. Tales restos sustituidos pueden ser introducidos en las regiones de los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 que, por ejemplo, son homólogas a las regiones de otros miembros de la familia de FGF o en las regiones no homólogas de la proteína.

En una realización específica, un polipéptido variante será preferiblemente sustancialmente homólogo a los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2. El término "sustancialmente homólogo" según se utiliza aquí, significa que tiene un grado de homología (es decir, identidad en la secuencia de aminoácidos) con los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 de más del ochenta por ciento (80%); preferiblemente, de más del noventa por ciento (90%); más preferiblemente, de más del noventa y cinco por ciento (95%); y muy preferiblemente de más del noventa y nueve por ciento (99%). El porcentaje de homología según se describe aquí se calcula como el porcentaje de restos aminoácido encontrados en la más pequeña de las dos secuencias que se alinean con idénticos restos aminoácido en la secuencia que está siendo comparada cuando se pueden introducir cuatro espacios en una longitud de 100 aminoácidos para ayudar en ese alineamiento, como muestra Dayhoff (1.972), en Atlas of Protein Sequence and Estructure, 5:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. Asimismo se incluyen como sustancialmente homólogas las variantes de los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 que pueden ser aislados en virtud de la reactividad cruzada con anticuerpos para los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2, o cuyos genes pueden ser aislados por medio de hibridación con el ADN de la SEC ID NUM: 1 o con los segmentos del mismo.

Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar muchas combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones, siempre que la proteína o las proteínas de KGF-2 finales sean biológicamente activas. Una proteína de KGF-2 puede ser rastreada rápidamente para evaluar sus propiedades físicas. Por ejemplo, el nivel de actividad biológica (v.g., unión al receptor y/o afinidad, actividad mitogénica, de proliferación celular y/o in vivo) puede ser sometido a ensayo utilizando una variedad de análisis. En uno de tales análisis se incluye un análisis mitogénico para someter a ensayo la capacidad de una proteína para estimular la síntesis de ADN (Rubin y col. (1.989), supra. En otro de tales análisis se incluye un análisis de proliferación celular para someter a ensayo la capacidad de una proteína para estimular la proliferación celular (Falco y col. (1.989), Oncogene, 2:573-578.

Derivados polipeptídicos

Los derivados de la proteínas o las proteínas de KGF-2 modificados químicamente en los que el polipéptido está conectado a un polímero con el fin de modificar las propiedades (referidos aquí como "derivados"), están incluidos en el alcance de la presente invención. Los derivados de la proteína o las proteínas de KGF modificados químicamente pueden ser preparados por un experto en la técnica dadas las descripciones de la presente. Los productos conjugados pueden ser preparados utilizando proteínas de KGF-2 glicosiladas, no glicosiladas o des-glicosiladas. Típicamente, se utilizarán una o varias proteínas de KGF-2 no glicosiladas.

Entre los radicales químicos adecuados para la derivación se incluyen los polímeros solubles en agua. Los polímeros solubles en agua son deseables porque la proteína a la cual se ancla cada uno no precipitará en un entorno acuoso, tal como el entorno fisiológico. Preferiblemente, el polímero será farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o composición terapéuticos. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones tales como si el producto conjugado polímero/proteína será utilizado terapéuticamente y, si lo es, en el perfil terapéutico (v.g., la duración de la liberación sostenida; la resistencia a la proteolisis, los efectos, si los hay, sobre la dosificación, la actividad biológica; la facilidad de manipulación; el grado o la carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua sobre una proteína terapéutica).

Entre los polímeros solubles en agua, clínicamente aceptables, adecuados se incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG), polietilenglicol-proopionaldehído, copolímeros de etilenglicol/-propilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, carboxi-metilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maléico, poli(\beta-aminoácidos) (o bien homopolímeros o bien copolímeros al azar), poli(n-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol (PPG) y otros poli(óxidos de alquileno), copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polietoxilados (POG) (v.g., glicerol) y otros polioles polietoxilados, sorbitol polietoxilado, o glucosa polietoxilada, ácidos colónicos u otros polímeros carbohidratados, Ficoll o dextrano y mezclas de los mismos. Según se utiliza aquí, se pretende que polietilenglicol abarque cualquiera de las formas que han sido utilizadas para derivar otras proteínas, tales como mono-alcoxi(C1-C10)- o ariloxi-polietilenglicol. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua.

Los polímeros solubles en agua pueden tener cada uno cualquier peso molecular y pueden ser ramificados o no ramificados. Generalmente, a mayor peso molecular o a más ramificaciones, mayor proporción polímero:proteína. Los polímeros solubles en agua tienen cada uno típicamente un peso molecular medio entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido). Preferiblemente el peso molecular medio de cada polímero soluble en agua está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 40 kDa, más preferiblemente entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 35 kDa y muy preferiblemente entre aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 30 kDa.

Existen numerosos métodos de anclaje asequibles para los expertos en la técnica, incluyendo las reacciones de acilación o las reacciones de alquilación (preferiblemente para generar una proteína químicamente modificada en su extremo N) con una molécula soluble en agua reactiva. Ver, por ejemplo, EP 0.401.384, cuya descripción se incorpora aquí como referencia; ver también, Malik y col. (1.992), Exp. Haematol., 20:1028-1035; Francis (1.992), Focus on Growth Factors, 3(2):4-10, publicado por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, Londres N20 OLD, UK; EP 0.154.316; EP 0.401.384; WO 92/16221; WO 95/34326; WO 95/13312; WO 96/11953; Solicitud Internacional PCT Núm. US96/19459; y las otras publicaciones citadas aquí que hacen referencia a la PEGilación.

Una realización específica de la presente invención es una molécula de aldehído de monometoxi-polietilenglicol no ramificado que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20 kDa conjugada vía alquilación reductora con el extremo N de una o varias proteínas de KGF-2.

Formas polivalentes

Se pueden construir formas polivalentes, es decir, moléculas que comprenden más de un radical activo. En una realización, la molécula puede poseer al menos una proteína KGF-2 y, dependiendo de la característica de la forma polivalente deseada, al menos otra molécula.

En una realización, la proteína o las proteínas de KGF-2 pueden estar acopladas químicamente. Por ejemplo, se pueden acoplar una o varias proteínas de KGF-2 a un polímero soluble en agua divalente por medio de la tecnología de la pegilación descrita antes. Adicionalmente, se pueden acoplar una o varias proteínas de KGF-2 a biotina, y la biotina/proteína o proteínas de KGF-2 que están conjugadas se dejan reaccionar después con avidina, dando como resultado avidina/biotina/una o varias proteínas de KGF-2 tetravalente. La proteína o proteínas de KGF-2 también pueden ser acopladas covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los productos conjugados resultantes precipitados con IgM anti-DNP o anti-TNP para formar productos conjugados decaméricos.

En otra realización más, también se puede producir una proteína de fusión recombinante que tenga una o varias proteínas de KGF-2 donde cada molécula quimérica recombinante tenga una secuencia de una o varias proteínas de KGF-2, como se ha descrito antes, sustituida por los dominios variables de cualquiera o de ambas cadenas pesada y ligera de molécula de inmunoglobulina y que tenga todos o parte de los dominios constantes, pero al menos un dominio constante, de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, cada una de tales proteínas de fusión proteína de KGF-2/IgG1 puede ser producida a partir de dos genes quiméricos: una quimera de proteína o proteínas de KGF-2/cadena ligera kappa humana (proteína o proteínas KGF-2/Ck) y una quimera de proteína o proteínas de KGF-2/cadena pesada gamma-1 humana (proteína o proteínas de KGF-2/Cg-1). Tras la transcripción y la traducción de los dos genes quiméricos, como se describe más abajo, los productos génicos pueden ser ensamblados en una única molécula quimérica que tenga una o varias proteínas de KGF-2 desplegadas bivalentemente. Los detalles adicionales referentes a la construcción de tales moléculas quiméricas se describen en la Patente de los Estados Unidos 5.116.964, en la Publicación PCT Núm. WO 89/09622, en la Publicación PCT Núm. WO 91/16437 y en EP 315062.

En otra realización adicional más, también se pueden producir proteínas de fusión recombinantes en las que cada molécula quimérica recombinante tenga al menos una proteína de KGF-2, como se ha descrito antes, y al menos una porción de la región 186-401 de la osteoprotegerina (OPG), como se describe en la Solicitud de Patente Europea Núm. 96309363.8.

La producción de una o varias proteínas de KGF-2 se describe con mayor detalle más abajo. Tales proteínas pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o mediante síntesis química in vitro de la proteína o las proteínas de KGF-2 deseadas.

Polinucleótidos

Basándose en la presente descripción y utilizando la tabla de codones universales, un experto normal en la técnica puede determinar fácilmente toda la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína o proteínas de KGF-2.

Se pueden seguir las técnicas de expresión recombinante llevadas a cabo según las descripciones mostradas más abajo para producir y expresar las proteínas codificadas. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifique una o varias proteínas de KGF-2 en un vector apropiado, un experto en la técnica puede producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleótidos deseada. Las secuencias pueden ser utilizadas para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, se puede insertar un polinucleótido que codifique una o varias proteínas de KGF-2 en un vector de expresión. Introduciendo el vector de expresión en un huésped apropiado, se puede producir la proteína o las proteínas de KGF-2 deseadas en grandes cantidades.

Como se describe adicionalmente aquí, existen numerosos sistemas huésped/vector asequibles para la propagación de las secuencias de ácido nucleico deseadas y/o la producción de la proteína o las proteínas de KGF-2. Entre estos se incluyen, pero no están limitados a, vectores plasmídicos, virales y de inserción, y huéspedes procariotas y eucariotas. Un experto en la técnica puede adaptar un sistema huésped/vector que sea capaz de propagar o expresar ADN heterólogo para producir o expresar las secuencias de la presente invención.

Además, los expertos en la técnica apreciarán que, a la vista de la presente descripción, en las secuencias de ácido nucleico se incluyen los ácidos nucleicos 109 a 624 de la SEC ID NUM: 1, así como las secuencias de ácido nucleico degeneradas de los mismos, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las variantes de KGF-2 maduro y aquellas secuencias de ácido nucleico que hibridan (en condiciones de hibridación descritas en la sección de rastreo de genotecas de ADNc descrita más abajo, o condiciones equivalentes o condiciones más rigurosas) con los complementos de los ácidos nucleicos 109 a 624 de la SEC ID NUM: 1.

Asimismo la presente invención proporciona constructos de ADN recombinantes que implican un ADN vector junto con las secuencias de ADN que codifican una o varias proteínas de KGF-2. En cada uno de tales constructos de ADN, la secuencia de ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de KGF-2 (con o sin péptidos señal) es una asociación operativa con una secuencia de control de la expresión o reguladora adecuada capaz de dirigir la replicación y/o la expresión de la proteína o proteínas KGF-2 en un huésped seleccionado.

Preparación de polinucleótidos

Se puede obtener fácilmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de KGF-2 de diversas maneras incluyendo, sin limitación, la síntesis química, el rastreo de genotecas de ADNc o genómicas, el rastreo de genotecas de expresión, y/o la amplificación mediante PCR del ADNc. Estos métodos y otros que son útiles para aislar tales secuencias de ácido nucleico las exponen Sambrook y col. (1.989), en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y col., (1.994), en eds. Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; y Berger y Kimmel (1.987), en Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, Ca.

La síntesis química de las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas deseadas puede ser completada utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como los mostrados por Engels y col. (1.989), en Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 y Wells y col. (1.985), Gene, 34:315. Entre estos métodos se incluyen, entre otros, los métodos de síntesis de secuencias de ácido nucleico del fosforotriéster, la fosforamidita y el H-fosfonato. Las grandes secuencias de ácido nucleico, por ejemplo aquellas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud pueden ser sintetizadas en forma de numerosos fragmentos. Los fragmentos pueden ser ligados después entre sí para formar una secuencia de ácido nucleico adecuada. Un método preferido es la síntesis con un soporte polimérico utilizando la química de la fosforamidita normalizada.

Alternativamente, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada rastreando una genoteca de ADNc apropiada (es decir, una genoteca preparada a partir de una o más fuentes que se cree que expresan la proteína) o una genoteca genómica (una genoteca preparada a partir del ADN genómico total). La fuente de la genoteca de ADNc es típicamente un tejido de cualquier especie que se crea que expresa una proteína deseada en cantidades razonables. La fuente de la genoteca genómica puede ser cualquier tejido o tejidos de cualquier mamífero u otra especie que se crea que alberga un gen que codifica una o varias proteínas de KGF-2.

Los medios de hibridación pueden ser rastreados en cuanto a la presencia de un ADN que codifique una o varias proteínas de KGF-2 utilizando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, ADNc o fragmentos de ADN genómico que posean un nivel aceptable de homología con el ADNc o el gen que se vaya a clonar) que hibridarán selectivamente con el ADNc o los ADNc o el gen o los genes presentes en la genoteca. Las sondas utilizadas típicamente para semejante rastreo codifican una pequeña región de la secuencia de ADN de la misma especie o una especie similar a la especie a partir de la cual se prepara la genoteca. Alternativamente, las sondas pueden ser degeneradas, como se trata aquí.

La hibridación se completa típicamente recociendo la sonda oligonucleotídica o el ADNc con los clones en condiciones rigurosas que evitan la unión no específica pero permiten la unión de aquellos clones que tienen un nivel significativo de homología con la sonda o el cebador. La hibridación típica y las condiciones rigurosas de lavado dependen en parte del tamaño (es decir, el número de nucleótidos de longitud) del ADNc o la sonda oligonucleotídica y de si la sonda es degenerada. También se considera la probabilidad de identificar un clon al diseñar el medio de hibridación (v.g., si está siendo rastreada una genoteca de ADNc o genómica).

Cuando se utiliza como sonda un fragmento de ADN (tal como ADNc), en las condiciones de hibridación típicas se incluyen aquellas mostradas por Ausubel y col. (1.994), en eds. supra. Tras la hibridación, el medio de hibridación se lava con un rigor adecuado, dependiendo de numerosos factores tales como el tamaño de la sonda, la homología esperada entre sonda y clon, el medio de hibridación que esté siendo rastreado, el número de clones que estén siendo rastreados, y similares. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares son la hibridación en 4 x SSC a 62-67ºC, seguido de lavado en 0,1 x SSC a 62-67ºC durante aproximadamente una hora. Alternativamente, las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares son la hibridación en formamida al 45-55%, 4 x SSC a 40-45ºC. Asimismo están incluidas las secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ácido nucleico mostradas en la Figura 1 en condiciones de hibridación relajadas y que codifican una o varias proteínas de KGF-2. Los ejemplos de tales condiciones de hibridación rigurosas son 4 x SSC a 45-55ºC o hibridación con formamida al 30-40% a 40-45ºC. Ver Maniatis y col. (1.982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a 389.

Asimismo existen protocolos ejemplares para condiciones de lavado rigurosas en los que se utilizan sondas oligonucleotídicas para rastrear medios de hibridación. Por ejemplo, en un primer protocolo se utiliza 6 x SSC con pirofosfato de sodio al 0,05 por ciento a una temperatura entre aproximadamente 35ºC y 63ºC, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, se lavan sondas de 14 bases a 35-40ºC, sondas de 17 bases a 45-50ºC, sondas de 20 bases a 52-57ºC, y sondas de 23 bases a 57-63ºC. La temperatura puede ser incrementada en 2-3ºC cuando la unión no específica de fondo parece elevada. En un segundo protocolo se utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para el lavado. Una de tales soluciones de lavado riguroso es TMAC 3M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y SDS al 0,2%.

Otro método para obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, se prepara ADNc a partir de poli(A)+ARN o ARN total utilizando la enzima transcriptasa inversa. Después se añaden dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas del ADNc (oligonucleótidos) que codifica una o varias proteínas de KGF-2 al ADNc junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.

Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas o cebadores deben tener la longitud adecuada y ser suficientemente inequívocas como para minimizar la cantidad de unión no específica que se puede producir durante el rastreo o la amplificación mediante PCR. La secuencia real de sondas o cebadores se basa normalmente en secuencias o regiones conservadas o altamente homólogas. Opcionalmente, las sondas o cebadores pueden estar total o parcialmente degenerados, codificando la misma secuencia de aminoácidos pero utilizando diferentes codones para hacerlo. Una alternativa para preparar sondas degeneradas es colocar una inosina en algunas o todas aquellas posiciones del codón que varían entre especies. Las sondas oligonucleotídicas o cebadores pueden ser preparadas mediante métodos de síntesis química para el ADN, como se ha descrito antes.

Vectores

Se puede insertar ADN que codifique una o varias proteínas de KGF-2 en vectores para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. Los vectores adecuados son asequibles comercialmente, o el vector puede ser construido específicamente. La selección o construcción de un vector apropiado dependerá de (1) si va a ser utilizado para la amplificación de ADN o para la expresión de ADN, (2) el tamaño del ADN que va a ser insertado en el vector, y (3) la célula huésped pretendida que va a ser transformada con el vector.

Cada uno de los vectores implica una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada conectada operativamente a una o más de las siguientes secuencias de control de la expresión o reguladoras susceptibles de dirigir, controlar o afectar de otro modo la expresión de una proteína deseada por una células huésped seleccionada. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de su compatibilidad con la célula huésped pretendida. Entre los componentes del vector se incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes de selección o marcadores, promotores, elementos intensificadores, una secuencia de terminación de la transcripción y similares. Estos componentes pueden ser obtenidos a partir de fuentes naturales o ser sintetizados mediante procedimientos conocidos.

Entre los ejemplos de los vectores de clonación procarióticos adecuados se incluyen bacteriófagos, tales como los derivados de lambda, o plásmidos de E. coli (v.g. pBR322, col E1, pUC, el factor F y derivados del plásmido Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Otros vectores de expresión apropiados, de los cuales se conocen numerosos tipos en la técnica para las células huésped descritas más abajo, también pueden ser utilizados para este fin.

Secuencia señal

El ácido nucleico que codifica una secuencia señal puede ser insertado en la posición 5' de la secuencia que codifica una o varias proteínas de KGF-2, v.g., puede ser un componente de un vector o puede ser parte de un ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de KGF-2. El ácido nucleico que codifica la secuencia señal nativa de KGF-2 es conocida (WO 96/25422).

Origen de replicación

Cada uno de los vectores de expresión y clonación incluye generalmente una secuencia de ácido nucleico que permite replicar el vector en una o más células huésped seleccionadas. En un vector de clonación, esta secuencia es típicamente una que permite replicar el vector independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son bien conocidas. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, y diversos orígenes (v.g., SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen de SV40 es utilizado a menudo solo porque contiene el promotor temprano).

Gen de selección

Los vectores de expresión y clonación contienen cada uno típicamente un gen de selección. Este gen codifica una proteína "marcadora" necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células huésped transformadas cuando se hacen crecer en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped que no son transformadas con el vector no contendrán el gen de selección y, por lo tanto, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, v.g., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxótrofas; o (c) suministran nutrientes críticos no asequibles a partir del medio de cultivo.

Se pueden utilizar otros genes de selección para amplificar los genes que van a ser expresados. La amplificación es el procedimiento en el que los genes que tienen mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Entre los ejemplos de los marcadores seleccionables adecuados para las células de mamíferos se incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina quinasa. Los transformantes celulares se colocan bajo una presión de selección de manera que sólo los transformantes que están adaptados de una forma única sobreviven en virtud del marcador presente en el vector. La presión de selección es impuesta cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica la proteína deseada. Como resultado, se sintetizan cantidades incrementadas de la proteína deseada a partir del ADN amplificado.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de la DHFR son identificadas primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster Chino deficiente en actividad DHFR (Urlaub y Chasin (1.980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(7):4216-4220. Las células transformadas son expuestas después a niveles incrementados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de la DHFR y, concomitantemente, múltiples copias de otro ADN presente en el vector de expresión, tal como el ADN que codifica la proteína deseada.

Promotor

Los vectores de expresión y clonación contendrán cada uno típicamente un promotor que sea reconocido por el organismo huésped y esté conectado operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifique la proteína deseada. Un promotor es una secuencia no traducida localizada aguas arriba (5') con respecto al codón de iniciación de un gen estructural (generalmente en aproximadamente 100 a 1.000 pb) que controla la transcripción y la traducción de una secuencia de ácido nucleico concreta. Un promotor puede ser convenientemente agrupado en una de dos clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Un promotor inducible inicia niveles de transcripción incrementados a partir del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Son bien conocidos un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Un promotor puede estar conectado operablemente a un ADN que codifica la proteína deseada eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora deseada. La secuencia promotora de KGF-2 nativo puede ser utilizada para la amplificación directa y/o la expresión del ADN que codifica una proteína deseada. Sin embargo se prefiere un promotor heterólogo, si éste permite una mayor transcripción y rendimientos más elevados de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo y si es compatible con el sistema de la célula huésped que ha sido seleccionado para su uso. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de las secuencias promotoras nativas de otros miembros de la familia de FGF para la amplificación directa y/o la expresión del ADN que codifica una proteína deseada.

Entre los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas promotores de la beta-lactamasa y la lactosa; la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp); un sistema génico de luminiscencia bacteriana (luxR); y promotores híbridos tales como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo de ese modo al experto en la técnica ligarlos a la secuencia o las secuencias de ADN deseadas utilizando conectores o adaptadores según sea necesario para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

Las secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura también son bien conocidas en la técnica. Los promotores adecuados para su uso en células huésped de mamífero son bien conocidos y entre ellos se incluyen los obtenidos a partir de los genomas de virus tales como el virus de polioma, el poxvirus aviar, adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, muy preferiblemente, el Virus de Simios 40 (SV40). Entre otros promotores de mamíferos adecuados se incluyen los promotores de mamíferos heterólogos, v.g., los promotores del choque térmico y el promotor de la actina.

Elemento intensificador

Los vectores de expresión y clonación contendrán cada uno típicamente una secuencia intensificadora para incrementar la transcripción por eucariotas superiores de una secuencia de ADN que codifique una proteína deseada. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en posición cis, normalmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el para incrementar su transcripción.

Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y la posición. Se han encontrado en posición 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción. Los intensificadores de levadura son utilizados ventajosamente con promotores de levadura. Se conocen numerosas secuencias intensificadoras asequibles de genes de mamíferos (v.g., globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Adicionalmente, los intensificadores virales tales como el intensificador de SV40, el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma y los intensificadores de adenovirus son elementos intensificadores ejemplares para la activación de promotores eucarióticos. Si bien un intensificador puede ser empalmado en un vector en una posición 5' o 3' con respecto a un ADN que codifica una proteína deseada, se localiza típicamente en un sitio 5' a partir del promotor.

Terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas contendrán típicamente cada uno una secuencia necesaria para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias son asequibles comúnmente de regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADN o ADNc eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica una proteína deseada.

La construcción de un vector adecuado que contiene uno o más de los componentes enumerados antes (junto con la secuencia codificadora deseada) se completa mediante técnicas de ligadura normalizadas. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son escindidos, ajustados y religados en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la secuencia correcta, la mezcla de ligadura puede ser utilizada para transformar E. coli, y los transformantes acertados pueden ser seleccionados mediante mecanismos conocidos como los descritos antes. Después se preparan cantidades del vector a partir de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian para confirmar la presencia del constructo deseado.

Se puede utilizar también un vector que proporciona la expresión transitoria de ADN que codifica una proteína deseada en células de mamífero. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicar eficazmente en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de la proteína deseada codificada por el vector de expresión. Cada sistema de expresión transitoria, que comprende un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permite la identificación positiva conveniente de las proteínas codificadas por los ADN clonados, así como el rápido rastreo de tales proteínas en cuanto a las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas.

Células huésped

Asimismo la presente invención proporciona cualquiera de una variedad de células huésped recombinantes, cada una de las cuales contiene una secuencia de ácido nucleico para su uso en la expresión de la proteína deseada. Entre las células huésped procarióticas o eucarióticas ejemplares se incluyen células bacterianas, de mamífero, fúngicas, de insecto, de levadura o vegetales.

Entre las células huésped procarióticas se incluyen, pero no están limitadas a, eubacterias tales como organismos Gram negativos o Gram positivos (v.g., E. coli (HB101, DH5a, DH10 y MC1061); Bacilli tal como B. subtilis; Pseudomonas sp. tal como P. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella typhimurium; o Serratia marcescens. Como realización específica, se pueden expresar una o varias proteínas de KGF-2 en E. coli.

Además de células huésped procarióticas, la proteína o las proteínas de KGF-2 pueden ser expresadas en forma glicosilada por cualquiera de las numerosas células huésped adecuadas derivadas de organismos multicelulares. Tales células huésped son susceptibles de complejas actividades de maduración y glicosilación. En principio, se podría utilizar cualquier cultivo de células eucarióticas superiores, ya implique dicho cultivo células de vertebrados o de invertebrados, incluyendo células de plantas o insectos.

Los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras pueden ser huéspedes adecuados para la expresión de una o varias proteínas de KGF-2. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura cervecera común, es el más comúnmente utilizado de los microorganismos huésped eucarióticos, pero se conocen y están comúnmente disponibles otros numerosos géneros, especies y cepas.

Se pueden utilizar células de vertebrados, ya que la propagación de células de vertebrados en cultivos (tejido de cultivos) es un procedimiento bien conocido. Entre los ejemplos de las líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen pero no están limitadas a la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7), la línea de riñón embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión), células de riñón de cría de hámster y células de ovario de hámster Chino. Entre otras líneas celulares de mamífero adecuadas se incluyen, pero no están limitadas a, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, y líneas celulares derivadas de las líneas 3T3. Como realización específica, se pueden expresar una o varias proteínas de KGF-2 en células COS o en células de baculovirus.

Una célula huésped puede ser transfectada y preferiblemente transformada con un ácido nucleico deseado en condiciones apropiadas que permitan la expresión del ácido nucleico. La selección de las células huésped adecuadas y de los métodos de transformación, el cultivo, la amplificación, el rastreo y la producción y purificación del producto son bien conocidos en la técnica (Gething y Sambrook (1.981), Nature, 293:620-625 o, alternativamente, Kaufman y col. (1.985), Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759, o Patente de los Estados Unidos Núm. 4.419.446. Por ejemplo, para las células de mamífero sin paredes celulares, se puede utilizar el método de precipitación con fosfato de calcio. También se pueden utilizar la electroporación, la microinyección y otros mecanismos conocidos.

Asimismo es posible producir una proteína deseada mediante recombinación homóloga o mediante métodos de producción recombinantes utilizando elementos de control introducidos en células que ya contienen ADN que codifica una o varias proteínas de KGF-2. La recombinación homóloga es una técnica desarrollada originalmente para dirigir genes para inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati (1.989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301. El mecanismo básico fue desarrollado como un método para introducir mutaciones especificas en regiones especificas del genoma de mamíferos (Thomas y col. (1.986), Cell, 44:419-428; Thomas y Capecchi (1.987), Cell, 51:503-512 y Doetschman y col. (1.988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587) o para corregir mutaciones específicas con genes defectuosos (Doetschman y col. (1.987), Nature, 30:576-578). Los mecanismos ejemplares se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.272.071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 y WO 94/31560.

Cultivo de las células huésped

El método para cultivar cada una de las una o más células huésped recombinantes para la producción de una proteína deseada variará dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento de producción óptimo para una situación dada será evidente para los expertos en la técnica a través de una experimentación mínima. Tales células huésped recombinantes se cultivan en un medio adecuado y la proteína expresada es después recuperada opcionalmente, aislada y purificada a partir del medio de cultivo (o a partir de la célula, si es expresada intracelularmente) mediante medios apropiados conocidos por los expertos en la técnica.

Específicamente, cada una de las células recombinantes utilizadas para producir una proteína deseada puede ser cultivada en medios adecuados para inducir promotores, seleccionar células huésped recombinantes adecuadas o amplificar el gen que codifica la proteína deseada. Los medios pueden ser suplementados según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como gentamicina), elementos vestigiales (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa u otra fuente de energía. Asimismo se pueden incluir otros suplementos, a concentraciones apropiadas, como apreciarán los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo adecuadas, tales como la temperatura, el pH y similares, también son bien conocidas por los expertos en la técnica para el uso con las células huésped seleccionadas.

El producto de expresión resultante puede ser purificado después hasta cerca de la homogeneidad utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los mecanismos de purificación ejemplares se ilustran en las Solicitudes PCT publicadas Núms. WO 90/08771 y WO 96/11952.

Usos

La proteína o las proteínas de KGF-2 y los derivados modificados químicamente de las mismas que tienen actividad biológica (colectivamente, "productos de proteína de KGF-2") puede ser utilizados como reactivos de investigación y como agentes terapéuticos y de diagnóstico. Así, se pueden utilizar uno o varios productos de proteína de KGF-2 en análisis de diagnóstico in vitro y/o in vivo para cuantificar la cantidad de KGF-2 en una muestra de tejido u órgano.

Por ejemplo, se pueden utilizar uno o varios productos de proteína de KGF-2 para la identificación del receptor o los receptores para la proteína o las proteínas de KGF-2 en diversos fluidos corporales y muestras de tejidos utilizando mecanismos conocidos en la técnica (WO 90/08771).

Esta invención también contempla el uso de uno o varios productos de proteína de KGF-2 en la generación de anticuerpos elaborados contra el producto o los productos de proteína de KGF-2, incluyendo KGF-2 nativo. Un experto normal en la técnica puede utilizar procedimientos publicados bien conocidos para obtener anticuerpos monoclonales y policlonales o anticuerpos recombinantes. Tales anticuerpos pueden ser utilizados después para purificar y caracterizar el producto o los productos de proteína de KGF-2, incluyendo el KGF-2 nativo.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención abarca preparaciones farmacéuticas que contienen cada una cantidades terapéuticamente o profilácticamente eficaces de uno o varios productos de proteína de KGF-2.

Las composiciones farmacéuticas incluirán cada una generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz de uno o varios productos de proteína de KGF-2 mezclado con un vehículo. En el vehículo se incluyen preferiblemente uno o más materiales de formulación farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables mezclados con el producto o los productos de proteína de KGF-2.

El disolvente primario de un vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH (v.g., tampones tales como citratos, fosfatos, y aminoácidos tales como glicina); la osmolaridad (v.g., manitol y cloruro de sodio); la viscosidad; la claridad; el color; la esterilidad; la estabilidad (v.g., sacarosa y sorbitol); el olor de la formulación; la velocidad de disolución (v.g., solubilizadores o agentes de solubilización tales como alcoholes, polietilenglicoles y cloruro de sodio); la velocidad de liberación; así como agentes para conferir volumen a la formulación liofilizada (v.g., manitol y glicina); tensioactivos (v.g., Polysorbate 20, Polysorbate 80, Tritón, y Pluronics); antioxidantes (v.g., sulfito de sodio e hidrogenosulfito de sodio); conservantes (v.g., ácido benzóico y ácido salicílico); agentes aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; agentes suspensores; disolventes; cargas; vehículos de liberación; diluyentes y/o coadyuvantes farmacéuticos. Asimismo se prevén otras formas de administración eficaces tales como formulaciones de liberación lenta parenteral, misturas de inhalación, formulaciones oralmente activas, o supositorios.

La composición también puede implicar preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como polímeros de erosión en masa (v.g., copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), mezclas de polímeros PLGA, copolímeros de bloques de PEG, y ácido láctico y glicólico, poli(cianoacrilatos)); polímeros de erosión superficial (v.g., poli(anhídridos) y poli(ortoésteres)); ésteres de hidrogel (v.g., polioles de Pluronic, poli(alcohol vinílico), poli(vinil-pirrolidona), copolímeros de anhídrido maléico-éter alquilvinílico, celulosa, derivados de ácido hialurónico, alginato, colágeno, gelatina, albúmina, y almidones y dextranos) y sistemas de composición de los mismos; o preparaciones de liposomas o microesferas. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de aclaramiento in vivo de las presentes proteínas y derivados. La formulación farmacéutica óptima para una proteína deseada será determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y de la dosificación deseada. Las composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. (1.990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712; Gombotz y Pettit (1.995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haas, y col. (1.995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1):93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 y WO 94/21235.

Las composiciones de liberación sostenida específicas son asequibles de una variedad de proveedores incluyendo Depotech Corp. (Depofoam®, un liposoma multivesicular); Alkermes, Inc. (ProLease®, una microesfera de PLGA). Según se utiliza aquí, se pretende que el hialuronano incluya hialuronano, ácido hialurónico, sales del mismo (tales como hialuronato de sodio), ésteres, éteres, derivados enzimáticos y geles entrecruzados de ácido hialurónico, y derivados químicamente modificados de ácido hialurónico (tales como hilano). Las formas de hialuronano ejemplares se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.582.865, 4.605.691, 4.636.524, 4.713.448, 4.716.154, 4.716.224, 4.772.419, 4.851.521, 4.957.774, 4.863.907, 5.128.326, 5.202.431, 5.336.767, 5.356.883; Solicitudes de Patente Europeas Núms. 0.507.604 A2 y 0.718.312 A2; y WO 96/05845. Entre los proveedores de hialuronano se incluyen BioMatrix, Inc., Ridgefield, NJ; Fidia S.p.A., Abano Terme, Italia; Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japón; Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia; Genzyme Corporation, Cambridge, MA; Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH; Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Suiza; Intergen Company, Purchase, NY y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japón.

Para el tratamiento y/o la prevención de las indicaciones orales, se puede utilizar una solución o suspensión líquida de un modo similar a un enjuague bucal, en el que el líquido se agita en la boca con el fin de maximizar el tratamiento de las lesiones (Patente de los Estados Unidos 5.102.870, cuyas enseñanzas se incorporan como referencia). El contacto más prolongado con la superficie de la mucosa se puede lograr seleccionando un vehículo adecuado que sea capaz de revestir la mucosa. Los ejemplos típicos son las formulaciones que contienen pectina tales como Orabase Registered® (Colgate-Hoyt Laboratories, Norwood, MA), suspensiones de sucralfato, Kaopectato y Leche de Magnesia. La formulación también puede ser un gel en crema untable, una loción o una pomada que tenga un vehículo o portador no tóxico farmacéuticamente aceptable. El producto o los productos de proteínas de KGF-2 también pueden ser incorporados en una gragea o trocisco de liberación lenta, una base para chicle, o una prótesis bucal o de liberación lenta enganchada a un molar posterior, por ejemplo. Los agentes terapéuticos tales como analgésicos y anestésicos pueden ser administrados para aliviar el dolor y se pueden administrar como anti-infecciosos, anti-bacterianos, anti-fúngicos y antisépticos para prevenir y/o tratar las infecciones secundarias de las lesiones.

Una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, puede ser almacenada en viales estériles en forma de solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden ser almacenadas o bien en una forma lista para su uso o bien en una forma (v.g., liofilizada) que requiera la reconstitución antes de su administración.

En una realización específica, la presente invención está dirigida a estuches para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los estuches pueden contener cada uno tanto un primer contenedor que tenga una proteína seca como un segundo contenedor que tenga una formulación acuosa. Los estuches incluidos en el alcance de esta invención son jeringas precargadas de una o de múltiples cámaras; son asequibles liojeringas precargadas ejemplares (v.g., jeringas de líquido, y liojeringas tales como Lyo-Ject®, una liojeringa precargada de doble cámara) de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.

Se pueden aplicar uno o varios productos de proteínas de KGF-2 en cantidades terapéutica y profilácticamente eficaces a órganos o tejidos caracterizados específicamente por estar lesionados o tener números clínicamente insuficientes de células epiteliales. Se debe observar que las formulaciones del producto o los productos de proteína de KGF-2 descritas aquí pueden ser utilizadas para aplicaciones veterinarias así como humanas y que el término "paciente" no debe ser considerado de una manera limitante.

La frecuencia de dosificación del producto o los productos de proteínas de KGF-2 a un paciente dependerá de la enfermedad y el estado del paciente, así como de los parámetros farmacocinéticos del producto o los productos de proteínas de KGF-2 formulados, y de la ruta de administración. El producto o los productos de proteínas de KGF-2 pueden ser administrados de una vez, administrados diariamente, o administrados con una dosis de bolo inicial seguida de una dosis continua o de liberación sostenida. Asimismo se contempla que se pueden poner en práctica otros modos de dosificación continuos o casi continuos. Por ejemplo, la transformación química puede dar como resultado formas de liberación sostenidas que tienen el efecto de una presencia continua en la corriente sanguínea, en cantidades predecibles, basándose en un régimen de dosificación determinado.

Se puede administrar una cantidad eficaz de uno o varios productos de proteínas de KGF-2 a un paciente que necesite estimulación (incluyendo citoprotección, proliferación y/o diferenciación) de las células epiteliales para lograr la respuesta deseada en el paciente. El régimen de dosificación implicado en un método para prevenir o tratar un estado específico será determinado generalmente por el médico que atienda, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, v.g., la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Las dosificaciones apropiadas pueden ser averiguadas por medio del uso de análisis establecidos para determinar las dosificaciones utilizadas junto con los datos dosis-respuesta apropiados. Las dosificaciones típicas oscilarán entre 0,001 mg/kg de peso corporal y 500 mg/kg de peso corporal, preferiblemente hasta 200 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente 100 mg/kg de peso corporal.

El producto o los productos de proteínas de KGF-2 pueden ser administrados vía administración tópica, entérica o parenteral incluyendo, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, e intraesternal. El producto o los productos de proteínas de KGF-2 pueden ser administrados vía administración oral o administrados a través de membranas mucosas, esto es, intranasalmente, sublingualmente, bucalmente o rectalmente para la liberación generalizada. El producto o los productos de proteínas de KGF-2 pueden ser utilizados una vez o administrados repetidamente, dependiendo de la enfermedad y el estado del paciente. En algunos casos, el producto o los productos de proteínas de KGF-2 pueden ser administrados como una ayuda para otra terapia y también con otras preparaciones farmacéuticas.

En otra realización, también se contempla la terapia celular (v.g. implante de células que producen una o varias proteínas de KGF-2. En esta realización de la presente invención se puede incluir el implante en células de pacientes que sean capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente activa de una o varias proteínas de KGF-2. Tales células productoras de una o varias proteínas de KGF-2 pueden ser células que no produzcan normalmente proteínas de KGF-2 pero que hayan sido modificadas para producir una o varias proteínas de KGF-2, o que pueden ser células cuya capacidad de producir una o varias proteínas de KGF-2 haya sido aumentada mediante transformación con un polinucleótido adecuado para la expresión y secreción de una o varias proteínas de KGF-2. Con el fin de minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes a los que se han administrado una o varias proteínas de KGF-2 de una especie foránea, se prefiere que las células sean de la misma especie que el paciente (v.g. humanas), o que las células puedan ser encapsuladas con material que proporcione una barrera frente al reconocimiento inmune, o que las células sean colocadas en una localización anatómica inmunológicamente privilegiada, tal como el testículo, el ojo y el sistema nervioso central.

Se pueden implantar células animales humanas o no humanas en pacientes en recintos poliméricos semi-permeables, biocompatibles o membranas para permitir la liberación de una o varias proteínas de KGF-2 pero evitar la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales del tejido circundante. Alternativamente, las propias células del paciente, transformadas ex vivo para producir una o varias proteínas de KGF-2, podrían ser implantadas directamente en el paciente sin semejante encapsulación. La metodología para la encapsulación en membranas de células vivas es familiar para los expertos normales en la técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su implante en pacientes puede ser completada mediante mecanismos conocidos (Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.892.538; 5.011.472; y 5.106.627).

En otra realización, también se prevé la terapia génica in vivo, donde una secuencia de ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de KGF-2 es introducida directamente en un paciente. Se requiere una transferencia génica eficaz y de larga duración a hepatocitos para una terapia génica eficaz para la expresión local de la proteína para prevenir y/o tratar enfermedades del hígado y/o para la secreción de la proteína para evitar y/o tratar enfermedades en otros órganos o tejidos.

El constructo de ADN puede ser inyectado directamente en el tejido del órgano que se vaya a tratar, donde puede ser recogido in vivo y expresado, siempre que el ADN esté conectado operablemente a un promotor que sea activo en semejante tejido. El constructo de ADN también puede incluir adicionalmente una secuencia vector de vectores tales como un vector de adenovirus, un vector retroviral, un vector de virus del papiloma y/o herpes virus, para ayudar a la absorción por las células. La transferencia física puede ser lograda in vivo mediante inyección local del constructo de ácido nucleico deseado u otro vector de liberación apropiado que contenga la secuencia de ácido nucleico deseada, tal como transferencia mediada por liposomas, inyección directa (ADN desnudo), transferencia mediada por receptores (complejo ligando-ADN), o bombardeo con micropartículas (pistola génica). Para la regeneración in vivo de hepatocitos en el hígado, puede ser especialmente eficaz el uso de los vectores retrovirales de Moloney (Bosch, y col. (1.996), Cold Spring Harbor, Gene Therapy Meeting, 25-29 de Septiembre, 1.996; y Bosch, y col., (1.996), Journal of Clinical Investigation, 98(12):2683-2687).

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar más completamente la presente invención.

Ejemplos

Los métodos normalizados para muchos de los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, o procedimientos alternativos adecuados, se proporcionan en manuales de biología molecular ampliamente reconocidos, por ejemplo, Sambrook y col. (1.989), supra y Ausubel y col. (1.990), supra. Todos los productos químicos son de calidad comercial o de calidad USP.

Ejemplo 1 Producción de proteína

El siguiente ejemplo ilustra la producción de His rFGF10 y hFGF10.

A. Preparación de ADN

pAMG21 His rFGF10:

El plásmido pAMG21 His rFGF10 contiene ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2. pAMG21 His rFGF10 fue construido como sigue.

Primero, se construyó el plásmido pAMG21 dN6 rFGF10. Para esta construcción, se realizó la PCR utilizando ADNc de FGF10 de rata madura (Yamasaki y col. (1.996), J. Biol. Chem., 271(27):15981-15921, rFGF) en el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI), denominado pGEM-T rFGF10, como molde con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO#1), que incorpora un sitio NdeI, y un cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO#2) que incorpora un sitio BamHI:

OLIGO#1: (SEC ID NUM: 7)

5'-AAA CAA CAT ATG GTT TCT CCG GAG GCT ACC AAC TCC-3'

OLIGO#2: (SEC ID NUM: 8)

5'-AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3'

El producto de la PCR generado en esta reacción fue purificado y digerido con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI. El producto de la PCR digerido con enzimas de restricción de 525 pares de bases (pb) fue purificado en gel de agarosa y ligado con un fragmento de ADN del vector pAMG21 BamHI y NdeI de 6 Kilobases (Kb) purificado de un modo similar. [El vector de expresión pAMG21 (núm. de acceso ATCC 98113) contiene sitios de restricción apropiados para la inserción de genes aguas abajo del promotor luxPR (ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.169.318 para la descripción del sistema de expresión lux)]. La proteína rFGF10 codificada resultante difiere de rFGF10 por la deleción de los 6 primeros restos aminoácido amino terminales hasta un resto metionina de origen natural, teniendo la proteína la siguiente secuencia de aminoácidos amino terminal (N-terminal): MVSPEAT .... (empezando en el resto #43, Figura 2, Yamasaki y col. (1.996), supra).

A continuación, se construyó el plásmido pAMG21 His rFGF10 utilizando un vector pAMG21 His. El vector pAMG21 His difiere de pAMG21 como sigue: entre el codón de metionina de iniciación de pAMG21 (ATG) y la secuencia le que sigue (GTTAACG...), se inserta la siguiente secuencia "AAA CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GCT AGC" que codifica "KHHHHHHHAS". La adición de los codones para Ala y Ser después de la etiqueta 7x His proporciona un sitio de restricción conveniente, NheI, para la clonación.

El fragmento BstXI-NheI de 4,7 Kb del vector plasmídico pAMG21 His fue ligado después con el fragmento BspEI-BstXI de 1,8 Kb de pAMG21 dN6 rFGF10 y los siguientes conectores oligonucleotídicos OLIGO#3 y OLIGO#4 (NheI a BspEI).

OLIGO#3: (SEC ID NUM: 9)

5'-CTA GCG ATG ACG ATG ATA AAC AGG AGG CTC TGG GTC AGG ACA TGG TTT CT-3'

OLIGO#4: (SEC ID NUM: 10)

5'-CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GAG CCT GTT TAT CAT CGT CAT CG-3'

La proteína codificada resultante difiere de dN6 rFGF10 por tener un etiqueta de histidina (7x His) seguida de un sitio de escisión de enteroquinasa con la secuencia N-terminal (madura) en toda su longitud (empezando en el resto #37, Figura 1, Yamasaki y col. (1.996), supra). Se añadieron veintidós aminoácidos al extremo amino de dN6 rFGF10 como sigue: MKHHHHHHHASDDDDKQALGQD [MVSPEAT....].

La cepa huésped de E. coli GM120 (núm. de acceso ATCC 55764) tiene el promotor lacIQ y el gen lacI integrados en un segundo sitio en el cromosoma huésped de un huésped de E. coli K12 prototrófico. La transformación del huésped de E. coli GM120 con esta mezcla de ligadura y el cultivo en placa sobre placas de agar Luria conteniendo 40 \mug/ml de kanamicina rendían colonias bacterianas recombinantes. Se identificó un clon bacteriano que contenía el plásmido recombinante correcto mediante rastreo por PCR. El ADN plasmídico fue purificado y secuenciado para confirmar la secuencia insertada. El crecimiento de los cultivos bacterianos recombinantes para expresar el producto génico se describe más abajo.

pAMG21 hFGF10:

El plásmido pAMG21 hFGF10 contiene ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (hFGF10). Así hFGF10 tiene la secuencia de Leu^{40} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2, mostrada antes. pAMG21 hFGF10 fue construido como sigue.

El plásmido pAMG21 dN20 hFGF10 contiene una deleción del ADN que codifica los primeros 28 aminoácidos de la secuencia de rFGF10 madura dando como resultado la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal: MSSPSSA... (comenzando en el resto #65, Figura 2, Yamasaki y col. (1.996), supra). pAMG21 dN20 hFGF10 fue construido como sigue.

El fragmento del vector pAMG21 BamHI-NdeI de 6 Kb fue ligado a un producto de PCR NdeI-BamHI dN20 hFGF10 generado como sigue: la PCR se llevó a cabo utilizando pGEM-T rFGF10 como molde y el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO #5) que incorpora un sitio NdeI en el extremo 5' del gen rFGF10 y suprime los codones para los primeros 28 aminoácidos, y el cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO#6) que incorpora un sitio BamHI en el extremo 3' del gen rFGF10:

OLIGO#5: (SEC ID NUM: 11)

5'-AAA CAA CAT ATG TCT TCT CCT TCC TCT GCA GGT AGG CAT GTG CGG AGC TAC AA-3'

OLIGO#6: (SEC ID NUM: 12)

5'-AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3'

Este producto de la PCR fue purificado, digerido con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y, como se ha descrito antes, ligado al fragmento del vector pAMG21 BamHI-NdeI de 6 Kb.

El plásmido pAMG21 rFGF10 fue creado mediante la ligadura del fragmento BspEI-NdeI de 6,5 Kb de pAMG21 His rFGF10 con los siguientes ligadores oligonucleotídicos OLIGO#11 y OLIGO#8 (NdeI a BspEI).

OLIGO#7: (SEC ID NUM: 13)

5'-TAT GCT GGG TCA GGA CAT GGT TTC T-3'

OLIGO#8: (SEC ID NUM: 14)

5'-CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GCA-3'

La proteína codificada resultante difiere de His rFGF10 en la deleción de la etiqueta 7x Histidina y la restauración de la secuencia de proteínas amino terminal madura (MLGQDM....).

Un fragmento BstXI-BspEI de 4,8 Kb de pAMG21 rFGF10 fue ligado con el fragmento de 1,8 Kb de pAMG21 dN20 hFGF10 PstI (introducido)-BstXI y los siguientes conectores oligonucleotídicos OLIGO#13 y OLIGO#14 (PstI a BspEI) para suprimir ocho codones de serina de la secuencia de rata.

OLIGO#9: (SEC ID NUM: 15)

5'-CCG GAG GCT ACC AAC TCT AGC TCC AGC AGC TTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA-3'

OLIGO#10: (SEC ID NUM: 16)

5'-GAG CTA GGA GAG GAG AAG CTG CTG GAG CTA GAG TTG GTA GCC T-3'

Se transformaron células huésped de E. coli GM120 con este producto de ligadura pAMG21 hFGF10, y cultivando en placa sobre placas de agar Luria conteniendo 40 \mug/ml de kanamicina se produjeron colonias bacterianas recombinantes. Un clon bacteriano que contenía el plásmido recombinante correcto fue identificado mediante rastreo por PCR. El ADN plasmídico fue purificado y secuenciado para confirmar la secuencia insertada. El crecimiento de los cultivos bacterianos recombinantes para expresar el producto génico se describe más abajo.

B. Producción en E. coli

Cada uno de los cultivos de células de E. coli GM120 recombinantes que contienen el plásmido con la secuencia de ADN confirmada de interés (pAMG21 His rFGF10 y pAMG21 hFGF10, respectivamente) se hace crecer para optimizar la expresión del gen introducido, como sigue:

Se sembraron matraces de 500 ml de Caldo Luria más Kanamicina con células y se hicieron crecer a 30ºC de 10 a 16 horas. Se añadieron los 500 ml a 9 litros - 11 litros de un medio con una base de amina NZ en un fermentador de 15 litros. Todos los lotes se hicieron crecer a un pH de 7 y a un nivel de oxígeno disuelto de >50%. Cada uno de los lotes de células que contenían pAMG21 His rFGF10 y que contenían pAMG21 hFGF10 se hizo crecer y se indujo a 30ºC. Los lotes se hicieron crecer a un pH de 7 y un nivel de oxígeno disuelto >50%. Cuando la densidad óptica alcanzaba 10 \pm 2, se añadió autoinductor al fermentador y las células se dejaron crecer durante 12 horas. Al cabo de 12 horas, el caldo se enfrió a menos de 15ºC, el fermentador se drenó y se recogieron las células mediante centrifugación. La pasta de células se congeló.

C. Purificación

His rFGF10:

Se purificó His rFGF10 a partir de la pasta de células de E. coli utilizando tres etapas cromatográficas: S-Sepharose a pH 7,5, S-Sepharose a pH 8,5, y (Ni)-Sepharose quelante. Se homogeneizaron 80 gramos de pasta de células de E. coli en 10 volúmenes de H_{2}O, después las células se desorganizaron en un microfluidificador. La suspensión de células rotas se centrifugó durante 3 horas a 15.300 x g. El sobrenadante que contenía His rFGF10 soluble se ajustó a Tris-HCl 40 mM, pH 7,5 mediante la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5, después se aplicó a una columna de S-Sepharose FF de 300 ml equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Tras lavar la columna extensamente con tampón de equilibrado para separa la proteína no unida, la columna se hizo eluir con un gradiente de 40 volúmenes de NaCl 0 a 2 M en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Las fracciones que eluían entre NaCl 0,8 M y 1,0 M contenían His rFGF10, que se detectaba como una banda de 24 kDa sobre SDS-PAGE. La identidad de esta banda fue confirmada mediante secuenciación N-terminal. Estas fracciones fueron reunidas, diluidas con H_{2}O para reducir la concentración de NaCl a 0,4 M, y ajustadas a pH 8,5 mediante la adición de Tris-HCl 1 M, pH 9,2. Esta muestra fue aplicada a una columna de S-Sepharose HP de 75 ml equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 8,5. La columna se lavó con Tris-HCl 40 mM, pH 8,5 para separar la proteína no unida, después se hizo eluir con un gradiente de 40 volúmenes de NaCl de 0 a 2 M en el mismo tampón. Las fracciones que eluían entre NaCl 0,9 M y 1,1 M fueron reunidas. Las fracciones reunidas se aplicaron a una columna de (Ni)-Sepharose quelante de 200 ml equilibrada en NaCl 1 M, Tris-HCl 40 mM, pH 8,5, imidazol 1 mM. La columna fue lavada con tampón de equilibrado para separar la proteína no unida, después eluida con un gradiente de 20 volúmenes de imidazol de 0 a 100 mM en NaCl 1 M, Tris-HCl 40 mM, pH 8,5, seguido de un gradiente de 20 volúmenes de imidazol de 100 a 500 mM en el mismo tampón. His rFGF10 eluía entre imidazol 100-200 mM. Las fracciones que contenían His rFGF10 fueron reunidas, concentradas y sometidas a cambio del tampón por una solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se estimó que la pureza de la muestra, analizada mediante geles SDS teñidos con plata o Azul de Coomassie era mayor del 97%. El rendimiento global era de 459 mg de His rFGF10 purificada a partir de 80 g de pasta de células.

hFGF10:

Se purificó hFGF10 utilizando tres etapas cromatográficas: S-Sepharose a pH 7,5, Heparina-Sepharose a pH 7,5, e hidroxiapatita. Se homogeneizaron 100 gramos de pasta de células de E. coli que contenían hFGF10 y se desorganizaron exactamente como se ha descrito antes. Tras la centrifugación a 15.300 x g durante 3 horas, el sobrenadante que contenía hFGF10 soluble se ajustó a Tris-HCl 40 mM, pH 7,5 mediante la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5, después se aplicó a una columna de S-Sepharose FF de 300 ml equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Tras lavar la columna con tampón de equilibrado para separar la proteína no unida, la columna se hizo eluir con un gradiente de 40 volúmenes de NaCl de 0 a 2 M en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Las fracciones que eluían entre NaCl 0,9 M y 1,1 M contenían His hFGF10, que se detectaba sobre SDS-PAGE. La identidad de esta banda fue confirmada mediante secuenciación N-terminal. Estas fracciones fueron reunidas, diluidas con Tris-HCl 40 mM, pH 7,5 para reducir la concentración de NaCl a 0,4 M, y aplicadas a una columna de Heparina-Sepharose de 60 ml equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. La columna se lavó con tampón de equilibrado para separar la proteína no unida, después se hizo eluir con un gradiente de 80 volúmenes de NaCl de 0 a 3 M en el mismo tampón. hFGF10 eluía entre NaCl 1,0 M y 1,35 M. Estas fracciones fueron reunidas y sometidas a diálisis frente a Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. La muestra sometida a diálisis fue aplicada a una columna de hidroxiapatita de 50 ml equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Tras la aplicación de la muestra la columna se lavó con tampón de equilibrado para separar la proteína no unida, después se hizo eluir a un gradiente de 40 volúmenes de NaCl de 0 a 0,5 M. Las fracciones que eluían entre NaCl 0,24 M y 0,44 M contenían hFGF10. Estas fracciones fueron reunidas, concentradas, y sometidas a cambio del tampón por (PBS). Se estimó que la pureza de la muestra era mayor del 97% mediante geles SDS teñidos con Azul de Coomassie. El rendimiento de hFGF10 purificado era de 90 mg a partir de 100 g de pasta de células.

Ejemplo 2 Supervivencia de hibridación in situ

Se consideró la supervivencia de la hibridación in situ para determinar lo sitios de expresión de KGF-2 en tejidos de ratas adultas normales y embrionarias.

Un segmento de la secuencia de KGF-2 de rata, incluyendo los primeros 128 nucleótidos de la región codificadora publicada (Genebank número de acceso: D79215) más 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de inicio de la traducción, fue amplificado a partir de ADNc de pulmón de rata y clonado en pGEM-T (Promega). El molde linealizado fue utilizado para sintetizar ribosondas marcadas con P^{32} con alta actividad específica.

Se fijó un panel de tejidos de rata embrionaria y adulta normal en paraformaldehído al 4%, embebidos en parafina y seccionados a 5 \mum. Antes de la hibridación in situ, los tejidos fueron permeabilizados con HCl 0,2 M, seguido de digestión con Proteinasa K, y acetilación con trietanolamina y anhídrido acético. Las secciones fueron hibridadas con las ribosondas marcadas con P^{32} a 55ºC, después sometidas a lavado muy riguroso en 0,1 X SSC a 60ºC. Los portas fueron sumergidos en emulsión de película NTB2 (Eastman Kodak, Rochester, NY), expuestos a 4ºC durante 3-4 semanas, revelados y contrateñidos. Las secciones fueron examinadas con iluminación de campo oscuro y normalizada para permitir la evaluación simultánea de la morfología del tejido y la señal de hibridación.

Sobretodo, la sonda de KGF-2 producía una clara distribución de señal en las secciones de tejido tanto de embriones como de adultos, con poca o ninguna señal de fondo. En los embriones de fase tardía, la mayoría de la señal de KGF-2 se observaba en células con apariencia mesenquimática, observándose poca expresión epitelial (Tabla 2). En el adulto, a diferencia del embrión, se detectaba la expresión de KGF-2 tanto en tejidos epiteliales como mesenquimáticos (Tabla 2).

TABLA 2 Hibridación in situ

2

Ejemplo 3 Proliferación y diferenciación de las células epiteliales estimuladas por His rFGF10

Se dividieron 18 ratones hembra BDF1 en 6 grupos de 3 ratones cada uno (1 grupo tratado y 1 de control en cada uno de los 3 momentos puntuales). Los dos primeros grupos recibían 5 mg/kg de His rFGF10 o tampón de control IV durante 1 día; el segundo de los grupos recibía 5 mg/kg de His rFGF10 o el tampón de control IV diariamente durante 3 días; y el tercero de los grupos recibía 5 mg/kg de His rFGF10 o el tampón de control IV diariamente durante 7 días. Todos los ratones fueron inyectados con 50 mg/kg de BrdU una hora antes de la recogida, radiografíados y sacrificados. Se tomaron los pesos de corporales y de los órganos seleccionados (incluyendo todos los segmentos del intestino delgado), se extrajo sangre para las pruebas químicas de hematología y del suero, y los órganos fueron cosechados para el análisis histológico y el marcaje BrdU.

Se realizó un estudio adicional utilizando ratones carentes de sistema inmune atímicos. En este estudio, se inyectaron subcutáneamente 5 mg/kg/día de His rFGF10 subcutáneamente en el flanco de cinco ratones carentes de sistema inmune hembra durante 8 días. Otros cinco ratones carentes de sistema inmune hembra recibieron el tampón de control. Todos los ratones fueron inyectados con 50 mg/kg de BrdU una hora antes de la cosecha y fueron sacrificados. Se tomaron los pesos corporales y de los órganos seleccionados, se extrajo sangre para las pruebas químicas de hematología y del suero, y se cosecharon los órganos para el análisis histológico y el marcaje BrdU.

Se realizó la inmunoquímica de BrdU sobre secciones de 4 \mum de espesor de tejido embebido en parafina, fijado con cinc-formalina. Se detecto BrdU con un anticuerpo monoclonal de rata (Mab) para BrdU (Accurate Chemical, Westbury, NY), seguido de un cóctel secundario anti-conejo/anti-ratón biotinilado (BioTek Solutions, Inc., Santa Bárbara, CA) y un ABC terciario acoplado a fosfatasa alcalina (BioTek). La reacción de tinción fue visualizada con cromógeno rojo (BioTek).

Las secciones teñidas H&E y BrdU fueron examinadas. Los descubrimientos histológicos significativos se resumen en la Tabla 3. Además de los descubrimientos enumerados más abajo, los ratones carentes de sistema inmune a los que se había inyectado subcutáneamente His rFGF10 tenían hiperplasia epidérmica y de las glándulas sebáceas localizada en el lugar de la inyección, así como normalización de la morfología folicular con tallos pilosos evidentes por encima de la superficie epidérmica.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Resumen histológico por sistemas de órganos

3

4

Ejemplo 4 Respuesta trófica en el intestino delgado de ratones normales

Se inyectaron ratones BDF1 hembra intraperitonealmente (IP) o bien con His rFGF10 (5 mg/kg) o bien con solución salina durante 3 días consecutivos. Veintitrés horas después de la última inyección, cada ratón fue sacrificado, se separaron los intestinos y se lavaron con un chorro de solución salina fría, se colgaron bajo una tensión uniforme y se dividieron en duodeno, yeyuno o íleon. Se tomaron los pesos húmedos de estos tejidos y se expresaron como el porcentaje de peso corporal, y se utilizó un test t desemparejado para comparar los tratados con His rFGF10 y los tratados con solución salina. Había un incremento del 26% en el peso húmedo del intestino delgado.

Ejemplo 5 Efecto trófico en ratas con una resección del intestino delgado del 80%

Para este estudio se realizó una resección del 80% del intestino delgado (5 cm distales del ligamento de Treitz a 5 cm proximales a la válvula íleocecal) y se dejó que los animales se recuperaran durante 4 semanas. Después los animales fueron tratados durante 7 días o bien con solución salina o bien con His rFGF10 subcutáneamente a 5 mg/kg. Los animales fueron sacrificados y el resto del intestino separado, lavado con un chorro de solución salina y colgado con una tensión uniforme de 10 g. Se determinó la longitud total y el intestino fue seccionado como sigue: el primer 1/3 denominado duodeno, el segundo 1/3 yeyuno y el último 1/3 íleon. Se tomó una porción de cada uno para el análisis histológico y bioquímico. La porción para histología se trabajó en parafina, se cortó en una sección transversal y se tiñó con hematoxilina y eosina. Se utilizó el análisis de la imagen para medir el grosor de la mucosa y la profundidad de la cripta en el íleon y el yeyuno, y estos datos se utilizaron para calcular la altura de la vellosidad donde el grosor de la mucosa - profundidad de la cripta = altura de la vellosidad. Había un incremento significativo del grosor de la mucosa debido a un incremento de la altura de la vellosidad.

Ejemplo 6 Supervivencia de la cripta en intestinos delgados de ratones irradiados

Se administraron dosis de 5 mg/kg/día de His rFGF10 o vehículo a ratones BDF1 hembra durante 3 días y después se sometieron a radicación con 12 Gy de una fuente de cesio. Cuatro días más tarde se inyectaron a los ratones 50 mg/kg de BrdU IP una hora antes para la eutanasia. Los intestinos fueron separados, lavados con un chorro de solución salina fría, colgados bajo una tensión uniforme utilizando un peso de 5 g y divididos en duodeno, yeyuno e íleon. Estos segmentos fueron pesados, fijados en formalina y bloqueados en parafina para su sección transversal. Las secciones fueron teñidas con anticuerpos para BrdU y las criptas marcadas fueron contadas utilizando un microscopio óptico. Las criptas positivas fueron identificadas por tener 3 o más núcleos marcados/cripta. El pretratamiento incrementaba la supervivencia de las criptas en un 45%, mientras el post-tratamiento era significativamente eficaz.

Ejemplo 7 Efecto del pre-tratamiento con His rGFG10 en un modelo de rata neonatal de alopecia inducida por quimioterapia con citosinarabinósido (ARA-c)

Se inyectó IP His rFGF10 a cinco camadas de ratas recién nacidas (aproximadamente 10-15 crías por grupo) a 5 mg/kg/día o PBS a los 5, 6, y/o 7 días de edad (días experimentales -3, -2, y/o -1). Los días experimentales 0-5 (8-12 días de edad), todas las crías fueron inyectadas IP con 30 mg/kg de citosinarabinósido (ARA-C).

Las crías fueron puntuadas de 0 a 4 en cuanto a la cobertura capilar y la densidad del pelo por tres observadores independientes ciegos para los grupos de tratamiento los días experimentales 6, 8, 11, 13 y 15. Las puntuaciones para la densidad y la cobertura fueron calculadas para cada cría de rata diariamente, se añadieron las puntuaciones, y se calcularon las sumas medias para cada grupo de tratamiento y se sometieron a ensayo para una significación estadística en cada momento puntual utilizando el test de la suma de rangos no paramétrica de Kruskal-Wallis.

His rFGF10 en todos los regímenes de dosificación sólo inducía un grado significativo de protección frente a la alopecia inducida por ARA-C el día experimental 8, aunque había una tendencia inducida por His rFGF10 hacia la protección contra ARA-C en todos los demás momentos.

Ejemplo 8 Modelo de mucositis inducida por quimioterapia

Se administraron vehículo solo (solución salina) e His rFGF10 a ratones (15/grupo) tratados con 5-fluorouracilo.

Grupo de control: Los días -2 a 0, se administró solución salina a un grupo de ratones los días -2 a 0, y se les inyectó intraperitonealmente 5- fluorouracilo (5-FU, 60 mg/kg/día) los días 1 a 4.

Pretratamiento con His rFGF10: Los días -2 a 0, se inyectó subcutáneamente His rFGF10 (5 mg/kg) a un grupo de ratones. Los días 1 a 4, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 5-fluorouracilo (5-FU, 60 mg/kg/día).

Se analizaron los efectos sobre los pesos corporales y la supervivencia de los diversos grupos. Los pesos corporales fueron tomados diariamente desde el día 0 a la terminación el día 30. Los ratones fueron examinados visualmente dos veces/día en cuanto a los signos de morbidez durante 30 días y los animales moribundos fueron sometidos a eutanasia. El porcentaje de cambio en el peso corporal el día 6 nadir se expone en la Tabla 4.

TABLA 4 Efectos de His rFGF10 sobre el Peso Corporal

Proteína	% de Cambio en el Peso Corporal
Salina	-11,6
Pretratamiento His rFGF10	-12,2

El pretratamiento con His rFGF10 también demostraba un incremento de la supervivencia.

Ejemplo 9 Modelo de mortalidad por radiación

El pretratamiento con KGF-2 humano recombinante (que tenía la secuencia de Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 y que había sido preparado generalmente según las enseñanzas de WO 96/25422, rhuKGF-2), o bien combinado con G-CSF o bien con solución salina post-BMT, mejoraba significativamente la supervivencia cuando se comparaba con los controles de G-CSF solo o de solución salina. El número de criptas proliferativas del intestino delgado aumentaba 4 días después de 12 Gy en ratones pretratados con rhuKGF-2 y el procedimiento con BMT no alteraba la magnitud de esta respuesta inducida por rhuKGF. Adicionalmente, rhuKGF-2 no alteraba la cinética de recuperación hematopoyética de ratones con BMT tras TBI no letal (9 Gy). Los pretratamientos con rhuKGF-2 evitaban la mortalidad en ratones irradiados letalmente (12 Gy) transplantados con células progenitoras de sangre periférica (1 x 10^{7} PBPC) cuando se utilizaba sola o combinada con G-CSF (100 \mug/kg/día, SC, días 1 a 10). De un modo similar a los experimentos con BMT, ningún ratón transplantado con PBPC de control sobrevivía y los ratones tratados con G-CSF solo tenían una mejoría. Los pretratamientos con rhuKGF-2 tampoco alteraban la cinética de la recuperación hematopoyética tras el transplante con PBPC, en presencia o ausencia de G-CSF, tras TBI no letal (8,5 Gy). Cuando se administraba rhuKGF-2 tanto antes como después de la irradiación letal y PBPC, ni deterioraba la mejoría de la supervivencia observada en ratones tratados con pretratamientos con rhuKGF-2 solo, ni alteraba la cinética de la reconstitución hematopoyética tras la irradiación no letal.

Ejemplo 10 Modelo de mucositis inducida por radiación

Se induce mucositis en ratones con 12 Gy de radiación a todo el cuerpo. Los ratones son tratados diariamente con 5 mg/kg/día de KGF-2 humano recombinante (preparado generalmente según las enseñanzas de WO 96/25422, rhuKGF-2) empezando el día antes de la radiación y continuando hasta el día tres después de la radicación. Cuatro días después de la radiación, se llevó a cabo la necropsia de los ratones y se contó el número de criptas proliferativas (que contenían células BUdR positivas).

El tratamiento con rhuKGF-2 incrementaba el número de criptas proliferativas en el duodeno, el yeyuno proximal y distal del intestino delgado en relación con los animales no tratados con rhuKGF-2. Asimismo rhuKGF-2 era capaz de disminuir la pérdida de peso corporal en los ratones irradiados.

Ejemplo 11 Modelo de mucositis inducida por adriamicina

Se induce mucositis en ratones con una única dosis intraperitoneal de Adriamicina a 24 mg/kg. Los ratones son tratados diariamente con 1 mg/kg/día de rhuKGF-2 empezando el día antes de la radicación y continuando hasta el día tres después de la radiación. Cuatro días después de la radicación, se lleva a cabo la necropsia de los ratones y se cuenta el número de criptas proliferativas (que contienen células BUdR positivas).

El tratamiento con rhuKGF-2 incrementa el número de criptas proliferativas en el duodeno, el yeyuno y el íleon en relación con los animales no tratados con rhuKGF-2.

Ejemplo 12 Modelo de colitis

En dos grupos de 10 animales cada uno, se indujo colitis mediante instilación colónica de ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico en etanol a una dosis de 50 mg/kg de peso corporal. Para determinar si rhuKGF-2 actúa a través de un mecanismos protector, se pretrata un grupo de ratas (grupo A) con rhuKGF-2 o vehículo a las 24 horas y 1 hora antes de la inducción de colitis a una dosis de 5 mg/kg (i.p.) y los animales se sacrifican 8 horas después de la lesión. Para evaluar los efectos de curación potenciales, se inyecta rhuKGF-2 o vehículo (la misma dosis, i.p.) en un segundo grupo (grupo B) 24 horas después de la inducción de la colitis y se continúa el tratamiento diariamente durante 1 semana. La lesión tisular se examina microscópicamente y se expresa como el porcentaje de ulceraciones o erosiones.

Los animales que eran tratados con rhuKGF-2 después de la inducción de la colitis (grupo B) mostraban significativamente menos ulceraciones en comparación con el grupo de control (grupo A). En los animales tratados antes de la inducción de la colitis, había erosiones, pero no se observan úlceras debido al corto período de estudio de 8 horas, y las erosiones no son significativamente diferentes de las observadas en el grupo de control (grupo A).

Ejemplo 13 Modelo de colitis inducido por sulfato de dextrano

Estudio 1

Se alimentan ratas con DSS en agua al 4% y 6% durante 1 semana. Al final de la segunda semana se preservaron los 4 cm distales del colon. Se preparan ocho secciones a intervalos de 0,5 cm y se tiñen con H & E. Se evalúa el porcentaje de cada sección de colon con necrosis (destrucción de la estructura glandular) de un modo al azar y codificado.

Estudio 2

Se administra a las ratas vehículo IP o rhuKGF-2 (1 mg/kg/día) y se alimentan con agua o sal de sodio de sulfato de dextrano durante 14 días. Las secciones colónicas se tiñen con PAS.

La sal de sodio de sulfato de dextrano parece inducir un incremento de la necrosis de la mucosa colónica relacionada con la dosis. rhuKGF-2 administrado a 1 mg/kg/día durante 14 días aumenta la producción de mucina colónica en el grupo de control asó como en las ratas tratadas con sal de sodio de sulfato de dextrano.

Ejemplo 14 Modelo de cirrosis en ratas

Se utilizan ratas Sprague-Dawley macho que pesan entre 150 y 175 g. Los animales se exponen a fenobarbitol (0,35 mg/ml) en su agua de bebida durante la duración del estudio. Semanalmente se aplica a los animales una dosis de CC14 en vehículo de aceite de maíz mientras se encuentran bajo anestesia ligera con isoflurance. La dosis inicial de CC14 es de 40 \mul por rata. La dosis se ajusta semanalmente, hacia arriba o hacia abajo en incrementos de 40 \mul basándose en la ganancia de peso. Diez animales de control se exponen a fenobarbitol en su agua de bebida y se someten a lavado semanalmente con vehículo de aceite de maíz. La función del hígado se evalúa mediante la medida del aclaramiento de bromosulfoftileína (BSP), niveles de transaminasa en suero y niveles de albúmina en suero. En el momento del sacrificio, se separan los hígados, se pesan y se tratan para la determinación de los niveles de hidroxipropilina como indicador del depósito de colágeno y la fibrosis.

Los animales se mantienen en el protocolo de inducción de cirrosis anterior durante 11 semanas. En la undécima semana, los animales se reparten aleatoriamente en grupos de control y de tratamiento con rhuKGF-2. Se administra rhuKGF-2 una vez al día mediante inyección subcutánea a una dosis de 1 mg/kg, durante un total de 25 días. Al cabo de 15 días de tratamiento con rhuKGF-2, los animales se someten a eutanasia.

Las ratas en las que se inducido la cirrosis con CC14 muestran una elevación de la concentración de BSP en suero, reflejando un aclaramiento en el hígado de este agente. Las ratas tratadas con rhuKGF-2 tienen un nivel en suero de BSP inferior al de los animales no tratados, sugiriendo una función del hígado mejorada. Las ratas que se han vuelto cirróticas por medio de CC14 muestran una elevación de SGPT que revierte mediante tratamiento con rhuKGF-2. El tratamiento con rhuKGF-2 es capaz de elevar la albúmina en suero. El tratamiento con rhuKGF-2 da como resultado un incremento de la razón en peso hígado-cuerpo, reflejando el crecimiento compensatorio del hígado.

Ejemplo 15 Modelo de hepatectomía

Las ratas sometidas a una hepatectomía parcial del 70% recuperan su masa de hígado original más rápidamente cuando son tratadas con 1 mg/kg/día de rhuKGF-2 que cuando se comparan con animales no tratados.

Ejemplo 16 Modelos de hepatotoxicidad aguda

En modelos de hepatotoxicidad aguda, el tratamiento con rhuKGF-2 (1 mg/kg o bien antes o bien 3 horas después del agente incitador) despunta incrementos de los en niveles de transaminasa en suero en ratas con insuficiencia hepática aguda inducida por tetracloruro de carbono, acetaminofeno o galactosamina. El pretratamiento con rhuKGF-2 también evita una disminución de las funciones de aclaramiento del hígado tras el acetaminofeno, como se mide mediante el aclaramiento de sulfobromoftaleína (BSP).

Ejemplo 17 Modelo de transferencia génica mediada por retro-virus in vivo

Se administra intravenosamente rhuKGF-2 (1-5 mg/kg) a ratones. A las 48 horas de la inyección intravenosa de rhuKGF-2, la proliferación de hepatocitos murinos aumenta, en comparación con los hígados no estimulados, y vuelve a niveles proliferativos normales. No se observan módulos ni anomalías microscópicas ni de forma aguda ni al cabo de 5 meses.

Cuando se sigue el tratamiento con rhuKGF-2 mediante inyección intravenosa de un título elevado de E. coli LacZ que expresa vectores retrovirales de Moloney (1 x 108 cfu.ml), la expresión de la \beta-galactosidasa aumenta con un porcentaje de hepatocitos que están siendo transducidos. Varios meses más tarde, una porción de los hepatocitos transducidos sigue siendo X-gal positiva.

Ejemplo 18 Modelo de diabetes in vivo

En este modelo se utilizan ratas macho que pesan 200 a 260 gramos al inicio del estudio (WO 9611950). La diabetes es inducida por una única inyección intravenosa de estreptozocina a 50 mg de estreptozocina en tampón citrato de sodio por kg de peso corporal. Las ratas no diabéticas de control reciben una única inyección intravenosa de tampón citrato de sodio con fines de control. Se administra diariamente rhuKGF-2 en forma de una inyección subcutánea. La dosis de rhuKGF-2 es de 3 ó 5 mg/kg/día, dependiendo del experimento.

En el primer experimento, se inicia la terapia con rhuKGF-2 dos días antes de inducir la diabetes y se continúa tras la inducción de la diabetes durante un total de ocho inyecciones. Aquellas ratas diabéticas que son tratadas con rhuKGF-2 antes de la inducción de la diabetes, y para las cuales rhuKGF-2 también se continúa tras la inducción, muestran síntomas indicativos de una forma de diabetes más suave. Así, la terapia con rhuKGF-2 o bien previene parcialmente la inducción de la enfermedad o bien restaura las células de los islotes productoras de insulina tras la destrucción de las células beta inducida por estreptozocina.

En el segundo y el tercer experimentos, se inicia la terapia con rhuKGF-2 administrada subcutáneamente un día después de la inducción de la diabetes con estreptozocina. En el segundo estudio, la abstinencia de la ingesta de agua y el volumen de producción de orina son significativamente menores en las ratas diabéticas tratadas con rhuKGF-2 en comparación con las ratas diabéticas el día 9, que es un indicativo adicional del alivio del estado de la enfermedad. En el tercer estudio, la terapia con rhuKGF-2 es susceptible de incrementar el contenido total de insulina y péptido C en el páncreas de las ratas diabéticas cuando se compara con las ratas diabéticas tratadas con solución de cloruro de sodio.

En el cuarto experimento, se inicia un curso de 7 días de terapia con rhuKGF-2 tras el tratamiento con estreptozocina y después los animales se siguen durante 12 semanas más. En todos los experimentos, excepto en el cuarto experimento, los niveles de glucosa en sangre, los niveles de glucosa en orina y el volumen de orina se utilizan como puntos finales para el análisis. Adicionalmente, la ingesta de agua, los niveles de péptido C, o la insulina pancreática total y el contenido en péptido C se miden en algunos experimentos. En el cuarto experimento, el único punto evaluado es la glucosa en sangre.

Debido a que una gran fracción de insulina es separada de la circulación por el hígado, la medida de las concentraciones de insulina periférica refleja los eventos del metabolismo post-hepático en lugar de la secreción de insulina desde el páncreas. Por lo tanto, las medidas del péptido C se realizan y se utilizan a menudo como un marcador periférico de la secreción de insulina. El péptido C es producido a partir de la maduración de la pro-insulina a insulina. La insulina y el péptido C son secretados a partir de las células beta en cantidades equimolares, y sólo una pequeña cantidad de péptido C es extraída por el hígado.

Los animales tratados con STZ de los grupos que recibían rhuKGF-2 tienen descensos significativos de la glucosa en sangre durante el período de dosificación de rhuKGF-2.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Amgen Inc.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: USO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE QUERATINOCITOS-2

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 16

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Amgen Inc.

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(B)

CALLE: 1840 De Havilland Drive

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(C)

CIUDAD: Thousand Oaks

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(D)

ESTADO: CA

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 91320-1789

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(v)

FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1,0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE SOLICITUD:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/028.495

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15- OCT-1.996

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/032.253

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-DIC-1.996

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/033.457

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-DIC-1.996

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 1

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 627 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..627

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 1:

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 2

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 209 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 2:

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 3

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 588 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..588

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 3:

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 4

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 196 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 4:

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 5

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 513 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..513

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 5:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 6

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 6:

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 7

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACAACATA TGGTTTCTCC GGAGGCTACC AACTCC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 8

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACCA TGGGG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 9

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGATGA CGATGATAAA CAGGCTCTGG GTCAGGACAT GGTTTCT

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 10

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGAAAC CATGTCCTGA CCCAGAGCCT GTTTATCATC GTCATCG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACAACATA TGTCTTCTCC TTCCTCTGCA GGTAGGCATG

\hfill

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCGGAGCTA CAA

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACCA TGGGG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATGCTGGGT CAGGACATGG TTTCT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGAAAC CATGTCCTGA CCCAGCA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGAGGCTA CCAACTCTAG CTCCAGCAGC TTCTCCTCTC

\hfill

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCTCTGC A

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: desconocida

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NUM: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCTAGGAG AGGAGAAGCT GCTGGAGCTA GAGTTGGTAG CCT

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (15)

1. Un método in vitro para estimular la producción de células epiteliales seleccionadas entre células del ojo, el oído, las encías, y la vejiga urinaria, que comprende poner en contacto tales células con una cantidad eficaz de un o varias proteínas de KGF-2.

2. El método según la Reivindicación 1, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 tienen una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 o una secuencia variante de la misma, donde dicha variante comprende deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la proteína de KGF-2 madura.

3. El método según la reivindicación 2, donde dicha secuencia variante comprende una secuencia de aminoácidos homóloga en más del ochenta por ciento (80%), noventa por ciento (90%), noventa y cinco por ciento (95%) o noventa y nueve por ciento (99%) a los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 y donde dicha variante comprende deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la proteína de KGF-2 madura.

4. El método según la Reivindicación 2, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 está fusionada con todo o parte del dominio constante de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana.

5. El método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 son modificadas químicamente conectándolas a un polímero.

6. El método según la Reivindicación 5, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 son modificadas químicamente mediante conjugación con un polímero soluble en agua.

7. El método según una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, donde antes de la administración dicha proteína o proteínas de KGF-2 son reconstituidas a partir de un polvo deshidratado o liofilizado.

8. El uso de una cantidad eficaz de una o varias proteínas de KGF-2 para la producción de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un estado en un paciente que padezca una afección seleccionada entre abrasión de la córnea o ulceraciones de la córnea, enfermedades de la encía, lesión del tímpano, o estados de ulceración o inflamatorios de la vejiga urinaria.

9. El uso según la Reivindicación 8, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 tienen una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 o una secuencia variante de la misma, donde dicha variante comprende deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la proteína de KGF-2 madura.

10. El uso según la Reivindicación 11, donde dicha secuencia variante comprende una secuencia de aminoácidos homóloga en más del ochenta por ciento (80%), noventa por ciento (90%), noventa y cinco por ciento (95%) o noventa y nueve por ciento (99%) a los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} de la SEC ID NUM: 2 y donde dicha variante comprende deleciones, inserciones, sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la proteína de KGF-2 madura.

11. El uso según la Reivindicación 9, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 están fusionadas con todo o parte del dominio constante de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana.

12. El uso según una cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 11, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 son modificadas químicamente conectándolas a un polímero.

13. El uso según la Reivindicación 12, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 son modificadas químicamente mediante conjugación con un polímero soluble en agua.

14. El uso según una cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 13, donde antes de la administración dicha proteína o proteínas de KGF-2 son reconstituidas a partir de un polvo deshidratado o liofilizado.

15. El uso según una cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 14, donde dicha proteína o proteínas de KGF-2 son administradas a través de una ruta tópica, entérica o parenteral.