MXPA99003532A

MXPA99003532A - Productos del factor 2 de crecimiento de queratinocitos

Info

Publication number: MXPA99003532A
Application number: MXPA/A/1999/003532A
Authority: MX
Inventors: Owers Narhi Linda; David Osslund Timothy
Original assignee: Amgen Inc; Narhi Linda Owens; Osslund Timothy D
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2000-04-24

Abstract

La presente invención se refiere a las variantes y a los derivados químicos de la proteína factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2). También se describen las moléculas deácido nucleico que codifican para tales variantes, asícomo los métodos para utilizar tales variantes y derivados químicos, para estimular la proliferación de células epiteliales.

Description

í PRODUCTOS DEL FACTOR 2 DE CRECIMIENTO DE QUERATINOCITOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la tecnología de ADN recombinante y a la ingeniería de proteínas. Específicamente, la presente invención se refiere a las variantes y derivados del factor 2 de crecimiento de queratinocitos (KGF-2), y a los usos de los mismos.

ANTECEDENTES" DE LA INVENCIÓN El proceso complejo de la generación y regeneración de los tejidos es mediado por un número de factores proteicos, algunas veces denominados como factores de crecimiento de tejido suave. Estas moléculas son en general liberadas por un tipo celular y actúan para influenciar la proliferación de otros tipos celulares (Rubin y colaboradores (1989), Proc. Nat'l. Acad Sci, USA, 86:802-806). Existen también algunos factores de crecimiento liberados de las células que por sí mismos tienen la capacidad para responder a tales factores de crecimiento. Algunos REF.: 30055 factores de crecimiento del tejido suave son secretados por tipos particulares de células e influyen sobre la proliferación, la diferenciación y/o la maduración de células respondedoras en el desarrollo de los organismos multicelulares (Finch y colaboradores (1989), Science, 245 : 752-755) . Además de sus papeles en los organismos en desarrollo, algunos factores de crecimiento de tejido suave son significativos en la salud continua y en el mantenimiento de sistemas más maduros. Por ejemplo, en mamíferos existen muchos sistemas donde ocurre la producción rápida de células. Tales sistemas incluyen la piel y el tracto gastrointestinal, los cuales están comprendidos de células epiteliales. Incluidos dentro de este grupo de factores de crecimiento de tejido suave está una familia de proteínas de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) . La familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) se sabe ahora que consiste de al menos catorce miembros, a saber FGF-1 al FGF-10 y factores homólogos FHF-1 al FHF-4, los cuales comparten una relación entre las estructuras primarias: el factor de crecimiento básico de fibroblastos, bFGF (Abraham y colaboradores. (1986), EMBO J., 5:2523-2528); factor de crecimiento de fibroblastos ácido, aFGF (Jaye y colaboradores (1986), Science, 233: 541-545) ; el producto del gen int-2 (Dickson & Peters (1987); Nature, 326:833) ; hst/kFGF (Delli-Bovi y colaboradores (1987), Cell, 50:729-737 y Yoshida y colaboradores (1987), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, ^4:7305-7309); FGF-5 (Zhan y colaboradores. (1989), Mol. Cell. Biol., .3487-3495) ; FGF-6 (Marics y colaboradores (1989), Oncogene, 335-340); factor de crecimiento de queratinocitos, KGF (Finch y colaboradores 1989), Science, 2_4: 752-755) ; hísactofilina (Habazzettl y colaboradores (1992), Nature, 359:855-858) ; FGF-9 (Miyamoto y colaboradores (1993), Mol. Cell. Biol., 13 (7) :4251-4249) ; y el factor 10 de crecimiento de fibroblastos también conocido como el factor 2 de crecimiento de queratinocitos, KGF-2 (solicitud de patente PCT WO 96/25422), las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente.

Más recientemente, fueron identificados cuatro factores (o "FHFs") a partir de la retina humana mediante una combinación de secuencia iento de ADNc aleatorio, búsquedas de bases datos de secuencias existentes y reacciones en cadena de polimerasa basadas en homología (Smallwood y colaboradores (1996), Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 93:9850-9857). Se ha propuesto que FHF-1, FHF-2, FHF-3 y FHF-4 deben ser designados como FGF-11, FGF-12, FGF-13 y FGF-14, respectivamente, de acuerdo con la recomendación del Comité de Nomenclatura (Coulier y colaboradores 1997) , Journal of Molecular Evolution, 4_4: 43-56, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . El documento WO 96/25422 describe la clonación, expresión y purificación de KGF-2 de longitud completa (con la secuencia de señal, los residuos Met1 a Thr36 de la SEQ ID NO: 2) y maduro (sin la secuencia de señal, residuos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2) en un sistema de expresión bacterial (por ejemplo E . coli ) y sistemas de expresión de eucarióticos (por ejemplo, baculovirus y células COS) . Esta referencia enseña además que KFG-2 puede ser útil para estimular el desarrollo celular y la proliferación para el crecimiento de los vasos sanguíneos nuevos o la angiogénesis, la prevención de la pérdida del pelo, el sanado de las heridas dérmicas y la diferenciación de las células musculares, tejido nervioso, células prostáticas y células pulmonares. Queda mucho por aprender respecto a KGF-2, incluyendo las modificaciones que pueden ser realizadas a éste para generar la o las variantes o derivados que conservan alguna o toda la actividad biológica de KGF-2. En general, los efectos de i cualquier cambio de aminoácido específico o derivatización química sobre la actividad biológica de una proteína, variará dependiendo de un número de factores, incluyendo si las modificaciones afectan o no la estructura tridimensional o la región de enlace al receptor de la proteína. Ya que no ha sido publicada la estructura tridimensional ni la región de enlace al receptor de KGF-2, el conocimiento dentro de la técnica no permite generalización respecto a los efectos de las modificaciones de aminoácidos específicas o la derivatización química a KGF-2. Un objetivo de esta invención es proporcionar variantes y derivados de KGF-2 que conserven alguna o toda la actividad biológica de KGF-2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida al producto o productos proteicos de KGF-2, como se define más adelante. Estos productos proteicos de KGF-2 tienen aplicabilidad general y pueden conservar alguna o toda la actividad biológica de KGF-2.

En un aspecto, una variante o variantes de KGF-2 es producida mediante técnicas de ingeniería genética recombinantes. En una modalidad alternativa, una variante de KGF-2 es sintetizada mediante técnicas químicas, o una combinación de las técnicas recombinantes y químicas. Se puede elaborar una o varias variantes de KGF-2 en forma glucosilada o no glucosilada. Otro aspecto más de la presente invención incluye los diversos polinucleótidos que codifican para una o varias variantes de KGF-2. Cada secuencia de ácido nucleico puede ser utilizada en la expresión de una o varias variantes de KGF-2 en una célula huésped eucariótica o procariótica. Los polinucleótidos pueden ser utilizados también en terapia celular o en aplicaciones de terapia génica. Un aspecto adicional de la presente invención involucra los vectores que contienen los polinucleótidos que codifican para una o varias variantes de KGF-2, operati amente ligados a la secuencia de control de amplificación y/o de expresión . Un aspecto adicional de la presente invención pertenece a las células huésped procarióticas y eucarióticas que comprenden ( polinucleótidos recombinantes que codifican para las variantes de KGF-2. En otro aspecto más, la presente invención incluye además la producción recombinante de una o varias variantes de KGF-2, en donde las células huésped recombinantes son desarrolladas en un medio nutritivo adecuado, y en donde una o varias variantes de KGF-2 expresadas por la células son opcionalmente aisladas de las células huésped y/o del medio nutritivo. Un aspecto adicional de la presente invención incluye la o las proteínas de KGF-2, como se define más adelante, unidas a un polímero soluble en agua. Por ejemplo, una o más variantes de KGF-2 pueden ser conjugadas a una o más moléculas de polietilenglicol con el fin de mejorar el funcionamiento farmacocinético al incrementar el peso molecular aparente de la molécula. Otro aspecto más de la presente invención incluye las composiciones farmacéuticas que contienen una o más variantes de KGF-2, o los derivados químicos de la o las proteínas de KGF-2. Típicamente, una o más variantes de KGF-2 pueden ser formuladas en asociación con vehículos farmacéuticamente aceptables. Se puede utilizar una variedad de otros materiales de formulación para facilitar la fabricación, el almacenamiento, el manejo, la distribución y/o la eficacia de una o más variantes de KGF-2. Otro aspecto más se refiere a los métodos de modulación del crecimiento y diferenciación de células epiteliales. Específicamente, a un paciente en necesidad de estimulación (incluyendo citoprotección, proliferación y/o diferenciación) de las células epiteliales, se le administrará una cantidad terapéuticamente efectiva o profilácticamente efectiva de una o más variantes de KGF-2 y/o un derivado químico de la o las proteínas de KGF-2. Los aspectos y ventajas adicionales de la invención se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica después de la consideración de la siguiente descripción, la cual detalla la práctica de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Numerosos aspectos y ventajas de la presente invención se volverán aparentes a partir de la revisión de las figuras, en donde: ( La Figura 1 describe una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 1) que codifica para KGF-2 humano recombinante, de longitud completa. También se describe la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 ) del KGF-2 humano recombinante, de longitud completa. Los 36 residuos de aminoácidos iniciales (Met1 a Thr36) representan la secuencia guía putativa de KGF-2 de longitud completa y los residuos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2 representan KGF-2 maduro. Las formas de longitud completa maduras son colectivamente denominadas "KGF-2".

La Figura 2 describe una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 3) que codifica para dN29 hFGFlO. También se describe la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de dN29 hFGFlO.

La Figura 3 describe una secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 5) que codifica para dN20 hFGFlO. También se describe la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de dN20 hFGFlO.

La figura 4 describe una secuencia de ADNc (SEQ ID No.7) que codifica para hFGFlO R149Q.

También se describe una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 8) de hFGFlO R149Q.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Proteína(s) KGF-2 De acuerdo con los términos de esta invención, por el término "proteína (s) de KGF-2" se entiende la proteína definida por los aminoácidos Cys37 al Ser208 de la SEQ ID NO: 2 (KGF-2 madura) y las proteínas variantes de la misma. El término "proteína (s) KGF-2" incluye de este modo una proteína en la cual han sido suprimidos uno o más residuos de aminoácidos de ("variante (s) de supresión"), insertados dentro ("variante (s) de adición") y/o sustituidos por ("variante (s) de sustitución") residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y la cual conserva actividad biológica. De este modo, mientras que las descripciones siguientes de modificaciones de proteína se refieren a KGF-2 madura, ésta no excluye las modificaciones adicionales a la misma. El término "actividad biológica" como se utiliza en la presente significa que una o varias proteínas de KGF-2 poseen algunas, pero no necesariamente todas, las mismas propiedades de (y no necesariamente al mismo grado que) KGF-2 maduro. La selección de las propiedades particulares de interés depende del uso deseado de la o las proteínas KGF-2. Podrá ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que pueden ser realizadas muchas combinaciones o supresiones, inserciones, y sustituciones, con la condición de que la proteína final sea biológicamente activa. Existen dos variables principales en la construcción de la o las variantes de la secuencia de aminoácidos: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. En la designación de variante (s), la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la o las características bioquímicas que se van a modificar. Los sitios de mutación pueden ser individualmente modificados o en serie, por ejemplo mediante (1) la supresión del residuo de aminoácido objetivo, (2) la inserción de residuos de aminoácidos adyacentes al sitio localizado o (3) la sustitución primeramente con elecciones de aminoácidos conservadores, y, dependiendo de los resultados logrados, luego con más selecciones radicales. Las supresiones de la secuencia de aminoácidos están en general en el intervalo de aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, desde aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, desde aproximadamente 20 aminoácidos, y típicamente desde aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las supresiones dentro de la secuencia de aminoácidos de KGF-2 maduro pueden ser realizadas, por ejemplo, en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia FGF. Las supresiones dentro de la secuencia de aminoácidos de KGF-2 maduro en áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia FGF más probablemente serán para modificar significativamente la actividad biológica. El número de supresiones totales y/o supresiones consecutivas preferentemente será seleccionado para preservar la estructura terciaria de KGF-2 maduro (aminoácidos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO. 2) en el dominio afectado, por ejemplo, la reticulación de la cisteína. La adición de secuencias de aminoácidos puede incluir funciones amino- y/o carboxilo-terminales en el intervalo de longitud desde un residuo hasta cien o más residuos, así como las inserciones intrasecuenciales internas de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Las adiciones internas pueden estar en el intervalo preferentemente de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 1 a 5 residuos de aminoácidos, y todavía más preferentemente de aproximadamente 1 a 3 residuos de aminoácidos. Las adiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de KGF-2 maduro pueden ser realizadas en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia FGF. Las adiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de KGF-2 maduro en áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia FGF, serán más probablemente para modificar de manera significativa la actividad biológica. Las inserciones o adiciones incluyen preferentemente secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencias de otros miembros de la familia FGF. Una adición amino-ter inal es contemplada para incluir la adición de una metionina (por ejemplo, como un artefacto de la expresión directa en cultivos de células recombinantes bacterianas) o un residuo de aminoácidos o secuencia de KGF-2 maduro. Un ejemplo adicional de una adición N-terminal incluye la fusión de una secuencia de señal al extremo N de KGF-2 maduro, con el fin de facilitar la secreción de la proteína de las células huésped recombinantes. Tales secuencias de señal serán obtenidas en general a partir de, y de este modo serán homologas, a la especie de la célula huésped pretendida. Incluida dentro del alcance de esta invención está la secuencia de señal nativa, por ejemplo, la secuencia de señal nativa de la proteína definida por los aminoácidos Met1 a Thr36 de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de señal heteróloga. Una secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada (por ejemplo, escindida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y no procesan la secuencia de señal nativa, la secuencia de señal puede ser sustituida por una secuencia se señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa o las guías de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción en levadura, la secuencia de señal puede ser seleccionada, por ejemplo, del grupo de la invertasa de levadura, el factor alfa o las secuencias guía de la fosfatasa acida. En la expresión en células de mamífero específicamente, las secuencias de señal de KGF-2 de longitud completa o de otros miembros de la familia FGF (por ejemplo, KGF) pueden ser adecuadas. Un ejemplo de una adición en el extremo carboxilo incluye proteínas quiméricas que comprenden la fusión de KGF-2 con todo o parte del dominio constante de la cadena pesada o ligera de la imunoglobulina humana. Tales polipéptidos quiméricos s son preferidos en donde la porción de la inmunoglobulina comprende todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana tal como IgG, IgA, IgM, o IgE, especialmente IgG, por ejemplo, IgGl o IgG3. Un experto en la técnica apreciará que cualquier aminoácido de la porción de la inmunoglobulina puede ser suprimido o sustituido por uno o más aminoácidos, o uno o más aminoácidos pueden ser agregados, siempre y cuando la porción de KGF-2 estimule todavía las células epiteliales y la porción de la inmunoglobulina muestre una o más de sus propiedades características. Otro grupo más de variantes (s) es la o las variantes de sustitución de aminoácidos de KGF-2 maduro. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la secuencia de Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2 eliminado y un diferente residuo insertado en su sitio. Las variantes de sustitución incluyen variantes alélicas, las cuales están caracterizadas por cambios en la secuencia nucleotídica de origen natural en la población de la especie que puede o no dar como resultado un cambio de aminoácido. Alguien de experiencia en la técnica puede utilizar cualquier información conocida respecto al enlace o al sitio i activo del polipéptido en la selección de los sitios de mutación posibles. Un método para identificar los residuos o regiones de aminoácidos para la mutagénesis es denominado "mutagénesis de exploración de alanina", como se describe por Cunningham y Wells (1989), Science, 244 : 1081-1085, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . En este método, se identifica un residuo de aminoácido o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o negativamente cargado, (más preferentemente alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el ambiente acuoso circunvecino dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestren sensibilidad funcional a la sustituciones son luego refinados dentro de la introducción de residuos adicionales o alternados en los sitios de sustitución. De este modo, el sitio para la introducción de una modificación en la secuencia de aminoácidos es predeterminado y, para optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se puede conducir la exploración de alanina o la mutagénesis aleatoria y la o las variantes pueden ser i seleccionadas para la combinación óptima de la actividad deseada y el grado de actividad. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen sitios en los cuales los residuos particulares dentro de los aminoácidos Cys37 al Ser208 de la SEQ ID NO: 2 son sustancialmente diferentes de las diversas especies o de otros miembros de la familia FGF, en términos del volumen de cadena lateral, de la carga y/o de la hidrofobicidad. Otros sitios de interés incluyen aquellos en los cuales los residuos particulares dentro de los aminoácidos Cys37 al Ser208 de la SEQ ID NO: 2, son idénticos entre diversas especies u otros miembros de la familia TGF. Tales posiciones son en general importantes para la actividad biológica de una proteína. En consecuencia, un experto en la técnica podría apreciar que inicialmente estos sitios deben ser modificados mediante sustitución de una manera relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadoras son mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezado de "Sustituciones Preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden ser introducidos más cambios sustanciales (Sustituciones Ejemplares) y/o otras adiciones/supresiones pueden ser realizadas y los productos resultantes se seleccionan. Tabla 1: sustituciones de aminoácidos En la realización de tales cambios de una naturaleza equivalente, el índice hidropático de aminoácidos puede ser considerado. La importancia del índice hidropático al conferir la función biológica interactiva sobre una proteína, es en general comprendida en la técnica (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157 : 105-131, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . Es sabido que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático similar o que todavía conserven una actividad biológica similar . Es también comprendido en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede ser efectivamente realizada con base en la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido equivalente funcional biológico, creado mediante ésta, está encaminada al uso de modalidades inmunológicas, como en el presente caso. La Patente Norteamericana No. 4,554,101, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente, establece que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como es gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, por ejemplo, con una propiedad biológica de la proteína. La Patente Norteamericana No. 4,554,101 también enseña la identificación y preparación de epítopes a partir de secuencias de aminoácidos primarias con base en la hidrofilicidad. A través de los métodos descritos en la Patente Norteamericana 4,554,101 un experto en la técnica podría ser capaz de identificar epítopes, por ejemplo, dentro de la secuencia de aminoácidos de KGF-2. Estas regiones son también denominadas como "regiones de núcleo epitópico". Han sido realizadas numerosas publicaciones científicas para la predicción de la estructura secundaria, y para la identificación de los epítopes, a partir de los análisis de las secuencias de aminoácidos (Chou y Fasman (1974), Biochemistry, 13 (2) :222-245; Chou y Fasman (1974), Biochemistry, 13 (2) .211-222; Chou y Fasman (1978), Adv. Enzymol.

Relat. Áreas Mol. Biol., 47:45-148; Chou y Fasman (1978), Ann, Rev. Biochem., _47:251-276 y Chou y Fasman (1979), Biophys. J., 2_6:367-384, la descripción de las cuales se incorporan por referencia en la presente) .

Además, los programas de computadoras son actualmente disponibles para ayudar con la predicción de las porciones antigénicas y las regiones de núcleo epitópico de las proteínas. Los ejemplos incluyen aquellos programas basados en el análisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf (1988), Comput. Appl. Biosci., 4 (1) .181-186 y Wolf y colaboradores (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1): 187-191, la descripción de las cuales se incorporan por referencia en la presente) ; el programa PepPlot® (Brutlag y colaboradores (1990), CABS, 60237-245 y Weinberger y colaboradores (1985), Science, 228 : 740-742, la descripción de las cuales se incorporan por referencia en la presente) ; y otros nuevos programas para la predicción de la estructura terciaria de la proteína (Fetrow y Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11:479-483, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . En contraste, pueden ser logradas modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los aminoácidos Cys37 a i Ser208 de la SEQ ID NO: 2, mediante la selección de las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) la estructura de la columna vertebral polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o de hélice, (b) la carga relativa o la hidrofobicidad de la proteína en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural son divididos en grupos basados en las propiedades de cadena laterales comunes: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras pueden involucrar un intercambio de un miembro de uno de estos grupos por otro. Tales residuos sustituidos pueden ser introducidos en regiones de los aminoácidos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2 que, por ejemplo, son homologas con las regiones de otros miembros de la familia de FGF o dentro de las regiones no homologas de la proteína. En una modalidad específica, un polipéptido variante será preferentemente sustancialmente homólogo a los aminoácidos Cys37 al Ser208 de la SEQ ID NO: 2. El término "sustancialmente homólogo", como se utiliza en la presente, significa que tiene un grado de homología (por ejemplo, identidad de residuos de aminoácidos) a los aminoácidos Cys37 al Ser208 de la SEQ ID NO: 2 mayor del ochenta por ciento (80%); preferentemente mayor de noventa por ciento (90%); más preferentemente, mayor del noventa y cinco por ciento (95%); y más preferentemente mayor de noventa y nueve por ciento (99%) . El porcentaje de homología como se describe en la presente es calculado como el porcentaje de residuos de aminoácidos encontrados en la más pequeña de las dos secuencias que se alinean con los residuos de aminoácidos idénticos en la secuencia que es comparada cuando pueden ser introducidos cuatro espacios vacíos en una longitud de 100 aminoácidos para ayudar a su alineamiento, como se describe por Dayhoff (1972), en Atlas of Protein Sequence And Structure, 5_:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente. También incluidas como sustancialmente homologas, están las variantes de los aminoácidos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2 los cuales pueden ser aislados en virtud de la radiactividad cruzada con los anticuerpos a los aminoácidos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2, o cuyos genes pueden ser aislados a través de la hibridación con el ADN de la SEQ ID NO: 1 o con los segmentos del mismo. Una primera clase de la o las variantes es un grupo de variantes de supresión de Cys37 a Ser208 de la SEQ ID No: 2. Estas variantes incluyen las proteínas de R?-[Asn71-Pro203]-COOH, e incluyen además una secuencia de aminoácidos que comprenden NH2-[His72-Ser208]-COOH (también denominada como ?N35 KGF-2), NH2-[Leu73-Ser208 -COOH (también denominada como ?N36 KGF-2), NH2-[Gln74-Ser208 -COOH (también denominada como ?N37 KGF-2), NH2-[Gly75-Ser208 -COOH (también denominada como ?N38 KGF-2), NH2-[Asp76-Ser208 -COOH (también denominada como ?N39 KGF-2), NH2-[Val77-Ser208 -COOH (también denominada como ?N40 KGF-2), y NH2-[Arg78-Ser208]-COOH (también denominada como ?N41 KGF-2), en las cuales cada una puede estar N-terminalmente metionilada o no metionilada, no obstante con la condición de que sea excluido Cys37 a Ser208 de la SEQ ID No. 2. Por "R1-[Asn71-Pro203]-COOH" se entiende un grupo de la o las variantes de supresión, en donde [Asn71-Pro203] representa los residuos 71 al 203 de la SEQ ID No. 2; en donde Ri representa un grupo amino metionilado o no metionilado de Asn71 o del o de los residuos de aminoácidos amino-terminales seleccionados del grupo: Tyr, Ser-Tyr, Arg-Ser-Tyr, Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 9) , His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 10), Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 11), Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 12), Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 13), Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 14), Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 15), Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 16), Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 17) , Ser- Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 18), Phe-Ser- Ser-Pro- Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 19), Ser-Phe-Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 20), Ser-Ser-Phe- Ser- Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 21), Ser- Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 22), Ser- Ser- Ser-Ser-Phe- Ser- Ser-Pro- Ser-Ser-Al a-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 23), Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 24), Asn- Ser- Ser- Ser- Ser- Ser- Phe- Ser- Ser-Pro- Ser- Ser-Al a-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 25), Thr-Asn- Se - Ser-Ser- Ser-Ser-Phe-Ser- Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 26), Al a-Thr-Asn- Ser- Ser-Ser- Ser-Ser- Phe-Ser- Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 27), Glu-Al a-Thr-Asn- Ser- Ser-Ser- Ser- Ser-Phe- Ser-Ser- Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 28) , Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser- Ser-Ser-Ser'•Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser--Tyr (SEQ ID NO. 29), Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-•Ser-Phe-Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg--Ser-Tyr (SEQ ID NO. 30) , Va1-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-ser- Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val--Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 31) , Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn- Ser-Ser• •Ser-Ser-Ser-Phe- Ser-Ser-Pro-Ser- Ser-Al a-Gly-Arg-His- Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 32) , Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser- Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser- Ser- Pro- Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-•His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 33), Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Al a-Thr-Asn-•Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly--Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 34), Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr--Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser- Ser-Pro-Ser-Ser-Ala--Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 35), Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val -Ser-Pro-Glu-Ala-•Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser--Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 36), Ala-Leu-G1y-Gln-Asp-Met-Val -Ser-Pro-Glu-Ala- hr-Asn-Ser- Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 37), Gln-Ala-Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn- Ser-Ser- Ser-Ser- Ser-Phe-Ser- Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 38), o Cys-Gln-Ala-Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Al a-Thr-Asn-Ser- Ser-Ser-Ser- Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 39) . y, en donde R2 representa un grupo carboxilo de Pro C3 O de residuos de aminoácidos carboxilo-terminales de: Met Met-Val Met-Val-Val Met-Val-Val-His (SEQ ID No. 40), o Met-Val-Val-His-Ser (SEQ ID No. 41), no obstante con la condición, de que Ri y R2 no se seleccionen para reconstruir Cys37 a Ser208 de la SEQ ID No. 2. La o las variantes preferidas dentro de esta clase incluyen las siguientes moléculas: ?N36 KGF-2; ?N35 KGF-2; NH2-[Asn71-Se~r,-2Z0UßB?]-C00H (también denominada como ?N34 KGF-2) ; NH2-Tyr-[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N33 KGF-2); NH2-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N32 KGF-2); NH2-Arg-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N31 KGF-2); NH2-Val-Arg-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N30 KGF-2); NH2-His-Val-Arg-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N29 KGF-2) ; NH2-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N28 KGF-2); NH2-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N27 KGF-2); y NH2-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr[Asn71-Ser208]-COOH (también denominada como ?N26 KGF-2), ya sea metionilada o no metionilada. Una segunda clase de variantes es un grupo de variantes de sustitución, supresión o adición de KGF-2 y/o de la primera clase de las variantes de KGF-2, descritas anteriormente, que tienen una región que corresponde a Asn168 hasta Met176 de la SEQ ID No. 2, en donde al menos un residuo de aminoácido dentro de la región correspondiente a Asn168 hasta Met17e de la SEQ ID No. 2 está suprimida o sustituida con un aminoácido no nativo, o se agrega un aminoácido no nativo dentro de la región correspondiente a Asn168 hasta Met176 de la SEQ ID No. 2; esta región es única entre la familia FGF y contiene residuos (Trp y His ) que pueden conferir predominantemente especificidad de enlace y los residuos (Gly173 y Met176) que pueden estabilizar predominantemente la estructura a la región. En una modalidad específica, la región correspondiente a Asn168 hasta Met176 está suprimida o reemplazada con la siguiente secuencia: NH2-Ala-Lys-Trp-Thr-His-Asn-Gly-Gly-Glu-Met-COOH, la cual es la secuencia de una región de enlace al receptor, putativa de KGF. Una tercera clase de variantes es un grupo de variantes de supresión o sustitución de KGF-2 y/o de la primera clase de variantes de KGF-2 y/o de la segunda clase de variantes de KGF-2, como se describe anteriormente, que tienen una región correspondiente a Phe85 hasta Ser198 de la SEQ ID No. 2, en donde al menos un residuo de aminoácido neutro o positivamente cargado dentro de la región correspondiente a Phe85 hasta Ser198 de la SEQ ID NO. 2 está suprimido o sustituido con un residuo neutro o un residuo negativamente cargado, seleccionado para efectuar una proteína de cambio de carga con una carga positiva reducida. Los residuos preferidos para la modificación son residuos que corresponden a Phe85, Thr86, Asn159, Gly182, Arg187, Asn196, Thr197, Ser198 de la SEQ ID No. 2, con los residuos Thr86, Gly182, Arg187 y Asn196 que son más preferidos. Los aminoácidos preferidos para la sustitución incluyen alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, asparagina, glicina, valina, leucina, isoieucina, serina y treonina; con la alanina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico y asparagina que son más preferidos; y con la alanina que es la más preferida. Una cuarta clase de variantes es un grupo de variantes de KGF-2 y/o de la primera clase de variantes de KGF-2 y/ó de la segunda clase de variantes de KGF-2 y/o de la tercera clase de variantes de KGF-2, descritas anteriormente, que tienen una región correspondiente a una región formadora de rizo superficial, putativa, Asn160 hasta Thrl 4 de la SEQ ID No. 2, en donde al menos un aminoácido que tiene un potencial más alto de formación de rizo o vuelta, está sustituido por al menos un aminoácido que tiene un potencial más bajo de formación de rizo o vuelta, dentro de la región correspondiente a Asn160 hasta Thr164 de la SEQ ID No. 2. El aminoácido no nativo se selecciona por su mayor potencial de formación de rizo o vuelta, con el fin de estabilizar esta área de la proteína. Los aminoácidos que tienen potencial relativamente alto para formación de rizo o vuelta, incluyen glicina, prolina, tirosina, ácido aspártico, asparagina, y serina. Leszcynski y colaboradores, Science, 234, 849-855 (1986) (valores relativos de potencial para la formación de rizo o vuelta, asignados con base en la frecuencia de aparición en las estructuras de rizo o vuelta de las moléculas de origen natural) . Preferentemente, un diferente aminoácido que tiene más alto potencial para la formación de rizo o vuelta reemplaza a un residuo de treonina correspondiente a Thr164 de la SEQ ID No. 2 en la secuencia de formación de rizo o vuelta. Una quinta clase de variantes es un grupo de variantes de sustitución de KGF-2 y/o de la primera clase de variantes KGF-2, y/o la segunda clase de variantes de KGF-2 y/o la tercera clase de variantes de KGF-2 y/o de la cuarta clase de variantes de KGF-2, descritas anteriormente, que tienen los residuos de aminoácidos correspondientes a Cys37, Cys106 o Cys150 de la SEQ ID No. 2, en donde al menos un residuo de cisteína de origen natural en una posición correspondiente a la posición 37, 106 ó 150 de la SEQ ID No: 2 está suprimida o sustituida ( con un residuo de aminoácido no nativo (por ejemplo, Ala, Leu, o Ser) . Una sexta clase de variantes es un grupo de variantes de sustitución o supresión de KGF-2 y/o de la primera clase de las variantes de KGF-2 y/o de la segunda clase de las variantes de KGF-2 y/o de la tercera clase de las variantes de KGF-2 y/o de la cuarta clase de las variantes de KGF-2 y/o de la quinta clase de las variantes de KGF-2, descritas anteriormente, que tienen al menos un sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado correspondiente a un sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado dentro de Cys37 hasta Ser208 de la SEQ ID No. 2. Tales variantes tiene al menos un aminoácido dentro del sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado dentro de la región correspondiente a un sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado dentro de Cys37 hasta Ser208 de la SEQ ID NO. 2 suprimido o sustituido con un aminoácido no nativo, para modificar el sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado y generar una proteína con glucosilación alterada. Un sitio de reconocimiento de glucosilación enlazada a la asparagina comprende una secuencia tripeptídica que es específicamente reconocida por las enzimas de glucosilación celulares, apropiadas. Estas secuencias tripeptídicas son ya sea Asn-Xaa-Thr o Asn-Xaa-Ser, en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido diferente de Pro. Los residuos de asparagina probados o predichos existen en las posiciones 51 y 196 de los aminoácidos Cys37 hasta Ser208 de la SEQ ID No. 2. Se puede realizar una variedad de sustituciones o supresiones de aminoácidos para modificar los sitios de glucosilación N-enlazados u O-enlazados. Una séptima clase de variantes es un grupo de variantes de adición de KGF-2 y/o de la primera clase de las variantes de KGF-2 y/o de la segunda clase de las variantes de KGF-2 y/o de la tercera clase de las variantes de KGF-2 y/o de la cuarta clase de las variantes de KGF-2 y/o de la quinta clase de las variantes de KGF-2 y/o de la sexta clase de las variantes, descritas anteriormente, en donde los sitios de escisión putativos Asn128-Gly129 y/o Asn1 1-Gly142 son modificados mediante una sustitución de un aminoácido (por ejemplo, Gln o Ser) para el Asn128 y/o Asn141. Una octava clase de las variantes es un grupo de variantes de adición de KGF-2 y/o de la primera clase de las variantes de KGF-2 y/o de la segunda clase de las variantes de KGF-2 y/o de la tercera clase de las variantes de KGF-2 y/o de la cuarta clase de las variantes de KGF-2 y/o de la quinta clase de las variantes de KGF-2 y/o de la sexta clase de variantes de KGF-2 y/o de la séptima clase de variantes de KGF-2, descritas anteriormente, en donde fusionada al extremo C de una de las proteínas anteriormente mencionadas está una porción inmunoglobulina que comprende al menos un dominio de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (excluyendo no obstante en general el primer dominio) tal como IgG, IgA, IgM o IgE, especialmente IgG, por ejemplo, IgGl o IgG3. Las sustituciones ejemplares de KGF-2 y de las variantes de KGF-2 (particularmente las proteínas de R?-[Asn71-Pro203]-COOH, y más particularmente ?N36 KGF-2, ?N35 KGF-2, ?N34 KGF-2, ?N33 KGF-2, ?N32 KGF-2, ?N31 KGF-2, ?N30 KGF-2, ?N29 KGF-2, ?N28 KGF-2, ?N27 KGF-2 y ?N26 KGF-2, ya sean metioniladas o no metioniladas ) se describen en la siguiente tabla: TABLA 2 Residuo Original Sustitución Preferida Asn71 Arg, Asp, Glu, Lys Leu82 Gly Phe85 Arg, Tyr Thr86 Ala, Asp, Glu, Gly, Ser Glu93 Asp Lys102 Gln, Glu Lys103 Glu, Gln Glu104 Met Cys106 Ser, Ala, Met, Asn Pro107 Ala, Asn, Gly Tyr108 Ala, Phe, Ser Leu111 Ala, Met, Ser Thr114 Ala, Arg, Lys, Ser Val123 He, Leu Asn127 Asp, Glu, Lys Tyr130 Phe Gly142 Ala, Ser Ser143 Ala, Glu, Lys Phe146 Tyr, Ser, Met Leu152 Ala, He, Met, Phe Asn159 Ala, Asp, Gln, Gly, Glu, He, Lys, Met i Gly160 Ala, His, Ser, Tyr Phe167 Ala, Ser, Tyr Gln170 Arg, Glu, Ser, Thr Arg174 Gly, Ala, Ser Tyr177 Phe, Leu Gly182 Ala, Asp, Glu, Ser Arg187 Ala, Glu, Gly, Ser Arg188 Gln Lys195 Glu, Gln Asn196 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu Gly, Lys Thr197 Ala, Arg, Asp, Lys, Glu, Gly Ser198 Ala, Asp, Glu, Gly, Thr Val206 Ala, He, Leu, Val His207 Leu, Ser, Thr, Tyr Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que pueden ser realizadas muchas combinaciones de supresiones, inserciones y sustituciones, con la condición de que la o las proteínas KGF-2 finales sean biológicamente activas. Una o varias variantes de KGF-2 pueden ser rápidamente seleccionadas para evaluar sus propiedades físicas. Por ejemplo, el nivel de f actividad biológica (por ejemplo, enlace y/o afinidad al receptor, actividad mitogénica, proliferativa celular y/o i n vi vo ) puede ser probado utilizando una variedad de ensayos. Un ensayo de este tipo incluye un ensayo mitogénico para probar la habilidad de una proteína para estimular la síntesis de ADN (Rubin y colaboradores (1989), supra, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . Otro ensayo de este tipo incluye un ensayo proliferativo celular para probar la habilidad de una proteína para estimular la proliferación celular (Falco y colaboradores (1988), Oncogene, 2^:573-578, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) .

Derivados polipeptídicos Los derivados químicamente modificados de la o las proteínas de KGF-2 en las cuales el polipéptido está ligado a un polímero, con el fin de modificar las propiedades (denominados en la presente como "derivados"), son incluidos dentro del alcance de la presente invención. Los derivados químicamente modificados de la o las proteínas de KGF-2 pueden ser preparados por alguien de t experiencia en la técnica, dadas las descripciones en la presente. Los conjugados pueden ser preparados utilizando la o las proteínas de KGF-2 glucosiladas, no glucosiladas o desglucosiladas . Típicamente, serán utilizadas proteínas de KGF-2 no glucosiladas . Las porciones químicas adecuadas para la derivatización incluyen polímeros solubles en agua.

Los polímeros solubles en agua son deseables debido a que la proteína a la cual se acopla cada uno no precipitará en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Preferentemente, el polímero será farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o composición terapéutica. Alguien de experiencia en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado con base en consideraciones tales como si el conjugado polímero/proteína será utilizado terapéuticamente y, si así es, el perfil terapéutico (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida; la resistencia a la proteólisis, los efectos, si los hay, sobre la dosificación, la actividad biológica; la facilidad del manejo; el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua sobre una proteína) . i Los polímeros solubles en agua, clínicamente aceptables, adecuados, incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG), polietilenglicol-propionaldehído, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poli (ß-aminoácidos ) (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli (n-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (POG) (por ejemplo, glicerol) y otros polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada, ácidos colónicos u otros polímeros de carbohidratos, Ficoll o dextrano y mezclas de los mismos. Como se utiliza en la presente, se entiende que polietilenglicol abarca cualquiera de las formas que han sido utilizadas para derivatizar otras proteínas, tales como mono- (alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol . El polietilenglicol- propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. Los polímeros solubles en agua pueden ser cada uno de cualquier peso molecular y pueden ser ramificados o no ramificados. En general, entre más alto sea el peso molecular o mayores sean las ramificaciones, más alta es la proporción polímero :proteína . Los polímeros solubles en agua tienen cada uno típicamente un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" que indica que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido). El peso molecular promedio de cada polímero soluble en agua está preferentemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 40 kDa, más preferentemente entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 35 kDa, y todavía más preferentemente entre aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 30 kDa. Existen un número de métodos de acoplamientos disponibles para aquellos expertos en la técnica, incluyendo reacciones de acilación o reacciones de alquilación (preferentemente para í generar una proteína N-terminal químicamente modificada) con una molécula soluble en agua, reactiva. Ver, por ejemplo, la Patente Europea EP 0,401,384, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente; ver también, Malik y colaboradores (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2): 4-10, publicado por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lañe, Londres N20 OLD, Reino Unido; y los documentos EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; WO 95/13312; WO 96/11953; solicitud internacional PCT No. US96/19459; y las otras publicaciones citadas en éstas que se refieren a la pegilación, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente. Una modalidad específica de la presente invención es una molécula no ramificada de monometoxi-polietilenglicol-aldehído que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa conjugada vía la alquilación reductiva al extremo N de una o varias proteínas KGF-2. f Formas Polivalentes Las formas polivalentes, por ejemplo, moléculas que comprenden más de una porción activa, pueden ser construidas. En una modalidad, la molécula puede poseer múltiples proteínas KGF-2. Además, la molécula puede poseer al menos una o varias proteínas KGF-2 y, dependiendo de la característica deseada de la forma polivalente, al menos otra molécula. En una modalidad, la o las proteínas de KGF-2 pueden ser químicamente acopladas. Por ejemplo, la o las proteínas de KGF-2 pueden ser químicamente acopladas a un polímero soluble en agua, divalente, por medio de tecnología de pegilación descrita anteriormente. Además, la o las proteínas de KGF-2 pueden ser químicamente acopladas a la biotina, y a la biotina/proteína ( s) de KGF-2 que se conjugan, se dejan luego enlazar a la avidina, dando como resultado el complejo tetravalente avidina/biotina/proteína (s ) de KGF-2. La o las proteínas de KGF-2 pueden también estar covalentemente acopladas al dinitrofenol (DNP) o al trinitrofenol (TNP) y los conjugados resultantes precipitan con IgM anti-DNP o anti-TNP, para formar conjugados decaméricos. En otra modalidad más, una proteína de fusión recombinante puede también ser producida teniendo una o varias proteínas de KGF-2, en donde cada molécula quimérica recombinante tiene una secuencia de proteína (s) de KGF-2, como se describe anteriormente, sustituida por los dominios variables de cualquiera o de ambas de las cadenas pesada y ligera de la molécula de la inmunoglobulina, y que tienen toda o partes de los dominios constantes, pero al menos un dominio constante, de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, cada una de tales proteínas de KGF-2 quiméricas/proteína de fusión de IgGl puede ser producida a partir de dos genes quiméricos: proteína (s) de KGF-2/quimera de la cadena ligera kappa humana (proteína (s) KGF-2/Ck) y una proteína (s) de KGF-2 /quimera de la cadena pesada gamma-1 humana (proteína KGF-2/Cg-l) . Después de la transcripción y la traducción de los dos genes quiméricos, como se describe más adelante, los productos génicos pueden ser ensamblados en una molécula quimérica simple que tiene una o varias proteínas KGF-2 desplegadas bivalentemente. Los í detalles adicionales respecto a la construcción de tales moléculas quiméricas se describen en la Patente Norteamericana No. 5,116,964, publicación PCT No. WO 89/09622, publicación PCT No. WO 91/16437 y patente Europea EP 315062, la descripción de las cuales se incorporan por referencia en la presente.

En una modalidad adicional, las proteínas de fusión recombinantes pueden también ser producidas, en donde cada molécula quimérica recombinante tiene al menos una o varias proteínas KGF-2, como se describe anteriormente, y al menos una porción de la región 186-401 de la osteoprotegerina (OPG), como se describe en la Solicitud de Patente Europea No. 96309363.8. La producción de la o las proteínas de KGF- 2 se describe con mayor detalle más adelante. Tales proteínas pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o mediante síntesis química in vi t ro de la o las proteínas de KGF-2 deseadas .

Polinucleótidos Con base en la presente descripción y utilizando la tabla de codones universal, alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente toda la secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de una o varias proteínas de KGF-2. Las técnicas de expresión recombinantes conducidas de acuerdo con las descripciones descritas más adelante, pueden ser seguidas para producir estos polinucleótidos y para expresar las proteínas codificadas. Por ejemplo, mediante la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una o varias proteínas de KGF-2 dentro de un vector apropiado, alguien de experiencia en la técnica puede producir fácilmente cantidades grandes de la secuencia nucleotídica deseada. Las secuencias pueden ser luego utilizadas para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, un polinucleótido que codifica para una o varias proteínas de KGF-2 puede ser insertado dentro de un vector de expresión. Mediante la introducción del vector de expresión dentro de un huésped apropiado, se pueden producir las proteínas de KGF-2 deseadas en grandes cantidades . Como se describe adicionalmente en la presente, existen numerosos sistemas de í huésped/vector disponibles para la propagación de las secuencias deseadas de ácido nucleico y/o para la producción de la o las proteínas de KGF-2. Éstas incluyen, pero no están limitadas a, vectores plasmídicos, virales y de inserción, y huéspedes procarióticos y eucarióticos. Alguien de experiencia en la técnica puede adaptar un sistema de huésped/vector el cual sea capaz de propagar o expresar el ADN heterólogo para producir o expresar las secuencias de la presente invención. Además, podrá ser apreciado por aquellos de experiencia en la técnica que, en vista ae la presente descripción, las secuencias de acido nucleico incluyen los ácidos nucleicos 109 al 624 de la SEQ ID NO. 1, así como las secuencias degeneradas de ácido nucleico de las mismas, las secuencias de ácido nucleico que codifican para la o las variantes del KGF-2 maduro y aquellas secuencias de ácido nucleico que se hibridan (bajo condiciones de hibridación descritas en la sección de selección de genoteca de ADNc más adelante, o condiciones equivalentes o condiciones más estrictas) a los complementos de los ácidos nucleicos 109 al 624 de la SEQ ID NO. 1.

También proporcionadas por la presente invención están las construcciones de ADN recombinantes que involucran el ADN vector junto con las secuencias de ADN que codifican para la o las proteínas de KGF-2. En tal construcción de ADN, la secuencia de ácido nucleico que codifica para una o varias proteínas de KGF-2 (con o sin péptidos de señal) es una asociación operativa con un control de expresión adecuado o secuencia reguladora capaz de dirigir la replicación y/o la expresión de la o las proteínas de KGF-2 en un huésped seleccionado.

Preparación de Polinucleótidos Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una o varias proteínas de KGF-2 puede ser fácilmente obtenida en una variedad de formas incluyendo, sin limitación, la síntesis química, la selección del ADNc o de la biblioteca genómica, la selección de la genoteca de expresión, y/o la amplificación por PCR del ADNc. Estos métodos y otros que son útiles para el aislamiento de tales secuencias de ácido nucleico se describen en Sambrook y colaboradores (1989), Mol ec ul a r Cl oni ng : A Labora t ory Man ual , Cold Spring Harbor Laboratory i Press, Cold Spring Harbor, NY; por Ausubel y colaboradores (1994), eds Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; y por Berger y Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente. La síntesis química de las secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas deseadas puede ser llevada a cabo utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos por Engels y colaboradores (1989), Angew.

Chem. Intl. Ed. , 2_8: 716-734 y Wells y colaboradores (1985), Gene, 3_4: 315, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente. Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos del fosfotriéster, la fosforamidita y la H-fosfonato de la síntesis de la secuencia de ácido nucleico. Las secuencias grandes de ácido nucleico, por ejemplo, aquellas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, pueden ser sintetizadas como varios fragmentos. Los fragmentos pueden ser luego ligados conjuntamente para formar una secuencia adecuada de ácido nucleico. Un método preferido es la síntesis t apoyada por polímero utilizando la química de la fosforamidita estándar. Alternativamente, puede ser obtenida una secuencia de ácido nucleico adecuada mediante la selección de una genoteca de ADNc apropiada (por ejemplo, una genoteca preparada a partir de una o más fuentes tisulares que se cree expresan la proteína) o una genoteca genómica (una genoteca preparada a partir del ADN genómico total) . La fuente de la genoteca de ADNc es típicamente un tejido proveniente de cualquier especie que se cree expresa una proteína deseada en cantidades razonables. La fuente de la biblioteca genóm_ca o genoteca genómica puede ser cualquier tejido o tejidos provenientes de cualquier mamífero u otra especie que se cree alberga un gen que codifica para la o las proteínas de KGF-2. Los medios de hibridación pueden ser seleccionados para la presencia de un ADN que codifica para una o varias proteínas KGF-2 utilizando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, ADNc o fragmentos de ADN genómico que poseen un nivel aceptable de homología al ADNc o al gen que va a ser clonado) que se hibridará selectivamente con los ADNc o los genes presentes en la genoteca. Las sondas utilizadas típicamente para tal selección codifican para una pequeña región de la secuencia de ADN a partir de la misma especie o de una especie similar, como la especie a partir de la cual se prepara la genoteca. Alternativamente, las sondas pueden ser degeneradas, como se discute en la presente. La hibridación es típicamente lograda mediante el recocido de la sonda oligonucleotídica o el ADNc a los clones bajo condiciones de exigencia que previenen el enlace no específico, pero que permiten el enlace de aquellos clones que tienen un nivel significativo de homología con la sonda o cebador. La hibridación típica y las condiciones de exigencia de lavado dependen en parte del tamaño (por ejemplo, el número de nucleótidos de longitud) del ADNc o de la sonda oligonucleotídica y de si la sonda está degenerada. La probabilidad de identificar un clon se considera también en la designación del medio de hibridación (por ejemplo, si está siendo seleccionado un ADNc o genoteca genómica ) . Donde se utiliza un fragmento de ADN (tal como ADNc) como una sonda, las condiciones de hibridación típicas incluyen aquellas como se describe en Ausubel y colaboradores (1984), eds . , s upra . Después de la hibridación, el medio de hibridación se lava a una exigencia adecuada, dependiendo de los diversos factores tales como el tamaño de la sonda, la homología esperada de la sonda que se va a clonar, el medio de hibridación que se selecciona, el número de clones que se seleccionan, y similares. Las condiciones de hibridación estrictas, ejemplares son la hibridación en 4 x SSC a 62-67°C, seguido por lavado en 0.1 x SSC a 62-67°C por aproximadamente una hora. Alternativamente, las condiciones ejemplares de hibridación estricta son la hibridación en 45-55% de formamida, 4 x SSC a 40-45°C. También incluidas están las secuencias de ADN que se hibridan a las secuencias de ácido nucleico descritas en la Figura 1 bajo condiciones de hibridación relajadas y las cuales codifican para la o las proteínas de KGF-2. Los ejemplos de tales condiciones relajadas de hibridación estricta son 4 x SSC a 45-55°C o la hibridación con 30-40% de formamida a 40-45°C. Ver Maniatis y colaboradores (1982), Mol ec ul ar Cl oni ng (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a la 389. i Existen también protocolos ejemplares para las condiciones de lavado estricto donde las sondas oligonucleotídicas son utilizadas para seleccionar medios de hibridación. Por ejemplo, un primer protocolo utiliza 6 x SSC con 0.05 por ciento de pirofosfato de sodio a una temperatura desde aproximadamente 35°C y 63°C, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, se lavan sondas de 14 bases a 35-40°C, sondas de 17 bases a 45-50°C, sondas de 20 bases a 52-57°C, y sondas de 23 bases a 57-63°C. La temperatura puede ser incrementada 2-3°C donde el enlace no específico antecedente parece alto. Un segundo protocolo utiliza el cloruro de tetrametilamonio ( TMAC ) para el lavado. Una solución de lavado estricto de este tipo es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 y 0.2% de SDS. Otro método más para la obtención de una secuencia adecuada de ácido nucleico es la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . En este método, el ADNc se prepara a partir del poli(A)+ARN o el ARN total utilizando la enzima transcriptasa inversa. Dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas del ADNc (oligonucleótidos) que codifican para una o varias proteínas de KGF-2, son luego agregadas al ADNc junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores. Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas o cebadores deben ser de longitud adecuada y suficientemente no ambiguas como para minimizar la cantidad de enlace no específico que pueda ocurrir durante la selección o la amplificación por PCR. La secuencia efectiva de las sondas o de los cebadores está usualmente basada en las secuencias o regiones conservadas o altamente homologas. Opcionalmente, las sondas o cebadores pueden ser completa o parcialmente degenerados, por ejemplo, pueden contener una mezcla de sondas/cebadores, codificando todos para la misma secuencia de aminoácidos pero utilizando diferentes codones para hacerlo. Una alternativa para preparar sondas degeneradas es colocar una inosina en alguna o en todas esas posiciones de codón que varían por especie. Las sondas oligonucleotídicas o cebadores pueden ser preparados mediante métodos de síntesis química para el ADN, como se describe anteriormente. Í Vectores El ADN que codifica para una o varias proteínas de KGF-2 puede ser insertado dentro de vectores para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. Los vectores adecuados son comercialmente disponibles, o el vector puede ser específicamente construido. La selección o construcción de un vector apropiado dependerá de 1) si éste va a ser utilizado para la amplificación de ADN o para la expresión de ADN, 2) el tamaño del ADN que va a ser insertado dentro del vector, y 3) la célula huésped pretendida a ser transformada con el vector. Los vectores involucran cada uno una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína deseada operativamente enlazada a una o más de las siguientes secuencias de control de la expresión o reguladoras, capaces de dirigir, controlar o de otro modo afectar la expresión de una proteína deseada por una célula huésped seleccionada. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y su compatibilidad con la célula huésped pretendida.

Los componentes vectores incluyen en general, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más elementos de selección o de genes marcadores, promotores, aumentadores, una secuencia de terminación de la transcripción y similares. Estos componentes pueden ser obtenidos a partir de fuentes naturales o ser sintetizados por procedimientos conocidos. Los ejemplos de vectores de clonación procarióticos adecuados incluyen bacteriófagos, tales como los derivados lambda, o plásmidos provenientes de E . col i (por ejemplo pBR322, col El, pUC, factor F y los derivados del plásmido pBluescript® (Stratagene, La Jolla, California)). Otros vectores de expresión apropiados, de los cuales son conocidos numerosos tipos en la técnica para las células huésped descritas más adelante, pueden también ser utilizados para este propósito.

Secuencia de Señal El ácido nucleico que codifica para una secuencia de señal puede ser insertado en dirección 5' de la secuencia que codifica para una proteína deseada, por ejemplo, puede ser un componente de un vector o éste puede ser una parte de un ácido nucleico que codifica para una proteína deseada. El ácido nucleico que codifica para la secuencia de señal nativa de KGF-2 es conocido (WO 96/25422) .

Origen de Replicación Los vectores de expresión y de clonación incluyen cada uno en general una secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En un vector de clonación, esta secuencia es típicamente una que hace posible que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye los orígenes de replicación o las secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas. El origen de replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, y son útiles diversos orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovírus, VSV o BPV) para los vectores de clonación en las células de mamífero. En general, el origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 es frecuentemente utilizado no sólo debido a que éste contiene el promotor temprano) .

Gen de Selección Los vectores de expresión y de clonación contienen cada uno típicamente un gen de selección. Este gen codifica para una proteína "marcadora" necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped transformadas, cuando se desarrollan en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped que no son transformadas con el vector no contendrán el gen de selección y, por lo tanto, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que a) confieren resistencia contra los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; b) complementan deficiencias auxotróficas ; o c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio de cultivo . Otros genes de selección pueden ser utilizados para amplificar los genes que van a ser expresados. La amplificación es el proceso en donde los genes que están en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento, son reiterados en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen la dihidrofolato-reductasa (DHFR) y la timidina-cinasa . Los transformantes celulares son colocados bajo presión de selección a la cual sólo los transformantes están únicamente adaptados para sobrevivir en virtud del marcador presente en el vector. La presión de selección es impuesta por el cultivo de las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio es sucesivamente cambiada, con lo cual se conduce a la amplificación del gen de selección y el ADN que codifica para la proteína deseada. Como resultado, cantidades incrementadas de la proteína deseada son sintetizadas a partir del ADN amplificado. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR son primeramente identificadas mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo silvestre, es la línea de células de ovario de hámster Chino deficientes en la actividad de DHFR (Urlaub y Chasin (1980), Proc . Na ti . Acad . Sci . , USA, 77(7) : 4216-4220, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . Las células transformadas son luego expuestas a niveles cada vez mayores de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR y, concomitantemente, a copias múltiples del otro ADN presente en el vector de expresión, tal como el ADN que codifica para la proteína deseada.

Promotor Los vectores de expresión y de clonación contendrán cada uno típicamente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína deseada. Un promotor es una secuencia no traducida localizada con dirección hacia arriba (5') al codón de inicio de un gen estructural (en general dentro de aproximadamente 100 a 1000 pares de bases) que controla la transcripción y la traducción de una secuencia particular de ácido nucleico. Un promotor puede ser convenientemente agrupado en una de dos clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Un promotor inducible inicia los niveles incrementados de transcripción a partir del ADN bajo su control, en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales, son bien conocidos. Un promotor puede ser operablemente ligado al ADN que codifica para la proteína deseada, mediante la eliminación del promotor a partir del ADN fuente, mediante digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia promotora deseada. La secuencia promotora de KGF-2 nativa puede ser utilizada para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN que codifica para una proteína deseada. Un promotor heterólogo es preferido, no obstante, si éste permite mayor transcripción y niveles más altos de la proteína expresada en comparación al promotor nativo y si éste es compatible con el sistema de la célula huésped que ha sido seleccionado para el uso. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de las secuencias promotoras nativas de otros miembros de la familia FGF, para dirigir la amplificación y/o la expresión del ADN que codifica para una proteína deseada . Los promotores adecuados para el uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de la beta-lactamasa y de la lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp); un sistema del gen de luminiscencia bacteriana (luxR); y promotores híbridos tales como el promotor tac. Son también adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas, con lo cual se hace posible que un experto en la técnica los ligue a la o las secuencias de ADN deseadas utilizando ligadores o adaptadores como sea necesario para suministrar cualesquiera sitios de restricción requeridos. Las secuencias promotoras para el uso con los huéspedes de levadura son también bien conocidos en la técnica. Los promotores adecuados para el uso con células huésped de mamífero son bien conocidos e incluyen aquellos obtenidos a partir de los genomas o virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela de las aves de corral, adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, ( el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y, más preferentemente, el Virus de Simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.

Elemento Aumentador Los vectores de expresión y de clonación contendrán cada uno típicamente una secuencia aumentadora para incrementar la transcripción por parte de eucariotes superiores de una secuencia de ADN que codifica para una proteína deseada. Los aumentadores son elementos que actúan en posición cis del ADN, usualmente desde aproximadamente 10 hasta 300 pares de bases de longitud, que actúan sobre el promotor para incrementar su transcripción. Los aumentadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición. Éstos han sido encontrados 5' y 3' a la unidad de transcripción. Los aumentadores de levadura son ventajosamente utilizados con promotores de levadura. Diversas secuencias aumentadoras disponibles de genes de mamífero son conocidas (por t ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) . Además, los aumentadores virales tales como el aumentador SV40, el aumentador del promotor temprano del citomegalovirus, el aumentador de polioma y los aumentadores de adenovirus son elementos aumentadores ejemplares para la activación de promotores eucarióticos.

Mientras que un aumentador puede ser empalmado dentro de un vector en una posición 5' ó 3' a un ADN que codifica para una proteína deseada, éste está localizado típicamente en un sitio 5' del promotor.

Terminación de la Transcripción Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas contendrán cada uno típicamente una secuencia necesaria para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias son comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de los ADNs y ADNcs eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para una proteína deseada. i La construcción de un vector adecuado que contiene uno o más de los componentes listados anteriormente (junto con la secuencia de codificación deseada) es lograda mediante técnicas de ligadura estándares. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son escindidos, diseñados y religados en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que ha sido construida la secuencia correcta, puede ser utilizada la mezcla de ligadura para transformar E . col i , y los transformantes exitosos pueden ser seleccionados mediante técnicas conocidas como se describen anteriormente. Las cantidades del vector a partir de los transformantes son luego preparadas, analizadas mediante digestión con endonucleasa de restricción, y/o secuenciadas para confirmar la presencia de la construcción deseada. Un vector que proporcione la expresión transitoria del ADN que codifica para una proteína deseada en células de mamífero, puede ser también utilizado. En general, la expresión transitoria involucra el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, tal que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de la proteína deseada codificada por el vector de expresión. Cada sistema de expresión transitorio, que comprende un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permite la identificación positiva y conveniente de las proteínas codificadas por los ADNs clonados, así como para la selección rápida de tales proteínas para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas .

Células Huésped Es también proporcionada por la presente invención cualquiera de una variedad de células huésped recombinantes, cada una de las cuales contiene una secuencia ácido nucleico para el uso en la expresión de una proteína deseada. Las células huésped procarióticas y eucarióticas ejemplares incluyen células bacterianas, de mamífero, de hongos, de insectos, de levadura o vegetales. Las células huésped procarióticas incluyen, pero no están limitadas a eubacterias tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos (por ejemplo, E . c ol i (HB101, DH5a, DH10 y MC1061); bacilos tales como B . s ubti l i s ; especies de ( Pse udomona s, tales como P. aeruginosa ; Strept omyces spp . ; Salmonel l a typhi urim ; o Serra ti a marcescens .

Como una modalidad específica, la o las proteínas de KGF-2 pueden ser expresadas en E . col i . Además de las células huésped procarióticas, la o las proteínas de KGF-2 pueden ser expresadas en forma glucosilada mediante cualquiera de un número de células huésped adecuadas derivadas de organismos multicelulares. Tales células huésped son capaces de realizar actividades complejas de procesamiento y de glucosilación. En principio, cualquier cultivo de célula eucariótica superior puede ser utilizado, ya sea que tal cultivo involucre células de vertebrado o de invertebrado, incluyendo células vegetales y de insecto. Los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras pueden ser huéspedes adecuados para la expresión de una o varias proteínas de KGF-2. Sa ccharomyces cerevi si a e, o levadura para hornear común, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores, pero otros géneros de especies y cepas son bien conocidos y comúnmente disponibles .

Las células de vertebrados pueden ser utilizadas, ya que la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) es un procedimiento bien conocido. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero, útiles, incluyen, pero no están limitadas a la línea CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea de riñon embrionario humano (células 293 o células 293 clonadas para el desarrollo en cultivo en suspensión) , células de riñon de hámster bebé y células de ovario de hámster Chino. Otras líneas celulares de mamífero, adecuadas, incluyen pero no están limitadas a las líneas de células HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swis, Balb-c o NIH, y líneas celulares de hámster BHK o HaK. Como una modalidad específica, la o las proteínas KGF-2 pueden ser expresadas en células COS o en células de baculovirus. Una célula huésped puede ser transfectada y preferentemente transformada con un ácido nucleico deseado bajo las condiciones apropiadas que permitan la expresión del ácido nucleico. La selección de las células huésped adecuadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación del producto, son bien t conocidos en la técnica (Gething y Sambrook (1981), Na t ure , 293 : 620-625 o, alternativamente, Kaufman y colaboradores (1985), Mol . Cel l . Bi ol . , 5(7): 1750- 1759, o Patente Norteamericana No. 4,419,446, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . Por ejemplo, para células de mamífero sin paredes celulares, puede ser utilizado el método de precipitación con fosfato de calcio. La electroporación, la microinyección y otras técnicas conocidas pueden también ser utilizadas . Es también posible que una proteína deseada pueda ser producida mediante recombinación homologa o con métodos de producción recombinantes utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen el ADN que codifica para una o varias proteínas de KGF-2. La recombinación homologa es una técnica originalmente desarrollada para dirigir genes a inducir o corregir las mutaciones en genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati (1989), Prog . In Nucí . Aci d Res . And Mol . Bi ol . , 3_6: 301, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente). La técnica básica fue desarrollada como un método para introducir mutaciones específicas dentro de regiones específicas del S genoma del mamífero (Thomas y colaboradores (1986), Cel l , 4 : 419-428; Thomas y Capecchi (1987), Cel l , 51 : 503-512 y Doetschman y colaboradores (1988), Proc . Na ti . Acad . Sci . , 8P3: 8583-8587, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) o para corregir mutaciones específicas dentro de los genes defectuosos (Doetschman y colaboradores (1987), Na t ure , 330 : 576-578, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . Las técnicas ejemplares se describen en la Patente Norteamericana No. 5,272,071; y en los documentos WO92/01069; WO93/03183; WO94/12650 y WO94/31560, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente.

Cultivo de Células Huésped El método para cultivar cada una o más de las células huésped recombinantes, para la producción de una proteína deseada, variará dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento de producción óptimo para una situación dada será aparente para aquellos expertos en la técnica a través de experimentación mínima.

Tales células huésped recombinantes son cultivadas en medio adecuado y la proteína expresada es luego opcionalmente recuperada, aislada y purificada del medio de cultivo (o de la célula, si se expresa intracelularmente) por medios apropiados conocidos por aquellos expertos en la técnica. Específicamente, cada una de las células recombinantes utilizadas para producir una proteína deseada pueden ser cultivadas en medios adecuados para inducir promotores, seleccionar células huésped recombinantes adecuadas o amplificar el gen que codifica para la proteína deseada. Los medios pueden ser suplementados como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como gentamicina) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , y glucosa o cualquier otra fuente de energía. Otros suplementos pueden también ser incluidos, a concentraciones apropiadas, como será apreciado por aquellos expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo adecuadas, tales como la temperatura, el pH y similares, son también bien conocidos por aquellos expertos en la técnica para el uso con las células huésped seleccionadas. El producto de expresión resultante puede ser luego purificado a casi homogeneidad utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas de purificación ejemplares son mostradas en las Solicitudes PCT publicadas Nos. WO90/08771 y W096/11952, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente.

Usos La o las variantes de KGF-2 descritas en la presente, y los derivados de KGF-2 químicamente modificados y la o las variantes de la proteína KGG-2 (colectivamente, "producto (s) proteico (s) de KGF-2") pueden ser utilizados como reactivos de investigación y como agentes terapéuticos y de diagnóstico. De este modo, el o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser utilizados en ensayos de diagnóstico i n vi tro y/o i n vi vo para cuantificar la cantidad de KGF-2 en una muestra de tejido o de órgano . Por ejemplo, uno o varios productos proteicos de KGF-2 pueden ser utilizados para la identificación del o de los receptores para la o las proteínas de KGF-2 en diversos fluidos corporales y muestras de tejido utilizando técnicas conocidas en la materia (WO 90/08771). Esta invención también contempla el uso del o de los productos proteicos de KGF-2 en la generación de anticuerpos elaborados contra el o los productos proteicos de KGF-2, incluyendo KGF-2 nativo. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede utilizar procedimientos publicados y bien conocidos para obtener anticuerpos monoclonales y policlonales o anticuerpos recombinantes. Tales anticuerpos pueden ser luego utilizados para purificar y caracterizar el o los productos proteicos de KGF-2, incluyendo KGF-2 nativo.

Composiciones Farmacéuticas La presente invención abarca las preparaciones farmacéuticas que contienen cada una í cantidades terapéutica o profilácticamente efectivas de uno o varios productos proteicos de KGF-2. Las composiciones farmacéuticas incluirán cada una en general una cantidad terapéuticamente efectiva o profilácticamente efectiva de uno o varios productos de la proteína de KGF-2 en mezcla con un vehículo. El vehículo incluye preferentemente uno o más materiales de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables en mezcla con el o los productos proteicos de KGF-2. El solvente primario en un vehículo puede ser ya sea acuoso o no acuoso por naturaleza. Además, el vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH (por ejemplo, amortiguadores tales como citratos, fosfatos, y aminoácidos tales como glicina); la osmolaridad (por ejemplo, manitol y cloruro de sodio); la viscosidad; la claridad; el color; la esterilidad; la estabilidad (por ejemplo, sucrosa y sorbitol); el olor de la formulación; la velocidad de disolución (por ejemplo, solubilizadores o agentes de solubilización tales como alcoholes, polietilenglicoles y cloruro de sodio); la velocidad de liberación; así como agentes de volumen para la formulación liofilizada (por ejemplo, manitol y glicina); surfactantes (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, y pluronics) ; antioxidantes (por ejemplo, sulfito de sodio y sulfito ácido de sodio) ; conservadores (por ejemplo, ácido benzoico y ácido salicílico); agentes saborizantes y diluyentes; agentes emulsificantes; agentes suspensores; solventes; rellenadores; vehículos de distribución; diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticos. Otras formas de administración efectivas tales como formulaciones parenterales de liberación lenta, nieblas para inhalación, formulaciones oralmente activas, o supositorios, son también consideradas. La composición puede también involucrar preparaciones particuladas de los compuestos poliméricos tales polímeros de erosión a granel (por ejemplo, copolímeros de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), mezclas de polímero PLGA, copolímeros en bloque de PEG, y ácido láctico y glicólico, poli ( cianoacri latos ) ; polímeros de erosión superficial (por ejemplo, poli (anhídridos ) y poli (ortoésteres ) ) ; esteres de hidrogel (por ejemplo, polioles de pluronic, poli (alcohol vinílico), poli (vinilpirrolidona) , copolímeros de anhídrido maleico-éter alquilviní lico, celulosa, í derivados de ácido hialurónico, alginato, colágeno, gelatina, albúmina, y almidones y dextranos) y sistemas de composición de los mismos; o preparaciones de liposomas o microesferas. Tales composiciones pueden influir sobre el estado físico, la estabilidad, la velocidad de la liberación in vivo, y la velocidad del despejo in vivo de las presentes proteínas y derivados. La formulación farmacéutica óptima para una proteína deseada será determinada por alguien de experiencia ordinaria en la técnica, dependiendo de la ruta de administración y de la dosis deseada. Las composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences 18a Ed. (1990), Mack Publishing Co . , Easton, PA 18042, páginas 1435-1712; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6_: 332-351; Leone-Bay y colaboradores (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 3_8_: 4263-4269; Haas y colaboradores (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1) : 93; los documentos internacionales WO94/06457; W094/21275; la Patente Francesa FR2706772 y el documento internacional W094/21235, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente. í Las composiciones específicas de liberación sostenida son disponibles de una variedad de proveedores incluyendo Depotech Corp. (DepofoamMR, un liposoma ultivesicular ) ; Alkermes, Inc. (ProLeaseMR, una microesfera de PLGA). Como se utiliza en la presente, se pretende que el hialuronano incluya hialuronano, ácido hialurónico, sales de los mismos (tales como hialuronato de sodio), esteres, éteres, derivados enzimáticos y geles reticulados del ácido hialurónico, y los derivados químicamente modificados del ácido hialurónico (tales como hilan) . Las formas ejemplares de hialuronano se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,582,865, 4,605,691, 4,636,524, 4,713,448, 4,716,154, 4,716,224, 4,772,419, 4,851,521, 4,957,774, 4,863,907, 5,128,326, 5,202,431, 5,336,767, 5,356,883; las Solicitudes de Patente Europea Nos. 0,507,604 A2 y 0,718,312 A2 ; y el documento internacional WO96/05845, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente. Los proveedores de hialuronano incluyen BioMatrix, Inc., Ridgefield, NJ; Fidia S.p.A., Abano Terme, Italia; Kaken Pharmaceutical Co . , Ltd., Tokio, Japón; Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia; Genzyme Corporation, < Cambridge, MA; Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH; Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Suiza; Intergen Company, Purchase, NY y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japón. Para el tratamiento y/o prevención de las indicaciones orales, una solución o suspensión líquida puede ser utilizada de una manera similar a un lavado bucal, donde el líquido es enjuagado rápidamente en la boca para maximizar el tratamiento de las lesiones (Patente Norteamericana No. 5,102,870, las enseñanzas de la cual se incorporan por referencia) . El contacto más prolongado con la superficie mucosal puede ser logrado mediante la selección de un vehículo adecuado el cual sea capaz de recubrir la mucosa. Los ejemplos típicos de formulaciones que contienen pectina tales como Orábase RegisteredMR (Colgate-Hoyt Laboratories, Norwood, MA) , suspensiones de sucralfato, Kaopectate y Leche de Magnesia. La formulación también puede ser una crema, gel, loción o ungüento untable que tenga un vehículo o portador no tóxico, farmacéuticamente aceptable. El o los productos proteicos de KGF-2 pueden también ser incorporados en una gragea o trocisco de disolución lenta, una base para goma de mascar, o una prótesis bucal o de í distribución lenta enganchada a un molar posterior, por ejemplo. Los agentes terapéuticos tales como analgésicos y anestésicos pueden ser administrados para aliviar el dolor y pueden ser administrados agentes tales como anti-infecciosos, antibacterianos, anti-micóticos y antisépticos para prevenir y/o tratar la infección secundaria de las lesiones . Una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, ésta puede ser almacenada en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales "formulaciones pueden ser almacenadas ya sea en una forma lista para utilizarse o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración. En una modalidad específica, la presente invención está dirigida a los equipos para producir una unidad de administración de dosis simple. Los equipos pueden contener cada uno un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Los equipos incluidos dentro del alcance de esta invención son jeringas previamente llenadas, de una t sola cámara y de cámaras múltiples; las jeringas prellenadas ejemplares (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas tales como Lyo-Ject®, una liojeringa prellenada, de cámara doble) son disponibles de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania. Se debe notar que las formulaciones del o de los productos proteicos de KGF-2 descritos en la presente, pueden ser utilizados para aplicaciones veterinarias así como humanas, y que el término "paciente" no debe ser considerado de una manera limitante . La frecuencia de dosificación del o de los productos proteicos de KGF-2 a un paciente, dependerá de la enfermedad y de la condición del paciente, así como de los parámetros farmacocinéticos del o de los productos proteicos de KGF-2 como son formulados, y de la ruta de administración. El o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser administrados una vez, administrados diariamente, o administrados con una dosis de bolo inicial seguida por una dosis continua o liberación sostenida. Se contempla también que pueden ser practicados otros modos de dosificación continua o casi continua. Por ejemplo, la derivatización química puede dar como resultado í formas de liberación sostenida de la proteína, que tienen el efecto de una presencia continua en la corriente sanguínea, en cantidades predecibles, con base en un régimen de dosificación determinado. Un paciente en necesidad de estimulación (incluyendo citoprotección, proliferación y/o diferenciación) de las células epiteliales puede ser administrado con una cantidad efectiva de uno o varios productos proteicos de KGF-2 para provocar la respuesta deseada en el paciente. El régimen de dosificación involucrado en un método para prevenir o tratar una condición específica, en general será determinado por el médico que atiende, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, condición, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Las dosis apropiadas pueden ser evaluadas a través del uso de ensayos establecidos para la determinación de las dosis utilizadas en conjunto con los datos apropiados de dosis-respuesta. Las dosis típicas estarán en el intervalo de 0.001 mg/kg de peso corporal hasta 500 mg/kg de peso corporal, preferentemente hasta de 200 mg/kg de peso corporal, más preferentemente 100 mg/kg de peso corporal. El o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser administrados vía la administración tópica, enteral o parenteral incluyendo, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular , intraarticular , subcapsular , subaracnoide, intraespinal e intraesternal . El o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser administrados vía la administración oral o administrados a través de las membranas mucosas, es decir, intranasalmente, sublingualmente, bucalmente o rectalmente para la distribución sistémica. El o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser utilizados una vez o administrados repetidamente, dependiendo de la enfermedad y de la condición del paciente. En algunos casos, el o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser administrados como un adjunto para otra terapia y también con otras preparaciones farmacéuticas. En otra modalidad más, la terapia celular (por ejemplo, implante de células que producen la o las proteínas de KGF-2, es también contemplado). Esta modalidad de la presente invención puede incluir el implante dentro de las células del paciente las cuales son capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente activa de la o las proteínas de KGF-2. Tales células que producen la o las proteínas de KGF-2 pueden ser células que no producen de manera normal la o las proteínas de KGF-2 pero las cuales han sido modificadas para producir la o las proteínas de KGF-2, o las cuales pueden ser células cuya habilidad para producir la o las proteínas de KGF-2 ha sido aumentada por transformación con un polinucleótido adecuado para la expresión y secreción de la o las proteínas de KGF-2. Con el fin de minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes a quienes se les administra la o las proteínas de KGF-2 de una especie extraña, se prefiere que las células sean de la misma especie que el paciente (por ejemplo, humanas), o que las células puedan ser encapsuladas con material que proporcione una barrera contra el reconocimiento inmune, o que las células sean colocadas en un sitio anatómico inmunológicamente privilegiado, tal como en los testículos, ojos y sistema nervioso central.

Las células humanas o de animal no humano pueden ser implantadas en pacientes en encerramientos o membranas poliméricas semipermeables, biocompatibles para permitir la liberación de una o más proteínas de KGF-2, pero para prevenir la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores dañinos del tejido circunvecino. Alternativamente, las células propias del paciente, transformadas ex vi vo para producir la o las proteínas de KGF-2, podrían ser implantadas directamente en el paciente sin tal encapsulamiento. La metodología para el encapsulamiento membranal de células vivas es familiar para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su implante en pacientes puede ser logrado con técnicas conocidas (Patentes Norteamericanas Nos. 4,892,538, 5,011,472; y 5,106,627, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente). En otra modalidad más, se considera también la terapia génica i n vi vo, en donde una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína KGF-2 es introducida directamente dentro de un paciente. Se requiere la transferencia génica eficiente y de r duración prolongada a los hepatocitos, para la terapia génica efectiva para la expresión local de la proteína, para prevenir y/o tratar enfermedades hepáticas y/o para la secreción de la proteína para prevenir y/o tratar enfermedades en otros órganos o tej idos . La construcción de ADN puede ser directamente inyectada dentro del tejido del órgano que va a ser tratado, donde éste puede ser recogido i n vi vo y expresado, con la condición de que el ADN sea ligado operablemente a un promotor que es inactivo en tal tejido. La construcción de ADN puede también incluir adicionalmente la secuencia vector a partir de vectores tales como un vector adenoviral, un vector retroviral, un virus de papiloma y/o un vector del virus del herpes, para ayudar a la captación de las células. La transferencia física puede ser lograda i n vi vo mediante inyección local de la construcción deseada de ácido nucleico u otro vector de distribución apropiado que contiene la secuencia deseada de ácido nucleico, tal como la transferencia mediada por liposomas, la inyección directa (ADN desnudo) , la transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN) , o bombardeo de micropartículas (pistola de genes) . Para la regeneración in vi vo de los hepatocitos en el hígado, puede ser especialmente efectivo el uso de los vectores retrovirales de Moloney (Bosch y colaboradores (1996), Cold Spring Harbor, Gene Therapy Meeting, Septiembre 25-29 de 1996; y Bosch y colaboradores (1996), Journal of Clini cal In vesti ga ti on , 98(12) : 2683-2687) . Uno o varios productos proteicos de KGF-2 pueden ser aplicados en cantidades terapéuticas y profilácticamente efectivas a los órganos o tejidos, específicamente caracterizados por tener daño a, o números clínicamente insuficientes de células epiteliales. Se debe notar que uno o varios productos proteicos de KGF-2 pueden ser utilizados para aplicaciones veterinarias así como humanas, y que el término "paciente" no debe ser considerado de una manera limitante. De acuerdo con la presente invención, se puede utilizar uno o varios productos proteicos de KGF-2 in vivo para inducir la estimulación (incluyendo ci toprotección, proliferación, y/o diferenciación), proliferación y/o diferenciación de células epiteliales incluyendo, pero no limitado a, el ojo, el oído, las encías, el pelo, el pulmón, la s piel, el páncreas (endocrino y exocrino), el timo, la tiroides, vejiga urinaria, el hígado y el tracto gastrointestinal, incluyendo células en la cavidad oral, en el esófago, en el estómago glandular y en el intestino delgado, en el colon y en la mucosa intestinal, en el recto y en el canal anal. Las indicaciones en las cuales puede ser exitosamente administrado un producto proteico de KGF-2, incluyen, pero no están limitados a: quemaduras y otros daños de espesor parcial o total en necesidad de estimulación de las estructuras anexas tales como folículos pilosos, glándulas sudoríparas, y glándulas sebáceas; lesiones provocadas por epidermolisis bulosa, la cual es un defecto de adherencia de la epidermis a la dermis subyacente, dando como resultado ámpulas dolorosas frecuentemente abiertas, las cuales provocan morbididad severa; alopecia inducida por quimioterapia y calvicie de patrón masculino, o la pérdida progresiva del pelo en hombres y mujeres; úlceras gástricas y duodenales; toxicidad en el intestino en regímenes de tratamiento por radiación y quimioterapia; erosiones del tracto intestinal (por ejemplo, esófago, estómago e intestinos) incluyendo gastritis erosiva, esofagitis, reflujo i esofágico o enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn (que afecta principalmente al intestino delgado) y colitis ulcerativa (que afecta principalmente al intestino grueso); desórdenes o daño al tejido de las glándulas salivales, incluyendo efectos de la radiación/quimioterapia, enfermedades autoinmunes tales como el Síndrome de Sjogren, las cuales pueden provocar insuficiencia de las glándulas salivales (síndrome seco); producción insuficiente de moco a todo lo largo de tracto gastrointestinal; síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (ARDS), neumonía, enfermedad de la membrana hialina (por ejemplo, síndrome de insuficiencia respiratoria del infante y displasia broncopulmonar ) en infantes prematuros; daño pulmonar agudo o crónico o insuficiencia debida a daños por inhalación (incluyendo altos niveles de oxígeno), enfisema, daño pulmonar por productos quimioterapéuticos, trauma ventilador u otras circunstancias que dañan al pulmón; cirrosis hepática, insuficiencia hepática fulminante, daño provocado por hepatitis viral aguda y/o daños tóxicos al hígado y/o desórdenes de los conductos biliares, y transferencia génica mediada por virus al hígado; abrasión corneal y/o i ulceraciones corneales debidas a productos químicos, o a bacterias o a virus; enfermedad progresiva de las encías; daño al tímpano; ulceraciones y/o inflamaciones incluyendo condiciones que resultan de la quimioterapia y/o la infección; desórdenes pancreáticos e insuficiencias pancreáticas incluyendo la diabetes (Tipo I y Tipo II), pancreatitis, fibrosis quística, y como un adyuvante en el trasplante de células de los islotes. Esta invención tiene de este modo implicaciones significativas en términos de hacer posible la aplicación del o de los productos proteicos de KGF-2 específicamente caracterizados por el uso profiláctico y/o terapéutico de KGF-2 para reducir, retardar y/o bloquear el inicio del daño o las deficiencias en estos tipos particulares de células. Lo siguiente es una descripción más específica de las enfermedades y las condiciones médicas que pueden ser tratadas con el o los productos proteicos de KGF-2 de acuerdo con la invención . Los usos específicos de KGF-2 del o de los productos proteicos de KGF-2 se describen en la Solicitud de Patente PCT No. , presentada en igual fecha con la presente por Lacey, Ulich, Danilenko y Farrell, titulada en la carta de transmisión de la Solicitud como "USOS DEL FACTOR 2 DE CRECIMIENTO DE QUERATINOCITOS" (Caso del Abogado No. A-422C-PCT), la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para incrementar la citoprotección, la proliferación y/o la diferenciación de hepatocitos con el fin de incrementar la función hepática. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la cirrosis hepática, la insuficiencia hepática fulminante, el daño provocado por hepatitis viral aguda, daños tóxicos al hígado y/o desórdenes de los conductos biliares. La cirrosis hepática, secundaria a la hepatitis viral y a la ingestión crónica de alcohol, es una causa significativa de morbididad y mortalidad. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir el desarrollo de la cirrosis. Un modelo i n vi vo estándar de la cirrosis hepática es conocido (Tomaszewski y colaboradores (1991), J. Appl. Toxicol., 11 : 229-231, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . i La insuficiencia hepática fulminante es una condición que amenaza la vida, la cual ocurre con la cirrosis en etapa terminal y la cual es actualmente tratable únicamente con trasplante de hígado. El o los productos proteicos KGF-2 son útiles para tratar y prevenir la insuficiencia hepática fulminante.

Los modelos estándares i n vi vo de la insuficiencia hepática fulminante son conocidos (Mitchell y colaboradores (1993), J. Pharmacol. Exp. Ther., 187: 185-194; Thakore y Mehendale (1991), Toxicologic Pathol., l_9:47-58; y Havill y colaboradores (1994), FASEB Journal, 8 (4-5) :A930, extracto 5387, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . La hepatitis viral aguda es frecuentemente subclínica y autolimitante . No obstante, en una minoría de pacientes puede resultar daño hepático severo en el transcurso de varias semanas. El o los productos proteicos KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la hepatitis viral. Los modelos estándares i n vi vo de la proliferación de hepatocitos son conocidos (Housley y colaboradores (1994), Journal of Clinical Investigation, 94 (5) :1764-1777; y Havill y colaboradores (1994; las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) .

Los daños tóxicos al hígado provocados por acetaminofen, halotano, tetracloruro de carbono y otras toxinas, pueden ser prevenidos o tratados por el o los productos proteicos de KGF-2. Los modelos estándares in vi vo de la toxicidad hepática son conocidos (Mithell y colaboradores (1973), supra; Thakore y Mehendale (1991), supra; y Havíll y colaboradores (1994), supra, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para incrementar la citoprotección, la proliferación y/o la diferenciación de las células epiteliales en el tracto gastrointestinal (por ejemplo la cavidad oral, el esófago, el estómago, el intestino delgado, el colon, el recto y el canal anal). Los términos "tracto gastrointestinal", como se define en la presente e "intestino" son términos reconocidos en la técnica y se utilizan aquí intercambiablemente. Específicamente, el o los productos proteicos KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir las úlceras gástricas, las úlceras duodenales, la enfermedad inflamatoria del intestino, la toxicidad del intestino y las erosiones del tracto gastrointestinal.

Las úlceras gástricas provocan morbididad significativa, tienen una proporción de recurrencia relativamente alta, y sanan mediante la formación de costra sobre el revestimiento mucosal. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para prevenir la degeneración de la mucosa glandular y para regenerar la mucosa glandular más rápidamente, por ejemplo, ofreciendo un mejoramiento terapéutico significativo en el tratamiento de las úlceras gástricas. Los modelos estándares i n vi vo de las úlceras gástricas son conocidos (Tarnawski y colaboradores (1991), "Indo ethacin Impair Quality of Experimental Gastric Ulcer Healing: A Quantitative Histological and Ultrastructural Analysis", In: Mechanisms of Injury, Protection and Repair of the Upper Gastrointestinal Tract, (eds) Garner and O'Brien, Wiley & Sons; Brodie (1968), Gastroenterology, 5_5:25; y Ohning y colaboradores (1994), Gastroenterology, 106 (4 Suppl . ) :A624, las descripciones de la cuales se incorporan por referencia en la presente) . Las úlceras duodenales, como las úlceras gástricas provocan morbididad significativa y tienen una proporción de recurrencia relativamente alta. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para prevenir la degeneración del revestimiento mucosal del duodeno y para regenerar rápidamente el revestimiento mucosal del duodeno para sanar esas úlceras y disminuir su recurrencia. Los modelos estándares i n vi vo de las úlceras duodenales son conocidos (Berg y colaboradores (1949), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1_ : 314 - 316; Szabo and Pihan, Chronobiol. Int. (1987), 6:31-42; y Robert y colaboradores (1970), Gastroenterology, 59:95-102, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . La toxicidad del intestino es un factor limitante mayor asociado con el tratamiento del cáncer, tanto en radiación (abdominal, del cuerpo total o local, por ejemplo, cabeza y cuello) y quimioterapia. De interés principal son aquellos pacientes que sufren: quimioterapia para el cáncer tal como leucemia, cáncer de mama o como un adyuvante para la extirpación del tumor, radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello; quimioterapia y radioterapia combinadas para trasplante de médula ósea. La severidad del daño está relacionada al tipo y a la dosis del o de los agentes quimioterapéuticos y de la terapia concomitante tal como la radioterapia.

La mucositis en porciones del tracto gastrointestinal puede representar dolor significativo e incomodidad para estos pacientes, y está en el intervalo de severidad desde rubicundez e hinchamiento hasta lesiones ulcerativas francas. Las lesiones frecuentemente se llegan a infectar secundariamente y se vuelven mucho más difíciles de sanar. Los modelos estándares in vi vo de la toxicidad al intestino inducida por radiación, son conocidos (Wihers y Elkind (1970), Int. J. Radiat., 17(3) : 261-267, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente) . Los modelos estándares in vi vo de la toxicidad del intestino inducida por la quimioterapia, son conocidos (Farrell y colaboradores, The American Society of Hematology, 38th Annual Meeting (Orlando, FL) , Diciembre 6-8, 1996; Sonis y colaboradores (1990), Oral Surg. Oral Med & Oral Pathol., 69(4) :437-443; y Moore (1985), Cáncer Chemotherapy Pharmacol., _1_5: 11-15, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente). Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, BCNU, busulfan, carboplatino, ciclofosfamida, cisplatino, arabinósido de citocina, daunorrubicina, doxorrubicina, etopósido, 5-fluorouracilo, gemcitabina, ifosfamida, irinotecan, melfalan, metotrexato, navelbina, topotecan, taxol y taxótero, y los regímenes de tratamiento ejemplares incluyen, pero no están limitados a BEAM (busulfan, etopósido, arabinósido de citocina y metotrexato); ciclofosfamida e irradiación total del cuerpo; ciclofosfamida, irradiación total del cuerpo y etopósido; ciclofosfamida y busulfan; y 5-fluorouracilo con leucovorina o levamisol. El tratamiento, el pretratamiento y/o el postratamiento con el o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para generar un efecto citoprotector o regeneración o ambos, por ejemplo, sobre la mucosa del intestino delgado, permitiendo dosis incrementada de tales terapias, al tiempo que se reducen los efectos colaterales fatales, potenciales de la toxicidad al intestino. El o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser preferentemente administrados en los siguientes protocolos. Los pacientes colorrectales rutinariamente son administrados con 5-fluororacilo con leucovorina en los días 1 al 5; el o los productos proteicos de KGF-2 se pueden administrar en los días -2, -1 y 0. Los pacientes con cáncer de Í cabeza y cuello son rutinariamente administrados con radioterapia hipofraccionada, más 5-fluorouracilo y cisplatino en un periodo de siete semanas; el o los productos proteicos KGF-2 pueden ser administrados en los días -2, -1 y 0 y después de esto una vez por semana hasta el final de la terapia con radiación.

En los pacientes con trasplante de linfoma es frecuentemente administrada la terapia BEAM por 6 días (días 1 al 6) ; el o los productos proteicos de KGF pueden ser administrados en los días -2, -1 y 0 y como un post-tratamiento de tres días (días 7 al 9) . En modalidades específicas, el o los productos proteicos de KGF-2 pueden ser administrados profilácticamente y/o terapéuticamente para reducir, retardar y/o bloquear el inicio de la mucositis (debido a la quimioterapia y a la radioterapia), en combinación con una o más citocinas hasta retardar y/o bloquear el inicio de la citopenia. Típicamente, la médula ósea, las células progenituras de sangre periférica o las células totipotenciales (McNiece y colaboradores (1989), Blood, 2A:60 ~612 Y Moore y colaboradores (1979), Blood Cells, 5:297-311, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) son retiradas de un paciente antes de la terapia citorreductiva mielosupresora (quimioterapia sola o con radioterapia) y son luego readministrados al paciente concurrentemente con o después de la terapia citorreductiva con el fin de contra-atacar los efectos mielosupresores de tal terapia. Han sido emprendidos muchos procedimientos diferentes para proteger un organismo de los efectos colaterales de la radiación o de los productos químicos tóxicos. Un procedimiento es remplazar las células de la médula ósea antes de que haya desarrollado la toxicidad. Otro procedimiento es utilizar células progenitoras provenientes de sangre periférica (PBPC) . Estas PBPC pueden ser recolectadas mediante aféresis o flebotomía después de la terapia con citocína sola (G-CSF o GM-CSF), o con quimioterapia o citocinas. Éstas pueden ser dadas nuevamente frescas o criopreservadas . Si se desea, las células pueden ser seleccionadas con CD34+, suprimidas en células T, suprimidas en células tumorales, o las células progenitoras pueden ser expandidas (promovidas a multiplicarse) por medios conocidos en la técnica, antes de la administración. Los beneficios de la re-infusión de progenitoras autólogas o alogénicas después de la terapia mielosupresora, han sido descritos en la literatura (Morse y colaboradores (1992), Ann. Clin. Lab. Sci., 22_:221-225; Kessinger y Armitage (1991), Blood, 77:211-213; Kessinger y colaboradores (1989), Blood, 7^:1260-1265; Takam y colaboradores (1989), Blood, 7_4 : ^245-1251 y Kessinger y colaboradores (1988), Blood, 171 : 723-727) . Como se utiliza en la presente, el término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular, las cuales actúan sobre otras células como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Incluidas entre las citocinas están los factores de crecimiento similares a la insulina, hormona humana del crecimiento; hormona humana del crecimiento N-metionilada; hormona bovina del crecimiento; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina, relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteicas tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante de tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hematopoyético; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina; factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; factores de desarrollo de plaquetas tales como TPO y MGDF; factores de crecimiento transformante (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor I y II de crecimiento similar a la insulina; eritropoyetina; factores osteoinductores ; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimuladores de colonias (CSFs) tales como el CSF de macrófagos (M-CSF) , CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (Hs) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, e IL-16; y otros factores polipeptídicos . Las citocinas pueden ser utilizadas solas o en combinación para proteger contra, mitigar y/o revertir la toxicidad mieloide o hematopoyética asociada con agentes citotóxicos . El modo de administración del o de los productos proteicos de KGF-2, así como de la citocina, debe ser coordinada y optimizada. Dependiendo de las circunstancias, puede ser administrada una dosis apropiada de la o las proteínas de KGF-2 antes de o subsecuente a la administración del o de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, un parámetro a ser considerado es si la citocina es administrada en una dosis simple o en dosis múltiples durante el curso de la terapia. Ciertas citocinas son rápidamente despejadas del cuerpo y requerirán administración periódica o continua con el fin de que su eficacia sea maxi izada. La manera de administración puede diferir dependiendo de si se da un pretratamiento o un post-tratamiento de la citocina. Por ejemplo, si la citocina es administrada antes del agente citotóxico, es preferible administrar la citocina mediante inyección por bolo intravenoso por varias horas y, opcionalmente, repetir tal administración en uno o más días durante y después de la terminación de la terapia citotóxica. En una modalidad específica, el o los productos proteicos de KGF-2 son administrados (por ejemplo, intravenosamente) a 0.1 a 500 microgramos/kg/dosis, preferentemente hasta aproximadamente 200 microgramos/kg/dosis, antes de (por ejemplo, 1 a 3 días) y/o después de la quimioterapia o la radioterapia, y se administra G-CSF (NeupogenMR o LenograstimMR o GM-CSF ( SargramostimMR) (por ejemplo, subcutáneamente) a 5 microgramos/kg/dosis por 1 a 10 días (preferentemente 7 a 10 días) después de la quimioterapia. Las erosiones del tracto gastrointestinal (por ejemplo, el esófago, estómago y el intestino) incluyen la gastritis erosiva, esofagitis, reflujo esofágico y enfermedades inflamatorias del intestino. Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn (que afecta principalmente el intestino delgado) y la colitis ulcerativa (que afecta principalmente el intestino grueso), son enfermedades crónicas de etiología desconocida que dan como resultado la destrucción de la superficie mucosal, inflamación, cicatrización y formación de adhesión durante la reparación, y morbididad significativa a los individuos afectados. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para regenerar el revestimiento mucosal y disminuir la recurrencia de estas erosiones, dando como resultado sanado más rápido, y puede ser de beneficio en el control de la i progresión de la enfermedad. Los modelos estándares in vi vo de la erosión del tracto gastrointestinal son conocidos (Geisinger y colaboradores (1990), Mod-Pathol., 3(5) .-619-624; Carlborg y colaboradores (1983), Laryngoscope, 93(2) .184-187; Carlborg y colaboradores (1980), Eur-Surg-Res . , 12 (4) :270-282; Kashavarzian y colaboradores (1991), Alcohol-Clin-Exp-Res., 15(1) : 116-121; Katz y colaboradores (1988), Dig-Dis-Sci. , 33 (2) :217-224; y Zeeh y colaboradores (1996), Gastroenterology 110 (4) : 1077-1083, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente). Los modelos estándares i n vi vo de la" enfermedad inflamatoria del intestino son bien conocidos (Morris y colaboradores (1989), Gastroenterology, 960795-803; Rachmilewitz y colaboradores (1989), Gastroenterology, 97:326-327; Allgayer y colaboradores (1989), Gastroenterology, 9^:1290-1300; y Kim y Borstad (1992), Scand. J. Gastroenterol, 27(7) : 529-537, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . Los estudios de animales han establecido la relación entre la nutrición parenteral total (TPN) y la atrofia de la mucosa intestinal (Buchman y colaboradores (1995), Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, l_9:453-460. La disminución en la altura de la vellosidad intestinal es atribuida a la falta de estímulo de crecimiento proporcionado a través de la ingestión oral de nutrientes. Esto es reflejado en una reducción en el índice de marcación, una medida del crecimiento. Las disminuciones en la altura del vello están también correlacionadas con las disminuciones en las actividades específicas de las enzimas involucradas en la absorción de nutrientes. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles ya sea para proteger contra la atrofia durante el ayuno y/o para facilitar el re-crecimiento después de la reintroducción de nutrientes orales. La enfermedad de la membrana hialina de los infantes prematuros da como resultado la ausencia de producciones surfactantes por los neumocitos del Tipo II, dentro del pulmón, dando como resultado el colapso de los alvéolos. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la enfermedad de la membrana hialina. La inhalación de humo es una causa significativa de la morbididad y la mortalidad en la semana después de un daño por quemadura, debido a la necrosis del epitelio bronquiolar y de los alvéolos.

! Los productos proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir los daños por inhalación. El enfisema resulta de la pérdida progresiva de los alvéolos. Los productos proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir el enfisema. Los desórdenes del páncreas pueden ser relacionados al sistema endocrino tales como la diabetes del Tipo I o del Tipo II o pueden ser relacionados al sistema exocrino tales como la pancreatitis y las ineficiencias pancreáticas o la fibrosis quística. Los pacientes con diabetes Tipo I diagnosticada requieren administración constante de insulina exógena. Los pacientes con diabetes Tipo II diagnosticada progresan a través de diversas etapas de resistencia/insuficiencia de insulina hasta requerir al final administración exógena de insulina. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para mejorar, retardar y/o circunvenir la manifestación permanente de la diabetes mellitus o como un adjunto en el establecimiento del trasplante de células de los islotes, mediante la inducción de la función de las células beta pancreáticas, con el fin de normalizar los niveles de glucosa sanguínea durante las demandas metabólicas variantes, evitando aún la hipoglucemia frecuente o profunda. Los modelos estándares de diabetes son conocidos (Junod y colaboradores (1967), Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 126 (1) :210-205; Rerup (1970), Pharm, Rev., 22:485-518; Rossini y colaboradores (1977), P.N.A.S. 7_4: 2485-2489; y Ar'Rajab y Ahren (1993), Páncreas, 8_:50-57, la descripción de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . Es conocido un modelo estándar de la proliferación de las células pancreáticas (Yi y colaboradores (1994), American Journal of Pathology, 145(1) :80-85, la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente ) . Las células corneales pueden ser dañadas por la abrasión corneal y/o las ulceraciones corneales debidas a los productos químicos, bacterias o virus. El o los proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la degeneración corneal. Son conocidos los modelos estándares i n vi vo de la regeneración de células corneales (Inatomi y colaboradores (1994), Investigative Opthalmology and Visual Science, 35(4) : 1318 , extracto 299; Sotozono y colaboradores (1994), Investigative Opthalmology and Visual Scie ce, 35(4) : 1941 , extracto 317; Wilson y colaboradores (1994), Investigative Opthalmology and Visual Science, 35(4) : 1319, Extracto 301; Wilson y colaboradores (1993), The FASEB Journal, 7 (3) :A493, Extracto 2857; Inatomi y colaboradores (1994), Investigative Opthalmology & Visual Science, 35(4) : 1318 ; Wilson y colaboradores (1994), Experimental Eye Research, 59(6) :665-678; y Sotozono y colaboradores (1995), Investigative Opthalmology & Visual Science, 36(8) : 1524-1529, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para prevenir y/o tratar la enfermedad de las encías. Los modelos estándares i n vi vo de enfermedad de las encías son conocidos. El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para prevenir y/o tratar las condiciones ulcerantes y/o inflamatorias, incluyendo condiciones relacionadas a la quimioterapia (como se discutió anteriormente) y/o infección. Los modelos estándares i n vi vo del daño a la vejiga urinaria son conocidos (Ford y Hesss (1976), Arch. Intern. Med. 136: 616-619 y Droller y colaboradores (1982), Urol., 2_0:256-258, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente). El o los productos proteicos KGF-2 son útiles para prevenir y/o tratar el daño al tímpano.

Los modelos estándares in vi vo de las perforaciones de la membrana timpánica son conocidos (Clymer y colaboradores (1996), Laryngoscope (USA), 106 ( 6) : 280-285, la descripción de las cuales se incorporan por referencia en la presente) . El o los productos proteicos de KGF-2 son útiles para prevenir la degeneración del tejido de las glándulas salivales o para proliferar el tejido de las glándulas salivales, para tratar desórdenes o el daño al tejido de las glándulas salivales, incluyendo los efectos de la radiación/quimioterapia (como se discutió anteriormente) y las enfermedades autoinmunes tales como el síndrome de Sjogren, las cuales pueden provocar insuficiencia de las glándulas salivales (síndrome de seco). Los modelos estándares i n vi vo del daño al tejido de las glándulas salivales, son conocidos. Los siguientes ejemplos son incluidos para ilustrar más completamente la presente invención. Se entiende que pueden ser realizadas modificaciones en los procedimientos descritos, sin apartarse del espíritu de la invención.

EJEMPLOS Los métodos estándares para muchos de los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, o los procedimientos alternativos adecuados, se proporcionan en manuales ampliamente reconocidos de biología molecular tales como, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989), s upra y Ausubel y colaboradores (1990), s upra . Todos los productos químicos son ya sea grado analítico o grado USP (Farmacopea de los Estados Unidos).

Ejemplo 1: Producción de Proteína El siguiente ejemplo muestra la producción de la o las proteínas de KGF-2 siguientes: dN29 hFGFlO, dN20 hFGFlO, hFGFlO y hFGFlO R149Q. Por favor nótese que la numeración de la designación "dN" está basada en el número de aminoácidos suprimidos de la secuencia de longitud completa de rata, N-terminal, normal. FGF10 humana tiene menos aminoácidos en el extremo N que la FGF10 de rata. El número no incluye la metionina agregada por la expresión de E. coli. La secuencia de aminoácido de dN37 rFGFlO es idéntica a dN29 hFGFlO.

La secuencia de aminoácido de dN28 rFGFlO es idéntica a dN20 hFGFlO.

A. Preparación de ADN pAMG21 dN29 rFGFlO: El plásmido pAMG21 dN29 hFGFlO contiene ADN que codifica para la secuencia de aminoácido descrita en la figura 2 (dN29 hFGFlO) . El plásmido pAMG21 dN29 hFGFlO contiene un truncamiento del ADN que codifica por los 37 residuos amino-terminales a partir de la secuencia madura de rFGFlO, con el truncamiento que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal: MSYNHLQ... (comenzando en el residuo #76, Figura 2, Yamasaki y colaboradores, (1996), supra). De este modo, dN29 hFGFlO tiene la secuencia de Ser69 a Ser208 de la SEQ ID No: 2 (?N32 KGF-2) . pAMG21 dN29 hFGFlO, se creó como sigue: Primeramente, el plásmido pAMG21 dN6 rFGFlO fue construido. Para esta construcción, se realizó PCR utilizando ADNc de FGF10 maduro de rata (Yamasaki y colaboradores (1996), J. Bi ol . Chem . , 271 (27) : 15918-15921, rFGF) en el vector pGEM-T (Promega, Madison, Wl), denominado pGEM-T rFGFlO, í como una plantilla con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (0LIG0#1), el cual incorpora un sitio Ndel, y el cebador oligonucleotídico 3' (0LIG0#2) el cual incorpora un sitio BamHI : 0LIG0#1: (SEQ ID NO.42) 5'AAA CAÁ CAT ATG GTT TCT CCG GAG GCT ACC ACC TCC-3' 0LIG0#2 : (SEQ ID NO.43) 5' -AAA CAÁ GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3' El producto de PCR generado en esta reacción fue purificado y digerido con las endonucleasas de restricción Ndel y BamHI . El producto de PCR digerido por restricción de 525 pares de bases (pb) fue purificado a partir de un gel de agarosa y ligado con un fragmento de ADN vector pAMG21 de BamHI a Ndel de 6 Kilobases (Kb) , similarmente purificado. [El vector de expresión pAMG21 (ATCC acceso no. 98113) contiene los sitios de restricción apropiados para la inserción de los genes con dirección hacia abajo de un promotor luxPR (ver la Patente Norteamericana No. 5,169,318 para la descripción del sistema de expresión lux) . La proteína rFGFlO codificada, resultante, difiere de rFGFlO por la supresión de los primeros 6 residuos de aminoácidos amino-terminales a un residuo de metionina de origen natural, con la proteína que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos a ino-terminal (N-terminal): MVSPEAT... (comenzando en el residuo #43, Figura 2, Yamasaki y colaboradores (1996) , s upra ) . En seguida, fue construido el plásmido pAMG21 His rFGFlO utilizando un vector pAMG21 His. El vector pAMG21 His difiere de pAMG21 como sigue: entre el codón de metionina inicial de pAMG21 (ATG) y la secuencia que le sigue (GTTAACG...) , se inserta la siguiente secuencia "AAA CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GCT AGC" la cual codifica para "KHHHHHHHAS" . La adición de los codones para Ala y Ser después de la etiqueta 7x His, proporciona un sitio de restricción conveniente, Nhel, para la clonación. El fragmento BstXI-Nhel de 4.7 kb del vector plasmídico pAMG21 His fue luego ligado con el fragmento BspEI-BstXI de 1.8 kb de pAMG21 dN6 rFGFlO y los siguientes ligadores oligonucleotídicos OLIGO#3 y OLIGO#4 (Nhel a BspEI) . \ 0LIG0#3: (SEQ ID NO.44) 5' -CTA GCG ATG ACG ATG ATA AAC AGG CTC TGG GTC .AGG ACÁ TGG TTT CT-3' OLIGO#4: (SEQ ID NO. 45 ) 5' -CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GAG CCT GTT TAT CAT CGT CAT CG-3' La proteína resultante codificada difiere de dN6 rFGFlO por tener una etiqueta de histidina (7x His) seguida por un sitio de escisión de enterocinasa con la secuencia N-terminal de longitud completa (madura) (comenzando en el residuo #37, Figura 1, Yamasaki y colaboradores (1996), s upra ) . Se agregaron veintidós aminoácidos al extremo amino del dN6 rFGFlO como sigue: MKHHHHHHHASDDDDKQALGQD[MVSPEAT...]. pAMG21 His rFGFlO se utilizó como una plantilla para la amplificación de PCR utiliando el siguiente cebador oligonucleotidico 5' (OLIGO # 5) el cual incorpora un sitio Ndel, y el cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO # 6) el cual incorpora un sitio BamHI : ( OLIGO #5: (SEQ ID No. 46) 5' -GGA GGA ATA ACÁ TAT GTC CTA CAÁ TCA CCT GCA GGG AGA TGT CCG-3' OLIGO #6: (SEQ ID No. 47) 5' -AAA CAÁ GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3' El producto de PCR generado en esta reacción fue purificado y luego utilizado como una plantilla para la amplificación subsecuente por PCR con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO #7) el cual incorpora un sitio Xbal, y el cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO #8) el cual incorpora un sitio BamHI : OLIGO # 7: (SEQ ID No. 48) 5'-TTA GAT TCT AGA TTT GTT TTA ACT AAT TAA AGG AGG AAT AAC ATA TG-3' OLIGO #8: (SEQ ID No. 49) 5' -AAA CAÁ GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3' El producto de PCR generado en esta reacción fue purificado y digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y Xbal. El producto de 455 pares de bases digerido por restricción fue purificado a partir de un gel de agarosa y ligado con un fragmento de ADN pAMG21 BamHI-Xbal de 6 kb similarmente purificado para formar pAMG21 dN29 hFGFlO. La cepa huésped de E. coli GM120 (ATCC número de acceso 55764) tiene el promotor lacIQ y el gen lacl integrado dentro de un segundo sitio en el cromosoma del huésped de un huésped fototrófico de E . coli K12. La transformación del huésped GM120 de E. coli con esta mezcla de ligadura y la siembra en placas sobre placas de agar Luria que contienen 40 µg/ml de kanamicina produjeron colonias bacterianas recombinantes. Se identificó mediante selección por PCR un clon bacteriano que contiene el plásmido recombinante correcto. El ADN plasmídico fue purificado y secuenciado para confirmar la secuencia de inserto. El desarrollo de los cultivos bacterianos recombinantes para expresar el producto génico se describe más adelante. pAMG 21 dN20 hFGFlO: El plásmido pAMG21 dN20 hFGFlO contiene ADN que codifica para la secuencia de aminoácido descrita en la figura 3 (dN20 hFGFlO) . El plásmido pAMG21 dN20 hFGFlO contiene una supresión del ADN que codifica para los primeros 28 aminoácidos de la secuencia rFGFlO madura, dando como resultado la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal: MSSPSSA... (comenzando en el residuo # 65, Figura 2, Yamasaki y colaboradores, (1996), supra). plásmido. De este modo dN20 hFGFlO tiene la secuencia de Ser58 a Ser208 de la SEQ ID No. 2 (?N21 KGF-2). pAMG21 dN20 hFGFlO se construyó como sigue. El fragmento vector BamHi-Ndel pAMG21 de 6 Kb se ligó a un producto de PCR, Ndel-BamHI dN20 hFGFlO, como sigue: se llevó a cabo la PCR utilizando pGEM-T rFGFlO como la plantilla y el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO#9) el cual incorpora un sitio Ndel en el extremo 5' del gen rFGFlO y suprime los codones para los primeros 28 aminoácidos, y el cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO#10) el cual incorpora un sitio BamHI en el extremo 3' del gen rFGFlO: OLIGO#9: (SEQ ID NO: 50) 5' -AAA CAÁ CAT ATG TCT TCT CCT TCC TCT GCA GGT AGG CAT GTG CGG AGC TAC AA -3' OLIGO#10: (SEQ ID NO: 51) 5' -AAA CAÁ GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3' Este producto de PCR fue purificado, digerido con endonucleasas de restricción Ndel y BamHI y, como se describe anteriormente, ligado al fragmento vector BamHI-Ndel pAMG21 de 6 Kb . Las transformación del huésped GM120 de E . col i con este producto de ligadura pAMG21 dN20 hFGFlO y sembrando en placas sobre placas de agar Luria que contenían 40 µg/ml de kanamicina, produjo colonias bacterianas recombinantes. Se identificó un clon bacteriano que contenía el plásmido recombinante correcto mediante selección por PCR El ADN plasmídico fue purificado y secuenciado para confirmar la secuencia de inserto. El desarrollo de los cultivos bacterianos recombinantes para expresar el producto géníco, se describe más adelante. pAMG21 hFGFlO R149Q: El plásmido pAMG21 hFGFlO R149Q reemplaza un residuo de arginina en la posición 149 en hFGFlO (Leu40 a Ser208 de la SEQ ID NO: 2) con un residuo de glutamina (Figura 4). pAMG21 hFGFlO R149Q se construyó como sigue.

El plásmido pAMG21 rFGFlO se creó mediante la ligadura del fragmento BspEI-Ndel de 6.5 Kb de pAMG21 His rFGFlO con los siguientes ligadores oligonucleotídicos, OLIGO#ll y OLIGO#12 (Ndel a BspEI) .

OLIGO#ll: (SEQ ID NO: 52) 5'- TAT GCT GGG TCA GGA CAT GGT TTC T -3' OLIGO#12: (SEQ ID NO: 53) 5'- CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GCA -3' La proteína codificada resultante difiere de His rFGFlO por la supresión de la etiqueta de histidina 7x y la restauración de la secuencia madura original de la proteína amino-terminal (MLGQDM.... ) . Un fragmento BstXI-BspEI de 4.8 Kb de pAMG21 rFGFlO se ligó con el fragmento de 1.8 Kb de pAMG21 dN20 hFGFlO PstI ( introducido ) -BstXI y los siguientes ligadores oligonucleotídicos OLIGO#13 y OLIGO#14 (PstI a BspEI) para suprimir ocho codones de serina de la secuencia de rata. í 0LIG0#13: (SEQ ID NO: 54) 5'- CCG GAG GCT ACC AAC TCT AGC TCC AGC AGC TTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA -3' OLIGO#14: (SEQ ID NO: 55) 5'- GAG CTA GGA GAG GAG AAG CTG CTG GAG CTA GAG TTG GTA GCC T -3' Se construyó pAMG21 hFGFlO R149Q mediante la ligadura del fragmento pAMG21 hFGFlO Ba HI-PstI de 6.1 Kb con un producto de PCR, hFGFlO R149Q Pstl-BamHI . Este producto de PCR fue creado como sigue: Se realizó PCR A utilizando pAMG21 dN29 hFGFlO como la plantilla con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO#15) y el cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO#16) el cual introduce un cambio de codón AGA-?CAG : OLIGO#15: (SEQ ID NO: 56) 5'- AAC ACC TAT GCA TCT TTT AAC TGG C -3' OLIGO#16: (SEQ ID NO: 57) 5'- GTC CCT GCC TGG GAG CTC CTT TTC CAT TC -3' Se realizó PCR B utilizando pAMG21 dN29 hFGFlO como la plantilla con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO#17), el cual introduce un cambio de codón, y el cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO#18), el cual incorpora un sitio BamHI : 0LIG0#17: (SEQ ID NO: 58) 5'- GCT CCC AGG CAG GGA CAÁ AAA ACÁ AGA AGG -3' OLIGO#18: (SEQ ID NO: 59) 5'- AAC AAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CC -3' Los productos de amplificaciones A y B de PCR anteriores fueron purificados y se realizó una PCR subsecuente utilizándolos como la plantilla con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' OLIGO#19, y OLIGO#20, el cual incorpora un sitio BamHI .

OLIGO#19: (SEQ ID NO: 60) 5'- AAC ACC TAT GCA TCT TTT AAC TGG C -3' OLIGO#20: (SEQ ID NO: 61) 5'- AAC AAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CC -3' El producto de esta reacción fue también purificado y se realizó una PCR subsecuente utilizándolo como plantilla con el siguiente cebador oligonucleotídico 5' 0LIG0#21, el cual incorpora un sitio BamHI, y OLIGO#22: 0LIG0#21: (SEQ ID NO: 62) 5'- AAC AAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CC -3' OLIGO#22: (SEQ ID NO: 63) 5'- CCG GAG GCT ACC AAC TCT AGC TCC AGC AGC TTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA -3' El producto de PCR final fue purificado y digerido con las endonucleasas de restricción PstI y BamHI. Después de la digestión por restricción, el fragmento de ADN de 440 pares de bases se purificó en gel y se ligó como se describe anteriormente. La transformación del huésped GM120 de E . col i con esta ligadura y la siembra en placa sobre placas de agar Luria que contiene 40 µg/ml de kanamicina, produjo colonias bacterianas recombinantes. Se identificó un clon bacteriano que contiene el plásmido recombinante correcto identificado por selección por PCR. El ADN i plasmídico fue purificado y secuenciado para confirmar la secuencia de inserto. El desarrollo de los cultivos bacterianos recombinantes para expresar el producto génico, se describe más adelante.

B . Producción en E . col i Los cultivos de células GM120 de E . col i recombinantes que contienen el plásmido confirmado por secuencia de ADN de interés (pAMG21 dN29 rFGFlO y pAMG21 hFGFlO R149Q, respectivamente) se desarrollaron cada uno para optimizar la expresión del gen introducido, como sigue: Matraces de 500 ml de caldo Luria más Kanamicina se sembraron con células y se desarrollaron a 30°C de 10 a 16 horas. Se agregaron a todos 500 ml a un medio basado en amina NZ, de 9 litros a 11 litros en un fermentador de 15 litros. Todos los lotes fueron desarrollados a un pH de 7 y un nivel de oxígeno disuelto mayor de 50%. Los lotes de células que contienen pAMG21 dN29 rFGFlO fueron desarrolladas e inducidas a 37°C y de las células que contienen pAMG21 hFGFlO R149Q fueron desarrollados e inducidos a 30°C. Los lotes fueron desarrollados a un pH de 7 y a un nivel de oxígeno disuelto mayor de 50%. Cuando la densidad óptica celular alcanzó 10 ± 2, se agregó autoinductor al fermentador, y las células se dejaron desarrollar por 12 horas. Después de 12 horas, el caldo se enfrió a menos de 15°C, el fermentador se drenó y las células se recolectaron mediante centrifugación. La pasta celular se congeló.

C. Purificación dN29 hFGFlO: Se purificó dN29 hFGFlO utilizando tres pasos de cromatografía: S-sefarosa a pH 7.5, heparina-sefarosa a pH 7.5, e hidroxiapatita . Cien gramos de pasta celular de E . Col i que contienen dN29 hFGFlO se homogeneizaron y se desintegraron exactamente como se describe anteriormente. Después de la centrifugación a 15,300 x g por 3 horas, el sobrenadante que contiene el dN29 hFGFlO soluble se ajustó a Tris-HCl 40 mM, pH 7.5, mediante la adición de Tris-HCl, pH 7.5 luego se aplicó a una columna de S-sefarosa FF de 300 ml equilibrada en Tris-HCl 40 M, pH 7.5. Después de lavar la columna con el amortiguador de equilibrio para eliminar la proteína no enlazada, la columna se eluyó con un gradiente de 40 volúmenes desde 0 hasta 2 M de cloruro de sodio en Tris-HCl 40 mM, pH 7.5. Las fracciones que eluyen entre 0.9 M y 1.1 M de cloruro de sodio contenían dN29 hFGFlO, el cual se detectó como una banda de 16 kDa sobre SDS-PAGE. La identidad de esta banda fue confirmada mediante secuenciamiento N-terminal. Estas fracciones fueron combinadas, diluidas con Tris-HCl 40 mM, pH 7.5, para reducir la concentración de cloruro de sodio hasta 0.4 M, y aplicadas a una columna de Heparina-Sefarosa de 60 ml equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7.5. La columna se lavó con amortiguador de equilibrio para eliminar la proteína no enlazada, luego se eluyó con un gradiente de 80 volúmenes desde 0 hasta 3 M de cloruro de sodio en el mismo amortiguador. dN29 hFGFlO se eluyó entre 1.0 M y 1.35 M de cloruro de sodio. Estas fracciones fueron luego combinadas y dializadas contra Tris-HCl 40 mM pH 7.5. La muestra dializada se aplicó a una columna de hidroxiapatita en 50 ml en Tris-HCl 40 mM, pH 7.5. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con amortiguador de equilibrio para eliminar la proteína no enlazada, luego se eluyó con un gradiente de 40 volúmenes desde 0 hasta 0.5 M de cloruro de sodio. s Las fracciones que eluyen entre 0.24 M y 0.44 M de cloruro de sodio contenían dN29 hFGFlO. Estas fracciones se combinaron, se concentraron, y se intercambiaron con amortiguador a PBS. La pureza de la muestra se estimó que era mayor de 97% mediante geles de SDS teñidos con azul de Coomassie. El rendimiento del dN29 hFGFlO purificado fue de 90 ml a partir de 100 gramos de pasta celular. hFGFlO R149Q: Se purificó hFGFlO R149Q exactamente como se describe anteriormente para dN29 hFGFlO. El R149Q FGF10 humano tuvo una afinidad de enlace menor para la Heparina-Sefarosa que el dN29 hFGFlO, eluyendo entre 0.5-0.8 M de cloruro de sodio. La identidad y la pureza de hFGFlO R149Q se analizó mediante secuenciamiento N-terminal, y electroforesis en gel de SDS.

Ejemplo 2: Bioensayo i n vi tro Se evaluó la bioactividad de dN29 hFGFlO purificado mediante el ensayo de proliferación de queratinocitos de ratón Balb/MK, el cual está diseñado para medir la actividad específica. Para el ensayo de queratinocitos Balb/MK, se prepararon soluciones de reserva de 0.5 mg/ml de dN29 hFGFlO en PBS. Estas muestras fueron diluidas en serie en el medio de ensayo y se agregaron 50 ml de cada dilución a los pozos del cultivo de tejido que contiene células Balb/MK en 180 ml de medio de ensayo. La concentración final de dN29 hFGFlO estuvo en el intervalo de 1.2 x 10"1 ng/ml hasta 2.2 x 104 ng/ml. La proliferación celular se midió mediante la captación de la timidina tritiada. El valor ED 0 estimado para dN29 hFGFlO fue de 46 ng/ml. Los resultados muestran que dN29 hFGFlO es efectivo en este ensayo.

Ejemplo 3: Estudios Exploratorios en Ratones Normales En el primer estudio, se dividieron 18 ratones hembra BDFl en 6 grupos de 3 ratones cada uno (1 grupo tratado y 1 grupo control en cada uno de los tres puntos de tiempo). Los primeros dos grupos recibieron 5 mg/kg de dN29 hFGFlO o el control con amortiguador intravenosamente (IV) por un día, los segundos dos grupos recibieron 5 mg/kg de dN29 hFGFlO o el control con amortiguador IV diariamente por 3 días, y los terceros dos grupos recibieron 5 mg/kg de dN29 hFGFlO o el control con amortiguador IV, diariamente por 7 días. Todos los ratones fueron inyectados con 50 mg/kg de BrdU una hora antes de la cosecha, se sometieron a radiografía y se sacrificaron. Se tomaron los pesos del cuerpo y de los órganos seleccionados (incluyendo todos los segmentos del intestino delgado), se extrajo sangre para hematología química de suero, y los órganos se cosecharon para el análisis histológico y marcación con BrdU. Existió cierta elevación del estómago en el día 7, del hígado en el día 3, del yeyuno en el día 7. No existió efecto sobre el timo. Las químicas sanguíneas fueron variables y se normalizaron muy rápidamente Ejemplo 4: Fibrosis Pulmonar Inducida por Quimioterapia Ratas macho Lewis que pesaban aproximadamente 225 gramos recibieron una inyección intravenosa o instilación intratraqueal de 5 mg/kg de dN29 de hFGFlO o vehículo, 72 y 48 horas antes de recibir 2.5U de bleomicina vía la ruta intratraqueal. El peso de la rata se verificó periódicamente en el curso de los siguientes 15 días, tiempo en el cual se realizaron las pruebas de la función pulmonar en las ratas que habían recibido el dN29 hFGFlO vía la ruta intratraqueal. Para histología, se colocaron catéteres en la traquea de cada rata y los pulmones se llenaron con 3 ml de formalina por medio de presión hidrostática . Después de la fijación por 48 horas los pulmones fueron procesados en parafina para el seccionamiento y la tinción. Las ratas que recibieron administración de solución salina perdieron 42% de su peso corporal, mientras que aquellas tratadas con dN29 hFGFlO estuvieron todas a 129% de su peso en comparación al día de la administración de la bleomicina. Una rata en el grupo con solución salina murió antes del tiempo del sacrificio, se asume que esta muerte es debida al daño de la bleomicina al pulmón. Existió una diferencia significativa en la velocidad respiratoria pulmonar y el volumen máximo entre los dos grupos. Las ratas tratadas con solución salina tuvieron una velocidad o proporción de la respiración de 286 respiraciones por minuto en comparación con 247 para el grupo de dN29 hFGFlO. Las ratas control no tratadas tuvieron velocidad respiratoria de 216 respiraciones por minuto, lo cual es significativo versus el grupo con dN29 hFGFlO al nivel de p<0.5. Histológicamente, existieron cambios notorios y microscópicos para el grupo tratado con solución salina. Los pulmones en este grupo se deformaron, como fue observado al tiempo del sacrificio, y tuvieron excesiva inflamación y fibrosis. Los pulmones del grupo con dN29 hFGFlO fueron muy similares a aquellos de los controles no tratados, con la excepción de tener inflamación microscópica leve, focal. No existió diferencia notoria distinguible entre las ratas con dN29 hFGFlO y las ratas normales.

Ejemplo 5: Modelo de Mucositosis inducida por Radiación La mucositis es inducida en ratones con 12 Gy de radiación al cuerpo entero. Los ratones se tratan diariamente con 5 mg/kg/día de KGF-2 humano recombinante (preparado en general de acuerdo con las enseñanzas de W096/25422, rhuKGF-2) comenzando en el día antes de la radiación y continuando al día tres después de la radiación. Cuatro días después de la radiación, los ratones se someten a necropsia y se cuentan el número de criptas proliferantes (que contienen células positivas a BUdR) . El tratamiento con rhuKGF-2 incrementa el número de criptas en proliferación en el duodeno, en el yeyuno proximal y distal del intestino delgado con relación a los animales no tratados con rhuKGF-2. rhuKGF-2 es también capaz de disminuir la pérdida de peso corporal en los ratones irradiados.

Ejemplo 6: Modelo de Mucositis Inducida por Adriamicina La mucositis es inducida en ratones con una dosis intraperitoneal simple de Adriamicina a 24 mg/kg. Los ratones se tratan diariamente con 1 mg/kg/día de rhuKGF-2 comenzando en el día antes de la radiación y continuando al día tres después de la radiación. Cuatro días después de la radiación, los ratones se someten a necropsia y se cuentan el número de criptas en proliferación (que contienen células positivas a BUdR) .

El tratamiento con rhuKGF-2 incrementa el número de criptas proliferantes en el duodeno, yeyuno e íleon con relación a los animales no tratados con rhuKGF-2.

Ejemplo 7: Modelo de Mucositis inducida por 5- fluorouracilo Se inyectaron ratones con 5-fluorouracilo (5-FU 50 mg/kg/día x 4 días), un régimen que en animales no tratados conduce a una supervivencia en el intervalo únicamente de entre 20-50%. Los pretratamientos con rhuKGF-2 (5 mg/kg/día x 3 días), pero no posttratamientos, incrementan la supervivencia con relación a los animales no tratados con rhuKGF-2 y los mejoramientos en la supervivencia son observados a dosis tan bajas como de 0.5 mg/kg/día. Los abscesos hepáticos son comúnmente encontrados en los ratones control supervivientes, pero no en los ratones pretratados con rhuKGF-2, indicando que la toxicidad por 5-FU es en parte debida a la pérdida de la función de la barrera Gl . Además, los ratones pretratados con rhuKGF-2 perdieron menos peso y consumieron más alimento y agua durante el periodo de tratamiento con 5-FU. Los pretratamientos con rhuKGF-2 también mejoran la pérdida en peso en ratones después de la exposición al carboplatino (125 mg/kg/ x 1 día), excluyendo la posibilidad de que los efectos de rhuKGF-2 sean específicos de 5-FU. Los pretratamientos con rhuKGF-2 también mejoran la supervivencia y los puntos bajos de pérdida en peso en los experimentos de combinación de quimioterapia/radiación, cuando los ratones son inyectados con una dosis simple de 150 ó 300 mg/kg de metotrexato seguido por irradiación (6 Gy) 1 hora después . Ejemplo 8: Modelo de Colitis En dos grupos de 10 animales cada uno, la colitis es inducida mediante instilación colónica del ácido 2 , 4, 6-trinitrobencensulfónico en etanol a una dosis de 50 mg/kg de peso corporal. Para determinar si rhuKGF-2 actúa a través de un mecanismo protector, un grupo de ratas (grupo A) se pretrata con rhuKGF-2 o vehículo a las 24 horas y a 1 hora antes de la inducción de la colitis a una dosis de 5 mg/kg (i.p.) y los animales se sacrifican 8 horas después del daño. Para evaluar los efectos de sanado potencial, se inyecta rhuKGF-2 o vehículo (misma dosis, i.p.) en un segundo grupo (grupo B) 24 horas después de la inducción de la colitis, y el tratamiento se continúa diariamente por 1 semana. El daño tisular es examinado microscópicamente y es expresado como el porcentaje de ulceraciones o erosiones. Los animales que se tratan con rhuKGF-2 después de la inducción de la colitis (grupo B) muestran ulceraciones significativamente menores en comparación al grupo control (grupo A) . En animales tratados antes de la inducción de la colitis, existen erosiones, pero no son observadas úlceras debido al corto periodo de estudio de 8 horas, y las erosiones no son significativamente diferentes de aquellas observadas en el grupo control (grupo A).

Ejemplo 9: Modelo de Colitis inducida por Sulfato de Dextrano Estudio 1: Se alimentan ratas con 4% y 6% de DSS en agua por 1 semana. Al final de la segunda semana los 4 cm distales del colon son preservados. Se preparan ocho secciones a intervalos de 0.5 cm y se tiñen con H & E. El por ciento de cada sección de colon con necrosis (destrucción de la estructura í glandular) se evalúa de una manera aleatorizada y codificada .

Estudio 2: Se administran ratas IP con vehículo o rhuKGF-2 (1 mg/kg/día) y se alimentan ya sea con agua o con dextran-sulfato de sodio al 4% por 14 días. Las secciones colónicas se tiñen con PAS. El dextran-sulfato de sodio parece inducir un incremento relacionado a la dosis en la necrosis mucosal colónica. El rhuKGF-2 administrado a 1 mg/kg/día por 14 días incrementa la producción de mucina colónica en el grupo control, así como en las ratas tratadas con dextran-sulfato de sodio.

Ejemplo 10: Modelo de Cirrosis en Rata Ratas macho Sprague-Dawley que pesan entre 150 y 175 gramos son utilizadas. Los animales se exponen a fenobarbitol (0.35 mg/ml) en su agua para beber por la duración del estudio. Los animales se dosifican semanalmente con tetracloruro de carbono en un vehículo de aceite de maíz mientras están bajo anestesia ligera con isofluorancia . La dosis inicial de CC14 es de 40 µl por rata. La dosis es \ ajustada semanalmente, hacia arriba o hacia abajo en incrementos de 40 µl con base en la ganancia en peso. Diez animales control se exponen a fenobarbitol en su agua para beber y se lavaron semanalmente con vehículo de aceite de maíz. La función hepática se evaluó mediante la medición del despejo de bromosulfoftileína (BSP) , los niveles de transaminasa sérica y los niveles de albúmina sérica. Al tiempo del sacrificio, se extirpan los hígados, se pesan y se procesan para la determinación de los niveles de hidroxiprolina, como un indicador de la deposición del colágeno y de la fibrosis . Los animales se mantienen en el protocolo de inducción de cirrosis anterior por 11 semanas. En la semana once, los animales son repartidos aleatoriamente en grupos control y el tratamiento con rhuKGF-2. Se administra rhuKGF-2 una vez por día mediante inyección subcutánea a una dosis de 1 mg/kg, para un total de 15 días. Después de 15 días de tratamiento con rhuKGF-2, los animales se sacrifican . Las ratas en las cuales se induce la cirrosis son CC14 muestran una elevación de la concentración de BSP en suero, reflejando el despejo hepático deteriorado de este agente. Las ratas tratadas con rhuKGF-2 tienen un más bajo nivel sérico de BSP que los animales no tratados, sugiriendo una función hepática mejorada. Las ratas hechas cirróticas por CC14 muestran una elevación en SGPT la cual es revertida por el tratamiento con rhuKGF- 2. El tratamiento con rhuKGF-2 es capaz de elevar la albúmina sérica. El tratamiento con rhuKGF-2 da como resultado una proporción incrementada en peso del hígado al cuerpo, reflejando crecimiento hepático compensatorio.

Ejemplo 11: Modelo de Hepatectomía Ratas sujetas a una hepatectomía parcial del 70% recuperan su masa hepática original más rápidamente cuando se tratan con 1 mg/kg/día de rhuKG-2 que cuando se comparan a los animales no tratados .

Ejemplo 12: Modelos de Hepatoxicidad Aguda En modelos de hepatoxicidad aguda, el tratamiento con rhuKGF-2 (1 mg/kg ya sea antes de o 3 horas después del agente de incitación) se i incrementan bruscamente los niveles de transaminasa sérica en ratas con insuficiencia hepática aguda inducida ya sea con tetracloruro de carbono, acetaminofen o galactosamina. El pretratamiento con rhuKGF-2 también previene una disminución en las funciones hepáticas de despejo después del acetaminofen, como se mide mediante bromosulfoftaleína (BSP) .

Ejemplo 13: Modelo de Transferencia de Genes Mediada por Retrovirus, In Vi vo Se administran ratones intravenosamente con rhuKGF-2 (1.5 mg/kg) . 48 horas después de la inyección intravenosa de rhuKGF-2, se incrementa la proliferación de hepatocitos murinos, en comparación a los hígados no estimulados, y regresa a niveles proliferativos normales. No se notan nodulos o anormalidades microscópicas ya sea agudamente o después de 5 meses. Cuando el tratamiento con rhuKGF-2 es seguido por inyección intravenosa de La cz de E . col i de alto título que expresa vectores retrovirales de Moloney (1 x 10B cfu/ml), la expresión de ß-galactosidasa se incrementa con un porcentaje de los ( hepatocitos que son transducidos . Varios meses después, una porción de los hepatocitos transducidos permanece positiva a X-gal .

Ejemplo 14: Modelo i n vi vo de la Diabetes Ratas macho que pesan 200 a 260 gramos al inicio del estudio se utilizan en este modelo (W096/11950 ) . La diabetes es inducida por una inyección intravenosa simple de estreptozotocina a 50 mg de estreptozotocina en un amortiguador de citrato de sodio por kg de peso corporal. Las ratas control no diabéticas reciben una inyección intravenosa simple del amortiguador de citrato de sodio para fines de control. rhuKGF-2 se administra diariamente como una inyección subcutánea. La dosis de rhuKGF-2 es 3 ó 5 mg/kg/día, dependiendo del experimento . En el primer experimento, la terapia con rhuKGF-2 se inicia dos días antes de que es inducida la diabetes y se continúa después de la inducción de la diabetes por un total de ocho inyecciones. Aquellas ratas diabéticas que son tratadas con rhuKGF-2 antes de la inducción de la diabetes, y para las cuales se continúa también rhuKGF-2 después 1 de la inducción, muestran síntomas indicativos de una forma más leve de diabetes. De este modo, la terapia con rhuKGF-2 previene ya sea parcialmente la inducción de la enfermedad o restaura las células de los islotes productoras de insulina después de la destrucción de las células beta inducida por estreptozotocina. En el segundo y tercer experimentos, la terapia con rhuKGF-2 administrada subcutáneamente es iniciada un día después de la inducción de la diabetes con estreptozotocina. En el segundo estudio, la ingestión de agua en ayunas y la producción de orina son significativamente menores en las ratas diabéticas tratadas con rhuKGF-2 cuando se comparan las ratas diabéticas en el día 9, lo cual es además indicativo del mejoramiento de la condición de la enfermedad. En el tercer estudio, la terapia con rhuKGF-2 es capaz de incrementar el contenido total de insulina y de péptido C en el páncreas de ratas diabéticas cuando se compara a las ratas diabéticas tratadas con solución de cloruro de sodio . En el cuarto experimento, se inicia un curso de 7 días de la terapia con rhuKGF-2, 7 días después del tratamiento con estreptozotocina y los animales son luego seguidos por un periodo de 12 semanas. En todos los experimentos, excepto por el cuarto experimento, se utilizan los niveles de glucosa sanguínea, los niveles de glucosa urinaria y el volumen de orina como puntos finales para el análisis. Además, la ingestión de agua, los niveles de péptido C en orina, o en la insulina pancreática total y el contenido de péptido C se miden en algunos experimentos. En el cuarto experimento, el único punto final evaluado es la glucosa sanguínea. Debido a que una fracción grande de insulina es removida de la circulación por el hígado, la medición de las concentraciones de insulina periférica refleja los eventos del metabolismo post-hepático en vez de la secreción de insulina a través del páncreas. Por lo tanto, las mediciones del péptido C son frecuentemente realizadas y utilizadas como un marcador periférico de la secreción de insulina. El péptido C es producido a partir del procesamiento de la pro-insulina a insulina. La insulina y el péptido C son secretados de las células beta en cantidades equimolares, y únicamente una pequeña cantidad de péptido C es extraída por el hígado .

Los animales tratados con STZ de ambos grupos que reciben rhuKGF-2 tienen declinaciones significativas en la glucosa sanguínea durante el periodo de dosificación con rhuKGF-2.

Ejemplo 15: Modelo de Mortalidad inducida por Hiperoxia Para determinar el efecto de la administración de rhuKGF-2 sobre el daño pulmonar inducido por hiperoxia, se tratan ratas mediante instilación intratraqueal y se exponen a más de 98% de oxígeno por hasta 120 horas. En la necropsia, después de 120 horas de exposición a la hiperoxia, los pulmones de animales tratados con rhuKGF-2 parecen casi normales, con pocas áreas dispersas de hemorragia por punción sobre la superficie de la pleura, en comparación con los pulmones notoriamente hemorrágicos de ratones no tratados que mueren entre 55 y 80 horas de exposición a la hiperoxia. Histopatológica ente, los pulmones de los animales no tratados demuestran áreas grandes de hemorragias y edema intersticial. El espacio intraalveolar contiene células sanguíneas rojas, células inflamatorias, y exudado proteico. En contraste, no \ existe exudado intra-alveolar y evidencia mínima de hemorragia en los pulmones de los animales tratados con rhuKGF-2 quienes sobreviven por 120 horas en hiperoxia. A dosis de 5 y 1 mg/kg rhuKGF-2 disminuye significativamente la mortalidad inducida por hiperoxia .

Ejemplo 16: Modelo de Daño Pulmonar Agudo El edema pulmonar agudo por permeabilidad es inducido con una inyección de a-naftiltiourea, y la fuga pulmonar es evaluada en un modelo de pulmón perfundido, aislado, en 180 minutos. La fuga es confirmada con las proporciones en peso del pulmón húmedo/seco, y la concentración de la proteína del fluido alveolar se mide después del lavado bronquioalveolar. El efecto del pretratamiento con rhuKGF-2 (inyectado intratraquealmente durante 48 horas antes del experimento) sobre el edema pulmonar inducido por a-naftiltiourea, es evaluado (grupo con rhuKGF-2/a-naftiltiourea) . Son también estudiados los grupos control (control y rhuKGF-2/control ) . La histopatología es realizada para cada uno de los cuatro grupos.

La a-naftiltiourea produce un edema pulmonar de permeabilidad aguda, detectado por la fuga pulmonar en un periodo ex vi vo de 180 minutos de verificación periódica del pulmón perfundido, aislado. El pretratamiento con rhuKGF-2 atenúa significativamente estos parámetros, los cuales no son significativamente diferentes del grupo control y del grupo rhuKGF-2/control . La histopatología muestra hiperplasia de neumocitos de tipo II abundantes en los pulmones de animales pretratados con rhuKGF-2, y edema pulmonar notorio en animales pretratados con a-naftilurea . Es aparente menos edema en el grupo de rhuKGF-2/a-naftiltiourea . Mientras que la presente invención ha sido descrita anteriormente en general y en términos de las modalidades preferidas, se debe entender que para aquellos expertos en la técnica ocurrirán otras variaciones y modificaciones a la luz de la descripción anterior.

LISTADO DE SECUENCIAS ) INFORMACIÓN GENERAL: i) SOLICITANTE: Amgen Inc. ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCTOS DEL FACTOR 2 CRECIMIENTO DE QUERATINOCITOS iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 63 iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: A) DESTINATARIO: Amgen Inc. B) CALLE: 1840 De Havilland Drive C) CIUDAD: Thousand Oaks D) ESTADO: California E) PAÍS: US F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: A) NUMERO DE LA SOLICITUD: B) FECHA DE PRESENTACIÓN: C) CLASIFICACIÓN: vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: A) NUMERO DE LA SOLICITUD: US 60/028,493 B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-OCT-1996 vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: A) NUMERO DE LA SOLICITUD: US 60/032,781 B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-DIC-1996 vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: A) NUMERO DE LA SOLICITUD: US 60/033,046 B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-DIC-1996 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 1: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 627 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOMBRE/CLAVE: CDS B) POSICIÓN: 1..627 xi ) DESCRI PC I ÓN DE LA SECUENC IA : SEQ ID NO . 1 ATG TGG AAA TGG ATA CTG ACÁ CAT TGT GCC TCA GCC TTT CCC CAC CTG 48 Met Trp Lys Trp lie Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro Hiß Leu 1 5 10 15 CCC GGC TGC TGC TGC TGC TGC TTT TTG TTG CTG TTC TTG GTG TCT TCC 96 Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser 20 25 30 GTC CCT GTC ACC TGC CAÁ GCC CTT GGT CAG GAC ATG GTG TCA CCA GAG 144 Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu 35 40 45 GCC ACC AAC TCT TCT TCC TCC TCC TTC TCC TCT CCT TCC AGC GCG GG 192 Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly 50 55 60 AGG CAT GTG CGG AGC TAC AAT CAC CTT CAÁ GGA GAT GTC CGC TGG AGA 240 Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg 65 70 75 80 AAG CTA TTC TCT TTC ACC AAG TAC TTT CTC AAG ATT GAG AAG AAC GGG 288 Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys lie Glu Lys Asn Gly 85 90 95 AAG GTC AGC GGG ACC AAG AAG GAG AAC TGC CCG TAC AGC ATC CTG GAG 336 Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu 100 105 110 ATA ACÁ TCA GTA GAA ATC GGA GTT GTT GCC GTC AAA GCC ATT AAC AGC 384 He Thr Ser Val Glu He Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Asn Ser 115 120 125 AAC TAT TAC TTA GCC ATG AAC AAG AAG GGG AAA CTC TAT GGC TCA AAA 432 Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys 130 135 140 GAA TTT AAC AAT GAC TGT AAG CTG AAG GAG AGG ATA GAG GAA AAT GGA 480 Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly 145 150 155 160 TAC AAT ACC TAT GCA TCA TTT AAC TGG CAG CAT AAT GGG AGG CAÁ ATG 528 Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Aßn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met 165 170 175 TAT GTG GCA TTG AAT GGA AAA GGA GCT CCA AGG AGA GGA CAG AAA ACÁ 576 Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr 180 185 190 CGA AGG AAA AAC ACC TCT GCT CAC TTT CTT CCA ATG GTG GTA CAC TCA 624 Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser 195 200 205 TAG 627 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 2: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 209 aminoácidos B) TIPO: aminoácido D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2 Met Trp Lys Trp He Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu 1 5 10 15 Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser 20 25 30 Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu 35 40 45 Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly 50 55 60 Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg 65 70 75 80 Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys He Glu Lys Asn Gly 85 90 95 Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu 100 105 110 He Thr Ser Val Glu He Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Asn Ser 115 120 125 Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys 130 135 140 Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly 145 150 155 160 "? r Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met 165 170 175 Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr 180 185 190 Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser 195 200 205 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 3 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 426 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ! ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOMBRE/CLAVE: CDS B) POSICIÓN: 1..426 xi ) DESCRI PC IÓN DE LA SECUENC IA : SEQ I D NO . 3 ATG TCC TAC AAT CAC CTG CAG GGA GAT GTC CGC TGG AGA AAG CTG TTC 48 Met Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe 1 5 10 15 TCC TTC ACC AAG TAC TTT CTC AAG ATT GAA AAG AAC GGC AAG GTC AGC 96 Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys He Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser 20 25 30 GGG ACC AAG AAG GAA AAC TGT CCG TAC AGT ATC CTA GAG ATA ACÁ TCA 144 Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu He Thr Ser 35 40 45 GTG GAA ATC GGA GTT GTT GCC GTC AAA GCC ATT AAC AGC AAC TAT TAC 192 Val Glu He Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Asn Ser Asn Tyr Tyr 50 55 60 TTA GCC ATG AAC AAG AAG GGG AAA CTC TAT GGC TCA AAA GAA TTT AAC 240 Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn 65 70 75 80 AAT GAC TGT AAA CTG AAA GAG AGG ATA GAG GAA AAT GGA TAC AAC ACC 288 Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr 85 90 95 TAT GCA TCT TTT AAC TGG CAG CAC AAC GGC AGG CAÁ ATG TAT GTG GCA 336 Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala 100 105 110 TTG AAT GGA AAA GGA GCT CCC AGG AGA GGA CAÁ AAA ACÁ AGA AGG AAA 384 Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys 115 120 125 AAC ACC TCC GCT CAC TTC CTC CCC ATG GTG GTC CAC TCA TAA 426 Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser * 130 135 140 f INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 4 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 142 aminoácidos B) TIPO: aminoácido D) TOPOLOGÍA: desconocida i i ) TI PO DE MOLÉCULA: proteína xi ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO . 4 Met Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lyß Leu Phe 1 5 10 15 Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys He Glu Lys Asn Gly Lyß Val Ser 20 25 30 Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu He Thr Ser 35 40 45 Val Glu He Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Asn Ser Asn Tyr Tyr 50 55 60 Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn 65 70 75 80 Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr 85 90 95 Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asp Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala 100 105 110 Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys 115 120 125 Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser * 130 135 140 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 5 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 459 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOMBRE/CLAVE: CDS B) POSICIÓN: 1..459 xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 5 ATG TCT TCT CCT TCC TCT GCA GGT AGG CAT GTG CGG AGC TAC AAT CAC 48 Met Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His 1 5 10 15 CTC CAG GGA GAT GTC CGC TGG AGA AAG CTG TTC TCC TTC ACC AAG TAC 96 Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 TTT CTC AAG ATT GAA AAG AAC GGC AAG GTC AGC GGG ACC AAG AAG GAA 144 Phe Leu Lys He Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lyß Glu 35 40 45 AAC TGT CCG TAC AGT ATC CTA GAG ATA ACÁ TCA GTG GAA ATC GGA GTT 192 Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu -Glu He Thr Ser Val Glu He Gly Val 50 55 60 GTT GCC GTC AAA GCC ATT AAC AGC AAC TAT TAC TTA GCC ATC AAC AAG 240 Val Ala Val Lys Ala l s ?sn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys 65 70 75 80 AAG GGG AAA CTC TAT GGC TCA AAA GAA TTT AAC AAT GAC TGT A?A CTG 288 Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu B5 90 95 AAA GAG AGG ATA GAG GAA AAT GGA TAC AAC ACC TAT GC? TCT TTT AAC 336 Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phß ?sn 100 IOS 110 TGG CAG CAC AAC GGC AGG CAÁ ATG TAT GTG GCA TTG AAT GGA AAA GGA 384 Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu ?sn Gly Lyß Gly 115 120 125 GCT CCC AGG AGA GGA CAÁ AAA ACÁ AGA AGG ?AA AAC ACC TCC GCT CAC 432 Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His 130 135 140 TTC CTC CCC ATG GTG GTC CAC TCA TAA 459 Phe Leu Pro Met Val Val His Ser * 145 150 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 6 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 153 aminoácidos B) TIPO: aminoácido D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 6 Met Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His 1 5 10 15 Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phß Ser Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 Phe Leu Lys He Glu Lys ?sn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu 35 40 45 Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu He Thr Ser Val Glu He Gly Val 50 55 60 Val Ala Val Lys Ala He Asn Ser ?sn Tyr Tyr Leu ?la Met ?sn Lys 65 70 75 80 Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe ?sn ?sn ?sp Cys Lys Leu 85 90 95 Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe ?sn 100 105 110 Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu ?sn Gly Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His 130 135 140 Phe Leu Pro Met Val Val His Ser 145 150 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 7 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 513 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOMBRE/CLAVE: CDS B) POSICIÓN: 1..513 á xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 7 ATG CTG GGT CAG GAC ATG GTT TCT CCG GAG GCT ACC A?C TCT ?GC TCC 48 Met Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser 1 5 10 15 AGC AGC TTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA GGT AGG CAT GTG CGG AGC TAC 96 Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 30 ?AT CAC CTC C?G GGA GAT GTC CGC TGG AG? ??G CTG TTC TCC TTC ?CC 144 ?sn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr 35 40 45 AAG TAC TTT CTC A?G ATT GAA A?G ?AC GGC A?G GTC ?GC GGG ACC ??G 192 Lys Tyr Phe Leu Lys He Glu Lys ?sn Gly Lyß Val Ser Gly Thr Lys 50 55 60 AAG GAA A?C TGT CCG T?C ?GT ?TC CTA GAG AT? ?C? TC? GTG GAA ATC 240 Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu He Thr Ser Val Glu He 65 70 75 80 GGA GTT GTT GCC GTC A?? GCC ?TT ??C ?GC ??C T?T T?C TT? GCC ATG 288 Gly Val Val ?la Val Lys Ala He ?sn Ser ?sn Tyr Tyr Leu ?la Het 85 90 95 AAC A?G ??G GGG ??A CTC T?T GGC TCA A?? G?? TTT ??C ??T GAC TGT 336 Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lye Glu Phe Asn Asn Asp Cys 100 105 110 AAA CTG AAA GAG AGG ATA GAG GAA AAT GGA TAC A?C ACC TAT GCA TCT 384 Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser 115 120 125 TTT AAC TGG CAG CAC AAC GGC AGG CAÁ ATG TAT GTG GCA TTG A?T GGA 432 Phß Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly 130 135 140 AAA GGA GCT CCC AGG CAG GGA CAÁ AAA ACÁ AGA AGG AAA A?C ?CC TCC 480 Lys Gly Ala Pro Arg Gln Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser 145 15D 155 160 GCT CAC TTC CTC CCC ATG GTG GTC CAC TCA TAA 513 Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser • 165 170 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 8 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 171 aminoácidos B) TIPO: aminoácido D ) TOPOLOGÍA : desconocida i i ) TI PO DE MOLÉCULA : proteína x i ) DESCRI PCI ÓN DE LA SECUENC IA : SEQ ID NO . 8 Met Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 30 Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr 35 40 45 Lys Tyr Phe Leu Lys He Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys 50 55 60 Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser He Leu Glu He Thr Ser Val Glu He 65 70 75 80 Gly Val Val Ala Val Lys Ala He Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu ?la Met 85 90 95 ?sn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Aan ?sn Asp Cys 100 105 110 Lys Leu Lys Glu Arg He Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser 115 120 125 Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu ?sn Gly 130 135 140 Lys Gly Ala Pro Arg Gln Gly G n Lys Thr Arg Arg Lys ?sn Thr Ser 145 150 155 160 Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser * 165 170 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 9: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 4 aminoácidos B) TIPO: aminoácido D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 9 Val Arg Ser Tyr 1 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 10: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 5 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 10 His Val Arg Ser Tyr 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 11 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 6 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 11 Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 12 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 7 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína r xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 12 Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 13: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 8 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 13 Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 14: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 9 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 14 Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 15: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 10 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 15: Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 16 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 11 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 16 Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 17 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 12 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 17: Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 ) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 18: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 13 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 18: Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 19: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 14 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 19: Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 20 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 15 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 20: Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 15 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 21 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 16 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 21: Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 1 5 10 15 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 22: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 17 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 22: Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser 1 5 10 15 Tyr 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 23: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 18 minoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 23: Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg 1 5 10 15 Ser Tyr 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 24 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 19 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 24: Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val 1 5 10 15 Arg Ser Tyr 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 25: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 20 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 25: Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His 1 5 10 15 Val Arg Ser Tyr 20 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 26: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 21 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 26: Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg 1 5 10 15 His Val Arg Ser Tyr 20 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 27 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 22 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 27: Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly 1 5 10 15 Arg His Val Arg Ser Tyr 20 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 23 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 28: Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala 1 5 10 15 Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 29: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 24 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 29: Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser 1 5 10 15 Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 30: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 25 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 30: Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 31: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 26 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 31: Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 32: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 27 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 32: Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 33: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 28 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína t xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 33: Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser 1 5 10 15 Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 34: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 29 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 34: Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe 1 5 10 15 Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 35: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 30 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 35: Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 30 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 36: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 31 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 36: Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 30 i 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 37 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 32 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 37: Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr 20 25 30 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 31 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 33 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 38: Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser 25 30 Tyr 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 39: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 34 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 39: Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg 25 30 Ser Tyr 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 40: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 4 aminoácidos B) TIPO: aminoácido i C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 40 Met Val Val His 1 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 41: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 5 aminoácidos B) TIPO: aminoácido C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 41 Met Val Val His Ser 1 5 INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 42: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 36 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 42: AAACAACATA TGGTTTCTCC GGAGGCTACC AACTCC 36 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 43: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 35 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 43: AAACAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACCA TGGGG 35 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 44: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 47 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 44: CTAGCGATGA CGATGATAAA CAGGCTCTGG GTCAGGACAT GGTTTCT 47 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 45: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 47 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 45: CCGGAGAAAC CATGTCCTGA CCCAGAGCCT GTTTATCATC GTCATCG 47 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 46: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 45 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 46: GGAGGAATAA CATATGTCCT ACAATCACCT GCAGGGAGAT GTCCG 45 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 47: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 35 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 47: AAACAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACCA TGGGG 35 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 48: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 47 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 48: TTAGATTCTA GATTTGTTTT AACTAATTAA AGGAGGAATA ACATATG 47 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 49: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 35 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 49: AAACAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACCA TGGGG 35 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 50: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 53 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 50: AAACAACATA TGTCTTCTCC TTCCTCTGCA GGTAGGCATG TGCGGAGCTA CAÁ 53 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 51 i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 35 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 51: AAACAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACCA TGGGG 35 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 52: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 25 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 52: TATGCTGGGT CAGGACATGG TTTCT 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 53: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 27 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 53: CCGGAGAAAC CATGTCCTGA CCCAGCA 27 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 54: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 51 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi ) DESCRI PC IÓN DE LA SECUENC IA : SEQ I D NO . 54 : CCGGAGGCTA CCAACTCTAG CTCCAGCAGC TTCTCCTCTC CTAGCTCTGC A 51 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 55: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 43 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 55: GAGCTAGGAG AGGAGAAGCT GCTGGAGCTA GAGTTGGTAG CCT 43 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 56: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 25 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 56: AACACCTATG CATCTTTTAA CTGGC 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 57: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 29 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 57: GTCCCTGCCT GGGAGCTCCT TTTCCATTC 29 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 58: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 30 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 58: GCTCCCAGGC AGGGACAAAA AACAAGAAGG 30 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 59: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 29 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 59: AACAAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACC 29 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 60: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 25 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 60: AACACCTATG CATCTTTTAA CTGGC 25 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 61: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 29 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 61: AACAAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACC 29 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 62: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 29 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 62: AACAAAGGAT CCTTTATGAG TGGACCACC 29 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 63: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 51 pares de bases B) TIPO: ácido nucleico C) TIPO DE HEBRA: desconocida D) TOPOLOGÍA: desconocida ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 63: CCGGAGGCTA CCAACTCTAG CTCCAGCAGC TTCTCCTCTC CTAGCTCTGC A 51 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de una proteína que comprende los residuos de aminoácidos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO. 2 (KGF-2), la variante está caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: una variante que comprende ?N41 KGF-2, ?N40 KGF-2, ?N39 KGF-2, ?N38 KGF-2, ?N37 KGF-2, ?N36 KGF-2 y ?N35 KGF-2, o las proteínas R?-[Asn71-Pro203]-COOH, en donde [Asn71-Pro203] representa los residuos 71 al 203 de la SEQ ID NO. 2; en donde Ri representa un grupo amino metionilado o no metionilado de Asn71 o del o de los residuos de aminoácidos amino-terminales de: Tyr, Ser-Tyr, Arg-Ser-Tyr, Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 9), His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 10), Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 11), Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 12), Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 13), Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 14), Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 15), Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 16) , Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg- Ser-Tyr (SEQ ID NO. 17) , Ser- Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 18), Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 19), Ser-Phe- Ser-Ser- Pro-Ser- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 20), Ser- Ser- Phe- Ser- Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 21), Ser-Ser- Ser- Phe- Ser- Ser- Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 22), Ser- Ser- Ser-Ser- Phe-Ser- Ser-Pro- Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 23), Ser- Ser-Ser- Ser- Ser- Phe- Ser- Ser-Pro- Ser- Ser-Al a-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 24), Asn-Ser- Ser- Ser- Ser- Ser-Phe- Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 25), Thr-Asn-Ser-Ser- Ser-Ser- Ser-Phe- Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 26), Ala-Thr-Asn- Ser- Ser- Ser- Ser- Ser- Phe- Ser- Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 27), Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe- Ser-Ser-Pro-Ser- Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 28) , Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser- Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser- yr (SEQ ID NO. 29) , Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn- Ser-Ser-Ser-Ser- Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val -Arg- Ser-Tyr (SEQ ID NO. 30) , Val-Ser-Pro-Glu-Al a-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser- Ser- Ser- Phe-Ser-Ser-Pro-Ser- Ser-Al a-Gly-Arg-His-Val- •Arg- Ser- Tyr (SEQ ID NO. 31) , Met-Val -Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser- Ser- Ser- Ser-Phe- Ser- Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His- Val -Arg- Ser-Tyr (SEQ ID NO. 32) , Asp-Met-Val -Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn- Ser- Ser- Ser- Ser-Ser- Phe-Ser- Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg- •Hi s-Val -Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 33) , Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn- Ser- Ser- Ser-Ser- Ser-Phe-Ser- Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly- •Arg-Hi s-Val -Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 34), Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr- Asn- Ser- Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro-Ser-Ser-Ala- Gly-Arg-Hi s -Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 35), Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe- Ser- Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 36), Ala-Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val- Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser- Ser-Ser- Ser- Ser-Phe- Ser- Ser-Pro-Ser-Ser-Al a-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 37), Gln-Ala-Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn- Ser-Ser-Ser-Ser- Ser-Phe- Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 38), o Cys-Gln-Ala-Leu-Gly-Gln-Asp-Met-Val-Ser-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Phe-Ser-Ser-Pro- Ser-Ser-Ala-Gly-Arg-His-Val-Arg-Ser-Tyr (SEQ ID NO. 39) . y, en donde R2 representa un grupo carboxilo de Pro 203 de residuos de aminoácidos carboxilo-terminales de: Met Met-Val Met-Val-Val Met-Val-Val-His (SEQ ID No. 40), o Met-Val-Val-His-Ser (SEQ ID No. 41), no obstante con la condición, de que Ri y R2 no se seleccionen para reconstruir Cys37 a Ser208 de la SEQ ID No. 2. ( una variante que comprende al menos un residuo de aminoácidos dentro de Asn168 a Met176 de la SEQ ID NO. 2 , que está suprimido o sustituido con un aminoácido no nativo; una variante que comprende al menos un aminoácido no nativo que es agregado dentro de Asn168 a Met176 de la SEQ ID NO. 2, y los derivados químicos de la misma; una variante que comprende al menos un residuo de aminoácido neutro o positivamente cargado dentro de los aminoácidos 85-198 de la SEQ ID NO. 2, que está suprimido o sustituido con un residuo neutro o un residuo negativamente cargado, con lo cual se genera una proteína de cambio de carga con carga positiva reducida, y los derivados químicos de la misma; una variante que comprende la sustitución de al menos un residuo de aminoácido que tiene un mayor potencial de formación de vuelta o rizo para un aminoácido que tiene un más bajo potencial de vuelta o rizo dentro de una región putativa formadora de vuelta o rizo de los residuos de aminoácidos 160-164 de la SEQ ID NO. 2, y los derivados químicos de la misma; una variante que comprende al menos una cisteína de origen natural en la posición 37, 106 ó 150 de la SEQ ID NO. 2 , que está suprimida o sustituida con un residuo de aminoácido no nativo, y los derivados químicos de la misma; una variante que comprende al menos un aminoácido neutro en el sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado, que está suprimido o sustituido con un aminoácido no nativo, con lo cual el sitio de glucosilación N-enlazado u O-enlazado es modificado, y los derivados de la misma; una variante que comprende la adición o la sustitución de al menos un aminoácido no nativo para generar un sitio de glucosilación N-enlazado u 0-enlazado, y los derivados químicos de la misma; y una variante que comprende una adición C-terminal de al menos un dominio de la región constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina humana, y los derivados químicos de la misma.

2. La variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de ?N36 KGF-2, ?N35 KGF-2, ?N34 KGF-2, ?N33 KGF-2, ?N32 KGF-2, ?N31 KGF-2, y ?N30 KGF-2, y los derivados químicos de la misma .

3. La variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque NH2-Ala-Lys-Trp-Thr-His-Asn-Gly-Gly-Glu-Met-COOH es sustituido por los residuos dentro de Asn168 a Met17b de la SEQ ID NO. 2.

4. La variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los residuos Thr86, Gly182, Arg187 o Asn196 de la SEQ ID NO. 2 son sustituidos con un aminoácido no nativo.

5. La variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque los aminoácidos son alanina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, asparagina, glicina, valina, leucina, isoieucina, serina y treonina.

6. La variante de KGF-2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos está no glucosilada.

7. La variante de KGF-2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos está glucosilada.

8. Un derivado químico caracterizado porque comprende un polímero soluble en agua, conjugado a una variante de KGF-2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7.

9. Un derivado químico caracterizado porque comprende un polímero soluble en agua conjugado a un KGF-2 que comprende los residuos de aminoácidos Cys37 a Ser208 de la SEQ ID NO. 2 (KGF-2) .

10. Un polinucleótido, caracterizado porque codifica para la variante de KGF-2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7.

11. Un vector, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10, operativamente enlazado a una secuencia de control de expresión.

12. Una célula huésped procariótica o eucariótica, caracterizada porque contiene un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10.

13. Un método, caracterizado porque comprende el desarrollo de las células huésped de conformidad con la reivindicación 12 en un medio nutritivo adecuado y, opcionalmente, el aislamiento de dicha variante de KGF-2 a partir de la células o del medio nutritivo.

14. El método para la producción de la variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las células huésped son E . col i .

15. El método para la producción de la variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las células huésped son seleccionadas de células de baculovirus, células COS y células de ovario de hámster Chino.

16. Un método, caracterizado porque comprende el paso de aislar una variante de KGF-2 a partir de una célula huésped que contiene un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10, cultivada bajo condiciones que permiten la expresión de la variante de KGF-2 por dicha célula huésped.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende el paso de modificar la variante aislada de KGF-2 para generar un compuesto capaz de estimular la producción de células epiteliales.

18. Un método, caracterizado porque comprende los pasos de: a) el cultivo de una célula huésped procariótíca o eucariótica que contiene un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10; b) el mantenimiento de dicha célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de una variante de KGF-2 por la célula huésped; y c) el aislamiento opcional de la variante de KGF-2 expresada por la célula huésped.

19. La variante de KGF-2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es el producto de expresión recombinante de una célula huésped procariótica o eucariótica que contiene un polinucleótido exógeno de conformidad con la reivindicación 10.

20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la variante de KGF-2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la variante de KGF-2, producida de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 13, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la variante de KGF-2 producida de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 18, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Un método para la estimulación de la producción de células epiteliales, caracterizado porque comprende el poner en contacto tales células con una cantidad efectiva de la variante de KGF-2 de conformidad con las reivindicaciones 1 a la 7.

24. Un método para la estimulación de la producción de células epiteliales, caracterizado porque comprende el poner en contacto tales células con una cantidad efectiva del derivado químico de conformidad con las reivindicaciones 8 a la 9.