KR19980702186A - 각질 세포 성장 인자-2 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(RNA) 및 재조합 기법에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상처 치료, 상흔 감소를 자극하고, 모발 손실을 예방하는데 사용할 수 있는 상피 세포 성장을 자극하기 위한 상기 폴리펩티드의 이용방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드에 대한 길항물질 및 암, 건선, 카포시 육종, 해족종, 망막장애 및 재발협착증과 같은 증식성 질병에 대한 치료제로서 상기 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 KGF-2 암호화 서열 내에서 돌연변이 및 숙주 유래의 샘플 내에서 KGF-2 단백질의 농도 변화를 검출하는 진단 방법도 기술하고 있다.
Description
섬유아세포 성장 인자군은 연조직 성장 및 재생에 연루된 커다란 성장 인자군으로 나타나 왔다. 지금까지 상기 군은 단백질 수준에서 다른 정도의 상동성을 공유하는 몇몇 성장 인자를 포함하였으며, 그 한 예외로 상기 성장 인자들은 유사한 범위의 유사분열 촉진성 스펙트럼을 보유하는 것으로 생각된다. 즉, 이들 성장 인자들은 중배엽 및 신경외배엽성 기원의 여러 가지 세포의 증식을 촉진하고/하거나 혈관생성을 촉진한다.
상기 성장 인자군의 다른 구성원들의 발현 패턴은 매우 상이한데, 여러 가지 조직 및 장기의 편재성 발현이라기 보다는 발육의 몇몇 단계의 발현이 극도로 제한된다. 모든 구성원들은 헤파린 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 및 글리코스아미노글리칸을 결합하는 것으로 생각되며, 외세포성 매트릭스 내에서 강하게 농축되는 것으로 생각된다. 본래 KGF 는 서열 상동성 또는 인자 정제 및 클로닝에 의해 KGF 군의 한 구성원으로서 동정되었다.
각질 세포 성장 인자(KGF)는 배양된 쥐의 각질 세포주를 위한 유사분열 유발인다로서 분리되었다[참조: Rubin, J.S. 등, PNAS, USA, 86:802-806 (1989)]. FGF 군의 다른 구성원과는 달리, KGF 는 간엽(間葉)조직에서 유래한 세포에 대한 활성이 거의 없었으나, 상피 세포의 성장을 자극하였다. 각질 세포 성장 인자 유전자는 194개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 암호화한다[참조: Finch, P.W. 등, Science, 245:752-755 (1989)]. N-말단의 64개의 아미노산은 독특하였으나, 상기 단백질의 나머지 아미노산은 bFGF와 약 30%의 상동성을 나타냈다. KGF 는 FGF 군 중에서 가장 개산(開散)성인 구성원이다. 상기 분자는 소수성 신호 서열을 보유하고 있으며, 효과적으로 분비된다. 해독후 변형은 한 위치에서 신호 서열의 절단 및 N-결합된 글리코실화를 포함하며, 이 결과 28 kDa의 단백질이 생성된다. 각질 세포 성장 인자는 피부 및 태아의 폐로부터 유래한 섬유아세포에 의해 생성된다[참조: Rubin 등, (1989)]. 각질 세포 성장 인자 mRNA는 성인의 신장, 결장 및 장골내에서 발현되는 것으로 확인되었으나, 뇌 또는 폐에서는 발현되지 않았다[참조: Finch, P.W. 등, Science, 245:752-755 (1989)]. KGF 는 FGF 단백질 군 내에서 보존된 부위를 나타낸다. KGF 는 높은 친화성으로 FGF-2 수용체에 결합한다.
본 발명은 신규하게 동정된 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 용도 뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 각질 세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor; KGF)이며, 종종 KGF-2로 언급된다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩티드의 작용을 억제하는 것에 관한 것이다.
첨부 도면은 본 발명의 구체예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 없다.
도 1은 본 발명의 cDNA 및 이에 상응하는 폴리펩티드의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 초기 36개의 아미노산 잔기는 추정적인 리더 서열을 나타낸다(밑줄친 부분). 아미노산에 대한 표준 일문자 약어를 이용하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 시도에서 서열 결정의 부정확성은 일반적인 문제이다. 서열 결정은 373 자동화 DNA 서열결정기(어플라이드 바이오시스템스, 인코오포레이티드에서 시판됨)를 이용하여 수행하였다. 서열 결정 정확성은 97% 이상으로 예상되었다.
도 2는 본 발명의 폴리펩티드와 기타 섬유아세포 성장 인자의 아미노산 서열을 비교 예시한 도면이다.
본 발명의 폴리펩티드는 FGF 군의 한 구성원으로 추정적으로 동정되었으며, 구체적으로 상기 폴리펩티드는 FGF 군의 다른 구성원과 아미노산 서열 상동성의 결과로서 추정적으로 KGF-2로 동정되었다.
본 발명의 한 관점에 따라, KGF-2인 신규의 성숙한 폴리페티드 뿐만 아니라 이의 생물학적으로 활성이있고, 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 상기 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 폴리펩티드는 인간으로부터 유래된 것이다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 인간 KGF-2를 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공되는데, 상기 핵산 분자는 mRNA, DNAs, cDNAs, 게놈 DNA 뿐만 아니라 이의 안티센스 유사체 및 이의 생물학적으로 활성이 있고, 진단학적으로 및 치료학적으로 유용한 단편을 포함한다.
본 발명의 다른 관점에 따라, KGF-2의 재조합 생성에서 시약으로서 유용한 클로닝 플라즈미드 및 발현 플라즈미드와 같은 재조합 벡터 뿐만 아니라 인간 KGF-2 핵산 서열을 포함하는 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 이용하는 재조합 기법에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 치료적 목적을 위해 이용하는 방법이 제공되는데, 상기한 치료적 목적이라 함은 상처 치료를 위한 상피 세포 증식의 자극, 모낭 생성의 자극 및 피부 상처의 치료 등을 의미한다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 인간 KGF-2 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브가 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 상기 폴리펩티드에 대한 길항물질이 제공되는데, 이는 상기 폴리펩티드의 작용을 억제하므로써 상처 치료 과정중의 상흔을 감소시키고, 종양 증식, 당뇨성 망막장애, 류마티스성 관절염 및 종양 성장을 치료 및/또는 예방할 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따라, KGF-2 핵산 서열의 변이 또는 상기 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 과발현과 관련된 질병 또는 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 과학적 연구, DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조를 위한 시험관내 목적을 위해 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법이 제공된다.
상술한 본 발명의 관점들은 당업자에게는 명백한 것이며, 본 명세서에 상세히 기술되어 있다.
첨부 도면은 본 발명의 구체예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 없다.
도 1은 본 발명의 cDNA 및 이에 상응하는 폴리펩티드의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. 초기 36개의 아미노산 잔기는 추정적인 리더 서열을 나타낸다(밑줄친 부분). 아미노산에 대한 표준 일문자 약어를 이용하였다. 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 시도에서 서열 결정의 부정확성은 일반적인 문제이다. 서열 결정은 373 자동화 DNA 서열결정기(어플라이드 바이오시스템스, 인코오포레이티드에서 시판됨)를 이용하여 수행하였다. 서열 결정 정확성은 97% 이상으로 예상되었다.
도 2는 본 발명의 폴리펩티드와 기타 섬유아세포 성장 인자의 아미노산 서열을 비교 예시한 도면이다.
본 발명의 다른 관점에 따라, 도 1의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 갖는 성숙한 폴리펩티드 또는 1994년 12월 16일에 ATCC에 수탁번호 75977로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)이 제공된다.
본 발명의 폴리핍티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 전립선 및 태아 폐로부터 수득할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 단편은 인간의 정상적인 전립선으로부터 유래한 라이브러리로부터 초기에 분리하였다. 이어서, 전장 단백질을 암호화하는 개방 해독틀은 무작위로 프라임된 인간 태아 폐 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 이는 FGF 군과 구조적으로 관련되어 있다. 이는 최초 약 36개의 아미노산 잔기가 추정적인 리더 서열이어서 성숙한 단백질이 172개의 아미노산으로 구성되는 208개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 암호화하는 개방 해독틀을 함유한다. 상기 단백질은 206개의 아미노산 신장부에 대해 45%의 동일성 및 82%의 유사성으로 인간 각질 세포 성장 인자와 최고의 상동성을 나타낸다. 또한, FGF 군을 통해 보존된 서열은 본 발명의 단백질 내에서 보존되는 것으로 확인된 것은 중요한 사실이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 형태일 수 있으며, DNA 는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. 상기 DNA 는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있으며, 일본쇄 DNA인 경우, 암호화 스트랜드 또느 비암호화(안티센스) 스트랜드일 수 있다. 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 스트랜드는 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 번호 1) 또는 기탁된 클론의 서열과 동일하거나, 유전 암호의 과잉 또는 퇴화의 결과 상이한 암호화 서열일 수 있다. 상기 상이한 암호화 서열도 도 1의 DNA(서열 번호 1)와 동일한 성숙한 폴리펩티드를 암호화한다.
도 1의 성숙한 폴리펩티드(서열 번호 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단지 성숙한 폴리펩티드를 위한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩티드를 위한 암호화 서열 및 기타 암호화 서열, 예를 들어 리더 서열 또는 분비 서열 또는 전구 단백질 서열; 성숙한 폴리펩티드를 위한 암호화 서열(및 임의의 추가 암호화 서열); 및 인트론과 같은 비암호화 서열 또는 성숙한 폴리펩티드를 위한 암호화 서열의 5' 및/또는 3' 비암호화 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 사용한 용어 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드를 위한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 추가의 암호화 서열 및/또는 비암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의미이다.
또한, 본 발명은 도 1의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 보유하는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 암호화하는 이미 기술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 상기 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하지 않는 변이체일 수 있다.
따라서, 본 발명은 도 1에 나타낸 것과 동일한 성숙한 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 것과 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 도 1의 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 첨가 또는 삽입 변이체를 포함한다.
이미 기술한 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드는 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 번호 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체인 암호화 서열을 보유할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립 유전자 변이체는 암호화된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가를 보유할 수 있는 대체 형태의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 이때 성숙한 폴리펩티드를 위한 암호화 서열은 동일한 해독틀 내에서 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비에 조력하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 상기 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 조절하는 분비 서열로서 작용하는 리더 서열에 융합될 수 있다. 리더 서열을 보유하는 폴리펩티드는 예비단백질이며, 숙주 세포에 의해 절단된 리더 서열을 보유하여 폴리펩티드의 성숙한 형태를 형성할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 전구단백질을 암호화할 수 있다. 전구 서열을 보유하는 성숙한 단백질은 불활성인 형태의 단백질이다. 전구 서열이 일단 절단되면, 활성인 성숙한 단백질이 남는다.
따라서, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질을 암호화하거나 전구 서열을 보유하는 단백질 또는 전구 서열 및 예비 서열(리더 서열) 둘 다를 보유하는 단백질을 암호화할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 해독틀 내에서 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 융합된 암호화 서열을 보유할 수 있다. 상기 마커 서열은 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있어 박테리아 숙주의 경우에 상기 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제에 대비하거나, 또는 포유동물 숙주, 예를 들어 COS-7 세포를 사용하는 경우, 상기 마커 서열은 헤마클루티닌(HA) 태그일 수 있다. 상기 HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응한다[참조: Wilson, I. 등, Cell, 37:767 (1984)].
또한, 본 발명은 상기 서열들 간에 50% 이상, 바람직하게는 70%의 동일성이 있는 경우, 상기 서열들에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 강성 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어 강성 조건은 서열들 사이에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 있는 경우에만 하이브리드화가 발생함을 의미하는 것이다. 바람직한 구체예에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 도 1의 cDNA(서열 번호 1) 또는 기탁된 cDNA 에 의해 암호화되는 성숙한 폴리펩티드와 거의 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
본 명세서에서 언급된 기탁물(들)은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약하에서 유지될 것이다. 이들 기탁물들은 단순히 당업자의 편의를 위해 제공되며, U.S.C. 35 112조에서 요구되는 승인을 득한 것은 아니다. 기탁물내에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 이 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본 명세서에 참고로 인용한 것이며, 본 명세서의 서열에 대한 기술에 대한 임의의 논쟁을 조절하기 위한 것이다. 기탁물의 제조, 이용 및 판매에 대해서는 어떤 허가가 필요할 수 있으며, 이러한 허가가 승인된 것은 없다.
또한, 본 발명은 도 1의 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 뿐만 아니라 상끼 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다.
본 명세서에서 도 1의 폴리펩티드(서열 번호 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 언급할 때 사용한 용어 단편, 유도체 및 유사체는 상기 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 유사체는 전구단백질의 절단에 의해 활성이 있는 성숙한 폴리펩티드를 생성할 수 있는 전구단백질을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 재조합 폴리펩티드가 바람직하다.
도 1의 폴리펩티드(서열 번호 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비보존된 아미노산 잔기(보존된 아미노산 잔기가 바람직함)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전 암호에 의해 암호화 되거나, 되지 않을 수 있는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드가 다른 화합물, 예를 들어 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것, 또는 (iv) 추가 아미노산이 성숙한 폴리펩티드, 예를 들어 성숙한 폴리펩티드 또는 전구 단백질의 정제를 위해 사용되는 리더 또는 분비 서열에 융합된 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범위 내에 속하는 것으로 생각된다.
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된 형태로 제공되는 것이 바람직하며, 균질하게 정제된 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용한 용어 분리된은 상기 물질이 그의 원래의 환경(예를들어, 자연적으로 발생하는 경우, 자연 환경)으로부터 제거되었음을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 내에 존재하는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않으나, 자연계에 동시에 존재하는 몇몇 또는 모든 물질로부터 분리된 동일한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있으며, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 그의 자연 환경의 일부가 아니기 때문에 상기한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 여전히 분리된 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.
숙주 세포는 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작(형질도입, 형질전환 또는 형질감염)할 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라즈미드 형태, 비루스 입자, 파지 등일 수 있다. 유전적으로 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키고, 형질전환체를 선택하거나 KGF-2 유전자를 증폭하기 위해 적합하게 변형된 통상적인 배양 배지내에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용되어 왔던 것들이며, 당업자에게는 명백한 것일 것이다.
재조합 기법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현하기 위한 여러 가지 발현 벡터중 임의의 한 벡터내에 포함될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 박테리아 플라즈미드; 파지 DNA; 바쿨로비루스; 효모 플라즈미드; 플라즈미드와 파지 DNA, 백시니아, 아데노비루스, 가금류 폭스 비루스 및 슈도라비에스와 같은 비루스 DNA의 조합으로부터 유도한 벡터를 포함한다. 그러나, 숙주 세포 내에서 복제할 수 있고, 생존 가능성이 있는 한, 임의의 다른 벡터를 사용할 수도 있다.
적합한 DNA 서열은 여러 가지 방법으로 벡터 내에 삽입할 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계에 공지된 방법으로 적합한 제한 엔도뉴클레아제 위치(들) 내로 삽입된다. 이러한 방법 및 기타 방법들은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
발현 벡터 내의 DNA 서열은 적합한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 작동가능하게 연결되어 mRNA 합성을 유도한다. 이들 프로모터의 대표적인 예로는 LTR 또는 SV40 프로모터, 이.콜리 lac 또는 trp, 파지 람다 PL프로모터 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 그들의 비루스 내에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 들 수 있다. 또한, 발현 벡터는 해독 개시 및 전사 종결을 위한 리보좀 결합 위치를 함유하고 있다. 또한, 상기 벡터는 발현을 증폭하기 위한 적합한 서열을 포함하고 있다.
또한, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자를 함유하여 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성, 예를 들어 진핵 세포 배양에 대해서는 디히드로폴레이트 리덕타아제 또는 네오마이신 내성 또는 이.콜리에 대해서는 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 제공한다.
상기한 바와 같은 적합한 DNA 서열 뿐만 아니라 적합한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 이용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환하여 단백질을 발현하도록 할 수 있다.
적합한 숙주의 대표적인 예로는 이.콜리, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포; 효모 같은 균류 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종 세포와 같은 동물 세포; 아데노비루스; 식물 세포 등을 들 수 있다. 적합한 숙주의 선택은 본 명세서의 교시로부터 당업자의 범위 내에 속하는 것으로 생각된다.
더 구체적으로, 본 발명은 이미 광범위하게 기술한 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 구성물을 포함한다. 상기 구성물은 본 발명의 서열이 역방향 또는 순방향으로 삽입된 플라즈미드 또는 비루스 벡터와 같은 벡터를 함유하고 있다. 본 구체예의 바람직한 관점에서, 상기 구성물은 예를 들어 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 그 예로는 박테리아의 pQE70, pQE60, pQE-9(퀴아젠), pBS, pD10, 파지스크립트, psiX174, p블루스크립트 SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타젠); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT5(파마시아); 진핵 세포의 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(스트라타젠), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(파마시아)를 들 수 있다. 그러나, 숙주 내에서 복제할 수 있고, 생존가능한 임의의 다른 플라즈미드 또는 벡터를 사용할 수 있다.
프로모터 부위는 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라아제) 벡터 또는 기타 선택성 마커를 보유한 벡터를 이용하여 임의의 목적 유전자로부터 선택할 수 있다. 두 개의 적합한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특정 박테리아 프로모터로는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL및 trp 를 들 수 있다. 진핵세포 프로모터는 초기 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 초기 및 후기 SV40, 레트로비루스 유래의 LTRs 및 생쥐 메탈로티오네인-I를 들 수 있다. 적합한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 범위 내에 속하는 것으로 생각된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 상기한 구성물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포, 예를 들어 포유류 세포일 수도 있고, 하등 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포일 수도 있다. 또한, 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포일 수도 있다. 숙주 세포 내로 구성물의 도입은 인산 칼슘을 이용한 형질감염, DEAE-덱스트란 개재된 형질감염 또는 전기적 천공법을 이용하여 수행할 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)].
숙주 세포내의 구성물은 통상적인 방법에 사용하여 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 생성할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상의 펩티드 합성기를 이용하여 합성할 수 있다.
성숙한 단백질은 포유류 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포 내에서 적합한 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있다. 또한, 무세포 해독 시스템을 이용하므로써 본 발명의 DNA 구성물로부터 유도된 RNAs를 이용하여 상기 단백질을 형성할 수 있다. 진핵 또는 원핵 숙주 세포와 함께 사용하기 위해 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 본 명세서에 참고로 인용한 문헌[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 뉴욕의 콜드 스프링 하버 출판사 (1989)]에 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 고등 진핵 세포에 의한 전사는 상기 벡터에 인핸서 서열을 삽입하므로써 증가된다. 인핸서는 일반적으로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스-작용성 요소이며, 프로모터에 작용하여 그의 전사를 증가시킨다. 그 예로는 복제 원점에서 하류로 100 내지 270 bp 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로비루스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점 후면상의 폴리오마 인핸서 및 아데노비루스 인핸서를 들 수 있다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 원점 및 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선택성 마커, 예를 들어 이.콜리의 앰피실린 내성 유전자 및 에스. 세레비제(S. cerevisiae) TRP1 유전자 및 고 발현된 유전자로부터 유래한 프로모터를 포함하여 하류의 구조 유전자의 전사를 유도할 것이다. 이러한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나아제(PGK), α-인자, 산 포스파타아제 또는 열 충격 단백질등과 같은 당분해성 단백질을 암호화하는 오페론으로부터 유도할 수 있다. 이종 구조 서열은 적합한 단계에서 해독 개시 및 종결 서열과 조립되며, 바람직하게는 해독된 단백질을 주변 공간 또는 세포외 배지내로의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열과 조립된다. 임의로 이종 서열은 예를 들어, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제와 같은 원하는 특성을 부여하는 N-말단 확인 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
박테리아 용으로 사용하기 위한 유용한 발현 벡터는 목적 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 적합한 해독 개시 및 종결 신호와 함께 작용성 프로모터를 가진 작동가능한 해독 상내에 삽입하므로써 구성된다.
상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선택성 마커 및 복제 원점을 포함하여 벡터의 항상성을 보장할 것이며, 필요에 따라 숙주 내에 증폭을 제공할 것이다. 형질전환을 위해 적합한 원핵 세포 숙주는 이.콜리, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피무리움 및 슈도모나스속(Pseudomonas), 스트렙토마이세스속 및 스타필로콕쿠스(Staphylococcus)의 여러 가지 종을 포함하나, 다른 숙주를 선택하여 사용할 수도 있다.
박테리아용으로 대표적인 비제한적인 발현 벡터는 널리 알려진 pBR322(ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판되는 플라즈미드로부터 유도된 선택성 마커 및 박테리아 복제 원점을 포함할 수 있다. 이러한 시판되는 벡터로는 예를 들어, pKK233-3(스웨덴, 웁살라에 소재하는 파마시아 파인 케미칼스에서 시판됨) 및 GEM1(미국, 위스콘신, 메이디슨에 소재하는 프로메가 바이오텍에서 시판됨)을 들 수 있다. 이들 pBR322 백본부는 적합한 프로모터 및 발현된 구조 서열과 조합되어 있다.
적합한 숙주 균주의 형질전환 및 상기 숙주 균주의 적합한 세포 밀도로의 성장이후에, 상기 선택된 프로모터는 적합한 수단(예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 유도되며, 세포들은 추가의 기간 동안 배양된다.
세포는 전형적으로 원심분리, 물리적 또는 화학적 수단에 의한 파괴 및 추가 정제를 필요로 하는 조 추출물의 수득에 의해 수거된다.
단백질의 발현을 위해 사용된 미생물 세포는 임의의 편리한 방법으로 파괴할 수 있는데, 그 예로는 냉동-해동 사이클의 반복, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제를 이용하는 방법을 들 수 있으며, 이 방법들을 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 여러 가지 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현할 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예로는 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 및 상용성 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 들 수 있다. 포유류 발현 벡터는 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서를 포함할 것이며, 또한 필요한 리보좀 결합 위치, 폴리아데닐화 위치, 스플라이스 공여체 및 수용체 위치, 전사 종결 서열 및 5' 인접 비전사 서열도 포함한다. SV40 스플라이스로부터 유도된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 위치를 사용하여 필요한 비전사 유전 요소를 제공할 수 있다.
KGF-2 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전법, 산 침전법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 필요에 따라 단백질 재접합 단계를 사용하여 성숙한 단백질의 구조를 완전하게 할 수 있다. 최종적으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 최종 정제 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 정제된 형태 또는 화학 합성법의 생성물 또는 원핵 또는 진핵 숙주(예를 들어, 배양물 내의 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포)로부터 재조합 기법에 의해 제조된 것일 수 있다. 재조합 제조 기법에서 사용된 숙주에 따라 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화될 수도 있고, 글리코실화되지 않을 수도 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 새로운 혈관 성장 또는 혈관 생성을 자극하는데 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 각질 세포 성장 및 증식을 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 상처 치료를 자극하는데 사용할 수 있으며, 또한 모발 손실의 예방에 관련된 각질 세포를 자극하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 상피 세포 증식을 자극하므로써 피부 상처를 치료하는데 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 세포, 예를 들어 근육 세포 및 신경 조직, 전립선 세포 및 폐 세포 분화를 자극하는데 사용할 수도 있다.
아미노산 1 내지 36을 암호화하는 KGF-2의 신호 서열은 하이브리드화 및/또는 연산 조사 알고리듬에 의해 일반적으로 분비된 단백질을 동정하는데 사용할 수 있다.
KGF-2의 뉴클레오티드 서열은 하이브리드화에 의해 5' 서열을 분리하는데 사용할 수 있다. KGF-2 본연의 프로모터/인핸서 서열의 조절하에서 상기 KGF-2 유전자를 포함하는 플라즈미드는 KGF-2 유전자 발현의 내인성 세포 또는 비루스 트랜스활성화제의 동정을 목적으로 한 시험관내 연구에 사용된다.
또한, KGF-2 단백질은 KGF-2 수용체에 대해 작용하는 펩티도-모방체를 동정하기 위해 고안된 실험에서 양성 대조용으로 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 관점에 따라, 과학적 연구, DNA 합성, DNA 벡터의 제조를 위한 시험관내 목적 및 인간 질병의 진단과 치료를 위한 목적으로 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 이용 방법이 제공된다.
전장 KGF-2 유전자의 단편은 cDNA 라이브러리용 하이브리드화 프로브로 사용하여 이들 유전자의 매우 높은 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 보유하는 다른 유전자를 분리할 수 있다. 이러한 형태의 프로브는 일반적으로 20개 이상의 염기를 보유한다. 그러나, 상기 프로브는 30개 이상의 염기를 보유하는 것이 바람직하며, 일반적으로 50개를 초과하는 염기를 보유하지 않지만, 그들은 더 큰 수의 염기를 보유할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 조절 영역, 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 KGF-2 유전자를 함유하는 전장 전사체 및 게놈성 클론(들)에 상응하는 cDNA 클론을 동정하는데 사용할 수 있다. 스크린의 한 예는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하는 공지된 DNA 서열을 이용하여 KGF-2 유전자의 암호화 부위를 분리하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 보유하는 표지된 올리고뉴클레오티드는 인간 cDNA 라이브러리, 게놈 DNA 라이브러리 또는 mRNA 라이브러리를 스크린하는데 사용하여 상기 프로프가 하이브리드를 형성하는 라이브러리의 구성원을 결정할 수 있다.
본 발명은 KGF-2 폴리펩티드를 위한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 상기 수용체를 암호화하는 유전자는 당업자에게 공지된 여러 가지 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 분류에 의해 동정할 수 있다[참조: Coligan 등, Current Protocols in Immun., 1(2) Ch.5 (1991)]. 상기 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 폴리아데닐화된 RNA 를 제조하고, 이 RNA 로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 푸울(pool)로 분리하고, 상기 폴리펩티드에 비반응성인 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염하는데 사용하는 발현 클로닝을 이용하는 것이 바람직하다. 유리 슬라이드에서 성장하는 형질감염된 세포는 표지된 폴리펩티드에 노출시킨다. 상기 폴리펩티드는 요오드화 또는 위치 특이성 프로테인 키나아제를 위한 인식 위치의 삽입을 포함하는 여러 가지 수단으로 표지할 수 있다. 고정 및 항온처리후, 상기 슬라이드는 자동방사선 사진 분석법으로 분석한다. 양성 푸울을 동정하고, 서브-푸울을 제조하고, 반복적 서브-풀링 및 재스크리닝법을 이용하여 재형질감염시켜 추정적인 수용체를 암호화하는 단일 클론을 실질적으로 수득한다.
수용체 동정을 위한 대체법으로서, 표지된 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포 막 또는 추출 제조물과 결합된 광친화성일 수 있다. 가교된 물질은 PAGE 분석법에 의해 용해시키고, x-선 필름에 노출시킨다. 상기 폴리펩티드로 이루어진 수용체를 함유하는 표지된 복합체는 절단되고, 펩티드 단편으로 분해될 수 있으며, 단백질 미세서열결정을 수행할 수 있다. 미세서열결정에 의해 수득된 아미노산 서열은 추정적인 수용체를 암호화하는 유전자를 동정하기 위한 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위한 일군의 퇴화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 KGF-2의 작용을 상승시키거나, KGF-2의 기능을 차단하는 화합물을 동정하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법의 한 예로는 포유류 각질 세포, 스크린하려는 화합물 및3[H] 티미딘을 세포 배양 조건 하에서 연합하는 것을 포함하는데, 상기 각질 세포는 정상적으로 증식한다. 대조용 분석은 스크린하려는 화합물 부재하에서 수행할 수 있으며, 상기 화합물이 각질 세포의 증식을 자극하는지 여부를 결정하기 위한 화합물의 존재 하에서 각질 세포 증식량을 비교할 수 있다.
길항물질에 대해 스크린하기 위해서는, 동일한 분석물을 KGF-2의 존재하에서 제조할 수 있고, 각질 세포 증식을 예방할 수 있는 화합물의 능력을 측정하고, 길항물질 능력을 결정한다. 각질 세포 증식량은3[H] 티미딘의 혼입량을 측정하는 액체 섬광 크로마토그래피로 측정한다.
다른 방법에서, KGF-2를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제조물은 상기 화합물의 존재하에서 표지된 KGF-2 와 함께 항온처리한다. 이어서, 이러한 상호작용을 증강 또는 차단할 수 있는 상기 화합물의 능력을 측정한다. 대안으로, KGF-2와 수용체의 상호작용후 공지된 제 2 메신저 시스템의 반응을 측정하고, 상기 화합물의 존재 또는 부재시를 비교한다. 이러한 제 2 메신저 시스템은 cAMP 구아닐레이트 사이클라아제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
가능한 KGF-2 길항물질의 예로는 상기 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 몇몇 경우의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 대안으로, 가능한 KGF-2 길항물질은 KGF-2 수용체에 결합하는 KGF-2의 돌연변이 형태일 수 있으나, 제 2 메신저 반응은 유도되지 않았으며, 따라서 KGF-2의 작용은 효과적으로 차단된다.
다른 가능한 KGF-2 길항물질은 안티센스 기법을 이용하여 제조된 안티센스 구성물이다. 안티센스 기법은 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합에 기초한 삼중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조조절하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 암호화 부위는 길이가 약 10 내지 40개의 염기쌍으로 이루어진 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안하는데 사용할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자의 일정 부위에 상보적으로 고안하므로써[참조: triple-helix, Lee 등, Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney 등, Science, 241:456 (1988); 및 Dervan 등, Science, 251: 1360 (1991)], KGF-2의 전사 및 제조를 방해한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 하이브리드를 형성하고, mRNA 분자의 KGF-2 폴리펩티드로의 해독을 차단한다[참조: Antisense - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligonucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression; 미국, 플로리다, 보카 라톤에 소재하는 CRC 출판사 (1988)]. 또한, 상기한 올리고뉴클레오티드는 세포 내로 전달되어 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 KGF-2의 생성을 억제하도록 할 수 있다.
가능한 KGF-2 길항물질은 KGF-2 수용체의 결합 위치에 결합하고, 이를 점유하므로써 상기 수용체가 KGF-2에 접근할 수 없도록 하여 정상적인 생물학적 활성을 방해하는 소분자를 포함한다. 상기 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
KGF-2 길항물질은 종양에서 새로운 혈관 성장 또는 혈관 생성의 유도를 방해하는데 사용할 수 있다. 또한, KGF-2에 의해 자극된 혈관 생성은 본 발명의 길항물질에 의해 치료할 수 있는 몇몇 질병, 예를 들어 당뇨성 망막장애의 치료, 병리학적 조직 성장, 예를 들어 류마티스성 관절염의 억제에 기여한다.
또한, KGF-2 길항물질은 보우만 낭을 충전하는 세포성 물질을 형성하는 사구체 상피 세포의 현저한 증식을 특징으로 하는 사구체신염의 치료에 사용할 수 있다.
또한, 상기 길항물질은 수술후 해족종(keloid) 형성, 심근경색후 섬유증 또는 폐 섬유증과 재발협착증과 관련된 결합조직 장애에서 나타나는 상처 조직의 과생성을 억제하는데 사용할 수 있다. 또한, KGF-2 길항물질은 KGF-2에 의해 자극된 기타 증식성 질병, 예를 들어 암 및 카포시 육종을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
또한, KGF-2 길항물질은 상피 세포 증식을 특징으로 하는 포도막염을 동반하는 각막 심층의 만성 침윤인 각막염을 치료하는데 사용할 수 있다.
상기 길항물질은 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 본 명세서에서 기술한 담체와 함께 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 작용물질 및 길항물질은 적합한 약학적 담체와 병용하여 약학 조성물로 사용할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 치료 유효량의 폴리펩티드, 작용물질 또는 길항물질 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체로는 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로오스, 물, 에탄올 및 이의 배합물을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 투여 형태에 적합하여야 한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물로 이루어진 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)는 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 관할하는 정부기관에 의한 표식을 하여야 하며, 이 표식은 인간 투여를 위해 제조, 사용 또는 판매를 관할하는 정부기관의 승인을 의미하는 것이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 작용물질 또는 길항물질은 다른 치료 화합물과 연합 사용할 수 있다.
약학 조성물은 경구 투여, 국소 투여, 정맥내 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 비강내 투여 및 피부내 투여와 같은 용이한 방법으로 투여할 수 있다. 약학 조성물은 특정 질환의 치료 및/또는 예방에 유효한 양으로 투여한다. 일반적으로, 상기 약학 조성물은 약 10 ㎍/㎏ 체중 이상의 양으로 투여되며, 대부분의 경우 상기 투여량은 1일당 8 mg/kg 체중을 초과하지 않을 것이다. 대부분의 경우, 투여량은 투여 경로, 징후 등을 고려하여 1일당 약 10 ㎍/㎏ 내지 약 1 mg/kg 체중이다. 국소 투여의 경우, 투여량은 1 cm2당 약 0.1 ㎍ 내지 9 mg이 바람직하다.
또한, 폴리펩티드인 KGF-2 폴리펩티드, 작용물질 및 길항물질은 본 발명에 따라 종종 유전자 치료법으로 언급되는 상기 폴리펩티드의 생체내 발현에 사용할 수 있다.
따라서, 예를 들어 환자의 세포는 생체 외에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 이용하여 유전적으로 조작되고, 이어서 조작된 세포는 상기 폴리펩티드를 이용하여 치료할 환자에게 제공된다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로비루스 입자를 이용하고, 당업계에 공지된 절차에 의해 조작할 수 있다.
유사하게, 세포들은 예를 들어 당업계에 공지된 방법으로 생체내에서 폴리펩티드의 발현을 위해 생체내에서 조작할 수 있다. 당업계에 이미 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로비루스 입자를 생성하는 생성 세포는 생체 내에서 세포를 조작하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현하기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 투여하기 위한 이들 방법 및 기타 방법은 본 발명의 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 세포를 조작하는 발현 비히클은 레트로비루스 이외의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 비히클은 적합한 전달 비히클과 조합한 후 생체 내에서 세포를 조작하는데 사용할 수 있는 아데노비루스이다. 기타 전달 비히클의 예로는 아데노-관련 비루스 벡터 및 곤충 비히클, 예를 들어 덱스트란 피복된 페라이트 입자를 들 수 있다.
또한, 본 발명은 KGF-2 핵산 서열 내의 돌연변이의 존재에 관련된 질병 또는 상기 질병에 대한 감수성을 검출하기 위한 진단 분석의 일부분으로서 상기 KGF-2 유전자의 용도에 관한 것이다.
KGF-2 유전자에 돌연변이를 보유하는 개체는 여러 가지 기법을 이용하여 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 환자의 세포, 예를 들어 혈액, 뇨, 타액, 조직 생체 검사 및 부검 재료로부터 수득할 수 있다. 게놈 DNA 는 검출에 직접 사용하거나, 분석 이전에 PCR을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다[참조: Saiki 등, Nature, 324:163-166 (1986)]. 또한, RNA 또는 cDNA 도 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 한 예로서, KGF-2를 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머는 KGF-2 돌연변이를 동정 및 분석하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상적인 유전형과 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 방사능 표지된 KGF-2 RNA, 또는 대체물로 방사능 표지된 KGF-2 안티센스 DNA 서열에 증폭된 DNA를 하이브리드화시키므로써 검출할 수 있다. 완전히 짝을 이룬 서열들은 RNase A 분해 또는 용융 온도의 차이에 의해 짝을 이루지 않은 이중 서열과 구별할 수 있다.
DNA 서열 차이에 기초한 유전적 테스트는 변성제의 존재 또는 부재하에서 겔 내의 DNA 단편의 전기영동에서의 이동성의 검출 또는 변경에 의해 획득할 수 있다. 작은 서열 결실 및 삽입은 고 해상 겔 전기영동에 의해 시각화할 수 있다. 상이한 서열의 DNA 단편은 변성 포름아미드 구배 겔 상에서 구별할 수 있는데, 상이한 DNA 단편의 이동성은 그들의 특정 용융 온도 또는 부분 용융 온도에 따라 상기 겔 내의 상이한 위치에서 지연된다[참조: Myers 등, Science, 230:1242 (1985)].
또한, 특정 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 SI 보호와 같은 뉴클레아제 보호법 또는 화학적 절단법에 의해 확인할 수 있다[참조: Cotton 등, PNAS, USA, 85: 44397-4401 (1985)].
따라서, 특이성 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접적인 DNA 서열 결정 또는 제한 효소의 이용(예를 들어, 제한 단편 길이 다형성(RFLP)) 및 게놈 DNA의 서던 블로팅과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다.
더 통상적인 겔 전기영동 및 DNA 서열 결정이외에, 돌연변이는 동일계내 분석에 의해서도 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 여러 가지 조직에서 변경된 수준의 KGF-2 단백질을 검출하기 위한 진단 분석법을 제공하는데, 그 이유는 정상적인 대조용 조직 샘플에 비해 상기 단백질의 과발현이 질병, 예를 들어 종양 또는 상기 질병에 대한 감수성의 존재를 검출할 수 있기 때문이다. 숙주로부터 유래한 샘플 내에서 KGF-2 단백질의 수준을 검출하기 위해 사용되는 분석법은 당업계에 공지되어 있으며, 방사성면역분석법, 경쟁적-결합 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, ELISA 분석법 및 샌드위치 분석법을 포함한다. ELISA 분석법[참조: Coligan 등, Current Protocols in Immunology, 1(2), Ch. 6 (1991)]은 초기에 KGF-2 항원에 특이적인 항체, 바람직하게는 단일클론 항체를 제조하는 단계를 포함한다. 또한, 리포터 항체가 상기 단일클론 항체에 대해 제조된다. 본 예에서, 상기 리포터 항체에는 방사능, 형광 또는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 효소와 같은 검출가능한 시약을 부착한다. 숙주로부터 샘플을 제거하고, 이를 상기 샘플 내에서 상기 단백질을 결합하는 고체 지지체, 예를 들어 폴리스티렌 접시 상에서 항온처리한다. 이어서, 상기 접시 상의 임의의 유리 단백질 결합 위치를 소 혈청 알부민과 같은 비특이성 단백질과 함께 항온처리하여 상기 단백질 결합 위치를 피복한다. 이어서, 단일클론 항체를 상기 접시 내에서 상기 단일클론 항체가 상기 폴리스티렌 접시에 부착된 임의의 KGF-2 단백질에 부착하는 시간 동안 항온처리한다. 호스 래디쉬 퍼옥시다아제에 결합된 리포터 항체는 상기 접시 내에 위치시켜 리포터 항체가 KGF-2에 결합된 임의의 단일클론 항체에 결합되도록 한다. 그후, 미부착된 리포터 항체는 세척해버린다. 이어서, 퍼옥시다아제 기질을 상기 접시에 첨가하고, 소정의 시간 내에 현상되는 색의 양은 표준 곡선에 대해 비교하는 경우, 소정 부피의 환자 샘플내에 존재하는 KGF-2 단백질 양의 측정치이다.
경쟁 분석을 사용할 수도 있는데, 여기서 KGF-2에 특이성인 항체는 고체 지지체에 부착되고, 표지된 KGF-2 및 숙주로부터 유래한 샘플은 고형 지지체를 그냥 통과하고, 예를 들어 액체 섬광 크로마토그래피로 검출된 표지의 양은 상기 샘플 내의 KGF-2의 양과 관계가 있을 수 있다.
샌드위치 분석법은 ELISA 분석법과 유사하다. 샌드위치 분석법에서, KGF-2는 고형 지지체를 그냥 통과하고, 고체 지지체에 부착된 항체에 결합한다. 이어서, 제 2 항체는 상기 KGF-2에 결합한다. 표지되고, 제 2 항체에 특이적인 제 3 항체는 고형 지지체를 그냥 통과하고, 제 2 항체에 결합하며, 그 양은 정량화할 수 있다.
또한, 본 발명의 서열은 염색체 동정에 사용할 수 있다. 상기 서열은 개개의 인간 염색체의 특정 위치에 특이적으로 표적화하고, 그 특정 위치에 하이브리드화할 수 있다. 또한, 염색체상의 특정 위치를 동정하고자 하는 요구도 존재한다. 염색체 위치를 표식하기 위한 현재 시판되는 실질적인 서열 데이터(반복 다형상)에 기초한 염색체 표식 시약은 거의 없다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 DNAs의 지도화는 질병과 관련된 유전자와 이들 서열 간의 상관관계에서 중요한 첫 번째 단계이다.
개략적으로, 서열은 cDNA로부터 유래한 PCR 프라이머(12 내지 25 bp가 바람직함)를 제조하므로써 염색체에 대한 지도화가 가능하다. 3' 비해독된 부위의 컴퓨터 분석은 게놈 DNA 내에서 하나 이상의 엑손에 걸치지 않는 프라이머를 용이하게 선택하기 위해 사용되는데, 이로써 증폭 과정이 복잡하게 된다. 이어서, 이들 프라이머는 개별적인 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝을 위해 사용된다. 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 이들 하이브리드만이 증폭된 단편을 생성할 것이다.
체세포 하이브리드의 PCR 지도화는 특정 DNA를 특정 염색체에 할당하기 위한 신속한 과정이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 본 발명을 이용하여, 하부편재화는 특이성 염색체 또는 유사한 방식으로 큰 게놈성 클론의 푸울로부터 유래한 단편의 패널로 획득할 수 있다. 염색체를 지도화하기 위해 유사하게 사용할 수 있는 기타 지도화 방법은 동일계내 하이브리드화, 표지된 유동-분리된 염색체를 이용하는 예비스크리닝 및 염색체 특이성-cDNA 라이브러리를 구성하는 하이브리드화에 의한 예비선택을 포함한다.
돌연변이 염색체 스프레드에 대한 cDNA의 동일계내 형광 하이브리드화(FISH)를 사용하여 단일 단계로 정확한 염색체 위치를 제공할 수 있다. 이 기법은 500 또는 600개의 염기인 cDNA와 함께 사용할 수 있으나, 2000 bp 이상의 클론은 단순한 검출을 위해 충분한 신호 세기를 가진 독특한 염색체 위치에 더 높은 친화성으로 결합할 것이다. FISH는 EST가 유도되는 클론을 필요로 하며, 길수록 더 양호하다. 예를 들어, 2,000 bp가 양호하며, 4,000 bp가 더 양호하며, 시간 비율에 적합한 양호한 결과를 수득하기 위해 4,000 이상은 불필요하다. 상기 기법에 대해서는 문헌[참조: Verma 등, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, 뉴욕의 페르가몬 출판사 (1988)]을 참고할 것.
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 대해 지도화되면, 염색체 상에서 상기 서열의 물리적인 위치는 유전 지도 데이터와 관련이 있을 수 있다. 이러한 데이터는 예를 들어, 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(존스 홉킨스 유니버시티 웰치 메티칼 라이브러리를 통해 온라인으로 이용가능함)]에서 확인할 수 있다. 그후, 동일한 염색체 부위에 지도화된 유전자와 질병간의 관계는 결합 분석을 통해 확인할 수 있다(물리적으로 인접한 유전자의 동시유전).
이어서, 영향받은 개체와 영향받지 않은 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 결정하는 것이 필요하다. 임의의 정상적인 개체를 제외하고, 영향받은 몇몇 개체 또는 모든 개체에서 돌연변이가 관찰되는 경우, 상기 돌연변이는 질병의 원인이 될 것이다.
현재의 물리적인 지도화 및 유전 지도화 기법의 분석에 따라, 질병에 관련된 염색체 부위에 정확하게 편재화된 cDNA 는 50 내지 500의 가능한 원인중 하나일 수 있다. (이는 1 메가베이스 지도화 분석 및 20 kb 당 한 유전자로 추정된다).
폴리펩티드, 그들의 단편 또는 이의 기타 유도체 또는 유사체, 또는 이들을 발현하는 세포는 이들에 대한 항체 생성을 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 이들 항체는 예를 들어, 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 키메라 쇄, 단일 쇄 및 인간화된 항체 뿐만 아니라 Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용하여 이러한 항체 및 단편을 생성할 수 있다.
본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 동물에게 상기 폴리펩티드를 직접 주입하거나, 동물, 바람직하게는 인간을 제외한 동물에게 상기 폴리펩티드를 투여하므로써 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 항체는 상기 폴리펩티드 자체를 결합할 것이다. 이 방식으로, 상기 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열도 전체적인 천연 폴리펩티드를 결합하는 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 이어서 상기 항체들을 이용하여 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 상기 폴리펩티드를 분리할 수 있다.
단일클론 항체의 제조에 있어서, 연속 세포주 배양에 의해 생성되는 항체를 제공하는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 그 예로는 하이브리도마 기법[참조: Kohler 및 Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)], 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법[참조: Kozbor 등, Immunology Today 4:72 (1983)] 및 인간 단일클론 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기법[참조: Cole 등, in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]을 들 수 있다.
단일 쇄 항체의 제조를 위해 기재된 기법(미국 특허 제 4,946,778 호)을 적용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 단일 쇄 항체를 제조할 수 있다. 또한, 돌연변이 생쥐를 이용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 인간화된 항체를 발현할 수 있다.
본 발명은 참고로 기재한 하기 실시예에 의해 추가 기술될 것이나, 본 발명이 기재된 실시예로 제한되는 것은 아니다. 모든 부 또는 양은 특별한 언급이 없는 한 중량을 기준한 것이다.
하기 실시예를 용이하게 이해하기 위해서, 빈번히 사용되는 방법 및/또는 용어에 대한 설명을 기술한다.
플라즈미드는 선행하거고/하는 소문자 p와 문자 및/또는 숫자로 표시한다. 본 명세서에서 출발 플라즈미드는 시판되거나, 아무런 제한없이 입수 용이한 것이며, 시판되는 플라즈미드로부터 이미 공지된 방법으로 구성할 수 있다. 또한, 기재된 플라즈미드와 등가의 플라즈미드도 당업계에 공지되어 있으며, 당업자에게는 명백할 것이다.
DNA의 분해라 함은 상기 DNA의 특정 서열에만 작용하는 제한 효소를 이용하는 DNA의 촉매적 절단을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 여러 가지 제한 효소는 시판되고 있으며, 이들의 반응 조건, 보조 인자 및 기타 요구조건들은 당업자에게 공지되어 있다. 분석하기 위해서는 전형적으로 1 ㎍의 플라즈미즈 또는 DNA 단편이 약 2 유니트의 효소와 함께 약 20 ㎕의 완충 용액내에서 사용된다. 플라즈미드 구성을 위한 DNA 단편의 분리를 위해서는, 전형적으로 DNA 5 내지 50 ㎍을 다량의 부피 내에서 20 내지 250 유니트의 효소로 분해한다. 특정 제한 효소를 위해 적합한 완충액 및 기질량은 제조자에 의해 언급된다. 37℃에서 약 1 시간의 배양 시간이 일반적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 변할 수 있다. 분해후, 반응을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동하여 목적 단편을 분리한다.
절단된 단편의 크기 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. 등, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)]에 기재된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 수행한다.
올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성할 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 두 개의 상보적인 폴리데옥시뉴클레오티드 스트랜드를 의미한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 포스페이트가 없으며, 따라서 키나아제 존재 하에서 ATP의 첨가와 같이 추가의 포스페이트를 첨가하지 않는 한 다른 올리고뉴클레오티드에 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화되지 않은 단편에 연결될 것이다.
연결(ligation)은 두 개의 이본쇄 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다[참조: Maniatis, T. 등, Id., p. 146]. 특별한 언급이 없으면, 연결은 공지된 완충액 및 조건 하에서 연결하려는 약 동량의 DNA 단편 0.5 ㎍ 당 T4 DNA 리가아제(리가아제) 10 유니트를 이용하여 수행된다.
세포는 외인성 DNA 가 세포 막 내에 도입되는 경우, 상기 외인성 DNA에 의해 형질전환된다. 외인성 DNA는 상기 세포의 게놈 DNA를 제조하는 염색체 DNA 내로 통합(공유적으로 결합)될 수도 있고, 통합되지 않을 수도 있다. 예를 들어, 원핵 세포 및 효모에서, 외인성 DNA 는 플라즈미드와 같은 에피좀의 요소상에 유지될 수 있다. 진핵 세포에서, 안정하게 형질전환된 또는 형질감염된 세포는 외인성 DNA 가 염색체 내로 통합되어 외인성 DNA가 염색체 복제를 통해 딸 세포로 유전되는 세포이다. 이러한 능력은 외인성 DNA를 함유하는 딸 세포의 군집으로 이루어지는 세포주 또는 클론을 형성할 수 있는 진핵 세포의 능력에 의해 입증된다. 형질전환의 한 예로는 문헌[참조: Graham, F. 및 Van der Eb, A., Virology, 52: 456-457 (1973)]을 참조할 것.
형질도입 또는 형질도입된은 세포가 외래 DNA를 취하고, 이 외래 DNA를 그들의 염색체 내로 통합하는 과정을 의미한다. 예를 들어, 형질도입은 형질감염에 의해 이루어질 수 있는데, 상기 형질감염은 세포가 DNA를 취하거나, DNA를 세포에 전이시키는데 사용되는 비루스에 의해 세포가 감염되게 하는 여러 가지 기법을 의미한다.
실시예 1
KGF-2의 박테리아 발현 및 정제
KGF-2를 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 75977)은 프로세싱된 KGF-2 cDNA(신호 펩티드 서열을 포함함)의 5' 및 3' 단부 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 초기 증폭시켰다. 상기 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5' CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC 3'(서열 번호 3)이며, Afl III 제한 효소 위치 및 그 뒤에 예정된 개시 코돈으로부터 출발하는 KGF-2 암호화 서열의 30개의 뉴클레오티드를 포함하고 있다. 3' 서열은 5' CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTCTATGAG 3'(서열 번호 4)이며, Hind III 위치에 상보적인 서열을 함유하며, 그 뒤에 KGF-2의 26개의 뉴클레오티드를 함유한다. 제한 효소 위치는 박테리아 발현 벡터인 pQE-60(미국, 캘리포니아 캐츠워드에 소재하는 퀴아젠 인코오포레이티드) 상의 제한 효소 위치와 상용성이었다. pQE-60은 항생제 내성(Ampr), 박테리아 복제 원점(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 위치(RBS), 6-His 태그 및 제한효소 위치를 암호화한다. 이어서, pQE-60은 NcoI 및 HindIII로 분해하였다. 증폭된 서열은 pQE-60내로 연결하였으며, 프레임 내에 삽입하였다. 이어서, 상기 연결 혼합물을 이용하고, 문헌[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 뉴욕의 콜드 스프링 하버 출판사 (1989)]에 기재된 방법을 이용하여 이.콜리 균주 M15/rep4(퀴아젠, 인코오포레이티드)를 형질전환하였다. M15/rep4 는 lacI 억제제를 발현하며, 카나마이신 내성(Kanr)을 부여하는 플라즈미드 pREP4의 다수의 사본을 함유하였다. 형질전환체는 LB 평판 상에서 성장할 수 있는 그들의 능력에 의해 동정하고, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 플라즈미드 DNA는 분리하고, 제한 분석으로 확인하였다. 목적하는 구성물을 보유하는 클론은 Amp(100 ㎍/㎖) 및 Kan(25 ㎍/㎖)이 보충된 LB 배지 내에서 하룻밤(O/N) 액체 배양하였다. 하룻밤 배양한 배양물을 이용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 큰 배양액을 접종하였다. 상기 세포를 광학 밀도 600(O.D.600) 값이 0.4 내지 0.6이 될때까지 성장시켰다. 이어서, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드)을 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. IPTG는 lacI 억제제를 불활성화시키고, 증가된 유전자 발현을 유도하는 P/O 를 제거하므로써 유도하였다. 세포는 추가 3 내지 4 시간 동안 성장시켰다. 이어서, 원심분리하여 세포를 수확하였다. 세포 펠렛은 카오트로픽 제제인 6 M 구아니딘 HCl 내에서 용해하였다. 투명하게 한 후, 용해된 KGF-2는 상기 용액을 상기 단백질의 견고한 결합을 가능하게 하는 조건 하에서 헤파린 친화성 칼럼 상에서 크로마토그래피하여 정제하였다[참조: Hochuli, E.등, J. Chromatography 411: 177-184 (1984)]. KGF-2(순도 75%)는 고염 완충액을 이용하여 상기 칼럼으로부터 용출하였다.
실시예 2
단부가 제거된 KGF-2의 박테리아 발현 및 정제
KGF-2를 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 75977)은 프로세싱된 KGF-2 cDNA(시혼 펩티드 서열을 포함함)의 5' 및 3' 단부 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 초기 증폭시켰다. 단부가 제거된 버전은 36 아미노산의 신호 서열이 제거된 폴리펩티드를 포함하며, 전장 단백질의 37번 아미노산을 포함하는 시스테인 잔기 직전에 첨가되는 메티오닌 및 알라닌 잔기를 보유한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5' CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTC AGGACATG 3'(서열 번호 5)이며, NcoI 제한효소 위치 및 그 뒤에 KGF-2 암호화 서열의 24개의 뉴클레오티드를 함유하고 있다. 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 5' CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3'(서열 번호 6)이며, HindIII 위치에 상보적인 서열 및 그 뒤에 KGF-2 유전자의 26개의 뉴클레오티드를 함유한다. 제한 효소 위치는 박테리아 발현 벡터인 pQE-60(미국, 캘리포니아 캐츠워드에 소재하는 퀴아젠 인코오포레이티드) 상의 제한 효소 위치와 상용성이었다. pQE-60은 항생제 내성(Ampr), 박테리아 복제 원점(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 위치(RBS), 6-His 태그 및 제한효소 위치를 암호화한다. 이어서, pQE-60은 NcoI 및 HindIII로 분해하였다. 증폭된 서열은 pQE-60내로 연결하였으며, 프레임 내에 삽입하였다. 이어서, 상기 연결 혼합물을 이용하고, 문헌[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 뉴욕의 콜드 스프링 하버 출판사 (1989)]에 기재된 방법을 이용하여 이.콜리 균주 M15/rep4(퀴아젠, 인코오포레이티드)를 형질전환하였다. M15/rep4 는 lacI 억제제를 발현하며, 카나마이신 내성(Kanr)을 부여하는 플라즈미드 pREP4의 다수의 사본을 함유하였다. 형질전환체는 LB 평판 상에서 성장할 수 있는 그들의 능력에 의해 동정하고, 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택하였다. 플라즈미드 DNA는 분리하고, 제한 분석으로 확인하였다. 목적하는 구성물을 보유하는 클론은 Amp(100 ㎍/㎖) 및 Kan(25 ㎍/㎖)이 보충된 LB 배지 내에서 하룻밤(O/N) 액체 배양하였다. 하룻밤 배양한 배양물을 이용하여 1:100 내지 1:250의 비율로 큰 배양액을 접종하였다. 상기 세포를 광학 밀도 600(O.D.600) 값이 0.4 내지 0.6으로 성장시켰다. 이어서, IPTG(이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드)을 최종 농도 1 mM로 첨가하였다. IPTG는 lacI 억제제를 불활성화시키고, 증가된 유전자 발현을 유도하는 P/O 를 제거하므로써 유도하였다. 세포는 추가 3 내지 4 시간 동안 성장시켰다. 이어서, 원심분리하여 세포를 수확하였다. 세포 펠렛은 카오트로픽 제제인 6 M 구아니딘 HCl 내에서 용해하였다. 투명하게 한 후, 용해된 KGF-2는 상기 용액을 상기 단백질의 견고한 결합을 가능하게 하는 조건 하에서 헤파린 친화성 칼럼 상에서 크로마토그래피하여 정제하였다[참조: Hochuli, E.등, J. Chromatography 411: 177-184 (1984)]. KGF-2 단백질은 고염 완충액을 이용하여 상기 칼럼으로부터 용출하였다.
실시예 3
바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 KGF-2의 클로닝 및 발현
전장 KGF-2 단백질을 암호화하는 DNA 서열(ATCC # 75977)은 상기 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
5' 프라이머의 서열은 5' GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC 3'(서열 번호 7)이며, BamHI 제한 효소 위치(굵은 문자) 및 그 뒤로 진핵 세포에서 해독 개시를 위해 필수적인 신호를 모방하는 6개의 뉴클레오티드[참조: Kozak, M., J. Mol. Biol., 196: 947-950 (1987)] 및 KGF-2 유전자의 바로 뒤의 최초 17개의 뉴클레오티드를 함유하고 있다(해독 개시 코돈인 ATG 는 밑줄로 나타냄).
3' 프라이머의 서열은 5' GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT 3'(서열 번호 8)이며, 제한 엔도뉴클레아제 Asp718을 위한 절단 위치 및 KGF-2 유전자의 3' 비해독 서열과 상보적인 19개의 뉴클레오티드를 포함하고 있다. 증폭된 서열은 미국, 캘리포니아, 캐츠워드에 소재하는 퀴아젠, 인코오포레이티드로부터 시판되는 키트를 이용하여 1% 아가로오즈 겔로부터 분리하였다. 이어서, 상기 단편은 엔도뉴클레아제인 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 다시 1% 아가로오즈 겔 상에서 정제하였다. 이 단편은 F2라 명명하였다.
벡터 pA2(하기하는 바와 같이 pVL941 벡터의 변형 벡터)는 바쿨로비루스 발현 시스템을 이용하는 KGF-2의 발현에 사용하였다[참조: Summers, M.D. 및 Smith, G.E. 1967, A Manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, 텍사스 농업 실험국 회보 1555]. 이 발현 벡터는 오토그라파 칼리포르니카 핵 다한증 비루스(AcMNPV)의 강한 폴리히드린 프로모터 및 이어서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718을 위한 제한 위치를 포함하고 있다. 시미안 비루스(SV) 40의 폴리아데닐화 위치는 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용하였다. 재조합 비루스의 용이한 선택을 위해, 이.콜리로부터 베타-갈락토시다아제 유전자를 폴리헤드린 프로모터와 동일한 배향으로 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 신호가 이어지도록 삽입하였다. 폴리헤드린 서열은 동시 형질감염된 야생형 비루스 DNA의 세포-개재된 동족 재조합을 위해 양 측면에서 비루스 서열과 인접하였다. 다수의 다른 바쿨로비루스 벡터가 pRG1 대신에 사용될 수 있는데, 그 예로는 pAc373, pVL941 및 pAcIM1을 들 수 있다[참조: Luckow, V.A. 및 Summers, M.D., Virology, 170:31-39].
상기 플라즈미드는 제한 효소 BamHI 및 Asp718로 분해하였다. 이어서, 상기 DNA는 시판되는 키트(퀴아젠, 인코오포레이티드)를 이용하여 1% 아가로오즈 겔로부터 분리하였다. 상기 벡터 DNA는 V2로 명명하였다.
단편 F2 및 플라즈미드 V2는 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결하였다. 이어서, 이.콜리 HB101 세포를 형질전화하고, 클로닝 올리고뉴클레오티드 둘 다를 사용하는 PCR을 이용하여 KGF-2 유전자와 함께 상기 플라즈미드(pBacKGF-2)를 함유하는 박테리아를 동정하였다. 클론된 단편의 서열은 DNA 서열 결정법으로 확인하였다.
상기 플라즈미드 pBacKGF-2 5 ㎍은 리포펙션법[참조: Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)]을 이용하여 시판되는 선형화된 바쿨로비루스(바쿨로골드(등록상표) 바쿨로비루스 DNA, 미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 파밍겐으로부터 시판됨) 1.0 ㎍으로 동시에 형질감염하였다.
바쿨로골드 비루스 DNA 1 ㎍ 및 플라즈미드 pBacKGF-2 5 ㎍을 무혈청 그레이스 배지(미국, 메릴랜드, 게테스베르그에 소재하는 라이프 테크놀로지즈 인코오포레이티드에서 시판됨) 50 ㎕를 함유하는 미량역가 평판의 멸균된 웰 내에서 혼합하였다. 이어서, 리포펙틴 10 ㎕ 및 그레이스 배지 90 ㎕를 첨가하고, 혼합하고, 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 상기 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지 1 ㎖를 함유하는 35 mm 조직 배양 평판에 접종한 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하였다. 상기 평판을 전후로 흔들어 새로이 첨가된 용액을 혼합하였다. 이어서, 상기 평판을 27℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 5 시간 후, 상기 형질감염 용액을 상기 평판으로부터 제거하고, 10% 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 상기 평판을 항혼처리기 내에 위치시키고, 27℃에서 4일 동안 항온처리를 계속하였다.
4일후, 상청액을 수거하고, Summers와 Smith의 문헌(상기 참조)에 기재된 방법과 유사한 방법으로 플라크 분석법을 수행하였다. 블루 갈(미국, 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스 인코오포레이티드에서 시판됨)로 변형한 아가로오즈 겔을 이용하여 청색으로 염색된 플라크를 더 용이하게 분리하였다.(플라크 분석법에 대한 더 자세한 설명은 라이프 테크놀로지스 인코오포레이티드에서 배포되는 곤충 세포 배양 및 바쿨로비루스학을 위한 사용자 가이드북 9 내지 10면에 기재되어 있다).
일련의 희석을 수행한후 4일이 경과한 다음, 상기 비루스는 상기 세포에 첨가하고, 청색으로 염색된 플라크는 레펜도르프 피펫의 팁으로 채취하였다. 이어서 재조합 비루스를 함유하고 있는 한천은 그레이스 배지 200 ㎕를 함유하고 있는 에펜도르프 튜브에 재현탁시켰다. 상기 한천은 간단한 원심분리로 제거하고, 재조합 바쿨로비루스를 함유하고 있는 상청액은 35 mm 접시내에 접종된 Sf9 세포를 감염하는데 사용하였다. 4일후, 이들 배양 접시의 상청액을 수거하고, 4℃에서 저장하였다.
Sf9 세포는 10%의 열 불활성화된 FBS 가 보충된 그레이스 배지 내에서 성장시켰다. 상기 세포는 감염 다중도(MOI) 2로 재조합 바쿨로비루스 V-KGF-2를 이용하여 감염시켰다. 6 시간후, 상기 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인이 없는 SF900 II 배지(라이프 테크놀로지스 인코오포레이티드)로 대체하였다. 42 시간후,35S-메티오닌 5 μCi 및35S-시스테인 5 μCi(아메르샴)을 첨가하였다. 상기 세포는 16 시간 동안 추가 배양하고, 이어서 원심분리로 수거하고, 표지된 단백질은 SDS-PAGE 및 자동방사능사진법으로 시각화하였다.
실시예 4
COS 세포 내에서 재조합 KGF-2의 발현
플라즈미드 KGF-2 HA의 발현은 1) SV40 복제 원점, 2) 앰피실린 내성 유전자, 3) 이.콜리 복제 원점, 4) 폴리링커 부위를 수반하는 CMV 프로모터, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 위치를 포함하는 벡터 pcDNAI/Amp(인비트로겐)으로부터 유도하였다. 전체 KGF-2 전구물질을 암호화하는 DNA 단편 및 틀 내에서 그의 3' 단부에 융합된 HA 태그는 상기 벡터의 폴리링커 부위로 클론하였다. 따라서, 재조합 단백질 발현은 CMV 프로모터 하에서 유도되었다. HA 태그는 이미 기술한 바와 같이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하였다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly 및 R. Lerner, Cell 37: 767 (1984)]. 표적 단백질에 대한 HA 태그의 융합은 상기 HA 에피토프를 인지하는 항체를 이용하는 재조합 단백질의 용이한 검출을 가능하게 한다.
플라즈미드 구성법은 하기하는 바와 같다:
KGF-2를 암호화하는 DNA 서열(ATCC #75977)은 두 개의 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 구성하였다. 5' 프라이머의 서열은 5' CCCAAGCTTATGTGGAAATG GATACTGACACATTGTGCC 3'(서열 번호 9)이며, HindIII 위치 및 이어서 개시 코돈으로부터 시작하는 KGF-2 암호화 서열의 30개 뉴클레오티드를 포함하며; 3' 프라이머의 서열은 5' TGCTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATGAGTGTACCACCATTGGA AGAAAGTGAGG 3'(서열 번호 10)이며, XbaI에 상보적인 서열, 해독 종결 코돈, HA 태그 및 KGF-2 암호화 서열의 최종 32개의 뉴클레오티드(종결 코돈은 포함하지 않음)를 포함하고 있다. 따라서, PCR 생성물은 HindIII 위치, KGF-2 암호화 서열, 이어서 프레임 내에서 융합된 HA 태그, HA 태그 다음의 해독 정지 종결 코돈 및 KbaI 위치를 함유하고 있다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터인 pcDNAI/Amp는 제한 효소인 HindIII 및 XbaI 으로 분해하고 연결하였다. 연결 혼합물은 이.콜리 균주 XL1 블루(미국, 캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 스트라타젠 클로닝 시스템스) 내로 형질전화하고, 상기 형질전환된 배양물은 앰피실린 배지 평판 상에 위치시키고, 내성 콜로니를 선택하였다. 플라즈미드 DNA는 형질전환체로부터 분리하였으며, 올바른 단편의 존재에 대해 PCR 및 제한 분석에 의해 조사하였다. 재조합 KGF-2의 발현을 위해, COS 세포는 DEAE-덱스트란법[참조: J. Sambrook, E, Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, 뉴욕의 콜드 스프링 하버 출판사 (1989)]에 의해 발현 벡터를 이용하여 형질감염하였다. KGF-2 HA 단백질의 발현은 방사능표지 및 면역침전법[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 뉴욕의 콜드 스프링 하버 출판사 (1988)]에 의해 검출하였다. 세포는 형질감염하고, 2일이 경과한후,35S-시스테인을 이용하여 8 시간 동안 표지하였다. 이어서, 배양 배지를 수거하고, 세포는 세정제(RIPA 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM 트리스, pH 7.5)를 이용하여 용균시켰다[참조: Wilson, I. 등, Id. 37:767 (1984)]. 세포 용균물 및 배양 배지는 HA 특이성 단일 클론 항체를 이용하여 침전시켰다. 침전된 단백질은 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다.
실시예 5
시험관 내에서 재조합 KGF-2의 전사 및 해독
PCR 생성물은 KGF-2의 곤충 세포 발현을 위해 사용한 pA2 벡터 내에서 클론된 cDNA로부터 유도하였다. 상기 PCR을 위해 하기 하는 프라이머를 사용하였다:
5' ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC 3'(서열 번호 11) 및 5' CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3'(서열 번호 12).
첫 번째 프라이머는 T3 프로모터 5' 서열 내지 ATG 개시 코돈을 포함하고 있다. 두 번째 프라이머는 KGF-2 개방 해독틀의 3' 단부에 상보적이며, 종결 코돈의 역 보체를 암호화한다.
생성되는 PCR 생성물은 퀴아젠에서 시판되는 키트를 이용하여 정제하였다. 이 DNA 0.5 ㎍을 주형으로 이용하여 시험관내 전사-해독 반응을 수행하였다. 상기 반응은 TNT로 프로메가에서 시판되는 키트를 이용하여 수행하였다. 상기 분석법은 기재로서 방사능 표지된 메티오닌을 이용하는, 상기 키트의 사용법에 기재된 바와 같이 수행하였으나, 제시된 시약 부피의 단지 1/2만을 사용하였으며, 반응은 33℃에서 1.5 시간 동안 수행하였다.
상기 반응물 5 ㎕를 10 내지 15% 폴리아크릴아미드 변성 겔 상에서 전기영동적으로 분리하였다. 상기 겔은 물:메탄올:아세트산의 부피비가 6:3:1인 혼합물 내에서 30분 동안 고정하였다. 이어서, 상기 겔을 열 및 진공하에서 건조하고, 후속하여 X-선 필름에 16 시간 동안 노출시켰다. 상기 필름을 현상하여 개념적으로 해독된 KGF-2에 상응하는 크기의 방사성 단백질 밴드의 존재를 확인하였으며, 이는 KGF-2를 위해 클론된 cDNA 가 예상 크기의 단백질을 암호화하는 개방 해독틀을 보유하고 있음을 강하게 암시하는 것이다.
지금까지 본 명세서의 기재를 통해 첨부하는 본 발명의 특허 청구의 범위내에서 본 발명의 변형 실시가 가능할 것이며, 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 기재된 것과는 다르게 실시될 수도 있다.
서 열 목 록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 그루버 등
(ii) 발명의 명칭 : 각질세포 성장 인자-2
(iii) 서열의 수 : 12
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인 : 카렐라, 바이른, 베인, 길필란, 세크히, 스튜워트 앤 올스테인
(B) 스트리트 : 베커 팜 로드 6
(C) 도시 : 로즈랜드
(D) 주 : 뉴저지
(E) 국가 : 미국
(F) ZIP : 07068
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 3.5 인치 디스켓
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 작동 체계 : MS-DOS
(D) 소프트웨어 : WORD PERFECT 5.1
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원 일자 :
(C) 분류 기호:
(vii) 종래 출원 데이터:
(A) 출원 번호 :
(B) 출원 일자 :
(viii) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 그레고리 디. 페라로
(B) 등록번호 : 36,134
(C) 참조번호 : 325800-261
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화 : 201-994-1700
(B) 팩스 : 201-994-1744
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 627 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 208 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 :
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 35 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 35 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 35 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 26 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 8:
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 39 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 9:
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 69 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 10:
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 54 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 11:
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 35 염기
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 : 서열 번호 12:
Claims (25)
- (a) 서열 번호 2의 추론된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 단편, 유사체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는(b) ATCC 수탁번호 75977에 함유된 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 단편, 유사체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA인 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 인 폴리뉴클레오티드.
- 제 2 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 2의 추론된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 2 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 ATCC 수탁번호 75977의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서, 서열 번호 1에 나타낸 암호화 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 2 항에 있어서, ATCC 수탁번호 75977로 기탁된 폴리펩티드의 암호화 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 2 항의 DNA를 함유하는 벡터.
- 제 9 항의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된 숙주 세포.
- 제 10 항의 숙주 세포로부터 상기 DNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
- 제 9 항의 벡터를 이용하여 세포를 유전적으로 조작하는 것을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 제조하는 방법.
- 제 2 항의 DNA에 하이브리드화할 수 있고, KGF-2 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 DNA.
- (i) 서열 번호 2의 추론된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 및 이의 단편, 유사체 및 유도체; 및(ii) ATCC 수탁번호 75977의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 및 이의 단편, 유사체 및 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
- 제 14 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 2의 추론된 아미노산 서열을 보유하는 KGF-2인 폴리펩티드.
- 제 14 항의 폴리펩티드에 대한 항체.
- 제 14 항의 폴리펩티드에 대한 작용물질로서 유용한 화합물.
- 제 14 항의 폴리펩티드에 대한 길항물질로서 유용한 화합물.
- 제 14 항의 폴리펩티드의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 KGF-2를 필요로하는 환자의 치료 방법.
- 제 18 항의 화합물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 KGF-2를 억제시킬 필요가 있는 환자를 치료하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 치료 유효량이 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 폴리펩티드를 발현하는 DNA를 환자에게 제공하므로써 투여되는 방법.
- (a) 세포가 KGF-2에 의해 정상적으로 자극되는 조건 하에서 세포가 증식함에 따라 상기 세포내로 혼입되는 표지를 함유하는 반응 혼합물과 스크린하려는 화합물을 배합하는 단계;(b) 상기 화합물이 효과적인 길항물질인지의 여부를 확인하기 위해 상기 세포의 증식 정도를 결정하는 단계를 포함하는 KGF-2에 대한 작용물질로서 작용하는 화합물을 동정하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 KGF-2가 상기 단계 (a)의 배합물에 첨가되는 KGF-2에 대한 길항물질로서 작용하는 화합물을 동정하는 방법.
- (a) 숙주로부터 유래한 샘플로부터 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 분리하는 단계;(b) 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 내에서 돌연변이를 결정하는 단계를 포함하는 제 14 항의 폴리펩티드의 불충분한 발현에 관련된 질병 또는 상기 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
- 숙주로부터 유래한 샘플 내에서 제 14 항의 폴리펩티드의 존재를 분석하는 것을 포함하는 진단 방법.
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