CN1958794A

CN1958794A - 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA及制备方法和应用

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Publication number: CN1958794A
Application number: CN 200510021996
Authority: CN
Inventors: 陈守春; 陈毅荣; 徐琦; 刘玉应; 高小平; 刘忠荣; 李伯刚
Original assignee: Chengdu Diao Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Chengdu Diao Jiuhong Pharmaceutical Factory
Priority date: 2005-11-03
Filing date: 2005-11-03
Publication date: 2007-05-09
Anticipated expiration: 2025-11-03
Also published as: CN1958794B

Abstract

本发明在现有技术的基础上，提供了重新设计的重组人TRAIL突变体多肽编码cDNA。将本发明重组人TRAIL突变体多肽编码cDNA构建成表达载体并转入常用的宿主细胞尤其是原核细胞中制备重组人TRAIL突变体多肽时，在比现有技术获得更高的表达效率的同时还能提高可溶性表达的比例，制备得到的重组人TRAIL突变体多肽的活性也大大高于现有技术。本发明克服了现有技术产率低、生产成本高、产品活性弱的缺点，能大大降低人TRAIL突变体多肽的使用成本，实现其产业化生产，促进其在基础研究和医药生产上的应用。

Description

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA及制备方法和应用

技术领域

本发明主要涉及基因工程领域，特别是涉及到一种新的编码人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的cDNA及其制备方法和应用。

背景技术

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing Ligand，TRAIL)是一种细胞因子，属于肿瘤坏死因子家族成员，其cDNA首先由Wiley等于1995年克隆获得^[1]。

TRAIL cDNA编码全长为281个氨基酸的前体蛋白，其中第114-281位氨基酸为其可溶性片断。TRAIL蛋白具有II型跨膜蛋白的结构特点，分子的N端位于胞膜内侧，无信号肽序列，膜外部分为C段，含亲水端^[2]。

研究表明，可溶性TRAIL单体分子包含两条反向平行的β折叠，两条β折叠形成一个以中心为平台的三明治结构；三个TRAIL分子分别以第230位Cys两两相连，通过二硫键形成三聚体，三聚体结构是TRAIL的稳定活性形式。Zn²⁺的存在对于形成和维持TRAIL分子稳定的同源三聚体结构具有重要作用^[3-7]。

中国专利ZL 01105946.X公开了一种旨在提高人可溶性TRAIL生物活性和稳定性的新型突变体，该突变体在已有克隆人TRAIL基因全序列cDNA和氨基酸序列的基础上，去除了N端编码第1-113位氨基酸的碱基序列，同时改造去除了编码第119和第120位两个氨基酸的编码碱基，保留C端氨基酸编码序列而获得的长度为168个氨基酸的人TRAIL缺失突变体及其编码cDNA。

但以上发明中公开的人TRAIL缺失突变体的编码cDNA还存在较大不足，比如：(1)人TRAIL突变体的编码基因为哺乳动物细胞偏爱密码子，在原核细胞中表达效率较低，表达蛋白约占菌体总蛋白的21.15％；(2)重组表达载体表达产物大部分以包涵体形式存在，可溶性表达产物的比例较低，产量小；(3)TRAIL突变体蛋白需采用包涵体变性、复性方法纯化目的蛋白，包涵体纯化方法不仅操作繁琐、目的蛋白回收率低，而且不能直接获得具有正确构象的目的蛋白，目的蛋白复性困难，生物活性较低^[8]。这些不足之处使该TRAIL突变体的产率较低、生产工艺复杂、成本过高，大大影响了对其进一步的应用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种人TRAIL突变体编码cDNA。

该人TRAIL突变体编码cDNA具有序列号SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列与ZL 01105946.X中公开的人TRAIL突变体编码cDNA所编码的氨基酸序列相同(新旧编码cDNA序列的对照见表1，其中：表1a为本发明TRAIL突变体编码cDNA序列；表1b为ZL 01105946.X公开的人TRAIL突变体编码cDNA序列)。

表1本发明与现有技术(ZL 01105946.X)的人TRAIL突变体编码cDNA序列对照表

表1a本发明人TRAIL突变体编码cDNA序列(SEQ ID NO.1)

ATG GTT CGT GAA CGT GGT CGT GTT GCT GCT CAC ATC ACT GGT ACT 45

CGT GGT CGT TCT AAC ACT CTT TCT TCT CCG AAC TCT AAA AAC GAA 90

AAA GCT CTT GGT CGT AAA ATC AAC TCT TGG GAA TCT TCT CGT TCT 135

GGT CAC TCT TTC CTT TCT AAC CTT CAC CTT CGT AAC GGT GAA CTT 180

GTT ATC CAC GAA AAA GGT TTC TAC TAC ATC TAC TCT CAG ACT TAC 225

TTC CGT TTC CAG GAA GAA ATC AAA GAA AAC ACT AAA AAC GAT AAA 270

CAG ATG GTT CAG TAC ATC TAC AAA TAC ACT TCT TAC CCG GAC CCG 315

ATC CTT CTT ATG AAA TCT GCT CGT AAC TCT TGC TGG TCT AAA GAT 360

GCT GAA TAC GGT CTT TAC TCT ATC TAC CAG GGT GGT ATC TTC GAA 405

CTT AAA GAA AAC GAT CGT ATC TTC GTT TCT GTT ACT AAC GAA CAC 450

CTT ATC GAT ATG GAT CAC GAG GCT TCT TTC TTC GGT GCT TTC CTT 495

GTT GGT TAA 504

表1b现有技术(ZL 01105946.X)公开的人TRAIL突变体编码cDNA序列

ATG GTG AGA GAA AGA GGT AGA GTA GCA GCT CAC ATA ACT GGG ACC 45

AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA 90

AAG GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT 135

GGG CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC TTG AGG AAT GGT GAA CTG 180

GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT TCC CAA ACA TAC 225

TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG AAC GAC AAA 270

CAA ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT GAC CCT 315

ATA TTG TTG ATG AAA AGT GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT 360

GCT GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG GGA ATA TTT GAG 405

CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA AGA AAT GAG CAC 450

TTG ATA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTC GGG GCC TTT TTA 495

GTT GGC TAA 504

本发明的第二个目的在于提供包含本发明人TRAIL突变体编码cDNA的重组载体。这些能携带本发明人TRAIL突变体编码cDNA的各种载体是本领域已知的，如：质粒、重组噬菌体或其他的经加工后能含有本发明重组人TRAIL突变体编码cDNA的原核或真核载体。

优选的，所述重组载体是原核表达载体。

更优选的，所述原核表达载体是质粒。

再优选的，所述质粒是pET32a。

本发明的第三个目的在于提供包含上述人TRAIL突变体编码cDNA或上述重组载体的宿主细胞。

优选的，所述的宿主细胞是原核细胞。

更优选的，所述原核细胞是大肠杆菌。

再优选的，所述大肠杆菌是BL21(DE3)或ER2566。

本发明的第四个目的是提供由本发明人TRAIL突变体编码cDNA所编码的人TRAIL突变体多肽。

进一步的，所述多肽是由本发明人TRAIL突变体编码cDNA在原核表达系统中表达得到的。

更进一步的，所述原核表达系统是大肠杆菌表达系统。

本发明的第五个目的是提供一种制备人TRAIL突变体多肽的方法。该方法包括以下步骤：

a、合成具有序列号SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的cDNA；

b、用步骤a所得的cDNA构建原核表达载体；

c、用步骤b所得的原核表达载体转化大肠杆菌，制备得到工程菌；

d、将所得工程菌进行培养增殖，培养后收集菌体；

e、破碎菌体，纯化制备人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽。

本发明的第六个目的是提供本发明重组人TRAIL突变体多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明的第七个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物是由上述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

本发明的第一个方面所提供的人TRAIL突变体编码cDNA是根据中国专利ZL 01105946.X公开的人TRAIL突变体编码氨基酸序列重新设计，根据大肠杆菌密码子偏好性原则设计引物，通过人工合成和基因拼接得到的人TRAIL突变体新编码cDNA。

将本发明合成的人TRAIL突变体编码cDNA连接进入载体而构建成本发明第二个方面所提供的的重组载体。在本发明的一个较优实施方案中，以pET32a载体为骨架，切除该载体的融合标签序列，将本发明人TRAIL突变体编码cDNA直接连接于载体编码阅读框atg后，得到新的重组原核表达载体pET/TRAIL(mutant)。

用以上所述的重组载体转化大肠杆菌，可得到本发明第三个方面提供的含有重组人TRAIL突变体编码cDNA的宿主细胞。在本发明的一个较优实施方案中，将该重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，鉴定筛选出了含有人TRAIL突变体编码cDNA的重组大肠杆菌BL21(DE3)。在本发明另一个较优实施方案中，将重组载体转化大肠杆菌ER2566，鉴定筛选出了含有人TRAIL突变体编码cDNA的重组大肠杆菌ER2566。将上述的重组大肠杆菌BL21(DE3)和重组大肠杆菌ER2566进行大规模发酵培养后取菌体进行提取纯化得到重组人TRAIL突变体多肽。

特别需要说明的是，以上生产和操作本发明公开的重组基因、重组多肽、重组载体和抗肿瘤注射剂的具体技术方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术完成。

本发明的有益效果在于：本发明在现有技术的基础上，重新设计并人工合成的新的重组人TRAIL突变体多肽编码cDNA，将本发明重组人TRAIL突变体多肽编码cDNA构建成表达载体并转入常用的宿主细胞尤其是原核细胞中制备重组人TRAIL突变体多肽，能比现有技术获得更高的表达效率并提高可溶性表达的比例，制备得到的重组人TRAIL突变体多肽活性大大高于现有技术；本发明克服了现有技术产率低、生产成本高、产品活性弱的缺点，能大大降低人TRAIL突变体多肽的使用成本、并实现其产业化生产、促进其在基础研究和医药生产上的应用。

附图说明

图1本发明人TRAIL突变体编码cDNA PCR扩增电泳图

其中M为核酸分子量marker，1、2、3为TRAIL全长cDNA扩增结果。

图2重组原核表达载体pET/TRAIL(mutant)构建示意图

图3重组原核表达载体pET/TRAIL(mutant)酶切电泳图

其中M1、M2为不同大小的核酸分子量marker，1为阳性重组质粒pET/TRAIL(mutant)双酶切电泳结果。

图4重组原核表达载体pET/TRAIL(mutant)测序图谱

图5不同宿主菌表达本发明人TRAIL突变体多肽的表达电泳图

其中M为标准蛋白分子量marker，1、2为重组质粒转化ER2566工程菌表达情况。1为沉淀(不溶蛋白)，2为上清(可溶蛋白)，经扫描分析表达目的蛋白中70％为可溶性蛋白，可溶性目的蛋白占菌体可溶性蛋白总量的比例为35％；3、4为重组质粒转化BL21(DE3)工程菌表达情况。3为沉淀，4为上清，分析结果显示表达目的蛋白中60％为可溶性蛋白，可溶性目的蛋白占菌体可溶性蛋白总量的比例为40％。

图6本发明TRAIL多肽纯化过程电泳图

其中M为标准蛋白分子量marker，1为纯化前样品，2、3为中度纯化样品，4、5为精细纯化样品。

图7本发明人TRAIL突变体多肽免疫印迹图谱

其中M为标准蛋白分子量marker，1、2、3为TRAIL目的蛋白免疫印迹阳性信号。

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明。但这种说明不应理解为是对本发明的限制，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。

具体实施方式

实施例一.本发明人TRAIL突变体编码cDNA的改造和合成

1材料

人TRAIL突变体编码cDNA拼接引物(均为5’到3’方向，20D值，PAGE纯化)由上海博亚公司合成。大肠杆菌JM109、克隆载体pGEM-T、T4多核苷酸磷酸化酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒，DNA纯化试剂盒为Omega公司产品。PCR扩增仪(Ferrotec，TC-25/H)为杭州大和公司产品。凝胶成像系统(Gel DOC2000)、垂直电泳系统(Power/Pac300)为BIO-RAD公司产品。

2方法

2.1引物设计

根据中国专利ZL 01105946.X中公开的的编码氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则设计用于基因拼接的25条正、反链DNA引物(如SEQ IDNO.2～26所示的正链TA1-TA12共12条引物，反链TA1-2-TA13-14共13条引物)，引物序列见表2。其中5’端加入Xba I酶切位点，3’端加入BamH I酶切位点序列，便于与载体连接。

表2本发明人TRAIL突变体编码cDNA合成引物(SEQ ID NO.2～26)

TA1(SEQ ID NO.2)：CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG

TA2(SEQ ID NO.3)：GTTCGTGAACGTGGTCGTGTTGCTGCTCACATCACTGGTACTCGTGG

TA3(SEQ ID NO.4)：TCGTTCTAACACTCTTTCTTCTCCGAACTCTAAAAACGAAAAAGCTC

TA4(SEQ ID NO.5)：TTGGTCGTAAAATCAACTCTTGGGAATCTTCTCGTTCTGGTCACTCT

TA5(SEQ ID NO.6)：TTCCTTTCTAACCTTCACCTTCGTAACGGTGAACTTGTTATCCACGA

TA6(SEQ ID NO.7)：AAAAGGTTTCTACTACATCTACTCTCAGACTTACTTCCGTTTCCAGG

TA7(SEQ ID NO.8)：AAGAAATCAA GAAAACACTAAAAACGATAAACAGATGGTTCAGTAC

TA8(SEQ ID NO.9)：ATCTACAAATACACTTCTTACCCGGACCCGATCCTTCTTATGAAATC

TA9(SEQ ID NO.10)：TGCTCGTAACTCTTGCTGGTCTAAAGATGCTGAATACGGTCTTTAC

TA10(SEQ ID NO.11)：TCTATCTACCAGGGTGGTATCTTCGAACTTAAAGAAAACGATCGTA

TA11(SEQ ID NO.12)：TCTTCGTTTCTGTTACTAACGAACACCTTATCGATATGGATCACGA

TA12(SEQ ID NO.13)：GGCTTCTTTCTTCGGTGCTTTCCTTGTTGGTTAATAAGGATCCGAA

TA1-2(SEQ ID NO.14)：GTTAAACAAAATTATTTCTAGAGG

TA2-3(SEQ ID NO.15)：AGCAACACGACCACGTTCACGAACCATATGTATATCTCCTTCTTAAA

TA3-4(SEQ ID NO.16)：GGAGAAGAAAGAGTGTTAGAACGACCACGAGTACCAGTGATGTGAGC

TA4-5(SEQ ID NO.17)：CCCAAGAGTTGATTTTACGACCAAGAGCTTTTTCGTTTTTAGAGTTC

TA5-6(SEQ ID NO.18)：ACGAAGGTGAAGGTTAGAAAGGAAAGAGTGACCAGAACGAGAAGATT

TA6-7(SEQ ID NO.19)：GAGTAGATGTAGTAGAAACCTTTTTCGTGGATAACAAGTTCACCGTT

TA7-8(SEQ ID NO.20)：TTTTAGTGTTTTCTTTGATTTCTTCCTGGAAACGGAAGTAAGTCTGA

TA8-9(SEQ ID NO.21)：CGGGTAAGAAGTGTATTTGTAGATGTACTGAACCATCTGTTTATCGT

TA9-10(SEQ ID NO.22)：TAGACCAGCAAGAGTTACGAGCAGATTTCATAAGAAGGATCGGGTC

TA10-11(SEQ ID NO.23)：AAGATACCACCCTGGTAGATAGAGTAAAGACGTATTCAGCATCTT

TA11-12(SEQ ID NO.24)：TTCGTTAGTAACAGAAACGAAGATACGATCGTTTTCTTTAAGTTCG

TA12-13(SEQ ID NO.25)：AGAAAGCACCGAAGAAAGAAGCCTCGTGATCCATATCGATAAGGTG

TA13-14(SEQ ID NO.26)：TTCGGATCCTTATTAACCAACA

2.2引物磷酸化

将上述引物稀释至100pmol/L的浓度，各取1ul，于70℃变性5min后立即置于冰上放置5min。上述混合液加入10×T4 ligase buffer、T4 polynucleotidekinase及ddH₂O，反应体系如下：

经处理的引物混合液 25ul

10×T4 ligase buffer 4ul

T4 polynucleotide kinase 1ul

ddH₂O 10ul

40ul

37℃反应1h后置70℃放置10min，然后置94℃1min，55℃1min，室温自然冷却。

2.3引物连接

将5’磷酸化产物加入以下反应体系：

5’磷酸化产物 40ul

10×T4 DNA ligase buffer 5ul

10×T4 DNA ligase 1ul

ddH₂O 4ul

50ul

于16℃连接4h后，65℃灭活10min。采用Omega核酸纯化回收试剂盒回收连接片断，最后以30ul ddH₂O洗脱。

2.4PCR扩增

以连接反应产物为模板，加入首条正链和末条反链引物，进行人全长TRAIL突变体cDNA基因扩增，PCR反应体系如下：

连接反应产物 2ul

10×PCR buffer 5ul

25mmol/L MgCl₂ 5ul

dNTPs(2mmol/each) 4ul

引物TA1(100mol/L) 1ul

引物TA13-14(100mol/L) 1ul

EX Taq酶(1U/ul) 0.5ul

ddH₂O 32.5ul

50ul

反应结束，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳。

2.5PCR产物的凝胶回收、纯化

合并PCR产物150ul，采用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片断，目的片断回收采用Omega公司凝胶回收试剂盒，最终洗脱液溶于30ul ddH₂O中。

2.6目的基因与T载体的连接、转化，克隆筛选及鉴定

取凝胶回收纯化的PCR产物4ul加入pGEM-T载体DNA 1ul，连接缓冲液5ul，16℃连接4h。将连接产物转化感受态细菌JM109，然后涂布于含100ug/mlAmp的固体LB培养基平板中，37℃培养过夜。挑取单菌落加入5ml含100ug/mlAmp的液体LB培养基试管中，37℃培养6h。采用Omega公司质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，对质粒进行酶切鉴定，鉴定阳性的载体送上海博亚公司测序。将测序证实完全正确的序列命名为pGEM-T/TRAIL(mutant)，保存菌种。

3结果

将博亚公司合成的25条引物磷酸化、连接，以连接产物为模板，经PCR扩增得到大小约560bp的新的人TRAIL突变体全长cDNA(PCR扩增结果见图1)，该序列成功连接于克隆载体pGEM-T，经测序证实得到阳性重组质粒pGEM-T/TRAIL(mutant)。

实施例二.重组原核表达载体pET/TRAIL(mutant)的构建

1材料

基因扩增引物(均为5’到3’方向，20D值，PAGE纯化)由上海博亚公司合成。大肠杆菌JM109、Deep Vent DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，原核表达载体pET32a购自Novagen公司，质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒，DNA纯化试剂盒为Omega公司产品。PCR扩增仪(Ferrotec，TC-25/H)为杭州大和公司产品。凝胶成像系统(Gel DOC2000)、垂直电泳系统(Power/Pac300)为BIO-RAD公司产品。

2方法

由于表达载体及质粒pGEM-T/TRAIL(mutant)上均含有Xba I及BamH I酶切位点序列，因而TRAIL突变体cDNA序列可以通过表达载体及pGEM-T/TRAIL(mutant)分别双酶切进行亚克隆，构建成以pET32a载体为骨架，缺失载体上融合标签Trx序列的全新表达载体。该载体以人TRAIL突变体编码cDNA序列直接连接于表达载体编码阅读框atg后，新的重组原核表达载体命名为pET/TRAIL(mutant)，其构建流程如图2所示。

2.1目的基因及载体的酶切

取表达载体pET32a质粒DNA及pGEM-T/TRAIL(mutant)质粒DNA各25ul(1ug/ul)，以限制性核酸内切酶Xba I和BamH I双酶切，酶切反应体系如下：

pET32a质粒DNA 25ul pGEM-T/TRAIL质粒DNA 25ul

Xba I(10u/ul) 1ul Xba I(10u/ul) 1ul

BamH I(10u/ul) 1ul BamH I(10u/ul) 1ul

10×buffer 5ul 10×buffer 5ul

ddH₂O 18ul ddH₂O 18ul

50ul 50ul

37℃，酶切3h。各取2ul酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳，若酶切完全，则采用低熔点琼脂糖回收载体及目的基因片断，最后分别溶于30ul ddH₂O中。

2.2目的基因与表达载体的连接、转化，克隆筛选及鉴定

取酶切回收的载体质粒DNA0.5ul，置于1.5mlEppendorf管底部，再加入酶切回收的目的基因DNA片断4.5ul，加入Takara公司DNA ligation Sol I 5ul，16℃连接过夜。将连接产物涂布于含100ug/ml Amp的固体LB培养基平板中，37℃培养过夜。挑取单菌落加入5ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基试管中，37℃培养6h。采用Omega公司质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，对质粒进行酶切鉴定，鉴定阳性的载体送上海博亚公司测序。将测序证实序列完全正确的质粒命名为pET/TRAIL(mutant)，保存菌种。

3结果

TRAIL突变体cDNA序列成功连接于原核表达载体pET32a，经酶切及测序证实得到阳性重组质粒pET/TRAIL(mutant)(酶切结果见图3、测序结果见图4)。

实施例三、重组pET/TRAIL(mutant)的BL21(DE3)工程菌的构建和发酵培养

1材料

表达大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司。质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒为Omega公司产品。70L自动控制发酵罐(D50)为B.Braun公司产品，细胞高压均质机(APV 1000)为AVP公司产品，凝胶成像系统(Gel DOC2000)、垂直电泳系统(Power/Pac300)为BIO-RAD公司产品。

2方法

2.1培养液的配制

(1)种子液培养基3000ml

Tryptone 30g

Yeast Extract 15g

NaCl 30g

加去离子水定容至3000ml，在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(2)基础培养基

Tryptone 240g

Yeast Extract 180g

NaCl 200g

加去离子水定容至35L，随发酵罐在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(3)磷酸盐缓冲液

K₂HPO₄·3H₂O 200g

KH₂PO₄ 100g

加去离子水定容至1L，在121℃，1.034×10⁵pa高压蒸气灭菌20min，随接种时加入。

(4)补料培养基I

葡萄糖 200g

微量元素溶液 100ml

维生素溶液 100ml

加去离子水定容至600ml，在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(5)补料培养基II

葡萄糖 400g

Yeast Extract 150g

MgSO₄.7H₂O 50g

加去离子水定容至1800ml，在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(6)补料培养基III

葡萄糖 500g

Tryptone 300g

Yeast Extract 200g

MgSO₄.7H₂O 30g

1MZnSO₄ 50ml

加去离子水定容至3600ml，在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

2.2菌种的转化和活化

将实施例2所得的阳性重组质粒pET/TRAIL(mutant)重新转化大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选得到pET/TRAIL(mutant)BL21(DE3)工程菌，20％甘油-70℃保种。

取-70℃，20％甘油保存菌种pET/TRAIL(mutant)BL21(DE3)种子菌100ul，接种于50ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基烧瓶中，32℃，220rpm培养至菌体密度A600为1-2后；再按1∶1000的比例接种于3000ml含100ug/ml Amp的种子培养基中，32℃，220rpm培养14h，成发酵种子液。将发酵种子液全部接种于含35L培养液的B.Braun 70L发酵罐中。

诱导前培养阶段温度保持32℃，pH由氨水和盐酸控制在7.0左右，溶解氧Do控制在30％以上。

接种后1h，监测菌体密度A600超过0.5后，开始缓慢流加补料培养基I，速度控制在2.5h流加完毕。

监测菌体密度A600约为6，且溶氧量Do、pH均明显上升时，开始流加补料培养基II，速度控制在2h内流加完毕，且无葡萄糖积累。

待补料培养基II流加完毕、且溶氧量Do、PH均明显上升，监测菌体密度A600约为14-16时，即进入诱导培养阶段。

诱导培养阶段温度保持26-28℃，直至诱导结束。诱导开始时加入0.5mol/L的IPTG，且同时流加补料培养基III，速度控制在3-4小时流加完毕，且保持无葡萄糖积累。

补料培养基III流加完毕，且溶氧量Do、PH均迅速上升时，发酵终止，收罐，离心收集菌体。

3结果：

菌体诱导起始密度A600值为14-16，诱导温度为26-28℃，诱导时间为3-4h时，共收集得到菌体总量约为4000g。表达的目的蛋白中70％为可溶性蛋白，此时可溶性目的蛋白占菌体可溶蛋白总量的比例为40％(见图5)。经文献对比^[8]，本发明技术与专利ZL 01105946.X采用相同表达载体和宿主细胞、表达氨基酸组成序列完全相同的目的多肽，仅通过编码基因密码子的改进即能获得更高的表达效率、且所得人TRAIL多肽具有更高的可溶性以及更高的活性(活性分析见试验例一)。

实施例四、重组pET/TRAIL(mutant)的ER2566工程菌的构建和发酵培养

1材料

表达大肠杆菌ER2566购自NEB公司。质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒为Omega公司产品。70L自动控制发酵罐(D50)为B.Braun公司产品，细胞高压均质机(APV 1000)为AVP公司产品，凝胶成像系统(Gel DOC2000)、垂直电泳系统(Power/Pac300)为BIO-RAD公司产品。

2方法

2.1培养液的配制

(1)种子液培养基3000ml

Tryptone 30g

Yeast Extract 15g

NaCl 30g

(2)基础培养基

Tryptone 240g

Yeast Extract 180g

NaCl 200g

(3)磷酸盐缓冲液

K₂HPO₄·3H₂O 200g

KH₂PO₄ 100g

(4)补料培养基I

葡萄糖 200g

微量元素溶液 100ml

维生素溶液 100ml

(5)补料培养基II

葡萄糖 400g

Yeast Extrac 150g

MgSO₄.7H₂O 50g

(6)补料培养基III

葡萄糖 500g

Tryptone 300g

Yeast Extract 200g

MgSO₄.7H₂O 30g

1MZnSO₄ 50ml

2.2菌种的转化和活化

将实施例2所得的阳性重组质粒pET/TRAIL(mutant)重新转化大肠杆菌ER2566，经筛选得到pET/TRAIL(mutant)ER2566工程菌，20％甘油-70℃保种。

取-70℃，20％甘油保存菌种pET/TRAIL(mutant)ER2566种子菌100ul，接种于50ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基烧瓶中，32℃，220rpm培养至菌体密度A600为1-2后；再按1∶1000的比例接种于3000ml含100ug/ml Amp的种子培养基中，32℃，220rpm培养14h，成发酵种子液。将发酵种子液全部接种于含35L培养液的B.Braun 70L发酵罐中。

3结果：

菌体诱导起始密度A600值为14-16，诱导温度为26-28℃，诱导时间为3-4h时，共收集得到菌体总量约为4000g。经检测，表达的目的蛋白中60％为可溶性蛋白，此时可溶性目的蛋白占菌体可溶性蛋白总量的比例为35％(见图5)。经文献对比，其表达效率和可溶性表达比例也显著高于采用专利ZL01105946.X技术所得结果^[8]。

实施例五.重组人TRAIL突变体的纯化

1材料

层析介质Chelating Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、CMSepharose Fast Flow及层析柱购自安玛西亚(中国)有限公司，超滤系统(MINIHOLDER)为Millipore产品，凝胶成像系统(Gel DOC2000)、垂直电泳系统(Power/Pac300)为BIO-RAD公司产品。

2方法

2.1亲和层析

采用亲和层析(Chelating Sepharose Fast Flow)。破菌液经离心，取上清，上Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，收集目的蛋白洗脱峰，得到纯度超过80％的产品。

2.2阴离子交换层析

采用阴离子交换层析(Q Sepharose Fast Flow)。取亲和层析纯化样品上QSepharose Fast Flow阴离子交换柱，收集目的蛋白洗脱峰，得到纯度大于90％的样品。

2.3阳离子交换层析

采用阳离子交换层析(CM Sepharose Fast Flow)。取阴离子交换层析纯化样品上CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，收集目的蛋白洗脱峰，得到纯度大于99％的样品。

3结果

本实例采用B.Braun发酵罐得到的35L培养液可纯化获得目的蛋白10g，可用于重组人TRAIL多肽的规模化纯化(见图6)。

经SDS-PAGE检测，纯化的重组人TRAIL多肽相对分子量为19.6KDa；经非还原电泳及HPLC检测，纯度大于99％。

经过western blot检测，确定纯化得到的重组人TRAIL多肽具有人TRAIL抗体特异性结合能力(见图7)。

以下通过试验例对本发明有益效果作进一步详述，但不能认为是对本发明的限制。

试验例一、本发明与现有技术(ZL 01105946.X)的人TRAIL突变体多肽抗肿瘤

活性对比试验

1材料

按现有技术(专利ZL 01105946.X)制备的重组人TRAIL突变体多肽对照品三批。

本发明重组人TRAIL突变体多肽样品三批。

结肠癌细胞COLO205、肺癌细胞NCI-H460、乳腺癌细胞株MDA-MB-231均来自ATCC。

DMEM培养基(GIBCO公司)。

SRB染色液：0.4％SRB，1％醋酸。

脱色液：50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸。

96孔培养板(NUNC公司)。

酶标仪(model 550，BIO-RAD公司)。

2实验方法

(1)将结肠癌细胞COLO205、肺癌细胞NCI-H460、乳腺癌细胞株MDA-MB-231维持培养于含10％FBS、100Unit/ml的链霉素和青霉素、0.03％谷胺酰氨的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5％CO₂。

(2)以15000个细胞/孔接种于96孔板，培养24小时后，加入系列浓度的受试样品(10ug/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml，0.001μg/ml)，继续培养48小时。

(3)采用SRB(Sulforhodamin B)染色法进行细胞增殖检测：加入10％三氯乙酸，于4℃固定1h；用PBS洗两次后用SRB染液(0.4％SRB，1％醋酸)染色30min，再用醋酸洗去未结合的染料，细胞于室温干燥后加入10mmol/L Tris-Cl(PH10.5)作用5min，然后在490nm波长下测定光吸收值。

(4)计算GI₅₀值(50％Growth inhibition concentration，半数生长抑制浓度)。

计算公式为：抑制率％＝T-T₀/Tc-TO

其中：T为给药48小时后细胞个数(OD值)

T₀为对照组或试验组给药前细胞个数(OD值)

Tc为对照组培养48小时后细胞个数(OD值)

然后根据测得的抑制率，采用回归法求得半数生长抑制浓GI₅₀。

3结果

将相同纯度的三批本发明提供的重组人TRAIL突变体多肽和三批按专利ZL01105946.X方法制备的重组人TRAIL突变体多肽进行抗结肠癌细胞COLO205、肺癌细胞NCI-H460、乳腺癌细胞MDA-MB-231活性测定，其测定的GI50值见表3。

表3抗肿瘤细胞活性实验GI₅₀值测定结果(ng/ml， x±s)

	COLO205	NCI-H460	MDA-MB-231
	COLO205	NCI-H460	MDA-MB-231	本发明重组人TRAIL突变体多肽	3.56±1.05	5.77±1.23	4.25±0.86
ZL01105946.X重组人TRAIL突变体多肽	53.66±10.32	62.32±12.21	47.32±10.78	本发明重组人TRAIL突变体多肽	3.56±1.05	5.77±1.23	4.25±0.86

由上表可见，本发明提供的重组人TRAIL突变体多肽的GI值为ZL01105946.X重组人TRAIL突变体多肽的1/10到1/15，生物活性约为ZL01105946.X重组人TRAIL突变体多肽的10～15倍。

上述实例表明，本发明重组人TRAIL突变体多肽编码cDNA与专利ZL01105946.X编码cDNA在采用相同的表达载体(pET3a)，且表达菌(BL21)也相同的情况下表达编码氨基酸序列相同的TRAIL突变体，仅通过编码cDNA的序列的改变，即能获得更高的表达效率和并提高可溶性表达的比例；同时本发明重组人TRAIL突变体编码cDNA能够在原核表达载体中大量表达生产活性为现有技术产品10倍以上的人TRAIL突变体多肽。本发明解决了现有技术制备人TRAIL突变体多肽产率较低、生产工艺复杂、成本过高等困难。本发明对人TRAIL突变体的相关研究和产业化应用将起极大的推动作用，具有很好的应用前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明作出各种改变及变形，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明权利要求所定义的范围。

参考文献

1.Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al.，Identification and characterization of anew member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity 1995；3：673-82.

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3.Bodmer J-L，Meier PTschopp J，et al.，Cystenine 230 is essential for the structureand activity of the cytototic ligand TRAIL.J Biol Chem 2000；275：20632-7.

4.Hymowitz SG，O’Connel MP，Ultsch MH，et al.，A unique zinc-binding site revealedby a high-resolution X-ray structure of homotrimeric rshApo2L/TRAIL.Biochemistry2000；39：633-40.

5.Hymowitz SG，Christinger HW，Fuh G，et al.，Triggering cell death：the crystalstructure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor 5.MolCell 1999；4：563-71.

6.Mongkolsapaya J，Grimes JM，Chem N，et al.，Structure of the TRAIL-DR5 complexreveals mechanisms conferring specificity in apoptosis initiation.Nat Struct Biol1999；6：1048-53.

7.Cha SS，Kim MS，Choi YH，et al.，2.8A resolution crystal structure of human TRAIL，acytokine with selective antitumor activity.Immunity 1999；11：253-61.

8、周建，彭旭东，张健等。重组人TRAIL蛋白的原核表达、纯化及鉴定。四川大学学报(自然科学版)，2002，39(增刊)：142-145。

一种人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA及其制备方法和应用.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>成都地奥制药集团有限公司

<120>一种人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA及其制备方法和应用

<130>3538

<160>26

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA

<400>1

atggttcgtg aacgtggtcg tgttgctgct cacatcactg gtactcgtgg tcgttctaac 60

actctttctt ctccgaactc taaaaacgaa aaagctcttg gtcgtaaaat caactcttgg 120

gaatcttctc gttctggtca ctctttcctt tctaaccttc accttcgtaa cggtgaactt 180

gttatccacg aaaaaggttt ctactacatc tactctcaga cttacttccg tttccaggaa 240

gaaatcaaag aaaacactaa aaacgataaa cagatggttc agtacatcta caaatacact 300

tcttacccgg acccgatcct tcttatgaaa tctgctcgta actcttgctg gtctaaagat 360

gctgaatacg gtctttactc tatctaccag ggtggtatct tcgaacttaa agaaaacgat 420

cgtatcttcg tttctgttac taacgaacac cttatcgata tggatcacga ggcttctttc 480

ttcggtgctt tccttgttgg ttaa 504

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<212>DNA

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA1

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cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatg 47

<210>3

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA2

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gttcgtgaac gtggtcgtgt tgctgctcac atcactggta ctcgtgg 47

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA3

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tcgttctaac actctttctt ctccgaactc taaaaacgaa aaagctc 47

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<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA4

<400>5

ttggtcgtaa aatcaactct tgggaatctt ctcgttctgg tcactct 47

<210>6

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA5

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ttcctttcta accttcacct tcgtaacggt gaacttgtta tccacga 47

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA6

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aaaaggtttc tactacatct actctcagac ttacttccgt ttccagg 47

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<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA7

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aagaaatcaa agaaaacact aaaaacgata aacagatggt tcagtac 47

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA8

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atctacaaat acacttctta cccggacccg atccttctta tgaaatc 47

<210>10

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA9

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tgctcgtaac tcttgctggt ctaaagatgc tgaatacggt ctttac 46

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA10

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tctatctacc agggtggtat cttcgaactt aaagaaaacg atcgta 46

<210>12

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA11

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tcttcgtttc tgttactaac gaacacctta tcgatatgga tcacga 46

<210>13

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA12

<400>13

ggcttctttc ttcggtgctt tccttgttgg ttaataagga tccgaa 46

<210>14

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA1-2

<400>14

gttaaacaaa attatttcta gagg 24

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA2-3

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agcaacacga ccacgttcac gaaccatatg tatatctcct tcttaaa 47

<210>16

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA3-4

<400>16

ggagaagaaa gagtgttaga acgaccacga gtaccagtga tgtgagc 47

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<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>发明人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA4-5

<400>17

cccaagagtt gattttacga ccaagagctt tttcgttttt agagttc 47

<210>18

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA5-6

<400>18

acgaaggtga aggttagaaa ggaaagagtg accagaacga gaagatt 47

<210>19

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA6-7

<400>19

gagtagatgt agtagaaacc tttttcgtgg ataacaagtt caccgtt 47

<210>20

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物7-8

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ttttagtgtt ttctttgatt tcttcctgga aacggaagta agtctga 47

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA8-9

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cgggtaagaa gtgtatttgt agatgtactg aaccatctgt ttatcgt 47

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA9-10

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tagaccagca agagttacga gcagatttca taagaaggat cgggtc 46

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA10-11

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aagataccac cctggtagat agagtaaaga ccgtattcag catctt 46

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<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA11-12

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ttcgttagta acagaaacga agatacgatc gttttcttta agttcg 46

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA12-13

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agaaagcacc gaagaaagaa gcctcgtgat ccatatcgat aaggtg 46

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<212>DNA

<213>Artificial

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<223>人TRAIL突变体编码cDNA合成引物TA13-14

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ttcggatcct tattaaccaa ca 22

Claims

1、一种人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的编码cDNA，其特征在于它具有序列号为SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

2、一种重组载体，其特征在于含有如权利要求1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA。

3、根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述载体是质粒。

4、根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述质粒是pET32a。

5、一种含有权利要求1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体的编码cDNA的宿主细胞。

6、根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞。

7、根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述原核细胞为大肠杆菌。

8、根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述大肠杆菌为BL21(DE3)或ER2566。

9、一种人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽，其特征在于它是由权利要求1所述的编码cDNA在原核表达系统中表达得到的。

10、根据权利要求9所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽，其特征在于所述的原核表达系统是大肠杆菌表达系统。

11、一种制备权利要求9或10所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、合成具有序列号SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的cDNA；

b、用步骤a所得的cDNA构建原核表达载体；

d、将所得工程菌进行培养增殖，培养后收集菌体；

12、权利要求9或10所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。

13、一种抗肿瘤药物，是由权利要求9或10所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。