CN106591449B - 预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法 - Google Patents

预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106591449B
CN106591449B CN201611147049.5A CN201611147049A CN106591449B CN 106591449 B CN106591449 B CN 106591449B CN 201611147049 A CN201611147049 A CN 201611147049A CN 106591449 B CN106591449 B CN 106591449B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor cell
datr
tumor
gene
sensitivity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611147049.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106591449A (zh
Inventor
赖兵
姬建新
翟祎星
钟应佳
黄迎春
杨莉
邢晔
陈娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHENGDU DI'AO JIUHONG PHARMACEUTICAL FACTORY
Original Assignee
CHENGDU DI'AO JIUHONG PHARMACEUTICAL FACTORY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHENGDU DI'AO JIUHONG PHARMACEUTICAL FACTORY filed Critical CHENGDU DI'AO JIUHONG PHARMACEUTICAL FACTORY
Priority to CN201611147049.5A priority Critical patent/CN106591449B/zh
Publication of CN106591449A publication Critical patent/CN106591449A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106591449B publication Critical patent/CN106591449B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种预测肿瘤对TRAIL类似物敏感性的方法，步骤如下：(1)以现有的肿瘤细胞株作为样本库，通过实时荧光定量PCR测定样本库中肿瘤细胞株的六种基因的mRNA表达水平，以Cq值表示；(2)在体外实验中测定样本库中肿瘤细胞株在不同浓度TRAIL类似物处理下的生存率，指示其对TRAIL类似物的敏感性；(3)以肿瘤细胞株中六种基因的Cq值为自变量，以TRAIL类似物处理下各肿瘤细胞株的生存率为因变量，通过多元线性回归建模，筛选并建立最优的多元线性方程；(4)提取患者肿瘤细胞，检测该其中对应基因的mRNA表达水平的Cq值，代入多元线性方程，通过计算预测该病人对该TRAIL类似物的敏感性。

Description

预测肿瘤对TRAIL类似物敏感性的方法
技术领域
本发明属于新型生物药研发领域，涉及筛选、检测及分析相关因子的mRNA表达水平以预测检测对象对TRAIL类似物的敏感性。
背景技术
DATR是由成都地奥制药集团有限公司自主发明的一种旨在提高人类肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)生物活性和稳定性的新型突变体，即一种TRAIL类似物。它在已知的人类TRAIL基因全序列cDNA的基础上，去除了N端编码第1～113位及第119、第120位氨基酸的碱基序列，保留了C端氨基酸的碱基序列而获得长度为168个氨基酸的人类TRAIL缺失突变体(ZL专利号：01105946.X一种突变的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体多肽及其用途)。研究表明，DATR具有与野生型TRAIL完全相同的空间构象，而其生物活性和稳定性优于野生型蛋白。
体外实验结果显示，DATR对人类肺、肝、胃、结直肠、乳腺、血液及淋巴、前列腺、卵巢、神经等9个系统的29株传代肿瘤细胞均有不同程度的诱导凋亡作用，而对正常细胞无显著毒性。体内实验结果显示，DATR对处于国内肿瘤发病率前10位的肺癌(NCI-H460)、肝癌(SMMC-7721)、胃癌(MKN45)、结直肠癌(COLO205、HCT-8)、乳腺癌(MDA-MB-231)、及淋巴瘤(29SR)等多种人体肿瘤均具有较强的抗肿瘤作用。体外及体内实验研究表明，在相同剂量下，DATR的抗肿瘤效果优于野生型TRAIL。
然而，与其他所有抗肿瘤药物相似，DATR仅对部分肿瘤患者有较好的疗效。因此，在对肿瘤患者用药前，利用可靠的生物学指标以预测该肿瘤对DATR是否敏感，对其临床应用具有重大意义。
目前已知在肿瘤细胞膜上TRAIL的受体有4种，即DR4，DR5，DcR1，DcR2；可溶性诱骗受体1种，即OPG(osteoprotegerin)(图2,Almasan and Ashkenazi,2003)。其中，OPG仅与TRAIL有极弱的结合能力，其功能尚未报道。当TRAIL与DR4或DR5结合，可诱导受体同型三聚化，招募FADD、CASP8或CASP10前体形成死亡诱导信号复合体(DISC)，进而激活下游以Caspase为核心的凋亡信号通路以促进肿瘤细胞凋亡(图3,Wiezorek et al.,2010)。而DcR1无胞内结构域，DcR2仅有部分胞内结构域，虽然它们亦能与TRAIL结合，但不能激活上述凋亡信号通路。据报道，DcR2还能激活NF kappaB信号通路拮抗肿瘤细胞凋亡。c-FLIP作为上述凋亡信号通路的负向调控因子，因与CASP8拥有相似的结构而被招募至DISC中阻碍CASP8后续结合及加工。由此可见，TRAIL在肿瘤细胞膜上受体、DISC组成及相关调控因子的表达量很可能与肿瘤对TRAIL类似物的敏感性密切相关。此外，已报道的可能与TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的相关因子亦值得关注，如HTATIP2。基于此，本发明提出利用上述相关因子的mRNA表达水平来预测肿瘤对TRAIL类似物敏感性的方法。
发明内容
本发明目的是建立了一种通过检测相关因子的mRNA表达水平，通过计算分析来预测肿瘤对TRAIL类似物敏感性的方法。
本发明的技术方案为：一种利用相关因子表达水平预测肿瘤对TRAIL类似物敏感性的方法，步骤如下：
(1)以现有的肿瘤细胞株作为样本库，通过实时荧光定量PCR测定样本库中肿瘤细胞株的DR4、DR5、DcR2、CASP8、c-FLIP和HTATIP2六种基因的mRNA表达水平，以Cq值表示；
(2)在体外实验中测定样本库中肿瘤细胞株在不同浓度TRAIL类似物处理下的生存率，指示其对TRAIL类似物的敏感性；
(3)以肿瘤细胞株中六种基因的Cq值为自变量，以TRAIL类似物处理下肿瘤细胞株的生存率为因变量，通过多元线性回归建模，筛选并建立最优的多元线性方程。公式为：V＝a*Cq(DR4)+b*Cq(DR5)+c*Cq(DcR2)+d*Cq(CASP8)+e*Cq(c-FLIP)+f*Cq(HTATIP2)+g，其中，V指生存率；Cq(X)指qPCR中目的基因X的绝对定量荧光阈值循环数，或相对于GAPDH的相对定量荧光阈值循环数；a-f为系数，g为常数，均可为0；
(4)提取患者肿瘤细胞株或循环肿瘤细胞或肿瘤组织，检测对应基因的mRNA表达水平，即Cq值，代入多元线性方程，通过计算预测该病人对该TRAIL类似物的敏感性。
进一步地，步骤(1)的方法为：
(a)提取肿瘤细胞株的总RNA，以此为模版反转录构建cDNA文库；
(b)利用实时荧光定量PCR检测DR4、DR5、DcR2、CASP8、c-FLIP和HTATIP2六种基因的mRNA表达水平，以Cq值表示。
进一步地，步骤(b)中，
DR4基因的上游引物为5’-AATCAGGCAATGGACATAA-3’，下游引物为5’-GCAACAACAGACAATCAG-3’，
DR5基因的上游引物为5’-TCAGGCATCATCATAGGA-3’，下游引物为5’-TCAGGTAAGGAAGGACTT-3’，
DcR2基因的上游引物为5’-TTGCCTTCTTGCCTGCTA-3’，下游引物为5’-GTCTCTGGTCGTGGTACA-3’，
CASP8基因的上游引物为5’-AAGAGAATGTTGGAGGAA-3’，下游引物为5’-TTAGGTAGGTAATCAGCAA-3’，
c-FLIP基因的上游引物为5’-GATACAGATGAGAAGGAGATG-3’，下游引物为5’-CCTGACATTAGGTGGAAC-3’，
HTATIP2基因的上游引物为5’-GTGAATCAAGAAGTGGTG-3’，下游引物为5’-CAACAGAATCCAACATCAT-3’。
进一步地，TRAIL类似物是指DATR及与DATR序列同源性不小于90％的同源蛋白质或包含同源性不小于90％的肽段。
DR4基因：Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamilymember 10a,TNFRSF10A,Gene ID:8797；
DR5基因：Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamilymember 10b,TNFRSF10B,Gene ID:8795；
DcR2基因：Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamilymember 10d,TNFRSF10D,Gene ID:8793；
CASP8基因：Homo sapiens caspase 8,Gene ID:841；
c-FLIP基因：Homo sapiens CASP8 and FADD like apoptosis regulator,GeneID:8837；
HTATIP2基因：Homo sapiens HIV-1 Tat interactive protein 2,Gene ID:10553。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
通过本发明的方法，筛选出六种与肿瘤对TRAIL类似物的敏感性相关程度较显著的基因，建立并优化了预测模型，可以非常方便的通过检测患者肿瘤细胞株或循环肿瘤细胞或肿瘤组织中上述基因的mRNA表达水平，通过计算预测出该患者对TRAIL类似物的敏感性，用于指导针对性的用药。
附图说明
图1：DATR的序列表；
图2：TRAIL受体；
图3：TRAIL与细胞膜上的受体结合诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制；
图4：DR4引物扩增效率；
图5：DR4扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增DR4的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线；溶解温度：81.0℃；
图6：扩增产物与DR4mRNA序列比对；
图7：DR5引物扩增效率；
图8：DR5扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增DR5的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：81.0℃；
图9：扩增产物与DR5mRNA序列比对；
图10：DcR1引物扩增效率；
图11：DcR1扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增DcR1的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：81.5℃；
图12：扩增产物与DcR1mRNA序列比对；
图13：DcR2引物扩增效率；
图14：DcR2扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增DcR2的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：78.5℃；
图15：扩增产物与DcR2mRNA序列比对；
图16：琼脂糖凝胶电泳鉴定实时荧光定量PCR产物；
图17：FADD引物扩增效率；
图18：FADD扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增FADD的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：81.0℃；
图19：扩增产物与FADD mRNA序列比对；
图20：CASP8引物扩增效率；
图21：CASP8扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增FADD的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：79.0℃；
图22：扩增产物与CASP8mRNA序列比对；
图23：c-FLIP引物扩增效率；
图24：c-FLIP扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增c-FLIP的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：80.0℃；
图25：扩增产物与c-FLIP mRNA序列比对；
图26：琼脂糖凝胶电泳鉴定实时荧光定量PCR产物；
图27：HTATIP2引物扩增效率；
图28：HTATIP2扩增曲线和溶解曲线；A：从HCT 116 cDNA中扩增HTATIP2的扩增曲线；B：与A对应的溶解曲线。溶解温度：80.5℃；
图29：扩增产物与HTATIP2mRNA序列比对；
图30：琼脂糖凝胶电泳鉴定实时荧光定量PCR产物；
图31：不同浓度DATR处理下NCI-H460和NCI-H647肿瘤细胞株的生存曲线；
图32：不同浓度DATR处理下NCI-H838和A427肿瘤细胞株的生存曲线；
图33：不同浓度DATR处理下SK-MES-1和NCI-H1650肿瘤细胞株的生存曲线；
图34：不同浓度DATR处理下NCI-H226和NCI-H23肿瘤细胞株的生存曲线；
图35：不同浓度DATR处理下NCI-H661和NCI-H522肿瘤细胞株的生存曲线；
图36：不同浓度DATR处理下SK-CO-1和SW1116肿瘤细胞株的生存曲线；
图37：不同浓度DATR处理下LS 174T和RKO肿瘤细胞株的生存曲线；
图38：不同浓度DATR处理下DLD-1和HCT116肿瘤细胞株的生存曲线；
图39：不同浓度DATR处理下HT-29和SW480肿瘤细胞株的生存曲线；
图40：不同浓度DATR处理下SW620和MDA-MB-231肿瘤细胞株的生存曲线；
图41：不同浓度DATR处理下MCF7和Hep G2肿瘤细胞株的生存曲线；
图42：在DATR 1.33μg/mL处理下，预设生存率<75％的为DATR敏感株，生存率>75％的为DATR耐受株；
图43：利用公式1分析相关因子mRNA表达水平与肿瘤对DATR敏感性的关系的观测值与回归预测值的散点图；图中，1,NCI-H1650；2,NCI-H226；3,NCI-H23；4,NCI-H460；5,NCI-H522；6,NCI-H647；7,NCI-H661；8,NCI-H838；9,A427；10,SK-MES-1；11,SK-CO-1；12,SW1116；13,LS 174T；14,RKO；15,DLD-1；16,HCT116；17,HT-29；18,SW480；19,SW620；20,MDA-MB-231；21,MCF7；22,Hep G2；
图44：利用公式1分析相关因子mRNA表达水平与肿瘤对DATR敏感性的关系的回归标准化残差的标准P-P图；图中，1,NCI-H1650；2,NCI-H226；3,NCI-H23；4,NCI-H460；5,NCI-H522；6,NCI-H647；7,NCI-H661；8,NCI-H838；9,A427；10,SK-MES-1；11,SK-CO-1；12,SW1116；13,LS 174T；14,RKO；15,DLD-1；16,HCT116；17,HT-29；18,SW480；19,SW620；20,MDA-MB-231；21,MCF7；22,Hep G2；
图45：利用公式1分析相关因子mRNA表达水平与肿瘤对DATR敏感性的关系的回归标准化残差的散点图；图中，1,NCI-H1650；2,NCI-H226；3,NCI-H23；4,NCI-H460；5,NCI-H522；6,NCI-H647；7,NCI-H661；8,NCI-H838；9,A427；10,SK-MES-1；11,SK-CO-1；12,SW1116；13,LS 174T；14,RKO；15,DLD-1；16,HCT116；17,HT-29；18,SW480；19,SW620；20,MDA-MB-231；21,MCF7；22,Hep G2；
图46：利用公式1分析相关因子mRNA表达水平与肿瘤对DATR敏感性的关系的ROC曲线图；
图47：依据公式1的最佳诊断临界点划分肿瘤的DATR敏感组和耐受组的生存曲线；
图48：利用公式2分析相关因子mRNA表达水平与肺癌对DATR敏感性的关系的观测值与回归预测值的散点图；图中，1,NCI-H1650；2,NCI-H226；3,NCI-H23；4,NCI-H460；5,NCI-H522；6,NCI-H647；7,NCI-H661；8,NCI-H838；9,A427；10,SK-MES-1；
图49：利用公式1分析相关因子mRNA表达水平与肺癌对DATR敏感性的关系的回归标准化残差的标准P-P图；图中，1,NCI-H1650；2,NCI-H226；3,NCI-H23；4,NCI-H460；5,NCI-H522；6,NCI-H647；7,NCI-H661；8,NCI-H838；9,A427；10,SK-MES-1；
图50：利用公式1分析相关因子mRNA表达水平与肺癌对DATR敏感性的关系的回归标准化残差的散点图；图中，1,NCI-H1650；2,NCI-H226；3,NCI-H23；4,NCI-H460；5,NCI-H522；6,NCI-H647；7,NCI-H661；8,NCI-H838；9,A427；10,SK-MES-1；
图51：利用公式2分析相关因子mRNA表达水平与肺癌对DATR敏感性的关系的ROC曲线图；
图52：依据公式2的最佳诊断临界点划分肺癌的DATR敏感组和耐受组的生存曲线；
具体实施方式
实验例
1.主要材料
1.1.细胞株：所有细胞株(表1)均购于美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection，ATCC)。
表1肿瘤细胞株
Figure BDA0001179104280000061
1.2.试剂：E.Z.N.A.Total RNA Kit I(Omega)；Reverse Transcription System(Promega)；SsoAdvanced SYBR Green Supermix(Bio-Rad)；CCK-8(南京旋光)；GoldView(Solarbio)；E.Z.N.A.Cycle Pure Kit(Omega)；ExTaq(Takara)；pMD19-T Vector CloningKit(Takara)；E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I(Omega)。
1.3.仪器：CFX96Real-Time System(Bio-Rad)；NanoDrop 2000(Thermo Fisher)。
1.4.相关因子引物：如表2。
表2用于qPCR的相关因子引物序列
Figure BDA0001179104280000071
2.方法与结果
2.1.引物验证
2.1.1.引物验证步骤：
2.1.1.1.cDNA文库制备：
提取106个HCT116细胞总RNA，测定其浓度及纯度(A260/A280≈2.00)；以300ng总RNA为模板进行反转录，体系如表3。
表3反转录体系
Figure BDA0001179104280000072
反转录步骤为：42℃15min；42℃60min；95℃5min，置冰上5min。
2.1.1.2.引物特异性验证：
以DEPC水1：10稀释的上述cDNA为模板进行qPCR，体系如表4。
表4 qPCR体系
Figure BDA0001179104280000073
qPCR步骤为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，40cycles；65-95℃0.5increment/0.05s。
2.1.1.3.扩增片段序列验证：
纯化上述qPCR产物，对其进行加A处理，体系如表5。
表5 qPCR产物加A体系
Figure BDA0001179104280000074
加A步骤为：72℃，10min。
纯化上述加A后的qPCR产物，连接至pMD19-T载体上，体系如表6。
表6 pMD19-T连接体系
Figure BDA0001179104280000081
连接步骤为：16℃，2h。
将上述连接产物用100μL TOP10转化后涂于氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃培养过夜。
挑取单克隆菌落入5mL氨苄抗性的LB培养基中，在摇床中37℃250rpm培养过夜。
提取质粒测序，完成序列比对分析。
2.1.1.4.引物扩增效率测定：
将上述质粒分别稀释至1pg/μL、10-1pg/μL、10-2pg/μL、10-3pg/μL、10-4pg/μL。利用上述qPCR体系和步骤测定引物扩增效率。
2.1.2.引物验证结果
2.1.2.1.TRAIL受体：
目的基因：DR4(NM_003844.3)
扩增片段序列：
5’-AATCAGGCAATGGACATAATATATGGGTGATTTTGGTTGTGACTTTGGTTGTTCCGTTGCTGTTGGTGGCTGTGCTGATTGTCTGTTGTTGC-3’
扩增片段长度92bp。扩增效率104.7％(图4)。扩增曲线和溶解曲线如图5所示。经分子克隆验证，扩增产物为DR4mRNA片段，序列比对结果如图6所示。
目的基因：DR5(NM_003842.4,NM_147187.2)
扩增片段序列：
5’-TCAGGCATCATCATAGGAGTCACAGTTGCAGCCGTAGTCTTGATTGTGGCTGTGTTTGTTTGCAAGTCTTTACTGTGGAAGAAAGTCCTTCCTTACCTGA-3’
扩增片段长度100bp。扩增效率93.8％(图7)。扩增曲线和溶解曲线如图8所示。经分子克隆验证，扩增产物为DR5mRNA片段，序列比对结果如图9所示。
目的基因：DcR1(NM_003841.3)
扩增片段序列：
5’-CATACTGGAGCCTGTAACCCGTGCACAGAGGGTGTGGATTACACCAACGCTTCCAACAATGAACCTTCTTGCTTCC-3’
扩增片段长度76bp。扩增效率99.3％(图10)。扩增曲线和溶解曲线如图11所示。经分子克隆验证，扩增产物为DcR1mRNA片段，序列比对结果如图12所示。
目的基因：DcR2(NM_003840.4)
扩增片段序列：
5’-TTGCCTTCTTGCCTGCTATGTACAGTTTGTAAATCAGGTCAAACAAATAAAAGTTCCTGTACCACGACCAGAGAC-3’
扩增片段长度75bp。扩增效率107.5％(图13)。扩增曲线和溶解曲线如图14所示。经分子克隆验证，扩增产物为DcR2mRNA片段，序列比对结果如图15所示。
上述因子的实时荧光定量PCR产物由琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小及特异性(图16)。
2.1.2.2.DISC其他构成因子及相关调控因子：
目的基因：FADD(NM_003824.3)
扩增片段序列：
5’-TGCAGCATTTAACGTCATATGTGATAATGTGGGGAAAGATTGGAGAAGGCTGGCTCGTCAGCTCAAAGTCTCAGACACCAAGATC G-3’
扩增片段长度86bp。扩增效率117.4％(图17)。扩增曲线和溶解曲线如图18所示。经分子克隆验证，扩增产物为FADD mRNA片段，序列比对结果如图19所示。
目的基因：CASP8(NM_001080124.1，NM_001080125.1，NM_001228.4，NM_033355.3，NM_033356.3，NM_033358.3)
扩增片段序列：
5’-AAGAGAATGTTGGAGGAAAGCAATCTGTCCTTCCTGAAGGAGCTGCTCTTCCGAATTAATAGACTGGATTTGCTGATTACCTACCTAA-3’
扩增片段长度88bp。扩增效率114.8％(图20)。扩增曲线和溶解曲线如图21所示。经分子克隆验证，扩增产物为CASP8mRNA片段，序列比对结果如图22所示。
目的基因：c-FLIP(NM_001127183.2，NM_001127184.2，NM_001202516.1，NM_001308042.1，NM_001308043.1，NM_003879.5)
扩增片段序列：
5’-GATACAGATGAGAAGGAGATGCTGCTCTTTTTGTGCCGGGATGTTGCTATAGATGTGGTTCCACCTAATGTCAGG-3’
扩增片段长度75bp。扩增效率113.8％(图23)。扩增曲线和溶解曲线如图24所示。经分子克隆验证，扩增产物为c-FLIP mRNA片段，序列比对结果如图25所示。
上述因子的实时荧光定量PCR产物由琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小及特异性(图26)。
2.1.2.3.其他相关因子：
目的基因：HTATIP2(NM_001098520.1，NM_001098521.1，NM_001098522.1，NM_001098523.1，NM_006410.4)
扩增片段序列：
5’-GTGAATCAAGAAGTGGTGGACTTTGAAAAGTTGGATGACTACGCCTCTGCCTTTCAAGGTCATGATGTTGGATTCTGTTG-3’
扩增片段长度80bp。扩增效率106.3％(图27)。扩增曲线和溶解曲线如图28所示。经分子克隆验证，扩增产物为HTATIP2mRNA片段，序列比对结果如图29所示。
上述因子的实时荧光定量PCR产物由琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小及特异性(图30)。
2.2.肿瘤细胞株中相关因子的mRNA表达水平检测
2.2.1.mRNA表达水平检测步骤：
每株肿瘤细胞提取106个细胞的总RNA，测定其浓度及纯度(A260/A280≈2.00)；以300ng总RNA为模板按上述方法进行反转录获得各自对应的cDNA文库；以DEPC水1：10稀释的cDNA为模板按上述方法进行qPCR，检测目的基因的mRNA表达水平。
2.2.2.mRNA表达水平检测结果：
以Cq值表示，即qPCR的荧光阈值循环数(表7)。GAPDH为内参基因。
表7各肿瘤细胞株中相关因子的mRNA表达水平
Figure BDA0001179104280000101
2.3.肿瘤细胞株对DATR的敏感性测定
2.3.1.肿瘤细胞株对DATR的敏感性测定步骤：
将处于对数生长期的各株肿瘤细胞以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，用100μL相应的完全培养基(含10％FBS)培养24h贴壁；
换为100μL相应的无血清培养基继续培养24h，同时加入不同浓度的DATR处理(最高浓度12μg/mL，依次3倍稀释呈11个浓度梯度)，以不加DATR组作为对照；
加入10μL CCK8 37℃孵育1h。测定OD490、OD630，以其差值指示细胞活力，生存率V(Viability)＝实验组细胞活力/对照组细胞活力；
将DATR 1.33μg/mL处理下，预设生存率<75％的为DATR敏感株，生存率>75％的为DATR耐受株。
2.3.2.肿瘤细胞株对DATR的敏感性测定结果：
各肿瘤细胞株对DATR的敏感性测定结果如图32-42所示。
2.4.相关因子mRNA表达水平的差异与肿瘤对DATR的敏感性的关系
利用SPSS软件，以各肿瘤细胞株中候选相关因子的Cq值为自变量，以1.33μg/mLDATR处理下各肿瘤细胞株的生存率为因变量，进行多元线性回归建模。
2.4.1.针对22株肿瘤细胞的多元线性回归模型Ⅰ
表8.
Figure BDA0001179104280000111
表9.
Figure BDA0001179104280000112
表10.
Figure BDA0001179104280000113
表11.
Figure BDA0001179104280000114
表12.
Figure BDA0001179104280000121
表13.
Figure BDA0001179104280000122
表8-表12：逐步筛选出对多元线性回归模型影响最显著的相关因子CASP8；表13：调整后的多元线性回归模型。
尝试建立多元线性回归模型。在初步筛选中，DcR1、FADD和c-FLIP因对模型的影响显著低于其他相关因子(p>0.70)首先被筛掉，且该模型中常量及所有相关因子均无显著性(p>0.05)(表8)；进一步筛掉DR4、DR5(p>0.4)后，DcR2、CASP8、HTATIP2对模型的影响程度相近但均无显著性(表9-10)；筛掉HTATIP2后，CASP8对模型的影响表现为显著(p<0.05)(表11)；再筛掉DcR2后，CASP8对模型的影响增加(p＝0.012)(表12)。由此逐步筛选出对多元线性回归模型影响最显著的相关因子CASP8。随后反向添加其他因子尝试优化多元线性回归模型。结果显示，加入DR4后，CASP8对模型的影响无显著变化(p＝0.012)，而R2显著增加(调整后R2＝0.375)(表13)，可见该模型更优。因此，公式1为：V＝0.127Cq(DR4)+0.134Cq(CASP8)-6.093；其中V(Viability)指生存率；Cq(X)指qPCR中目的基因X的绝对定量荧光阈值循环数(图43-45)。
2.4.2.针对10株肺癌细胞的多元线性回归模型Ⅱ
表14.
Figure BDA0001179104280000123
表15.
Figure BDA0001179104280000131
表16
Figure BDA0001179104280000132
表14-表16：逐步筛选并建立最优多元线性回归模型。
尝试建立多元线性回归模型。在初步筛选中，DR4、DcR1、FADD和HTATIP2因对模型的影响显著低于其他相关因子(p>0.70)首先被筛掉，且该模型中常量及所有相关因子均无显著性(p>0.05)(表14)，之后DR5、DcR2、CASP8、c-FLIP对模型的影响均表现为显著(表15)，且DR5、DcR2、CASP8的影响程度相近(p<0.01)，CASP8依然为最显著的影响因子(p＝0.001)；若进一步筛掉c-FLIP亦可获得较优的多元线性回归模型(表16)，但不如前者(含c-FLIP调整后R2＝0.916，无c-FLIP调整后R2＝0.837)。因此，公式2为：V＝0.130Cq(DR5)+0.186Cq(DcR2)+0.165Cq(CASP8)-0.085Cq(c-FLIP)-9.975；其中V(Viability)指生存率；Cq(X)指qPCR中目的基因X的绝对定量荧光阈值循环数(图48-50)。
2.5.多元线性回归模型的ROC曲线
利用SPSS软件，依据DATR 1.33μg/mL处理下生存率预设值0.75将肿瘤细胞株分为DATR敏感组和耐受组，带入由上述公式所得的生存率预测值，绘制ROC曲线评价该诊断方法并确定最佳诊断临界点。
2.5.1.多元线性回归模型Ⅰ的ROC曲线
表17 ROC曲线下面积概述
Figure BDA0001179104280000133
表18确定最佳诊断临界点
Figure BDA0001179104280000141
由ROC曲线知，曲线下面积0.867，与真实面积0.500相比差异有统计学意义(图46)，说明该诊断方法水平较高；预测值0.7450为最佳诊断临界点，敏感度100％，特异性67％。
综上所述，利用公式1：V＝0.127Cq(DR4)+0.134Cq(CASP8)-6.093可以有效预测肿瘤细胞株对DATR的敏感性，V预测值0.7450为最佳诊断临界点(图47)。
2.5.2.多元线性回归模型Ⅱ的ROC曲线
表18 ROC曲线下面积概述
Figure BDA0001179104280000142
表19确定最佳诊断临界点
Figure BDA0001179104280000143
由ROC曲线知，曲线下面积1.000，与真实面积0.500相比差异有统计学意义(图51)，说明该诊断方法水平较高；预测值0.6450为最佳诊断临界点，敏感度100％，特异性100％。
综上所述，利用公式2：V＝0.130Cq(DR5)+0.186Cq(DcR2)+0.165Cq(CASP8)-0.085Cq(c-FLIP)-9.975可以有效预测肺癌细胞株对DATR的敏感性，V预测值0.6450为最佳诊断临界点(图52)。
由此可见，就肺癌而言，利用公式2预测其对DATR的敏感性优于公式1，即具有更优的多元线性回归模型和更高的诊断特异性。

Claims (3)

1.检测基因表达水平的试剂在制备预测肿瘤对DATR敏感性的产品中的用途，其特征在于：基因包括DR4、DR5、DcR2、CASP8、c-FLIP和HTATIP2，肿瘤细胞株来源于肺，结直肠，胸或肝，检测步骤如下：
(1)以上述的肿瘤细胞株作为样本库，通过实时荧光定量PCR测定样本库中肿瘤细胞株的DR4、DR5、DcR2、CASP8、c-FLIP和HTATIP2六种基因的mRNA表达水平，以Cq值表示；
(2)在体外实验中测定样本库中肿瘤细胞株在浓度为0.0002-12μg/mL的DATR处理下的生存率，生存率＝实验组细胞活力/对照组细胞活力，指示其对DATR的敏感性；
(3)以肿瘤细胞株中六种基因的Cq值为自变量，以DATR处理下各肿瘤细胞株的生存率为因变量，通过多元线性回归建模，筛选并建立最优的多元线性方程，公式为：
V＝a*Cq(DR4)+b*Cq(DR5)+c*Cq(DcR2)+d*Cq(CASP8)+e*Cq(c-FLIP)+f*Cq(HTATIP2)+g，其中，V指生存率；Cq(X)指qPCR中目的基因X的绝对定量荧光阈值循环数，或相对于GAPDH的相对定量荧光阈值循环数；a-f为系数，g为常数，均可为0；
(4)提取患者肿瘤细胞株或循环肿瘤细胞或肿瘤组织，检测上述基因的mRNA表达水平，即Cq值，代入多元线性方程，通过计算预测该病人对DATR的敏感性。
2.根据权利要求1所述的检测基因表达水平的试剂在制备预测肿瘤对DATR敏感性的产品中的用途，其特征在于，步骤(1)的方法为：
(a)提取肿瘤细胞株的总RNA，以此为模版反转录构建cDNA文库；
(b)利用实时荧光定量PCR检测DR4、DR5、DcR2、CASP8、c-FLIP和HTATIP2六种基因的mRNA表达水平，以Cq值表示。
3.根据权利要求2所述的检测基因表达水平的试剂在制备预测肿瘤对DATR敏感性的产品中的用途，其特征在于，步骤(b)中，
DR4基因的上游引物为5’-AATCAGGCAATGGACATAA-3’，下游引物为5’-GCAACAACAGACAATCAG-3’，
DR5基因的上游引物为5’-TCAGGCATCATCATAGGA-3’，下游引物为5’-TCAGGTAAGGAAGGACTT-3’，
DcR2基因的上游引物为5’-TTGCCTTCTTGCCTGCTA-3’，下游引物为5’-GTCTCTGGTCGTGGTACA-3’，
CASP8基因的上游引物为5’-AAGAGAATGTTGGAGGAA-3’，下游引物为5’-TTAGGTAGGTAATCAGCAA-3’，
c-FLIP基因的上游引物为5’-GATACAGATGAGAAGGAGATG-3’，下游引物为5’-CCTGACATTAGGTGGAAC-3’，
HTATIP2基因的上游引物为5’-GTGAATCAAGAAGTGGTG-3’，下游引物为5’-CAACAGAATCCAACATCAT-3’。
CN201611147049.5A 2016-12-13 2016-12-13 预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法 Active CN106591449B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611147049.5A CN106591449B (zh) 2016-12-13 2016-12-13 预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611147049.5A CN106591449B (zh) 2016-12-13 2016-12-13 预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106591449A CN106591449A (zh) 2017-04-26
CN106591449B true CN106591449B (zh) 2020-09-22

Family

ID=58801100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611147049.5A Active CN106591449B (zh) 2016-12-13 2016-12-13 预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106591449B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1380339A (zh) * 2001-04-10 2002-11-20 成都地奥制药集团有限公司 一种突变的人基因核苷酸序列编码多肽
CN1958794A (zh) * 2005-11-03 2007-05-09 成都地奥制药集团有限公司 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA及制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1380339A (zh) * 2001-04-10 2002-11-20 成都地奥制药集团有限公司 一种突变的人基因核苷酸序列编码多肽
CN1958794A (zh) * 2005-11-03 2007-05-09 成都地奥制药集团有限公司 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变体编码cDNA及制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Acute toxicity of a single dose DATR,recombinant soluble human TRAIL mutant, in rodents and crab-eating macaques;YX Zou等;《Human and Experimental Toxicology》;20100606;第29卷(第8期);645-652 *
Doxorubicin Pretreatment Sensitizes Prostate Cancer Cell Lines to TRAIL Induced Apoptosis Which Correlates with the Loss of c-FLIP Expression;Margaret M. Kelly等;《Cancer Biology & Therapy》;20020813;第1卷(第5期);520-527 *
ER、PR、CA125、Ki67及P53的表达对上皮性卵巢癌化疗敏感性的预测作用;姜秋红等;《中国临床药学杂志》;20121231;第21卷(第6期);354-358 *
Preclinical toxicity of DATR, a recombinant soluble human TRAIL mutant, in rats and cynomolgus monkeys;Xiaodong Zhang等;《Regulatory Toxicology and Pharmacology》;20110812;第61卷(第2期);230-235 *
TRAIL的研究进展;唐蓓等;《生命的化学》;20031231;第23卷(第3期);174-176 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106591449A (zh) 2017-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xue et al. Development and validation of serum exosomal microRNAs as diagnostic and prognostic biomarkers for hepatocellular carcinoma
KR102622309B1 (ko) 염색체 상호작용의 검출
Cutcutache et al. Exome-wide sequencing shows low mutation rates and identifies novel mutated genes in seminomas
Hu-Lieskovan et al. EGF61 polymorphism predicts complete pathologic response to cetuximab-based chemoradiation independent of KRAS status in locally advanced rectal cancer patients
Kim et al. Novel chemosensitive single-nucleotide polymorphism markers to targeted regimens in metastatic colorectal cancer
Wei et al. Whole-genome sequencing of a malignant granular cell tumor with metabolic response to pazopanib
Gomes et al. Influence of functional genetic polymorphism (− 590C/T) in non-small cell lung cancer (NSCLC) development: the paradoxal role of IL-4
Ren et al. Association of MDR1 gene polymorphisms with susceptibility to hepatocellular carcinoma in the Chinese population
Al-Darraji et al. The effect of LL37 antimicrobial peptide on FOXE1 and lncRNA PTCSC 2 genes expression in colorectal cancer (CRC) and normal cells
Niu et al. ACE2 is a prognostic biomarker and associated with immune infiltration in kidney renal clear cell carcinoma: implication for COVID-19
Li et al. SAMD9 Promotes Postoperative Recurrence of Esophageal Squamous Cell Carcinoma by Stimulating MYH9‐Mediated GSK3β/β‐Catenin Signaling
Zhao et al. Recognition of immune-related tumor antigens and immune subtypes for mRNA vaccine development in lung adenocarcinoma
Kanemura et al. The tumor immune microenvironment and frameshift neoantigen load determine response to PD-L1 blockade in extensive-stage SCLC
Cheng et al. Relationship between LAPTM4B gene polymorphism and susceptibility of colorectal and esophageal cancers
CN106591449B (zh) 预测肿瘤对trail类似物敏感性的方法
Gao et al. Quantitative proteomics analysis of differentially expressed proteins in activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma using quantitative proteomics
Zhang et al. Relationship between LAPTM4B gene polymorphism and susceptibility of malignant melanoma in Chinese patients
CN109112213B (zh) 检测黏着斑激酶结构变异体的pcr引物及其检测方法与应用
CN115845057A (zh) 抑制srpk1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性的药物中的应用
JP2020536111A (ja) リンパ腫を処置する方法
Ma et al. Case report: identification of ERC1-RET fusion in a patient with pancreatic ductal adenocarcinoma
Jiang et al. Construction and validation of a necroptosis-related lncRNA signature in prognosis and immune microenvironment for glioma
Suhail et al. Oscillatory Hypoxia Induced Unfolded Protein Folding Response Gene Expression Predicts Low Survival in Human Breast Cancer Patients
Monterde et al. Integrating differential expression, co-expression and gene network analysis for the identification of common genes associated with tumor angiogenesis deregulation
Qu et al. Integration analysis using bioinformatics and experimental validation on the clinical and biological significance of TSLP in cancers

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant