CN115845057A - 抑制srpk1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抑制SRPK1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性的药物中的应用，所述SRPK1的间隔区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明研究SRPK1在NSCLC对gefitinib耐药性中的分子调控机制，基于蛋白相互作用开发一种新型的非激酶活性ATP结合域的SRPK1小分子抑制剂设计靶标，提供SRPK1的间隔区作为药物靶点在抑制wnt信号通路与NSCLC耐药中的治疗新策略。通过抑制SRPK1的间隔区表达，降低wnt途径的GSK3βSer9的磷酸化表达水平和β‑catenin的核内表达，降低NSCLC对gefitinib耐药性，达到治疗NSCLC的效果。

Description

抑制SRPK1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替 尼耐药性的药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及抑制SRPK1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性的药物中的应用。

背景技术

肺癌是危害人类健康的常见的肿瘤之一，肺癌的死亡率高居恶性肿瘤的首位。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80％～85％，是最常见的病理组织类型。肺癌的治疗包括手术切除，放化疗和靶向治疗。即使治疗的手段不断进步，NSCLC患者的5年生存率仍然很低，预后也仍然相对较差。大多数肺腺癌患者在确诊时即为晚期，这类患者的治疗策略主要是化疗和靶向治疗。然而，无论是化疗还是靶向治疗，治疗后30％患者仍会出现不同程度的复发和耐药。因此，肿瘤耐药是NSCLC治疗失败和预后不良的重要原因，为了克服NSCLC的耐药和复发，亟需发展准确、稳定的治疗新靶点，以辅助抵抗NSCLC靶向耐药和复发的风险。50％的晚期NSCLC患者携带表皮生长因子受体(EGFR)突变。携带这类突变的患者肿瘤进展迅速，生存预后差，且往往对传统化疗不敏感。目前，已研发多种药物靶向EGFR的酪氨酸激酶位点的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)被应用于治疗NSCLC患者进行治疗，如gefitinib等。这些TKIs改善了患者的生存，但80～90％的患者将在10～12年内获得TKIs耐药性导致复发。TKIs的继发性耐药已经成为限制其临床应用和患者生存预后差的关键因素，因此，为了克服及逆转NSCLC对EGFR-TKIs耐受，需要寻找耐药发生后潜在的稳定、特异的新靶点，协同指导临床用药，以提高临床疗效，改善患者预后。

丝/精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)及其下游靶点在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌等多种癌症激活机制中发挥关键作用，SRPK1可以作为肿瘤靶向治疗的潜在广谱靶点。目前已研发出少量SRPK1抑制剂，其中SRPIN340是一种SRPK1/2的高选择性异烟酰胺类ATP竞争抑制剂，可通过选择性地抑制SRPK1的活性调节VEGF、FAS、MAP2K1和MAP2K2基因的表达；在黑色素瘤中，注射SRPIN340具有抗肿瘤活性；在小鼠眼血管生成模型中，SRPIN340被发现具有抗血管生成的活性。类似的抑制剂SRPKIN-1与SRPIN803也均被报道能够抑制VEGF的生成，SRPKIN-1具有抑制促血管生成的VEGF-A165a亚型的活性，从而阻断激光诱导的新生血管；SRPIN803由于对CK2和SRPK1的双重抑制作用能更有效地抑制VEGF的产生。此外，腹腔内注射SRPK1抑制剂SPHINX可降低各种前列腺癌、淋巴和髓系白血病、黑色素瘤和色素细胞癌的肿瘤生长。然而，上述传统SRPK1抑制剂主要是针对其激酶的ATP结合域进行设计，细胞内ATP水平常在毫摩尔范围内，ATP竞争性激酶抑制剂能达到的的效力十分有限；其次，长期给药时ATP结合位点极易产生耐药性突变，许多临床批准的ATP竞争性抑制剂中均有耐药突变，如上述所说的NSCLC中EGFR的TKIs耐药突变等。不同于基于ATP结构的激酶抑制剂，肽抑制剂DBS1可阻断SRPK1和SRSF1(富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子1)之间的蛋白质-蛋白质相互作用，有效抑制SRSF1的结合和磷酸化，改变VEGF的剪接异构体从而抑制血管生成，但该类口服肽类抑制剂在药物递送方面仍具有很大的挑战性。此外，SRPK1参与NSCLC患者的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药，目前也尚无相关研究。针对这个问题进行深入、全面的探究，研究SRPK1调控NSCLC耐药的分子机制，进一步寻找SRPK1高选择性的新靶点，对NSCLC耐药的逆转及临床治疗中发挥重要的指导作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供抑制SRPK1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性的药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段的试剂在制备SRPK1抑制剂和/或治疗肺癌的药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种降低治疗肺癌的药物的耐药性的药物。、

本发明的第三个目的是提供一种检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段的试剂，在制备评估肺癌对抗酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段的试剂在制备SRPK1抑制剂和/或治疗肺癌的药物中的应用，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

优选地，所述试剂通过抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段与GSK3β结合，抑制SRPK1蛋白对GSK3β的磷酸化修饰。

优选地，所述治疗肺癌的药物为降低治疗肺癌的药物的耐药性的药物。

更优选地，所述耐药性为对抗酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。

更优选地，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。

最优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

一种降低治疗肺癌的药物的耐药性的药物，所述药物中含有SRPK1抑制剂，所述SRPK1抑制剂用于抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

优选地，所述SRPK1抑制剂通过抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段与GSK3β结合，抑制SRPK1蛋白对GSK3β的磷酸化修饰。

优选地，所述耐药性为对抗酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。

更优选地，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。

最优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

一种检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段的试剂，在以下任意一项或几项中的应用：

在制备评估肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的试剂盒中的应用；

在评估肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性中的应用；

在筛选对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物中的应用；

在制备筛选对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物的试剂盒的应用；

其中，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

优选地，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。

更优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

肺癌对酪氨酸激酶抑制剂有耐药性的检测结果是，检测出SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的片段与GSK3β结合，SRPK1蛋白对GSK3β有磷酸化修饰。

对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物对应的检测结果是，所述治疗药物抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段与GSK3β结合，抑制SRPK1蛋白对GSK3β的磷酸化修饰。

一种评估肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的方法，其特征在于，检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段。

肺癌对酪氨酸激酶抑制剂有耐药性的检测结果是，检测出SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的片段与GSK3β结合，SRPK1蛋白对GSK3β有磷酸化修饰。

优选地，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。

优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

一种筛选对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物的方法，其特征在于，检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段。

对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物对应的检测结果是，检测出所述治疗药物抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段与GSK3β结合，抑制SRPK1蛋白对GSK3β的磷酸化修饰。

优选地，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。

优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了提供抑制SRPK1的间隔区在制备降低治疗非小细胞肺癌的吉非替尼耐药性的药物中的应用，所述SRPK1的间隔区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明研究SRPK1在非小细胞肺癌(NSCLC)对gefitinib耐药性中的分子调控机制，进一步突破SRPK1的传统激酶抑制剂的瓶颈，基于蛋白相互作用开发一种新型的非激酶活性ATP结合域的SRPK1小分子抑制剂设计靶标，提供SRPK1的间隔区作为药物靶点在抑制wnt信号通路与NSCLC耐药中的治疗新策略。通过敲除和/或抑制SRPK1的间隔区，用于降低wnt途径的GSK3βSer9的磷酸化表达水平和β-catenin的核内表达，降低NSCLC对gefitinib耐药性，从而达到治疗NSCLC的效果。

附图说明

图1为免疫组织化学方法检测SRPK1蛋白在NSCLC患者的临床样本中的表达，其中，PFS指无进展生存期，是患者给药后到下次进展之间的时间间隔(月)。图中显示6例代表性结果，每例展示了200x(100μM)和400x(50μM)两种放大倍数。

图2为PFS>9和PFS≦9两组NSCLC患者临床样本切片的SRPK1免疫组化染色的统计分析箱型图，以平均光密度值(MOD)继进行定量。两组之间的差异用非配对t检验，p<0.05为有显著性差异。

图3为实时荧光定量检测SRPK1在gefitinib敏感细胞NCI-H1650、PC9和gefitinib耐药细胞NCI-H1975、PC9GR中的转录表达。其中A为电泳图，B为SRPK1在NSCLC耐药与敏感的细胞中的相对mRNA表达水平统计图。

图4为免疫印迹法检测SRPK1在gefitinib敏感细胞NCI-H1650、PC9和gefitinib耐药细胞NCI-H1975、PC9GR中蛋白表达情况。

图5为用慢病毒感染法在敏感细胞NCI-H1650、PC9中构建过表达SRPK1的及耐药细胞NCI-H1975、PC9 GR中构建敲低SRPK1的稳定细胞株。其中A为NCI-H1650和NCI-H1975细胞，B为PC9和PC9 GR细胞。

图6为MTT法检测所构建稳定细胞株中gefitinib给药的半数抑制浓度(IC50)。其中A为NCI-H1650和NCI-H1975细胞，B为PC9和PC9 GR细胞。

图7为将稳定细胞株在裸鼠皮下成瘤的生长情况。其中A为将稳定细胞株在裸鼠皮下成瘤的生长情况照片，B为各组肿瘤生长情况曲线图。

图8为用PI/AnnexinⅤ双染法检测稳定细胞株在gefitinib给药后的细胞凋亡。其中A为PC9细胞组，B为PC9 GR细胞组。

图9为PI/AnnexinⅤ染色结果分析柱状图。

图10为免疫印迹法表明SRPK1激酶活性缺失突变(K109A)的细胞模型成功构建。

图11为MTT法检测不同细胞模型中gefitinib给药的IC50。其中A为NCI-H1650细胞组，B为PC9细胞组。

图12为免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达情况。其中A为NCI-H1650细胞组，B为PC9细胞组。

图13为双荧光酶报告基因实验检测稳定细胞株中wnt通路激活情况。

图14为实时荧光定量检测稳定细胞株中wnt信号通路下游靶基因的mRNA水平。

图15为免疫印迹法检测稳定细胞株中wnt激活的上游关键蛋白的表达。

图16为应用免疫沉淀法检测SRPK1与GSK3β在细胞内存在互作。

图17为相应标签质粒转染后用免疫沉淀法检测SRPK1与GSK3β在细胞内互作。

图18为用体外GST Pulldown检测在原核表达纯化的SRPK1、GSK3b蛋白是否直接相互作用。

图19为用同位素标记放射自显影标记磷酸化修饰的蛋白。

图20为体外激酶实验检测原核表达纯化的His-SRPK1是否促进GST-GSK3β的Ser9位点磷酸化修饰而失活。

图21为体内激酶检测质粒转染后胞内表达纯化的的HA-SRPK1是否促进GST-GSK3β的Ser9位点磷酸化修饰。

图22为过表达及敲低SRPK1的细胞模型免疫印分析显示。

图23为SRPK1全长进行单功能片段的删减后的示意图。

图24为GST Pulldown实验寻找与GSK3β在互作的SRPK1片段。

图25为体外激酶实验检测SRPK1的S片段影响GSK3βSer9位点的磷酸化修饰。

图26为双荧光素酶报告基因检测SRPK1的S片段对wnt信号通路的影响。

图27为MTT实验检测SRPK1的S片段对gefitinib耐药性的影响。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1分析丝/精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)是参与调控吉非替尼(gefitinib)敏感性的分子靶标

一、实验方法

SRPK1基因在NCBI上的登录号为Gene ID:6732(人源)；其蛋白质在NCBI上的登录号为NP_003128(人源)。分析对gefitinib耐药的组织和细胞中的SRPK1的表达水平，明确SRPK1与非小细胞肺癌(NSCLC)细胞对gefitinib耐药的相关性。

1、免疫组化分析吉非替尼治疗NSCLC后出现肿瘤进展的NSCLC患者样本中SRPK1的表达情况，以无进展生存时间进行患者的分组，明确SRPK1在NSCLC的患者组织中的表达与给药后的无进展生存期之间是否具有相关性。

无进展生存期(PFS)定义为给药开始到病人出现肿瘤进展或死亡的时间。收集来自医院的NSCLC病人的病理组织，根据病例回顾分析每位患者PFS。吉非替尼治疗的PFS中位数在9～10个月，故将组织分为PFS>9和PFS≤9两组。将gefitinib敏感及耐药病人组织进行分组固定、包埋和切片，得到石蜡切片。将石蜡切片放置于60°烤箱烤片120min进行脱蜡，而后依次将其放入二甲苯I、II各浸泡15min脱蜡，各乙醇梯度(乙醇体积浓度由高至低：100％、95％、75％和0％)浸泡3min，水洗5min复水。用EDTA抗原修复液浸泡复水切片，在微波炉里高火10min至沸腾后，再选择抵档火修复20min。取出切片自然冷却至室温后，用PBST洗3次，用免疫组化笔圈出组织，用3％双氧水浸润切片30min(RT避光)，去除内源性过氧化物酶。用PBS洗3次，甩干后5％BS室温封闭30min。去除封闭液，至于湿盒中，对圈内的组织滴加1：50稀释的SRPK1一抗100μL，4℃过夜。次日，恢复室温(25℃)30min后，PBS洗3次，5min/次，滴加稀释好的二抗100μL，37℃孵育30min。PBS洗3次后，滴加新鲜配置的DAB显色液染色，水盒冲洗1h后苏木素细胞核染色7min，水洗，盐酸酒精分化5s，流水浸入30min。脱水时，乙醇梯度(乙醇体积浓度由低至高：60％、80％和100％)各2min。用二甲苯浸泡切片2min使切片透明化，最后加入中性树胶封片，用病理切片扫面仪扫描石蜡组织切片。任取10个视野分析染色强弱，用image J对染色结果进行分析，将所得各组平均光密度值(MOD)用PRISM7软件处理，绘制NSCLC病人组织切片的SRPK1表达箱型图。

2、实时荧光定量检测SRPK1在gefitinib耐药细胞和敏感细胞中的mRNA水平，探究SRPK1在NSCLC耐药与敏感的细胞中的mRNA转录水平差异。

用Trizol法提取gefitinib敏感细胞NCI-H1650、PC9和gefitinib耐药细胞NCI-H1975、PC9GR细胞的总RNA，用逆转录试剂盒分别将所述总RNA逆转为cDNA后，以NCI-H1650细胞为control组，以PC9、NCI-H1975和PC9GR细胞为实验组，选择GAPDH基因作为内参基因，设计检测SRPK1的qPCR引物，并设置3次技术重复，用SYBR Green法实时定量PCR检测。

所述SRPK1的qPCR引物如下：

Forward:ATGGAGCGGAAAGTGCTTG；Reverse:GAGCCTCGGTGCTGAGTTT。

根据扩增过程生成的扩增曲线及得到各组Ct值，计算ΔCt(ΔCt＝基因值-内参均值)，再得到ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(control组均值)，最后计算每组得出2^(-ΔΔCt)的值，即为SRPK1在NSCLC耐药与敏感的细胞中的相对mRNA表达水平。

3、免疫印迹法检测SRPK1在gefitinib耐药细胞和敏感细胞中的蛋白表达水平，明确SRPK1在NSCLC耐药与敏感的细胞中的蛋白表达差异。

用细胞裂解液收集gefitinib敏感细胞NCI-H1650、PC9和gefitinib耐药细胞NCI-H1975、PC9GR细胞的总蛋白，用BCA法定量后，用免疫印迹法检测不同细胞中SRPK1的蛋白表达水平，并使用image J对每个条带灰度值定量，将每组SRPK1与内参(β-tubulin)的比值进行定量分析。

二、实验结果

如图1和图2所示，SRPK1在NSCLC的患者组织中的表达与患者给药后的无进展生存时间之间具有显著相关性。与PFS较长、肿瘤延缓进展的患者相比，PFS较短、肿瘤进展较快的患者组织中SRPK1表达显著较高。表明在NSCLC患者的吉非替尼治疗过程中，SRPK1的高表达促进疾病进展，促进吉非替尼耐药。如图3所示，图3A为SRPK1在NSCLC耐药与敏感的细胞中的相对mRNA表达情况的实时荧光定量电泳图，图3B为SRPK1在NSCLC耐药与敏感的细胞中的相对mRNA表达水平统计图，gefitinib敏感细胞(NCI-H1650、PC9)相比，SRPK1在gefitinib耐药细胞(NCI-H1975、PC9 GR)中mRNA水平更高，耐药细胞系中SRPK1 mRNA水平显著高于敏感细胞系。如图4所示，免疫印迹结果及其定量分析显示，与敏感细胞(NCI-H1650、PC9)相比，SRPK1在gefitinib耐药细胞(NCI-H1975、PC9 GR)中蛋白表达量更高，耐药细胞系中SRPK1蛋白表达量高于的敏感细胞系。

以上结果表明，SRPK1的表达与gefitinib给药后的进展与耐药存在相关性，SRPK1是参与调控gefitinib敏感性的分子靶标。

实施例2丝/精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)是调节吉非替尼(gefitinib)敏感性的关键靶点

一、实验方法

1、慢病毒感染构建过表达SRPK1基因和敲低SRPK1基因的细胞模型。

(1)过表达细胞株的构建：分别瞬时转染慢病毒载体pSin-Vector质粒或pSin-SRPK1过表达质粒于293FT细胞，得到转染pSin-Vector质粒的293FT细胞和转染pSin-SRPK1过表达质粒的293FT细胞，每组293FT细胞都共转染pSPAX2和pMD2.G病毒包装质粒，4～8h后换液，48h后收集上清病毒液，经0.45μM滤膜过滤后，gefitinib敏感细胞NCI-H1650培养基中分别加入上述2种过滤的病毒液，gefitinib敏感细胞PC9的培养基中也分别加入上述2种过滤的病毒液，感染24h。感染完成后，加入嘌呤霉素(puromycin)筛选一周。得到转染慢病毒载体pSin-Vector质粒的NCI-H1650细胞模型(NCI-H1650 Vector)、转染pSin-SRPK1过表达质粒的NCI-H1650细胞模型(NCI-H1650 SRPK1)、转染慢病毒载体pSin-Vector质粒的PC9细胞模型(PC9 Vector)和转染pSin-SRPK1过表达质粒的PC9细胞模型(PC9 SRPK1)。

用免疫印迹法检测构建的NCI-H1650 Vector、NCI-H1650 SRPK1、PC9 Vector和PC9 SRPK1细胞模型的SRPK1表达情况，判断细胞模型是否构建成功。若NCI-H1650 SRPK1细胞中SRPK1相比于NCI-H1650 Vector高表达即代表构建成功；若PC9 SRPK1细胞中SRPK1相比于PC9 Vector高表达即代表构建成功。

(2)敲低细胞株的构建：分别瞬时转染pLKO.1-Vector载体质粒或pLKO.1-SRPK1-sh1或pLKO.1-SRPK1-sh2的敲低质粒于293T细胞中，得到转染pLKO.1-Vector载体质粒的293T细胞、转染pLKO.1-SRPK1-sh1敲低质粒的293T细胞和转染pLKO.1-SRPK1-sh2敲低质粒的293T细胞。每组293FT细胞都共转染pSPAX2、pMD2.G病毒包装质粒，4～8h后换液，48h后收集上清病毒液，经0.45μM滤膜过滤后，gefitinib耐药细胞NCI-H1975培养基中分别加入上述3种过滤的病毒液，gefitinib耐药细胞PC9GR培养基中也分别加入上述3种过滤的病毒液，感染24h。感染完成后，加入puromycin筛选一周。得到转染pLKO.1-Vector载体质粒的NCI-H1975细胞模型(NCI-H1975 Vector)、转染pLKO.1-SRPK1-sh1敲低质粒的NCI-H1975细胞模型(NCI-H1975 SRPK1-sh1)、转染pLKO.1-SRPK1-sh2敲低质粒的NCI-H1975细胞模型(NCI-H1975 SRPK1-sh2)、转染pLKO.1-Vector载体质粒的PC9GR细胞模型(PC9 GRVector)、转染pLKO.1-SRPK1-sh1敲低质粒的PC9GR细胞模型(PC9 GR SRPK1-sh1)和转染pLKO.1-SRPK1-sh2敲低质粒的的PC9GR细胞模型(PC9 GR SRPK1-sh2)。

用免疫印迹法检测构建的NCI-H1975 Vector、NCI-H1975 SRPK1-sh1、NCI-H1975SRPK1-sh2、PC9 GR Vector、PC9 GR SRPK1-sh1和PC9 GR SRPK1-sh2细胞模型的SRPK1表达情况表达情况，判断是否构建成功。

若NCI-H1975 SRPK1-sh1细胞中SRPK1相比于NCI-H1975 Vector低表达即代表构建成功；若NCI-H1975 SRPK1-sh2细胞中SRPK1相比于NCI-H1975 Vector低表达即代表构建成功；若PC9 GR SRPK1-sh1细胞中SRPK1相比于PC9 GR Vector低表达即代表构建成功；若PC9 GR SRPK1-sh2细胞中SRPK1相比于PC9 GR Vector低表达即代表构建成功。

2、MTT法检测所构建稳定细胞株中gefitinib给药的半数抑制浓度(IC₅₀)。

MTT法检测所构建非小细胞肺癌(NSCLC)细胞模型对gefitinib的敏感性变化，确定SRPK1的表达调控NSCLC细胞对gefitinib的敏感性。

以步骤1构建PC9 Vector细胞作PC9 SRPK1细胞的对照组，NCI-H1650 Vector细胞作NCI-H1650 SRPK1细胞的对照组。NCI-H1975 Vector细胞作NCI-H1975 SRPK1-sh1细胞和NCI-H1975 SRPK1-sh2细胞的对照组，PC9 GR Vector细胞作PC9 GR SRPK1-sh1细胞和PC9GR SRPK1-sh2细胞的对照组。

将上述稳定细胞株，分别以5000细胞/孔密度种于96孔板中，种植12h后加入含有梯度浓度gefitinib的培养基，所述梯度浓度为0、0.2、1、2、5、10、20、30、40和50μM，放入培养箱中继续培养48h后，每孔加入含20μL的CellTiter

AQueous One Solution Assay底物的培养基100μL，等待反应30～60min，用多功能酶标仪进行检测，计算不同浓度下的gefitinib处理细胞后的平均值占对照组的百分比，所得结果即为细胞活力(cellviability)，将所得结果用PRISM7软件处理，绘制不同细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀)的箱型图。

3、构建裸鼠皮下成瘤模型，观察并记录gefitinib给药时小鼠肿瘤体积的变化，明确SRPK1的表达对皮下肿瘤对gefitinib的耐药性的相关性。

将步骤1构建的PC9 Vector细胞、PC9 SRPK1细胞、PC9 GR Vector细胞或PC9 GRSRPK1-sh2细胞分别种植到BALB/c裸鼠皮下，待肿瘤体积长到50mm³后，将gefitinib以5mg/kg剂量给药，每3天以腹腔注射给药1次，并测量肿瘤体积。给药27天后将裸鼠安乐死，小心剥离肿瘤，记录肿瘤体积并拍照。

4、PI/Annexin Ⅴ双染法检测所构建NSCLC细胞模型在gefitinib给药后的细胞凋亡情况，明确SRPK1的表达与gefitinib引起的细胞凋亡的相关性。

将步骤1构建的PC9 Vector细胞、PC9 SRPK1细胞、PC9 GR Vector细胞或PC9 GRSRPK1-sh2细胞用浓度为0、1、5、10μM的gefitinib给药诱导24h，收集细胞并用标记缓冲液重悬细胞，吸取适量细胞用Annexin V-FITC试剂盒(Promega，Cat.#JA1000 and JA1001)标记早期的细胞凋亡，同时PI染色标记死细胞，反应完成后立即流式细胞仪上机检测，同时检测Annexin V-FITC(绿色荧光)和PI(红色荧光)的信号，对早期凋亡和死亡及晚期凋亡的细胞比例进行分析。将流式细胞仪所得结果输入PRISM7软件，绘制各组细胞给药后的凋亡率的柱状图。

二、实验结果

如图5A所示，与NCI-H1650 Vector细胞相比，NCI-H1650 SRPK1细胞中检测到SRPK1表达信号增加。如图5B所示，与PC9 Vector细胞相比，PC9 SRPK1细胞中检测到SRPK1表达信号增加。与NCI-H1975 Vector细胞相比，NCI-H1975SRPK1-sh1细胞和NCI-H1975SRPK1-sh2细胞中检测到SRPK1表达信号减少，与PC9 GR Vector细胞相比PC9 GR SRPK1-sh1细胞和PC9 GR SRPK1-sh2细胞中检测到SRPK1表达信号减少，表明已成功构建NCI-H1650、PC9过表达SRPK1的细胞模型和NCI-H1975、PC9 GR敲低SRPK1的细胞模型。如图6A所示，与NCI-H1650 Vector相比，NCI-H1650 SRPK1细胞存活率更高(p<0.05)，反之，与NCI-H1975 Vector相比，NCI-H1975 SRPK1-sh1或NCI-H1975 SRPK1-sh2的细胞存活率更低(p<0.05)。如图6B所示，与PC9 Vector细胞相比PC9 SRPK1细胞存活率更高(p<0.05)，反之，与PC9 GR Vector相比，PC9 GR SRPK1-sh1或C9 GR SRPK1-sh2细胞存活率更低(p<0.05)。过表达SRPK1降低了敏感细胞NCI-H1650和PC9对gefitinib的敏感性，敲低SRPK1则增加了耐药细胞NCI-H1975和PC9 GR对gefitinib的敏感性。图7A为稳定细胞株在裸鼠皮下成瘤的生长情况照片。如图7B所示，在gefitinib给药情况下，与对照组相比，PC9SRPK1组小鼠肿瘤显著维持生长，gefitinib敏感性下降；PC9 GR SRPK1-sh2组小鼠肿瘤生长受抑制，恢复了其对gefitinib的敏感性。过表达SRPK1的PC9细胞在gefitinib给药时维持裸鼠皮下肿瘤的生长，敲低SRPK1则抑制了裸鼠皮下肿瘤的生长。如图8A所示，随着gefitinib给药浓度升高，与PC9 Vector细胞相比，PC9 SRPK1细胞中，凋亡早期的细胞(annexin V单阳，右下象限)和凋亡中期(PI/AnnexinⅤ双阳，右上象限)显著减少。如图8B所示，随着gefitinib给药浓度升高，与PC9 GR Vector细胞相比，PC9 GR SRPK1-sh2细胞中凋亡细胞显著增多。如图9所示，分别将PC9 SRPK1细胞的凋亡率之和和PC9 GR SRPK1-sh2细胞的凋亡率之和输入PRISM7软件，得到PC9细胞PI/AnnexinⅤ染色结果分析柱状图和PC9 GR细胞PI/AnnexinⅤ染色结果分析柱状图，PC9SRPK1细胞中细胞凋亡率显著减少(p<0.05)，PC9 GR SRPK1-sh2中凋亡率显著增多(p<0.05)。

以上结果表明，在gefitinib敏感细胞中过表达SRPK1抑制了gefitinib给药诱导的细胞凋亡，而在耐药细胞中敲低SRPK1促进了细胞gefitinib给药后的细胞凋亡。

实施例3丝/精氨酸蛋白激酶1激酶活性缺失突变体对非小细胞肺癌抗凋亡的影响

SRPK1作为丝精氨酸激酶，用于特异性磷酸化RNA剪切因子内SR结构域，使SR蛋白与mRNA前体特异性结合，从而促进mRNA的正确剪接，其激酶活性在肿瘤中发挥重要的作用。因此，本发明构建SRPK1的激酶活性缺失的突变体SRPK1-K109A(SEQ ID NO：1)，该突变体无法结合ATP，SRPK1激酶活性丧失，考察SRPK1对非小细胞肺癌(NSCLC)抗凋亡的影响。

一、实验方法

1、利用瞬时转染的方式构建不同表达的细胞模型

构建携带HA-Vector标签质粒、SRPK1野生型(WT)cDNA的HA标签质粒(HA-SRPK1-WT)及携带SRPK1激酶活性缺失突变型(K109A)cDNA的HA标签质粒(HA-SRPK1-K109A)，HA-SRPK1-WT和HS-SRPK1-K109A质粒经Sanger测序正确后，HA-Vector标签质粒、HA-SRPK1-WT和HS-SRPK1-K109A经Lipo3000脂质体瞬时转染PC9、NCI-H1650细胞，得到转染HA-Vector标签质粒的PC9细胞(PC9-HA-Vector细胞)，转染HA-SRPK1-WT质粒的PC9细胞(PC9-SRPK1 WT细胞)，转染HS-SRPK1-K109A质粒的PC9细胞(PC9-SRPK1 K109A细胞)，转染HA-Vector标签质粒的NCI-H1650细胞(NCI-H1650-HA-Vector细胞)，转染HA-SRPK1-WT质粒的NCI-H1650细胞(NCI-H1650-SRPK1 WT细胞)和转染HS-SRPK1-K109A质粒的NCI-H1650细胞(NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞)，6h后换液，转染48h后提取各细胞的蛋白，用免疫印迹法检测SRPK1的表达情况验证是否可以成功表达。

2、MTT法检测SRPK1激酶活性缺失突变型(K109A)对gefitinib给药后细胞凋亡敏感性影响

将步骤1构建的PC9-HA-Vector细胞、PC9-SRPK1 WT细胞、PC9-SRPK1 K109A细胞、NCI-H1650-SRPK1 WT细胞、NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞和NCI-H1650-HA-Vector细胞，分别以5000细胞/孔密度种于96孔板中，种植12h后加入含有梯度浓度gefitinib的培养基，所述梯度浓度为0、0.2、1、2、5、10、20、30、40和50μM，放入培养箱中继续培养48h后，每孔加入含20μL的CellTiter

AQueous One Solution Assay底物的培养基100μL，等待反应30～60min，用多功能酶标仪进行检测，计算不同浓度下的gefitinib处理细胞后的平均值占对照组的百分比，所得结果即为细胞活力(cell viability)，将所得结果用PRISM7软件处理，绘制半数抑制浓度(IC₅₀)的箱型图。

3、免疫印迹法检测SRPK1激酶活性缺失突变型(K109A)对NSCLC细胞凋亡蛋白表达的影响

收集本实施例步骤1构建的NCI-H1650-HA-Vector细胞、NCI-H1650-SRPK1 WT细胞、NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞、PC9-HA-Vector细胞、PC9-SRPK1 WT细胞和PC9-SRPK1K109A细胞，裂解液收集总蛋白，用免疫印迹法进一步明确细胞模型中SRPK1激酶活性缺失突变型(K109A)对抗凋亡蛋白BcL-xL及凋亡蛋白cleave-casepase3蛋白表达水平的影响。

二、实验结果

如图10所示，与NCI-H1650-HA-Vector细胞相比，NCI-H1650-SRPK1 WT细胞和NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞中检测到SRPK1表达信号显著增强，表明质粒可以在细胞内成功表达，成功构建了NCI-H1650-SRPK1 WT(SRPK1野生型)细胞和NCI-H1650-SRPK1 K109A(SRPK1激酶活性缺失突变型)细胞。与PC9-HA-Vector细胞相比，PC9-SRPK1 WT细胞和PC9-SRPK1K109A细胞中检测到SRPK1表达信号显著增强，表明质粒可以在细胞内成功表达，成功构建了PC9-SRPK1 WT细胞和PC9-SRPK1 K109A细胞。如图11A所示，与NCI-H1650-HA-Vector细胞相比，NCI-H1650-SRPK1 WT细胞和NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞存活率更高(p<0.05)。NCI-H1650-SRPK1 WT细胞和NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞之间无显著性差异。同样地，如图11B所示，与PC9-HA-Vector细胞相比，PC9-SRPK1 WT细胞和PC9-SRPK1 K109A细胞存活率更高(p<0.05)。PC9-SRPK1 WT细胞和PC9-SRPK1 K109A细胞之间无显著性差异。转染SRPK1激酶活性缺失突变(HA-SRPK1-K109A)质粒的细胞模型同样降低NSCLC细胞的gefitinib处理的凋亡敏感性。表明SRPK1 K109A在NSCLC抗凋亡中与SRPK1 WT表现一样的功能。如图12所示，随着gefitinib给药浓度升高，与0μM组相比，各组细胞抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达会随之减少。如图12A所示，在gefitinib同一浓度作用下，与NCI-H1650-HA-Vector细胞相比，NCI-H1650-SRPK1 WT细胞和NCI-H1650-SRPK1 K109A细胞抗凋亡蛋白Bcl-xL表达上调，但促凋亡蛋白Cleaved Caspase 3下调。如图12B所示，与PC9-HA-Vector细胞相比，PC9-SRPK1 WT细胞和PC9-SRPK1 K109A细胞抗凋亡蛋白Bcl-xL表达上调，但促凋亡蛋白Cleaved Caspase3下调。进一步表明携带NCI-H1650-SRPK1 WT(SRPK1野生型)质粒和NCI-H1650-SRPK1K109A(SRPK1激酶活性缺失突变型)质粒均促进抗凋亡蛋白的表达介导NSCLC抗凋亡，与SRPK1激酶活性无关。

以上结果表明SRPK1激酶活性缺失对非小细胞肺癌(NSCLC)抗凋亡能力不产生影响，SRPK1在gefitinib耐药中表现的抗凋亡能力与其激酶活性无关。

实施例4 SRPK1通过wnt/β-catenin途径拮抗细胞凋亡

经典Wnt信号是由β-catenin介导的Wnt信号途径，在没有Wnt信号的情况下，细胞内的β-catenin会被由Axin、APC、GSK3和CK1形成的降解复合体降解，Wnt配体能够抑制β-catenin的降解介导β-catenin在细胞核内积累，从而与TCF/LEF家族转录因子形成复合体，共同起始Wnt下游靶基因的转录。SRPK1可以参与Wnt通路调控，促进NSCLC细胞干性。Wnt信号可通过上调Bcl-xL、Caspase抑制剂Survivin等抗凋亡蛋白来阻止细胞凋亡，因此，本发明进一步考察SRPK1与wnt/β-catenin途径调控gefitinib敏感性的联系，探究SRPK1是否通过wnt/β-catenin途径拮抗细胞凋亡。

一、实验方法

1、双荧光酶报告基因检测所构建非小细胞肺癌(NSCLC)细胞模型中wnt通路的转录活性

(1)将实施例2中所构建的NCI-H1650 Vector、NCI-H1650 SRPK1、PC9 Vector、PC9SRPK1、NCI-H1975 Vector、NCI-H1975 SRPK1-sh1、NCI-H1975 SRPK1-sh2、PC9 GR Vector、PC9 GR SRPK1-sh1、PC9 GR SRPK1-sh2的稳定细胞模型分别铺板于24孔板，每组6个复孔。

(2)种植12h后，每组取3个复孔转染含TCF/LEF DNA结合位点的TOP-Flash萤火虫荧光素酶质粒，每组另外3个复孔转染包含突变的TCF/LEF DNA结合位点的FOP-Flash萤火虫荧光素酶质粒作阴性对照，每组6个复孔均共转染表达海肾荧光素酶载体作为内对照，从而消除细胞活力、转染效果、裂解效果等系统误差。

(3)质粒转染4～8h后换液，48h后用细胞裂解液收样，用双荧光素酶报告基因系统试剂盒和多功能酶标仪检测各组萤火虫荧光素酶(Firefly)活性及海参荧光素酶(Renilla)活性，根据各组所得荧光素酶活性(Firefly/Renilla)数据进一步得到TOP-Flash组与FOP-Flash组的比值(TOP/FOP Flash)，即为wnt通路的活性，分析各组之间的wnt通路的转录活性之间是否有差异。

2、实时荧光定量检测NSCLC细胞模型中经典wnt信号通路下游靶基因的mRNA水平

收获实施例2中所构建的NCI-H1650 Vector、NCI-H1650 SRPK1、PC9 Vector、PC9SRPK1稳定细胞模型，Trizol法提取其总RNA，用逆转录试剂盒将其逆转为cDNA后，以NCI-H1650 Vector、PC9 Vector为control组，以NCI-H1650 SRPK1、PC9 SRPK1为实验组，选择GAPDH基因作为内参基因，设计wnt信号通路下游靶基因BcL-xL、CCD1、c-Myc、Mcl-1和Survivin的qPCR引物(表1)，设置3次技术重复，以SYBR Green法实时定量PCR。

根据扩增过程生成的扩增曲线及得到各组Ct值，计算ΔCt(ΔCt＝基因值-内参均值)，再得到ΔΔCt值(ΔΔCt值＝ΔCt(实验组)-ΔCt(control组均值))，最后计算每组得出2^(-ΔΔCt)的值，即可检测实验组中BcL-xL、CCD1、c-Myc、Mcl-1和Survivin的mRNA表达水平。

表1 BcL-xL、CCD1、c-Myc、Mcl-1和Survivin的qPCR引物

3、免疫印迹法检测NSCLC细胞模型中β-catenin的核内表达及GSK3β的磷酸化水平

β-catenin在胞质中的稳定性受其降解复合体(Axin、APC、GSK3和CK1)调控，复合体可以促进β-catenin Ser33/37位点的磷酸化，从而介导其泛素化降解。当GSK3βSer9位点被磷酸化失活后，在没有Wnt信号的情况下，胞浆内β-catenin无法降解从而异常积累入核，从而异常激活wnt通路。因此，考察SRPK1是否通过促进GSK3βSer9位点磷酸化失活激活Wnt通路。

收获实施例2中所构建的NCI-H1650 Vector、NCI-H1650 SRPK1、PC9 Vector、PC9SRPK1、NCI-H1975 Vector、NCI-H1975 SRPK1-sh1、NCI-H1975 SRPK1-sh2、PC9 GR Vector、PC9 GR SRPK1-sh1、PC9 GR SRPK1-sh2的稳定细胞模型，裂解收集细胞总蛋白，用亚组分分离法提取细胞核内蛋白并保留部分总蛋白，免疫印迹法分析β-catenin核内表达情况及总蛋白中GSK3β磷酸化水平。

二、实验结果

如图13所示，NCI-H1650细胞组中，以NCI-H1650 Vector为对照组，过表达SRPK1的NCI-H1650 SRPK1细胞TOP/FOP Flash比值显著升高，表明Wnt/β-catenin活性更高。PC9细胞组中，以PC9 Vector为对照组，过表达SRPK1的PC9 SRPK1细胞TOP/FOP Flash比值显著升高，表明Wnt/β-catenin活性更高。NCI-H1975细胞组中，以NCI-H1975 Vector为对照组，敲低SRPK1的NCI-H1975 SRPK1-sh1和H1975 SRPK1-sh2细胞的TOP/FOP Flash比值减少，wnt活性受抑制。PC9 GR细胞组中，以PC9 GR Vector为对照组，敲低SRPK1的PC9 GR SRPK1-sh1和PC9 GR SRPK1-sh2的TOP/FOP Flash比值减少，wnt活性受抑制。表明高表达SRPK1促进wnt通路激活，而敲低SRPK1相应抑制了wnt通路的活性。如图14所示，以NCI-H1650 Vector细胞为对照组NCI-H1650 SRPK1细胞中BcL-xL、CCD1、c-Myc、Mcl-1和Survivin的mRNA表达水平显著升高。以PC9 Vector为对照组，PC9 SRPK1细胞中BcL-xL、CCD1、c-Myc、Mcl-1和Survivin的mRNA表达水平显著升高。表明SRPK1的过表达促进了wnt下游靶基因的转录表达增多。如图15所示，以NCI-H1650 Vector为对照组，NCI-H1650 SRPK1免疫印迹法检测到的GSK3βpSer9和核内β-catenin信号显著增多。以PC9 Vector为对照组，PC9 SRPK1免疫印迹法检测到的GSK3βpSer9和核内β-catenin信号显著增多。表明过表达的SRPK1增加了敏感细胞NCI-H1650、PC9中GSK3βSer9位点的磷酸化和β-catenin的核内表达。以NCI-H1975Vector为对照组，NCI-H1975 SRPK1-sh1和H1975 SRPK1-sh2的免疫印迹法检测到的GSK3βpSer9和核内β-catenin信号显著减少。以PC9 GR Vector为对照组，PC9 GR SRPK1-sh1和PC9 GR SRPK1-sh2的免疫印迹法检测到的GSK3βpSer9和核内β-catenin信号显著减少。表明敲低SRPK1后则抑制耐药细胞NCI-H1975、PC9 GR中GSK3βSer9位点的磷酸化和β-catenin的核内表达。上述结果表明SRPK1的高表达促进β-catenin的核内表达以及总蛋白中GSK3β的磷酸化，抑制SRPK1的表达则起相反的作用。

综上所述，结果表明SRPK1通过促进GSK3β的磷酸化，从而激活wnt/β-catenin通路，促进下游靶基因表达而拮抗细胞凋亡。

实施例5 SRPK1通过蛋白-蛋白相互作用调控GSK3β自磷酸化

一、实验方法

1、明确SRPK1与GSK3β内源性及外源性的蛋白-蛋白相互作用

用免疫共沉淀的方法，将SRPK1及GSK3β的特异性抗体分别富集NCI-H1975细胞的SRPK1及GSK3β蛋白，明确SRPK1与GSK3β的内源性相互作用。

为排除这种互作是由于抗体的非特异性反应导致的，设计引物，用分子克隆法构建携带标签的FLAG-GSK3β、HA-SRPK1质粒，在293T细胞中共表达两种质粒，用标签抗体做免疫共沉淀实验来验证，明确SRPK1与GSK3β的外源性相互作用。

SRPK1引物为：

Forward:ATGGAGCGGAAAGTGCTTGC；Reverse:TTAGGAGTTAAGCCAAGGGTGC。

GSK3β引物为：

Forward:ATGTCAGGGCGGCCCAGA；Reverse:TCAGGTGGAGTTGGAAGCTGA。

2、明确SRPK1与GSK3β直接的蛋白-蛋白相互作用

以本实施例步骤1的SRPK1和GSK3β的引物，用分子克隆法构建在原核细胞表达的His-SRPK1及GST-GSK3β的质粒，在大肠杆菌中表达并亲和纯化重组蛋白，用GST pulldown实验来验证SRPK1与GSK3β间是否存在直接相互作用。

为了明确SRPK1、GSK3β的激酶活性及GSK3β的主要磷酸化位点Ser9对SRPK1-GSK3β互作的影响，设计引物(表1)，用分子克隆法构建携带标签的SRPK1激酶活性缺陷的His-SRPK1(K109A)、SRPK1激酶活性缺陷的GST-GSK3β(K85A)和磷酸化修饰缺陷的GST-GSK3β(S9A)的质粒，将纯化的带不同标签融合蛋白共同孵育过夜，用GST-pulldown明确SRPK1K109A及GSK3βK85A、S9A位点突变对SRPK1-GSK3β互作的影响。

表1 SRPK1(K109A)、GSK3β(S9A)和GSK3β(K85A)的引物序列

3、通过体外重组蛋白来源的SRPK1探究SRPK1对GSK3β的磷酸化修饰

用步骤2纯化的重组融合蛋白His-SRPK1野生型(WT)或His-SRPK1(K109A)分别与GST-GSK3β野生型(WT)、磷酸化修饰缺陷的GST-GSK3β(S9A)、没有激酶活性的GST-GSK3β(K85A)及激酶活性与磷酸化修饰双缺陷的GST-GSK3β(K85A/S9A)在含有32P-ATP的体外激酶实验缓冲液中孵育(30℃，30min)，通过放射自显影观察放射性同位素存在的位置，判断GST-GSK3β能否被His-SRPK1磷酸化(与³²P-ATP交换放射性同位素³²P)。由此明确SRPK1在体外能否对GSK3β磷酸化修饰，其主要修饰位点是否是Ser9。

4、采用体内来源的SRPK1探究SRPK1对GSK3β的磷酸化修饰

为了排除体外重组蛋白缺乏翻译后修饰从而活性降低以及缺乏分子伴侣的影响，用本实施例步骤1的方法，在293T细胞中表达SRPK1、HA-SRPK1和HA-SRPK1(K109A)，将从293T细胞中纯化收集内源性的SRPK1激酶、内源性的HA-SRPK1或HA-SRPK1(K109A)分别与GST-GSK3β野生型(WT)、磷酸化修饰缺陷的GST-GSK3β(S9A)、SRPK1激酶活性缺陷的GST-GSK3β(K85A)、激酶活性与磷酸化修饰双缺陷的GST-GSK3β(K85A/S9A)在体外激酶实验缓冲液中孵育(30℃，30min)，观察GST-GSK3β能否被SRPK1磷酸化。由此明确SRPK1在体内对GSK3β磷酸化修饰情况。

为了排除放射自显影观察中GSK3β其他磷酸化位点修饰干扰的影响，同时用GSK3βSer9位点的磷酸化特异性抗体Phospho-GSK3β(Ser9)检验是否生成了GSK3βpSer9以进一步验证实验结果。

5、明确SRPK1在体内对GSK3β的磷酸化修饰

如果GSK3β在体外被SRPK1进行修饰的话，那么SRPK1在细胞内也能对GSK3β进行磷酸化修饰。为此在NSCLC细胞中用慢病毒介导基因表达技术及RNAi技术过表达或抑制SRPK1的表达，用GSK3βSer9的磷酸化特异性抗体来监测GSK3β的磷酸化修饰状态。

二、实验结果

如图16所示，两种免疫沉淀复合物中均可检测到SRPK1及GSK3β蛋白存在，表明SRPK1与GSK3β之间存在内源性相互作用。如图17第2泳道所示，HA-SRPK1与FLAG-GSK3β的标签抗体可以相互富集，而第1泳道中的阴性对照无法富集。表明，SRPK1与GSK3β之间存在外源性相互作用。如图18所示，在第2～5、7～10泳道中，GST-GSK3β野生型(WT)及SRPK1激酶活性缺陷的GST-GSK3β(K85A)、磷酸化修饰缺陷的GST-GSK3β(S9A)和磷酸化修饰双缺陷的GST-GSK3β(K85A/S9A)的纯化蛋白均可下拉His-SRPK1和His-SRPK1(K109A)蛋白，而第1、6泳道的阴性对照组不能够下拉两种His标签蛋白，说明SRPK1与GSK3β存在直接的蛋白-蛋白相互作用，而这种作用与SRPK1、GSK3β的激酶活性及GSK3β的磷酸化位点无关。结果表明SRPK1与GSK3β在体外直接相互作用。如图19所示，与第1泳道相比，第5、9泳道中His-SRPK1或His-SRPK1(K109A)的加入均显著促进了GST-GSK3β的磷酸化水平，说明GST-GSK3β可以被His-SRPK1磷酸化且这种作用不受SRPK1激酶活性调控，表明His-SRPK1促进GST-GSK3β的自磷酸化。但在磷酸化位点Ser9突变后，在第6、10泳道中磷酸化水平与第2泳道几乎没有差异，说明His-SRPK1或His-SRPK1(K109A)无法磷酸化磷酸化修饰缺陷的GST-GSK3β(S9A)，表明His-SRPK1对GST-GSK3β的磷酸化修饰位点主要是Ser9。如图20所示，与第1泳道相比，第5、9泳道中GST-GSK3βpSer9的表达水平明显上调，表明外源性的SRPK1可以在体外促进GSK3βSer9位点的自磷酸化。如图21所示，与第1泳道相比，第5、9泳道中GSK3βpSer9的表达水平明显上调，表明内源性的SRPK1在体外直接促进GSK3βSer9位点的自磷酸化。如图22所示，在PC9、NCI-H1650细胞中过表达的SRPK1后，GSK3βSer9的磷酸化表达水平上调。这些结果证明，SRPK1在体内也促进GSK3βSer9位点的自磷酸化修饰。

以上结果表明SRPK1与GSK3β直接蛋白-蛋白相互作用，促进GSK3βSer9位点的自磷酸化修饰，从而参与调控Wnt信号通路拮抗凋亡、促进Gefitinib耐药。

实施例6 SRPK1非激酶活性ATP结合域的SRPK1小分子抑制剂设计靶标开发

一、实验方法

目前已有一些SRPK1的抑制剂被研究和报道出来，但它们全都属于与ATP竞争的抑制剂。然而，ATP竞争的抑制剂不仅要与细胞内高浓度的ATP竞争，还容易因目标激酶ATP结合域耐药突变的产生而失效。这种ATP结合域的耐药突变会阻止药物的结合但不影响激酶的催化活性，并且目前已经在多种临床批准的以蛋白激酶为靶向目标的ATP竞争的小分子抑制剂中被发现。SRPIN340对SRPK1介导GSK3βSer9位点的磷酸化调控无显著性影响，ATP竞争抑制剂在针对依赖于蛋白-蛋白间相互作用进行的磷酸化调控中可能无法起到相应的作用。因此进行靶向激酶底物对接槽小分子抑制剂开发。

1、明确SRPK1与GSK3β直接互作的肽段

目前已知SRPK1全长为655个氨基酸包含4个主要的功能片段，其中1至57为N端，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；57至225为第一个激酶活性片段K1(kinase domains I-VI)，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；225至491为间隔区(spacer)，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；491至655为第二个激酶活性片段K2(kinase domains VII-XI，包括C端)，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

(1)首先将SRPK1全长进行单功能片段的删减，用分子克隆技术中SOE-PCR方法，通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增，从而将两段不相邻基因片段连接在一起，成为新的杂交基因片段，以分别形成删除SRPK1各个功能片段的序列。

具体思路为：删除SRPK1的N端片段(SEQ ID NO：2)，得到SRPK1-ΔN(SEQ ID NO：6)，删除SRPK1的间隔区spacer片段(SEQ ID NO：4)，得到SRPK1-ΔS(SEQ ID NO：7)，删除SRPK1的第一个激酶活性片段K1(SEQ ID NO：3)，得到SRPK1-ΔK1(SEQ ID NO：8)，删除SRPK1的第二个激酶活性片段K2(SEQ ID NO：5)，得到SRPK1-ΔK2(SEQ ID NO：9)。

(2)用表2中引物进行SOE-PCR延伸后，用T4连接酶分别将其与酶切后的C端含有一个6×His标签的pet-28a载体16℃连接过夜，次日将连接产物分别转化于大肠杆菌DH-5α并涂布卡那霉素抗性的平板上，12h后挑取存活的单个菌落于LB培养基，37℃摇床培养12h后提取质粒并测序，检测质粒是否构建成功，得到构建成功的His-SRPK1-ΔN、His-SRPK1-ΔS、His-SRPK1-ΔK1和His-SRPK1-ΔK2质粒。

表2 SRPK1(ΔK1)、SRPK1(ΔK2)和SRPK1ΔS引物序列

(3)将构建成功的His-SRPK1-ΔN、His-SRPK1-ΔS、His-SRPK1-ΔK1和His-SRPK1-ΔK2质粒转化于在大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单个菌落过夜培养后，以1：100的比例扩培于200mLYT培养基，待2h后培养至对数生长期后，加入0.03mM IPTG在16℃摇床进行诱导蛋白表达，20h后离心收菌。用PBS重悬细菌，加入溶菌酶冰浴1h后，以100w功率超声15min破碎裂解细菌，再次离心收取上清蛋白后，使用相应的Ni NTABeads纯化携带His标签的蛋白，并用含咪唑的洗脱液将其蛋白洗脱后，考马斯亮蓝染色进行定量后保存。

(4)将步骤(3)纯化后的蛋白通过与GST-GSK3β进行GST-pulldown实验，用GSTbeads下拉可以与GST-GSK3β互作的蛋白，明确SRPK1各个功能片段在与GSK3β相互作用中的重要性。

(5)进一步，用与本实施例同样步骤纯化SRPK1蛋白的全长His-SRPK1-FL、SRPK1删减S片段的蛋白His-SRPK1-ΔS和只有SRPK1的S片段的蛋白His-SRPK1-S，将其分别与GST-GSK3β在体外激酶实验缓冲液中孵育(30℃，30min)，通过免疫印迹法检测激酶反应中GSK3β是否被磷酸化产生GSK3βpSer9，判断GST-GSK3β能否被His-SRPK1-S磷酸化，明确SRPK1的S片段在体外能否直接促进GSK3βSer9的磷酸化修饰而无需其他K1、K2激酶结构。

2、在体内验证SRPK1的S片段的功能

在明确SRPK1的S片段与GSK3β互作的基础上，为了排除截短型蛋白在体内翻译后修饰以及定位改变对调控机制的干扰，在未经处理的PC9细胞及实施例1中构建的敲低SRPK1的PC9 GRSRPK1-sh1细胞内，将本实施例步骤1纯化的HA-Vector、HA-SRPK1-FL、HA-SRPK1-ΔS和His-SRPK1-S质粒分别和TOP/FOP报告基因及海肾荧光素酶基因共转染，用双荧光素酶报告基因检测实验分析Wnt信号通路的转录活性，明确SRPK1的S片段在促进wnt/β-catenin途径激活中重要性。

紧接着在NSCLC中采用MTT实验检测SRPK1的S片段对NSCLC细胞凋亡能力的影响，进一步明确S片段的功能，由此评估S片段作为抑制剂设计靶标的价值。在PC9细胞及敲低SRPK1的PC9 GR SRPK1-sh1细胞内，转染HA-Vector、HA-SRPK1-FL、HA-SRPK1-ΔS或His-SRPK1-S质粒，经过Gefitinib处理48h后检测细胞的半数致死率(IC₅₀)。

二、实验结果

图23为SRPK1全长进行单功能片段的删减后的示意图。如图24所示，在第5～8泳道中，纯化后的GST-GSK3β可以拉下His-SRPK1-ΔN、His-SRPK1-ΔK1及His-SRPK1-ΔK2三种重组蛋白，但无法下拉His-SRPK1-ΔS蛋白。表明GST-GSK3β通过S片段与His-SRPK1结合，S片段删除后的蛋白His-SRPK1-ΔS则失去与GSK3β的结合能力。如图25所示，结果表明，His-SRPK1-FL和His-SRPK1-S促进对GSK3βSer9位点的磷酸化修饰，在第3泳道中，纯化的S片段直接促进GSK3βSer9的磷酸化表达，而第4泳道的His-SRPK1-ΔS失去了这个能力。以上结果表明，SRPK1的S片段在其与GSK3β相互作用，促进GSK3βSer9的自磷酸化过程中发挥着重要作用。如图26A和图26B所示，PC9细胞和PC9 GR SRPK1-sh1细胞内，与HA-Vector相比，HA-SRPK1-FL、HA-SRPK1-S显著增强细胞内Wnt转录活性，而HA-Vector与HA-SRPK1-ΔS之间没有显著差异。表明SRPK1中S片段在细胞内单独表达也激活Wnt/β-catenin信号通路，与前述机制一致。如图27A和图27B所示，PC9细胞和PC9 GR SRPK1-sh1细胞内，与HA-Vector相比，HA-SRPK1-FL、HA-SRPK1-S显著拮抗Gefitinib给药后诱导的细胞凋亡，显著增加Gefitinib的IC₅₀，而HA-Vector与HA-SRPK1-ΔS则不能，表明SRPK1的抗凋亡能力也主要通过S片段发挥作用。

以上结果表明SRPK1通过S片段与GSK3β的相互作用，激活Wnt/β-catenin通路。该结果体现了SRPK1的非激酶活性的S片段在调控Wnt/β-catenin信号通路及拮抗细胞凋亡、维持肿瘤进展中发挥着关键作用，直接作为SRPK1的潜在候选靶标，证明了S片段作为设计靶标在肿瘤耐药解救及协同用药方面有广泛的应用前景和临床价值。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段的试剂在制备SRPK1抑制剂和/或治疗肺癌的药物中的应用，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗肺癌的药物为降低治疗肺癌的药物的耐药性的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述耐药性为对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼。

5.根据权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。

6.一种降低治疗肺癌的药物的耐药性的药物，其特征在于，所述药物中含有SRPK1抑制剂，所述SRPK1抑制剂用于抑制SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述耐药性为对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。

8.一种检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段的试剂，在以下任意一项或几项中的应用：

在制备评估肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的试剂盒中的应用；

在评估肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性中的应用；

在筛选对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物中的应用；

在制备筛选对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物的试剂盒的应用；

其中，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

9.一种评估肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的方法，其特征在于，检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

10.一种筛选对酪氨酸激酶抑制剂具有耐药性的肺癌的治疗药物的方法，其特征在于，检测SRPK1蛋白中氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的片段，所述SRPK1蛋白在NCBI上的登录号为NP_003128。

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