CN109112213B - 检测黏着斑激酶结构变异体的pcr引物及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物及其检测方法与应用，包括检测黏着斑激酶串联重复突变体的PCR引物和/或检测黏着斑激酶可变剪切异构体的PCR引物和/或检测黏着斑激酶点突变体的PCR引物；所述检测方法包括利用检测黏着斑激酶基因内部的串联重复突变体引物和/或可变剪切异构体引物和/或检测黏着斑激酶点突变体的PCR引物进行PCR扩增，进而将上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和/或进行Sanger测序；本发明所提供PCR引物及其检测方法利用特异性反转录PCR方法检测肿瘤组织或外周血中黏着斑激酶结构变异体，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、所需时间短、可行性强等优点，在黏着斑激酶抑制剂的临床应用中具有一定意义。

Description

检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物及其检测方法与应用

技术领域

本发明涉及肺癌相关基因检测领域，具体涉及到一种检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物及其检测方法与应用。

背景技术

细胞外基质参与调控许多细胞生物学行为，包括细胞形态的维持，增殖与分化，细胞的运动能力等。其中，细胞外基质与一个细胞的肌动蛋白细胞骨架之间的物理联系由被称为“黏着斑”的细胞器组成，它们通过整合素蛋白发挥作用。局部黏着斑内的整合素蛋白通过胞外受体段与细胞外基质配体结合，除了形成结构连接，成簇活化的整合素蛋白还能够起始细胞内信号传导过程，从而调控细胞增殖、存活和迁移等重要的生物学功能。虽然整合素蛋白自身没有催化活性，但是其胞内段与黏着斑内的多个信号分子和结构蛋白相互作用，介导细胞外基质信号的传导，其中，局部黏着斑激酶是最早鉴定到的黏着斑信号分子，在黏着斑信号传导的过程中起着重要的作用。

黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是物种间高度保守的非受体型酪氨酸激酶，在多种组织中广泛表达。FAK蛋白主要由4个结构域组成：位于N端的FERM结构域，位于中间的激酶结构域，C端的黏着斑靶向FAT结构域以及脯氨酸富集结构域。FERM结构域存在于多种细胞骨架蛋白中，由三叶的蛋白相互作用结构区域组成，通过分子内相互作用介导FAK激酶活性的自抑制，除了与FAK激酶区直接作用，FERM还可以直接或间接地结合整合素蛋白、活化的生长因子受体胞内端，从而调控FAK的活化。FAK的C端没有激酶催化活性，包括长度约100个氨基酸的FAT结构域，FAK通过FAT结构域的α螺旋结构与黏着斑结构蛋白paxillin结合，而paxillin可以直接结合整合素受体的胞内段和黏着斑蛋白vinculin，因此FAT结构域对FAK在黏着斑的定位起着重要作用。

从FAK最早作为Src激酶的底物在癌基因v-Src转化的细胞中被发现以来，大量的研究证据表明FAK参与调控肿瘤细胞的增殖、存活、粘附、侵袭转移等多个生物学过程，在肿瘤的发生和发展中扮演着重要作用。一方面，FAK具有激酶活性依赖的功能，能够被结合细胞外基质的整合素蛋白活化，活化的FAK与Src激酶形成复合物，通过磷酸化下游蛋白和蛋白之间的相互作用介导多个信号通路(包括PI3K/Akt、ERK和JNK/MAPK通路等)的活化，从而促进肿瘤的生长和转移；另一方面，FAK还可以作为分子支架，与p53、Mdm2等蛋白结合，通过激酶非依赖的方式调控肿瘤细胞的增殖和存活。

大量研究证据表明，FAK在多种肿瘤类型中高表达，其中包括非小细胞肺癌。在肺癌细胞系和肺癌肿瘤组织中，FAK均是磷酸化程度最高的非受体型酪氨酸激酶，并且FAK的表达上调与肺癌肿瘤的分期与病人的生存期相关。研究发现，在头颈癌、乳腺癌、结肠鳞细胞癌和肺癌细胞系等多种肿瘤类型中，FAK的基因发生扩增，增加的基因拷贝数与FAK表达的上调在部分肿瘤类型中具有相关性，并且在体内和体外模型中，抑制FAK的表达和活化能够抑制肿瘤细胞的生长和存活，阻止肿瘤的形成和转移。因而，大量的实验证据已证实了FAK作为肿瘤治疗靶点的潜力。

目前，一些FAK小分子抑制剂进入早期临床实验，展现了良好的临床应用前景。FAK的小分子抑制剂主要分为两类：一类是ATP竞争性的激酶抑制剂，可以抑制FAK的激酶活性；另一类是靶向FAK分子支架的结构抑制剂。针对FAK分子支架结构的抑制剂还处于研发的早期，而FAK小分子激酶抑制剂受到较多关注，部分已经处在临床I期/II期或临床前实验中。抑制剂PF-562,271和GSK2256098分别在2008年和2009年开始临床I期实验。结果显示两个药物均具有较低的副作用和较好的耐受性。另外，抑制剂PF-04554878在临床I期实验中显示了更好的药物动力学特征，一些卵巢癌、结直肠癌和胆管癌病人的疾病进程稳定。在另一个PF-04554878的临床II期实验中，实验对象是KRAS突变的非小细胞肺癌患者。研究人员分别根据肺癌病人CDKN2A(INK4A和ARF的编码基因)和TP53的突变状态来检测病人对抑制剂的敏感性。大量肿瘤体外和体内实验以及临床前实验表明，FAK小分子抑制剂单独使用或与其他靶向药物或细胞毒性药物联合使用均展现出了良好的抗肿瘤效应，并且具有较好的细胞耐受性。因此，FAK抑制剂在肿瘤临床治疗上具有良好的应用前景。

然而，由于生物体中所存在的基因突变有可能导致最终翻译出的蛋白质以及功能的变化，相应地也会影响到医学上对其检测的灵敏性与准确性，但目前并没有对肺癌中FAK结构变异体的研究，因此，检测肿瘤细胞特异的FAK突变体在FAK抑制剂的临床应中有可能具有一定意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

由于目前没有对肺癌中FAK结构变异体的研究，因此检测肿瘤细胞特异的FAK突变体对指导FAK抑制剂的临床应用具有一定意义。

本发明的目的在于提供一种检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物及其检测方法与应用，其具有灵敏度度高、特异性强、可行性强等优点，在黏着斑激酶抑制剂的临床应用中具有一定意义。

为实现上述目的，本发明提供了一种检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物，包括检测黏着斑激酶串联重复突变体的PCR引物和/或检测黏着斑激酶可变剪切异构体的PCR引物和/或检测黏着斑激酶点突变体的PCR引物。

上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在另一种实施方式中，所述黏着斑激酶串联重复突变体包括FAK-ITD，其中，相比于野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA，FAK-ITD对应的成熟mRNA为在野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA的第27号外显子后同向串联地插入有编码野生型黏着斑激酶的第6-27号外显子的串联重复融合区域；检测FAK-ITD的PCR引物靶向编码野生型黏着斑激酶的第6-27号外显子区域；可选的，所述检测FAK-ITD的PCR引物中的正向引物所靶向的编码野生型黏着斑激酶的外显子编号大于反向引物所靶向的编码野生型黏着斑激酶的外显子编号；进一步可选的，检测FAK-ITD的PCR引物中的正向引物靶向编码野生型黏着斑激酶的第27号外显子区域，检测FAK-ITD的PCR引物中的反向引物靶向编码野生型黏着斑激酶的第6号外显子区域。

FAK基因内部序列串联重复突变体FAK-ITD中，约175kb的基因组片段chr8:141690508-141865885发生同向的串联重复扩增。比对FAK转录本NM_153831基因组断裂位点分别位于FAK第5号内含子和第27号内含子内，重复扩增的区域包含FAK完整的第6-27号外显子。在FAK-ITD的成熟的mRNA中，第27号外显子与第6号外显子发生同向融合，外显子之间不增加或删除额外的序列。在野生型FAK转录产物中不存在该外显子融合。串联重复的第6-27号外显子区域长度为3的整数倍，因此FAK-ITD不发生移码，重复扩增的蛋白区域包括FAK FERM结构域的部分C端序列以及完整的酪氨酸激酶结构域。

上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在另一种实施方式中，所述检测FAK-ITD的PCR引物中的正反向引物的碱基序列依次为：

FITD：5’-GAAAGATTACCAATGCCTCCAA-3’即SEQ ID:1，

RITD：5’-TCTCCCAGTATGATCGCCGTAT-3’即SEQ ID:2。

本发明是根据FAK转录本NM_153831第6-27号外显子的碱基序列设计反转录PCR扩增引物，引物对应扩增片段的长度应为300-1000bp，符合反转录PCR的要求。

上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在另一种实施方式中，所述黏着斑激酶可变剪切异构体包括FAK^6/7，其中，相比于野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA，FAK^6/7对应的成熟mRNA在野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA中插入Box6外显子序列和Box7外显子序列中的至少一种，并且所述Box6外显子序列是位于编码野生型黏着斑激酶的第14号外显子之后的长度18bp、编码6个氨基酸的外显子序列，所述Box7外显子序列是位于编码野生型黏着斑激酶的第15号外显子之后的长度21bp、编码7个氨基酸的外显子序列；检测FAK^6/7的PCR引物靶向Box6外显子序列、Box7外显子序列和第14-16号外显子区域中的至少一种。

上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在另一种实施方式中，靶向Box6外显子序列的检测FAK^6/7的PCR引物中，正向引物的3’端至少15个碱基对应于Box 6外显子序列，反向引物对应于编码野生型黏着斑激酶的第16号外显子及其之后的序列；

靶向Box7外显子序列的检测FAK^6/7的PCR引物中，正向引物对应于编码野生型黏着斑激酶的第14号外显子及其之前的序列，反向引物中的3’端至少15个碱基对应于Box 7外显子序列；

靶向第14-16号外显子区域的检测FAK^6/7的PCR引物中，正向引物对应于编码野生型黏着斑激酶的第14号外显子及其之前的序列，反向引物对应于编码野生型黏着斑激酶的第16号外显子及其之后的序列。

上述可变剪切异构体FAK^6/7的三种可变剪切情况：FAK⁶、FAK⁷和FAK^6,7分别由两个FAK可变外显子不同组合表达产生，其中，Box 6长度为18bp，Box 7长度为21bp；FAK⁶为单独表达Box 6，FAK⁷为单独表达Box 7，FAK^6，7为同时表达Box 6和7。

上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在另一种实施方式中，靶向Box6外显子序列的检测FAK^6/7的PCR引物中，正向引物为Fi6，反向引物为Rplus；

靶向Box7外显子序列的检测FAK^6/7的PCR引物中，正向引物为Fplus，反向引物为Ri7；

靶向第14-16号外显子区域的检测FAK^6/7的PCR引物中，正向引物为Fplus，反向引物为Rplus，并且所述引物Fplus、Rplus、Fi6和Ri7的碱基序列依次为：

Fplus：5’-AAGCAAGGCATGCGGACACA-3’即SEQ ID:3；

Rplus：5’-CTCTTTGAATCTCATAATCCCTGG-3’即SEQ ID:4；

Fi6：5’-ATGAAATTAGTGGGGACG-3’即SEQ ID:5；

Ri7：5’-CTTCATCTATTCCATAGCT-3’即SEQ ID:6；

可选的，所述引物Fi6的5’端还包含序列A，所述序列A与引物Fi6所对应的Box6外显子序列的上游序列相匹配；进一步可选的，所述引物Ri7的5’端还包含序列B，所述序列B与引物Ri7所对应的插入Box7外显子序列的黏着斑激酶可变剪切异构体的下游序列相匹配。

本发明上述提供的检测FAK^6/7的反转录PCR引物设计方案共包括三类引物：第一类引物为Fplus和Rplus所组成的正反向引物对；第二类引物为可变剪切外显子Box 6特异性扩增正向引物；第三类引物为可变剪切外显子Box 7特异性扩增反向引物。Fplus和Rplus分别位于FAK第14号和第16号外显子上，局部扩增FAK第14-16号外显子区域；正向引物Fi6的3’端18个碱基对应Box 6序列；反向引物Ri7的3’端19个碱基对应Box 7序列。

上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在另一种实施方式中，所述黏着斑激酶点突变体包括p.A1004S，其中，相比于野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA，p.A1004S对应的成熟mRNA在野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA蛋白编码区的第3010处碱基发生突变；检测p.A1004S的PCR引物靶向野生型黏着斑激酶的整个蛋白编码区，可选的，所述黏着斑激酶的整个蛋白编码区位于野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA序列的311bp-3469bp，所述检测p.A1004S的PCR引物中的正向引物靶向野生型黏着斑激酶的整个蛋白编码区的5’端上游，反向引物靶向野生型黏着斑激酶的整个蛋白编码区3’端下游；进一步可选的，所述检测p.A1004S的PCR引物中的正反向引物的碱基序列依次为：

Fcds:AGCTCCTCAAGAATAACGGAAGG即SEQ ID:7，

Rcds:AAATGAACCCAAATCAAAGTGT即SEQ ID:8。

上述点突变体p.A1004S为首次被鉴定出来，比对人类hg19参考基因组序列，其基因组位置为chr8：141,669,714；比对野生型FAK的成熟mRNA序列，该点位于蛋白编码区第3010处碱基位置；比对野生型FAK的氨基酸序列，该突变导致第1004位的丙氨酸突变成丝氨酸；FAK第1004位丙氨酸位于其C端无催化活性的黏着斑靶向结构域，此结构域通过与黏着斑内的结构蛋白相互作用调控FAK的黏着斑定位，因此，点突变p.A1004S可能影响FAK的黏着斑定位，进而调控FAK的功能。

本发明还提供了一种检测黏着斑激酶结构变异体的方法，包括如下步骤：

(1)提取患者肿瘤组织和/或外周血样品的RNA，生成cDNA的第一条链；

(2)以上述cDNA的第一条链为模板，利用上述检测黏着斑激酶串联重复突变体的PCR引物和/或检测黏着斑激酶可变剪切异构体的PCR引物和/或检测黏着斑激酶点突变体的PCR引物进行PCR扩增；

(3)将上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和/或进行Sanger测序。

上述检测方法在另一种实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为：

93℃-95℃预变性4-5min；

循环扩增：93℃-95℃ 30s-1min，55-60℃ 30s-1min，延伸：70-72℃ 30s-1min，

30-35个循环之后，继续在70-72℃延伸3-5min。

本发明还提供了上述检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在制备检测黏着斑激酶结构变异体的产品中的应用。

在本发明中除了所涉及的黏着斑激酶结构变异体，其余涉及的黏着斑激酶均指野生型黏着斑激酶。

在本发明中所涉及的某碱基对应于某序列或者某序列与某序列相匹配中的“对应于”和“相匹配”为“相同”或“互补”的含义，其中本发明所涉及的引物是按照本领域的引物设计原则进行设计的。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所提供的检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物及其检测方法利用特异性反转录PCR方法检测肿瘤组织和/或外周血中黏着斑激酶结构变异体，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、所需时间短、可行性强等优点，在黏着斑激酶抑制剂的临床应用中具有一定意义。

附图说明

图1A是FAK以及FAK-ITD的基因结构图，图1B和图1C分别是以实施例1中患者肿瘤组织cDNA为模板，使用PCR引物FITD-RITD进行反转录PCR扩增后的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测图及Sanger测序图。

图2A是实施例2中表达FAK^6/7的肺癌病人的Sanger测序图，图2B是FAK^6/7结构示意图，图2C是针对FAK^6/7的PCR引物设计图，图2D是以实施例2中4例患癌病人的肿瘤组织和癌旁组织cDNA为模板，使用PCR引物Fplus-Rplus、Fi6-Rplus和Fplus-Ri7进行反转录PCR扩增后的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中T代表肿瘤，N代表正常。

图3A是以肺癌细胞系Calu-6、A549、NCI-H460、NCI-H1975、EPLC-32M1和L78的cDNA为模板，利用引物Fplus-Rplus进行反转录PCR扩增后的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测图，图3B是对肺癌细胞系Calu-6和NCI-H460扩增产物的Sanger测序图。

图4是发生点突变的肺癌病人肿瘤组织和癌旁正常对照组织扩增产物的Sanger测序图。

图5A是检测表达带Flag标签的野生型FAK(FAK WT)和FAK-ITD的自磷酸化水平对比图；图5B是检测表达带EGFP标签的野生型FAK和FAK可变剪切异构体之一FAK^6,7的自磷酸化水平对比图。

图6A和图6C是FAK-ITD与野生型黏着斑激酶(WT FAK)对不同浓度的黏着斑激酶抑制剂PF562271的敏感性的Western对比图和线性对比图；图6B和图6D是FAK-ITD与野生型黏着斑激酶(WT FAK)对不同浓度的黏着斑激酶抑制剂PF573228的敏感性的Western对比图和线性对比图。

图7A是FAK^6,7与野生型黏着斑激酶(WT FAK)分别对不同浓度的FAK激酶抑制剂PF562271和PF573228的敏感性的Western对比图；图7B是FAK^6,7与野生型黏着斑激酶(WTFAK)分别对不同浓度的FAK激酶抑制剂PF562271和PF573228的敏感性的线性对比图。

图8A是黏着斑激酶抑制剂对过表达FAK^6,7和野生型黏着斑激酶(WT FAK)的FAK稳定敲除的肺癌细胞A549生长抑制情况对比图；图8B是黏着斑激酶抑制剂对过表达FAK^6,7和野生型黏着斑激酶(WT FAK)的FAK稳定敲除的肺癌细胞NCI-H460生长抑制情况对比图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

发明人提取肺癌病人的肿瘤组织和癌旁对照正常组织的总RNA，并且反转录生成cDNA第一条链，以肺癌病人组织cDNA第一条链为模板，利用FAK-ITD和FAK^6/7特异性检测引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带的大小和亮度判断肺癌病人组织中是否存在FAK结构变异体FAK-ITD和FAK^6/7，具体的操作步骤详见如下的实施例1-3中：发明人在对91例肺癌病人的FAK基因进行测序时发现，1例肺癌病人中存在FAK基因内部序列串联重复扩增FAK-ITD；4例肺癌病人中存在FAK可变剪切异构体FAK^6/7；1例肺癌病人肿瘤组织中存在一个FAK点突变体p.A1004S。

实施例1：

对一例男性吸烟肺癌病人#711的肿瘤组织和癌旁正常组织进行全基因组测序发现，在该病人肿瘤组织中特异性存在黏着斑激酶基因内部序列串联重复扩增FAK-ITD。用Trizol法提取肺癌病人#711的RNA，然后取2ug RNA用oligo(dT)15进行反转录，生成cDNA第一条链。取1ul肺癌病人#711的肿瘤组织的cDNA，用PCR级别的水稀释20倍，混匀后取2ul作为PCR扩增的模板。利用引物对FITD-RITD进行扩增，PCR反应体系如下：

反应总体积为20ul。涡旋混匀，反应条件为：95℃预变性5min；循环扩增95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环之后，继续在72℃延伸5min。

扩增结束后，向20 ul PCR产物中加入一定量6×DNA上样缓冲液，混匀后取5ul用琼脂糖凝胶电泳检测。如图1B的电泳结果显示，在病人#711中，肿瘤组织cDNA中能扩增出大小约为750bp的单一条带。对PCR产物进行Sanger测序验证，该PCR条带对应FAK-ITD的第27号和第6号外显子的融合区域(见图1C)。结果表明，反转录PCR引物FITD-RITD的扩增结果与#711病人的全基因组测序结果一致，该病人肿瘤组织中存在FAK-ITD。

实施例2：

在对4例肺癌病人肿瘤组织的FAK编码序列进行测序时发现，在第14号和15号外显子后面分别插入表达了可变剪切外显子Box 6和Box 7(见图2A)。PCR正向测序峰图显示在第14号外显子后出现测序双峰，反向测序峰图显示在第16号外显子前面出现测序双峰。在对应的癌旁对照组织的测序峰图中没有双峰存在。以4例病人的肿瘤组织和癌旁正常组织的cDNA为模板，分别利用引物Fplus-Rplus、Fi6-Rplus、Fplus-Ri7进行PCR扩增。PCR反应体系和反应条件同实施1。PCR产物用3％的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果显示，Fplus-Rplus扩增的产物中，4例肺癌病人的肿瘤组织均扩增出3条带(见图2D)，克隆并测序PCR产物发现，最上面的条带对应FAK^6,7，中间的条带对应FAK⁶或FAK⁷，最下面的条带对应野生型FAK，癌旁组织中均只有野生型FAK的条带；Fi6-Rplus扩增产物中，肿瘤组织均有两条带，最上面条带对应FAK^6,7，下面条带对应FAK⁶，癌旁组织中均没有明显的扩增条带；Fplus-Ri7扩增产物中，肿瘤组织均有两条带，最上面条带对应FAK^6,7，下面条带对应FAK7，癌旁组织中均没有明显的扩增条带。4例肺癌病人的反转录PCR扩增结果与测序结果一致。因此，利用引物Fplus-Rplus、Fi6-Rplus、Fplus-Ri7进行反转录PCR扩增可以检测肺癌病人中是否存在可变剪切异构体FAK^6/7。

实施例3：

以肺癌细胞系Calu-6、A549、NCI-H460、NCI-H1975、EPLC-32M1和L78的cDNA为模板，利用引物Fplus-Rplus进行反转录PCR扩增，反应体系和条件同实施例2。扩增结束后，用3％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，在肺癌细胞系Calu-6中，有3个扩增条带，分子量大小与实施例2中Fplus-Rplus的扩增产物大小一致，其余5个肺癌细胞系中只有一条野生型FAK的扩增条带(见图3A)；对肺癌细胞系Calu-6的扩增产物进行Sanger测序，结果与实施例2一致：正向测序峰图在14号外显子后出现双峰，表明Box 6表达；反向测序峰图在16号外显子前出现双峰，表明Box 7表达，而对其他肺癌细胞系的扩增产物进行Sanger测序，以NCI-H460为代表性地未表达Box6和Box7(见图3B)。因此，利用引物Fplus-Rplus进行反转录PCR扩增可以检测肺癌细胞系中可变剪切异构体FAK^6/7的表达。

实施例4：

为了检测肺癌病人FAK的结构变异情况，我们以病人肿瘤组织和癌旁正常对照组织的cDNA样品为模板，利用特异性引物Fcds和Rcds扩增FAK的mRNA编码区(3159bp)。PCR扩增的退火温度为55℃，延伸时间为3min。然后将扩增产物进行Sanger测序。扩增引物序列如下：

Fcds:AGCTCCTCAAGAATAACGGAAGG

Rcds:AAATGAACCCAAATCAAAGTGT

1例肺癌病人肿瘤组织扩增产物测序结果显示FAK蛋白编码区第3010个碱基处出现测序双峰：原始序列碱基为G，突变双峰碱基为T(见图4)。该碱基替换突变c.3010G>T导致野生型FAK第1004位丙氨酸突变成丝氨酸。在该病人对应的癌旁正常组织中，该位点为野生型，没有发生突变，测序峰图为单一的G峰。

实施例5：

这些肺癌肿瘤组织特异的FAK结构变异体的自磷酸化水平增强、促进肺癌细胞的增殖和迁移能力，并且对FAK激酶抑制剂的敏感性增强。FAK抑制剂对表达这些FAK结构变异体的肺癌细胞生长的抑制率显著高于表达野生型FAK的细胞。因此，FAK结构变异体FAK-ITD和FAK^6/7可以作为生物标志物来预测肺癌病人对FAK抑制剂的敏感性，在FAK靶向药物的临床应用中具有一定意义。

(1)为了检测FAK-ITD的自磷酸化水平，我们分别构建了稳定表达带Flag标签的野生型FAK(FAK WT)和FAK-ITD的HEK293细胞株。利用免疫沉淀的方法获得目的蛋白。具体操作如下：向细胞密度约为80％的直径10cm培养皿中加入细胞裂解液(提前加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，用刮子将细胞刮下，转移到预冷的离心管中，4℃旋转裂解30分钟。裂解完成后，4℃ 12,000g离心10分钟，上清即为细胞裂解液。转移上清至新的预冷的离心管中，加入protein A/G agarose珠子于4℃旋转孵育30分钟，4℃ 12,000g离心5分钟。转移上清至新的预冷的离心管中，加入抗-Flag抗体在4℃旋转孵育过夜。然后加入30ul proternA/G agarose珠子于4℃继续孵育4-6小时。反应结束后，用细胞裂解液洗珠子4次，每次6分钟，1000g离心3分钟。最后一次离心后去除上清，向珠子中加入30ul 2×SDS样品缓冲液，99℃煮沉淀10分钟。样品用于western blot实验，检测免疫沉淀样品中野生型FAK和FAK-ITD的含量和磷酸化水平。FAK-ITD的自磷酸化水平(p-Y397)显著高于野生型FAK，并且总酪氨酸的磷酸化水平也显著增强(见图5A)。

(2)为了检测FAK可变剪切异构体的磷酸化水平，我们分别构建了稳定表达带EGFP标签的野生型FAK和FAK可变剪切异构体之一FAK^6,7的HLF细胞株。用1×SDS样品缓冲液裂解细胞，收取细胞总蛋白。Western blot检测FAK自磷酸化水平。结果显示，FAK^6,7的自磷酸化水平显著增强(见图5B)。

(3)将相同数量的稳定表达FAK WT和FAK-ITD的细胞分别接种于12孔板中，培养24小时后，用不同浓度的FAK激酶活性抑制剂PF562271和PF573228分别处理这两种细胞。抑制剂处理15分钟后，用1×SDS样品缓冲液裂解细胞，western blot检测p-Y397水平(见图6A,图6B)。用Image J软件扫描显影条带，统计条带高密度值并作图(见图6C，图6D)。在0.003uMPF562271和0.05uM PF573228处理条件下，FAK-ITD的Y397磷酸化水平低于野生型FAK。结果表明，FAK-ITD对FAK激酶抑制剂的敏感性增强。

(4)同上述(3)中的操作步骤，用不同浓度的FAK激酶活性抑制剂处理稳定表达FAKWT和FAK^6,7的HLF细胞，检测Y397磷酸化水平。在0.05uM抑制剂PF562271和PF573228处理条件下，FAK^6,7Y397磷酸化水平低于野生型FAK(见图7A和图7B)。结果表明，FAK^6,7对FAK激酶抑制剂的敏感性增强。

(5)在FAK稳定敲除的肺癌细胞A549(见图8A)以及肺癌细胞NCI-H460(见图8B)中过表达野生型FAK和FAK^6,7。转染FAK相关质粒和对照质粒后12小时后，胰酶消化细胞，分别将相同数量的细胞接种于12孔板中。培养24小时后，更换含有2uM激酶抑制剂的正常培养基。抑制剂处理细胞48小时后，对细胞进行计数，计算抑制剂对细胞生长的抑制率。在相同激酶抑制剂处理条件下，表达FAK^6,7的肺癌细胞的生长抑制率高于表达野生型FAK的肺癌细胞。这些结果表示，表达FAK^6,7的肺癌细胞对FAK激酶抑制剂的响应增强。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物及其检测方法与应用

<130> P170930DD1F

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（SEQ ID:1）

<400> 1

gaaagattac caatgcctcc aa 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（SEQ ID:2）

<400> 2

tctcccagta tgatcgccgt at 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（SEQ ID:3）

<400> 3

aagcaaggca tgcggacaca 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID:4)

<400> 4

ctctttgaat ctcataatcc ctgg 24

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID:5)

<400> 5

atgaaattag tggggacg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（SEQ ID:6）

<400> 6

cttcatctat tccatagct 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（SEQ ID:7）

<400> 7

agctcctcaa gaataacgga agg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（SEQ ID:8）

<400> 8

aaatgaaccc aaatcaaagt gt 22

<210> 9

<211> 4561

<212> DNA

<213> Homo sapiens（野生型成熟mRNA对应的外显子序列）

<400> 9

gcgcacgcgc gcgggcccgc gccgacgcag cacggcctcg agggcgcgag cccgcgccgc 60

cgccgccgcc gccggtcccg gaccactgtg agcccgcggc gtgaggcgtg ggaggaagcg 120

cggctgctgt cgcccagcgc cgccccgtcg tcgtctgcct tcgcttcacg gcgccgagcc 180

gcggtccgag cagaactggg gctcccttgc atcttccagt tacaaattca gtgccttctg 240

cagtttcccc agagctcctc aagaataacg gaagggagaa tatgacagat acctagcatc 300

tagcaaaata atggcagctg cttaccttga ccccaacttg aatcacacac caaattcgag 360

tactaagact cacctgggta ctggtatgga acgttctcct ggtgcaatgg agcgagtatt 420

aaaggtcttt cattattttg aaagcaatag tgagccaacc acctgggcca gtattatcag 480

gcatggagat gctactgatg tcaggggcat cattcagaag atagtggaca gtcacaaagt 540

aaagcatgtg gcctgctatg gattccgcct cagtcacctg cggtcagagg aggttcactg 600

gcttcacgtg gatatgggcg tctccagtgt gagggagaag tatgagcttg ctcacccacc 660

agaggagtgg aaatatgaat tgagaattcg ttatttgcca aaaggatttc taaaccagtt 720

tactgaagat aagccaactt tgaatttctt ctatcaacag gtgaagagcg attatatgtt 780

agagatagct gatcaagtgg accaggaaat tgctttgaag ttgggttgtc tagaaatacg 840

gcgatcatac tgggagatgc ggggcaatgc actagaaaag aagtctaact atgaagtatt 900

agaaaaagat gttggtttaa agcgattttt tcctaagagt ttactggatt ctgtcaaggc 960

caaaacacta agaaaactga tccaacaaac atttagacaa tttgccaacc ttaatagaga 1020

agaaagtatt ctgaaattct ttgagatcct gtctccagtc tacagatttg ataaggaatg 1080

cttcaagtgt gctcttggtt caagctggat tatttcagtg gaactggcaa tcggcccaga 1140

agaaggaatc agttacctaa cggacaaggg ctgcaatccc acacatcttg ctgacttcac 1200

tcaagtgcaa accattcagt attcaaacag tgaagacaag gacagaaaag gaatgctaca 1260

actaaaaata gcaggtgcac ccgagcctct gacagtgacg gcaccatccc taaccattgc 1320

ggagaatatg gctgacctaa tagatgggta ctgccggctg gtgaatggaa cctcgcagtc 1380

atttatcatc agacctcaga aagaaggtga acgggctttg ccatcaatac caaagttggc 1440

caacagcgaa aagcaaggca tgcggacaca cgccgtctct gtgtcagaaa cagatgatta 1500

tgctgagatt atagatgaag aagatactta caccatgccc tcaaccaggg attatgagat 1560

tcaaagagaa agaatagaac ttggacgatg tattggagaa ggccaatttg gagatgtaca 1620

tcaaggcatt tatatgagtc cagagaatcc agctttggcg gttgcaatta aaacatgtaa 1680

aaactgtact tcggacagcg tgagagagaa atttcttcaa gaagccttaa caatgcgtca 1740

gtttgaccat cctcatattg tgaagctgat tggagtcatc acagagaatc ctgtctggat 1800

aatcatggag ctgtgcacac ttggagagct gaggtcattt ttgcaagtaa ggaaatacag 1860

tttggatcta gcatctttga tcctgtatgc ctatcagctt agtacagctc ttgcatatct 1920

agagagcaaa agatttgtac acagggacat tgctgctcgg aatgttctgg tgtcctcaaa 1980

tgattgtgta aaattaggag actttggatt atcccgatat atggaagata gtacttacta 2040

caaagcttcc aaaggaaaat tgcctattaa atggatggct ccagagtcaa tcaattttcg 2100

acgttttacc tcagctagtg acgtatggat gtttggtgtg tgtatgtggg agatactgat 2160

gcatggtgtg aagccttttc aaggagtgaa gaacaatgat gtaatcggtc gaattgaaaa 2220

tggggaaaga ttaccaatgc ctccaaattg tcctcctacc ctctacagcc ttatgacgaa 2280

atgctgggcc tatgacccca gcaggcggcc caggtttact gaacttaaag ctcagctcag 2340

cacaatcctg gaggaagaga aggctcagca agaagagcgc atgaggatgg agtccagaag 2400

acaggccaca gtgtcctggg actccggagg gtctgatgaa gcaccgccca agcccagcag 2460

accgggttat cccagtccga ggtccagcga aggattttat cccagcccac agcacatggt 2520

acaaaccaat cattaccagg tttctggcta ccctggttca catggaatca cagccatggc 2580

tggcagcatc tatccaggtc aggcatctct tttggaccaa acagattcat ggaatcatag 2640

acctcaggag atagcaatgt ggcagcccaa tgtggaggac tctacagtat tggacctgcg 2700

agggattggg caagtgttgc caacccatct gatggaagag cgtctaatcc gacagcaaca 2760

ggaaatggaa gaagatcagc gctggctgga aaaagaggaa agatttctga aacctgatgt 2820

gagactctct cgaggcagta ttgacaggga ggatggaagt cttcagggtc cgattggaaa 2880

ccaacatata tatcagcctg tgggtaaacc agatcctgca gctccaccaa agaaaccgcc 2940

tcgccctgga gctcccggtc atctgggaag ccttgccagc ctcagcagcc ctgctgacag 3000

ctacaacgag ggtgtcaagc ttcagcccca ggaaatcagc ccccctccta ctgccaacct 3060

ggaccggtcg aatgataagg tgtacgagaa tgtgacgggc ctggtgaaag ctgtcatcga 3120

gatgtccagt aaaatccagc cagccccacc agaggagtat gtccctatgg tgaaggaagt 3180

cggcttggcc ctgaggacat tattggccac tgtggatgag accattcccc tcctaccagc 3240

cagcacccac cgagagattg agatggcaca gaagctattg aactctgacc tgggtgagct 3300

catcaacaag atgaaactgg cccagcagta tgtcatgacc agcctccagc aagagtacaa 3360

aaagcaaatg ctgactgctg ctcacgccct ggctgtggat gccaaaaact tactcgatgt 3420

cattgaccaa gcaagactga aaatgcttgg gcagacgaga ccacactgag cctcccctag 3480

gagcacgtct tgctaccctc ttttgaagat gttctctagc cttccaccag cagcgaggaa 3540

ttaaccctgt gtcctcagtc gccagcactt acagctccaa cttttttgaa tgaccatctg 3600

gttgaaaaat ctttctcata taagtttaac cacactttga tttgggttca ttttttgttt 3660

tgtttttttc aatcatgata ttcagaaaaa tccaggatcc aaaatgtggc gtttttctaa 3720

gaatgaaaat tatatgtaag cttttaagca tcatgaagaa caatttatgt tcacattaag 3780

atacgttcta aagggggatg gccaaggggt gacatcttaa ttcctaaact accttagctg 3840

catagtggaa gaggagagca tgaagcaaag aattccagga aacccaagag gctgagaatt 3900

cttttgtcta ccatagaatt attatccaga ctggaatttt tgtttgttag aacacccttc 3960

agttgcaata tgctaatccc actttacaaa gaatataaaa gctatatttt gaagacttga 4020

gttatttcag aaaaaactac agcccttttt gtcttacctg ccttttactt tcgtgtggat 4080

atgtgaagca ttgggtcggg aactagctgt agaacacaac taaaaactca tgtctttttt 4140

cacagaataa tgtgccagtt ttttgtagca atgttatttc tcttggaagc agaaatgctt 4200

tgtaccagag cacctccaaa ctgcattgag gagaagttcc agaaccatcc cctttttcca 4260

tttttatata atttataaag aaagattaaa gccatgttga ctattttaca gccactggag 4320

ttaactaacc cttccttgta tctgtcttcc caggagagaa tgaagcaaaa caggaatttg 4380

gttttctttt gatgtccagt tacaccatcc attctgttaa ttttgaaaaa atataccctc 4440

cctttagttt gttgggggat ataaattatt ctcaggaaga atataatgaa ctgtacagtt 4500

actttgacct attaaaaagg tgttaccagt aaagttcttg ttgtaatatc cttaaaaaaa 4560

a 4561

<210> 10

<211> 4600

<212> DNA

<213> Homo sapiens（同时表达Box6和Box7的可变剪切异构体FAK6,7序列）

<400> 10

gcgcacgcgc gcgggcccgc gccgacgcag cacggcctcg agggcgcgag cccgcgccgc 60

cgccgccgcc gccggtcccg gaccactgtg agcccgcggc gtgaggcgtg ggaggaagcg 120

cggctgctgt cgcccagcgc cgccccgtcg tcgtctgcct tcgcttcacg gcgccgagcc 180

gcggtccgag cagaactggg gctcccttgc atcttccagt tacaaattca gtgccttctg 240

cagtttcccc agagctcctc aagaataacg gaagggagaa tatgacagat acctagcatc 300

tagcaaaata atggcagctg cttaccttga ccccaacttg aatcacacac caaattcgag 360

tactaagact cacctgggta ctggtatgga acgttctcct ggtgcaatgg agcgagtatt 420

aaaggtcttt cattattttg aaagcaatag tgagccaacc acctgggcca gtattatcag 480

gcatggagat gctactgatg tcaggggcat cattcagaag atagtggaca gtcacaaagt 540

aaagcatgtg gcctgctatg gattccgcct cagtcacctg cggtcagagg aggttcactg 600

gcttcacgtg gatatgggcg tctccagtgt gagggagaag tatgagcttg ctcacccacc 660

agaggagtgg aaatatgaat tgagaattcg ttatttgcca aaaggatttc taaaccagtt 720

tactgaagat aagccaactt tgaatttctt ctatcaacag gtgaagagcg attatatgtt 780

agagatagct gatcaagtgg accaggaaat tgctttgaag ttgggttgtc tagaaatacg 840

gcgatcatac tgggagatgc ggggcaatgc actagaaaag aagtctaact atgaagtatt 900

agaaaaagat gttggtttaa agcgattttt tcctaagagt ttactggatt ctgtcaaggc 960

caaaacacta agaaaactga tccaacaaac atttagacaa tttgccaacc ttaatagaga 1020

agaaagtatt ctgaaattct ttgagatcct gtctccagtc tacagatttg ataaggaatg 1080

cttcaagtgt gctcttggtt caagctggat tatttcagtg gaactggcaa tcggcccaga 1140

agaaggaatc agttacctaa cggacaaggg ctgcaatccc acacatcttg ctgacttcac 1200

tcaagtgcaa accattcagt attcaaacag tgaagacaag gacagaaaag gaatgctaca 1260

actaaaaata gcaggtgcac ccgagcctct gacagtgacg gcaccatccc taaccattgc 1320

ggagaatatg gctgacctaa tagatgggta ctgccggctg gtgaatggaa cctcgcagtc 1380

atttatcatc agacctcaga aagaaggtga acgggctttg ccatcaatac caaagttggc 1440

caacagcgaa aagcaaggca tgcggacaca cgccgtctct gtgtcagatg aaattagtgg 1500

ggacgaaaca gatgattatg ctgagattat agatgaagaa gatacttaca ccatgccctc 1560

aaaaagctat ggaatagatg aagccaggga ttatgagatt caaagagaaa gaatagaact 1620

tggacgatgt attggagaag gccaatttgg agatgtacat caaggcattt atatgagtcc 1680

agagaatcca gctttggcgg ttgcaattaa aacatgtaaa aactgtactt cggacagcgt 1740

gagagagaaa tttcttcaag aagccttaac aatgcgtcag tttgaccatc ctcatattgt 1800

gaagctgatt ggagtcatca cagagaatcc tgtctggata atcatggagc tgtgcacact 1860

tggagagctg aggtcatttt tgcaagtaag gaaatacagt ttggatctag catctttgat 1920

cctgtatgcc tatcagctta gtacagctct tgcatatcta gagagcaaaa gatttgtaca 1980

cagggacatt gctgctcgga atgttctggt gtcctcaaat gattgtgtaa aattaggaga 2040

ctttggatta tcccgatata tggaagatag tacttactac aaagcttcca aaggaaaatt 2100

gcctattaaa tggatggctc cagagtcaat caattttcga cgttttacct cagctagtga 2160

cgtatggatg tttggtgtgt gtatgtggga gatactgatg catggtgtga agccttttca 2220

aggagtgaag aacaatgatg taatcggtcg aattgaaaat ggggaaagat taccaatgcc 2280

tccaaattgt cctcctaccc tctacagcct tatgacgaaa tgctgggcct atgaccccag 2340

caggcggccc aggtttactg aacttaaagc tcagctcagc acaatcctgg aggaagagaa 2400

ggctcagcaa gaagagcgca tgaggatgga gtccagaaga caggccacag tgtcctggga 2460

ctccggaggg tctgatgaag caccgcccaa gcccagcaga ccgggttatc ccagtccgag 2520

gtccagcgaa ggattttatc ccagcccaca gcacatggta caaaccaatc attaccaggt 2580

ttctggctac cctggttcac atggaatcac agccatggct ggcagcatct atccaggtca 2640

ggcatctctt ttggaccaaa cagattcatg gaatcataga cctcaggaga tagcaatgtg 2700

gcagcccaat gtggaggact ctacagtatt ggacctgcga gggattgggc aagtgttgcc 2760

aacccatctg atggaagagc gtctaatccg acagcaacag gaaatggaag aagatcagcg 2820

ctggctggaa aaagaggaaa gatttctgaa acctgatgtg agactctctc gaggcagtat 2880

tgacagggag gatggaagtc ttcagggtcc gattggaaac caacatatat atcagcctgt 2940

gggtaaacca gatcctgcag ctccaccaaa gaaaccgcct cgccctggag ctcccggtca 3000

tctgggaagc cttgccagcc tcagcagccc tgctgacagc tacaacgagg gtgtcaagct 3060

tcagccccag gaaatcagcc cccctcctac tgccaacctg gaccggtcga atgataaggt 3120

gtacgagaat gtgacgggcc tggtgaaagc tgtcatcgag atgtccagta aaatccagcc 3180

agccccacca gaggagtatg tccctatggt gaaggaagtc ggcttggccc tgaggacatt 3240

attggccact gtggatgaga ccattcccct cctaccagcc agcacccacc gagagattga 3300

gatggcacag aagctattga actctgacct gggtgagctc atcaacaaga tgaaactggc 3360

ccagcagtat gtcatgacca gcctccagca agagtacaaa aagcaaatgc tgactgctgc 3420

tcacgccctg gctgtggatg ccaaaaactt actcgatgtc attgaccaag caagactgaa 3480

aatgcttggg cagacgagac cacactgagc ctcccctagg agcacgtctt gctaccctct 3540

tttgaagatg ttctctagcc ttccaccagc agcgaggaat taaccctgtg tcctcagtcg 3600

ccagcactta cagctccaac ttttttgaat gaccatctgg ttgaaaaatc tttctcatat 3660

aagtttaacc acactttgat ttgggttcat tttttgtttt gtttttttca atcatgatat 3720

tcagaaaaat ccaggatcca aaatgtggcg tttttctaag aatgaaaatt atatgtaagc 3780

ttttaagcat catgaagaac aatttatgtt cacattaaga tacgttctaa agggggatgg 3840

ccaaggggtg acatcttaat tcctaaacta ccttagctgc atagtggaag aggagagcat 3900

gaagcaaaga attccaggaa acccaagagg ctgagaattc ttttgtctac catagaatta 3960

ttatccagac tggaattttt gtttgttaga acacccttca gttgcaatat gctaatccca 4020

ctttacaaag aatataaaag ctatattttg aagacttgag ttatttcaga aaaaactaca 4080

gccctttttg tcttacctgc cttttacttt cgtgtggata tgtgaagcat tgggtcggga 4140

actagctgta gaacacaact aaaaactcat gtcttttttc acagaataat gtgccagttt 4200

tttgtagcaa tgttatttct cttggaagca gaaatgcttt gtaccagagc acctccaaac 4260

tgcattgagg agaagttcca gaaccatccc ctttttccat ttttatataa tttataaaga 4320

aagattaaag ccatgttgac tattttacag ccactggagt taactaaccc ttccttgtat 4380

ctgtcttccc aggagagaat gaagcaaaac aggaatttgg ttttcttttg atgtccagtt 4440

acaccatcca ttctgttaat tttgaaaaaa tataccctcc ctttagtttg ttgggggata 4500

taaattattc tcaggaagaa tataatgaac tgtacagtta ctttgaccta ttaaaaaggt 4560

gttaccagta aagttcttgt tgtaatatcc ttaaaaaaaa 4600

Claims (6)

1.一种检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物为检测黏着斑激酶串联重复突变体的PCR引物；

所述黏着斑激酶串联重复突变体包括FAK-ITD，其中，相比于野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA，FAK-ITD对应的成熟mRNA为在野生型黏着斑激酶对应的成熟mRNA的第27号外显子后同向串联地插入有编码野生型黏着斑激酶的第6-27号外显子的串联重复融合区域；检测FAK-ITD的PCR引物靶向编码野生型黏着斑激酶的第6-27号外显子区域；

所述检测FAK-ITD的PCR引物中的正反向引物的碱基序列依次为：

FITD：5’- GAAAGATTACCAATGCCTCCAA-3’ 即SEQ ID:1，

RITD：5’- TCTCCCAGTATGATCGCCGTAT-3’ 即SEQ ID:2。

2.根据权利要求1所述的检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物，其特征在于，所述检测FAK-ITD的PCR引物中的正向引物所靶向的编码野生型黏着斑激酶的外显子编号大于反向引物所靶向的野生型编码黏着斑激酶的外显子编号。

3.根据权利要求1所述的检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物，其特征在于，检测FAK-ITD的PCR引物中的正向引物靶向编码野生型黏着斑激酶的第27号外显子区域，检测FAK-ITD的PCR引物中的反向引物靶向编码野生型黏着斑激酶的第6号外显子区域。

4.权利要求1所述的检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在制备检测黏着斑激酶串联重复突变体结构变异体试剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取患者肿瘤组织和/或外周血样品的RNA，生成cDNA的第一条链；

（2）以上述cDNA的第一条链为模板，利用权利要求1所述的检测黏着斑激酶串联重复突变体结构变异体的PCR引物进行PCR扩增；

（3）将上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和/或进行Sanger测序。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：

93˚C -95˚C 预变性4-5min；

循环扩增：93˚C-95˚C 30s-1min，55-60˚C 30s-1min，延伸：70-72˚C 30s-1min，

30-35个循环之后，继续在70-72˚C延伸3-5min。

6.根据权利要求1所述的检测黏着斑激酶结构变异体的PCR引物在制备检测黏着斑激酶串联重复突变体结构变异体的产品中的应用。

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