JP2020536111A - リンパ腫を処置する方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において開示されるのは、被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法であって、PD−1/CD279阻害剤、PD−L1/CD274阻害剤、またはそれらの組合せを被験者に投与することを含む方法である。また本明細書において開示されているのは、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に罹患している被験者のペムブロリズマブ処置に対する応答を決定する方法であって、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出することを含む方法である。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2017年10月6日に出願されたSG仮出願第10201708262R号の優先権の利益を主張し、その内容は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2017年10月6日に出願されたSG仮出願第10201708262R号の優先権の利益を主張し、その内容は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般に分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、がんの検出および処置のためのバイオマーカーの使用に関する。
ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)は、アジア、メキシコおよび南米の集団に好発するまれであり、侵攻性の悪性腫瘍である。日本を除き、それは、アジアでは最も一般的な成熟T細胞リンパ腫である。腫瘍細胞は、エプスタインバーウイルス(EBV)に常に感染し、細胞傷害性表現型によって特徴づけられる。
免疫チェックポイント阻害剤は、一部の血液悪性腫瘍を含む多くのがんの処置の状況を変化させている。非小細胞肺がん、黒色腫および膀胱がんを含むいくつかの固形腫瘍に関する研究では、免疫組織化学(IHC)PD−L1陽性はPD−1/PD−L1遮断に対する応答のより高い可能性と一致すると一般的に結論づけられている。しかしながら、PD−L1陰性腫瘍患者では、より低いが明確な応答速度も認められた。これらの観察は、PD−1遮断療法の絶対的選択基準として、患者1人当たりの単一の腫瘍標本に基づいてPD−L1免疫組織化学を採用することの多くの落とし穴を強調している。
節外ナチュラルキラー/T細胞鼻型リンパ腫(ENKL)は、アジア、メキシコおよび南米の集団に好発するまれであり、侵攻性の悪性腫瘍である。現在までのところ、ENKLの処置に利用可能な標的療法はない。ENKLを伴うアントラサイクリンをベースにしたレジメンは不良な結果と関連するため、L−アスパラギナーゼをベースにしたレジメンは、SMILE(デキサメタゾン、メトトレキサート、イホスファミド、L−アスパラギナーゼ、エトポシド)レジメンと同様に、特に播種性疾患患者の臨床転帰を有意に改善している。しかしながら、SMILEまたはSMILE様レジメンは依然として症例の最大40〜50%で失敗し、SMILEに関連する毒性はまたより高齢の患者での使用を妨げる。
さらに、疾患がまれであるので、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)を管理するためのFDAが承認した標的レジメンはまだ存在せず、療法に対する応答のバイオマーカーを同定することを困難にした。このように、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を同定する方法およびそれを処置する方法に対する満たされていないニーズが存在する。
1つの態様において、本発明は、被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法に言及し、当該方法は、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者は、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在によって特徴づけられる。
別の態様において、本発明は、ペムブロリズマブ処置に対するナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に罹患している被験者の応答を決定する方法に言及し、この方法は、被験者から試料を得るステップ;少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するステップを含み、少なくとも1つのJAK活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在は、被験者がペムブロリズマブ処置に応答することを示す。
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットに言及し、このキットは、検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含み;プライマーは、JAK3およびPD−L1遺伝子のゲノム領域を濃縮する。
さらなる局面において、本発明は、次世代シークエンシングのための少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットに言及する。
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法に従って使用するための、本明細書中に開示されるキットに言及する。
本発明は、非限定的な例および添付図面と併せて検討すると、詳細な記載を参照して、より良好に理解されるであろう:
近年、免疫チェックポイント(ICP)阻害剤は、多くの悪性腫瘍の処置において有望な客観的奏効率(ORR)を示している。注目すべきことに、ある結果は、再発または難治性(RR)ホジキンリンパ腫(HL)におけるプログラム化デス−1(PD−1またはCD279)阻害剤の使用からの80%の客観的奏効率を示している。現在、非小細胞肺がん、黒色腫および膀胱がんを対象とした臨床試験では、一般的に、プログラムされたデスリガンド1(PD−L1)の免疫組織化学(IHC)陽性はPD−1/PD−L1遮断に対する応答の可能性がより高いことと一致すると結論づけられている。興味深いことに、PD−L1陰性腫瘍を有する患者では、より低いが明確な奏効率も認められた。これらの観察は、腫瘍からより多くの情報を利用することができ、PD−1遮断療法のために患者を選択する現在の事実上の基準を増大させることができることを示唆する。
本発明者らは、プログラムされた細胞死1(PD−1)遮断療法により完全な応答(CR)を達成した再発または難治性ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(RR NKTL)患者における再発性遺伝子変化を同定した。
シークエンシング技術の進歩に伴い、JAK−STAT経路、後成的修飾因子、DDX3X遺伝子およびHLA−DPB1遺伝子における生殖細胞系の遺伝的素因を変化させる再発性体細胞突然変異がナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)患者で見出されているが、これらの研究のどれも全ゲノムシークエンシング(WGS)技術を用いていない。ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫ゲノムを、標的化可能なゲノム変化のための高シークエンシング処理能力およびゲノムワイド様式で探索するために、全ゲノムシークエンシングデータを用いて、ペムブロリズマブ処置に対するその後の臨床的応答データを有する11の前処理したナチュラルキラー/T細胞リンパ腫腫瘍の体細胞変化を研究した。
対になったナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍正常サンプルの全ゲノムシークエンシングにより、腫瘍の36%(11例中4例)で高度に再発するプログラムされた細胞死リガンド1(PD−L1/CD274)遺伝子内に体細胞切断点クラスターが存在することが示された。これらの構造的再配列(SR)は、PD−L1遺伝子の3’非翻訳領域(UTR)を破壊することが確認され、PD−L1キメラ転写物の異常発現をもたらす。
1つの例では、再発または難治性ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)を有する11人の個体を、ペムブロリズマブで処置したところ、PD−L1 3’UTR構造的再配列が応答例4人全員に認められたが、非応答例4人には認められなかった。理論に拘束されることなく、PD−L1 3’UTR構造的再配列はPD−1遮断に対する応答およびM2−マクロファージシグネチャーの低下と関連し、それによりPD−L1再配列ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に対するPD−1遮断療法の使用が可能となり、ひいてはこれらの患者に対する処置成績が改善すると考えられた。
本明細書において開示されるのは、被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法であり、この方法は、治療有効量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者の分子ゲノムプロファイルは、少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在によって特徴づけられる。一実施例において、被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法が開示されており、この方法は、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者は、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在によって特徴づけられる。
このように、一実施例において、構造的再配列によってPD−L1遺伝子の3’非翻訳領域(3’UTR)が破壊される。別の例では、PD−L1構造的再配列は、PD−L1遺伝子の変異である。さらに別の例では、PD−L1遺伝子の突然変異は、PD−L1遺伝子の3’UTRを破壊する。
一実施例において、JAK3活性化突然変異は、いずれか1つ以上の以下の突然変異であるが、これらに限定されない:M511I、A572V、A573V、R657Q、V722I、V674A、L857P、R403H、Q501H、E958K。別の実施例において、JAK3活性化突然変異は、JAK3遺伝子(JAK3 RefSeq遺伝子ID:NM_000215)における一塩基置換(p.A572Vまたはp.A573V)である。言い換えれば、一実施例において、JAK3活性化変異はA572Vである。用語「JAK3活性化突然変異」と「JAK3突然変異」は、互換性があると考えられる。
本明細書中で使用される「突然変異」という用語は、生物または遺伝要素のゲノムのヌクレオチド配列の永久的な変化を指す。突然変異は、限定されるものではないが、挿入、欠失、置換、転座、逆位、微小逆位、重複、縦列反復、切断点(複数可)(突然変異)、およびそれらの組合せであり得る。
本明細書中で使用される「構造的再配列」という用語は、関連する核酸配列の全体的構造に変化をもたらす1つ以上の突然変異を指す。「構造的再配列」はゲノム領域にわたり、この突然変異の境界は切断点として知られている。例えば、切断点が遺伝子内に存在する場合、ここに開示する突然変異は、前記遺伝子の構造の変化をもたらす。このような構造的再配列は、関連する遺伝子または核酸配列を包含する染色体構造の変化をも参照することができる。したがって、1つの例において、突然変異は、微小逆位、逆位、転座、縦列反復、もしくは切断点(突然変異)、またはそれらの組合せである。
本明細書中で使用される「逆位」という用語は、特定の配列内の核酸配列の逆位を指し、それによって、その配列が以前にあった方向と比較して逆向きに切り出され、挿入される。言い換えると、関連する核酸配列は、突然変異の結果として端部から端部に逆転される。用語「微小逆位」は、長さが50〜1000bp(塩基対)の核酸配列を意味する。一実施例において、突然変異は、長さ150〜250bpの微小逆位である。一実施例において、突然変異は、長さが200〜210bpの微小逆位である。別の実施例において、この変異は、約206bpの長さの微小逆位である。
本明細書において使用される「再発」または「常習性」という用語は、例えば医学的状態のような過去の状態の再発を指す。長期の再発期間を有することが知られている医学的状態(例えばマラリア)が存在する。本文脈において、「再発」という用語は、以前に医学的状態が存在し(例えば、特定の疾患の存在)、被験者において処置された、またはもはや存在しなかった、現在被験者において再発または再表面化したシナリオを指す。
本明細書中で使用される用語「難治性」は、いかなる試みられた形態の処置にも応答しない疾患または状態を指す。例えば、がんは、がん処置に応答しない(または抵抗性である)場合、難治性であるといわれる。難治性がんは、抵抗性がんとしても知られている。
したがって、一実施例において、本明細書に記載されるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫は、再発した、および/または難治性のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫である。一実施例において、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫は、再発したナチュラルキラー/T細胞リンパ腫である。別の実施例において、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫は、難治性ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫である。
再発した、または難治性のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)患者におけるペムブロリズマブに対する応答
化学療法レジメンを含むL−アスパラギナーゼに再発した、または難治性(RR)であったシンガポール、中国および香港からのナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者11例を、平均2線(1〜5線の処置範囲)の処置後に、本試験に組み入れた(表1)。これらのペムブロリズマブで処置した患者11例の診断時年齢中央値は42歳(27〜66歳の範囲)、ペムブロリズマブで処置してからの追跡期間中央値は11ヵ月(2〜25ヵ月の範囲)であった。患者の64パーセント(64%;11例中7例)は完全な応答(CR)を達成し、一方患者の36%(11例中4例)は進行性疾患(PD)であった。2例(NKTL26およびNKTL31)はペムブロリズマブから2年超寛解を維持しており、それは、再発した、または難治性のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(RR NKTL)では稀少な発生と考えられる。最新のペムブロリズマブで処置した症例(NKTL28)は、少なくとも6か月間、進行中の寛解を達成した。ペンボリズマブ(応答する患者について)の応答の継続期間の中央値は、14カ月であった。
化学療法レジメンを含むL−アスパラギナーゼに再発した、または難治性(RR)であったシンガポール、中国および香港からのナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者11例を、平均2線(1〜5線の処置範囲)の処置後に、本試験に組み入れた(表1)。これらのペムブロリズマブで処置した患者11例の診断時年齢中央値は42歳(27〜66歳の範囲)、ペムブロリズマブで処置してからの追跡期間中央値は11ヵ月(2〜25ヵ月の範囲)であった。患者の64パーセント(64%;11例中7例)は完全な応答(CR)を達成し、一方患者の36%(11例中4例)は進行性疾患(PD)であった。2例(NKTL26およびNKTL31)はペムブロリズマブから2年超寛解を維持しており、それは、再発した、または難治性のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(RR NKTL)では稀少な発生と考えられる。最新のペムブロリズマブで処置した症例(NKTL28)は、少なくとも6か月間、進行中の寛解を達成した。ペンボリズマブ(応答する患者について)の応答の継続期間の中央値は、14カ月であった。
したがって、一実施例において、被験者は、以前にSMILE(デキサメタゾン、メトトレキサート、イホスファミド、L−アスパラギナーゼおよびエトポシド)療法に応答しなかった。別の実施例において、被験者は以前にSMILEに応答していた。すなわち、被験者は、以前にSMILE療法に応答したが、疾患が再び起こったかまたは再発した。別の実施例において、被験者は、デキサメタゾン、メトトレキサート、イホスファミド、L−アスパラギナーゼもしくはエトポシド、またはそれらの組合せのいずれか1つ以上の化合物で以前に処置されていた。
PD−L1陽性はナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)患者におけるペムブロリズマブへの応答を層別化できなかった
ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍におけるPD−L1陽性がペムブロリズマブへの応答を予測できるかどうかを検証するために、免疫組織化学(IHC)を用いて、前処置したNKTL腫瘍11例全例におけるPD−L1の陽性率を測定した。同一の病理医が、一貫性を確保するために、本試験のすべての腫瘍においてPD−L1陽性を評価した(表2)。腫瘍細胞におけるPD−L1陽性率は、完全な応答を達成した患者でも進行性疾患を達成した患者でも大きく異なっていた。完全な応答が得られた患者の前処置した腫瘍におけるPD−L1陽性率は6%〜100%の範囲であり、一方進行性疾患を有する患者の中でのPD−L1染色強度は35%〜90%の範囲であった。したがって、PD−L1染色強度は、完全な応答を達成した患者と疾患が進行した患者とを区別できなかった。興味深いことに、NKTL29は、PD−L1について陽性に染色された腫瘍細胞の6%のみを有したが、ペムブロリズマブから完全な応答を達成した。このPD−L1の低い完全な応答症例とは別に、進行例疾患の4例全例がPD−L1に対して強く染色され、PD−L1に対して陽性に染色された腫瘍細胞は平均69%(範囲:50%〜90%)であった。これは、PD−1遮断療法からの抗腫瘍活性が、ベースラインのPD−L1陽性が低い黒色腫および非小細胞肺がん患者においても観察されたことを報告した臨床試験と一致している。対照的に、本明細書に開示される方法は、PD−L1陽性が低い一部の患者がPD−1遮断に対して良好な反応を有する可能性があることを示す。要約すると、理論に拘束されることなく、これは、当技術分野で知られていることと合わず、当技術分野で示されるような免疫組織化学染色に基づくように、PD−1遮断に対する完全な応答を達成した被験者は、達成しなかった被験者よりもそれらの腫瘍において高いPD−L1陽性と有意に関連するはずである。
ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍におけるPD−L1陽性がペムブロリズマブへの応答を予測できるかどうかを検証するために、免疫組織化学(IHC)を用いて、前処置したNKTL腫瘍11例全例におけるPD−L1の陽性率を測定した。同一の病理医が、一貫性を確保するために、本試験のすべての腫瘍においてPD−L1陽性を評価した(表2)。腫瘍細胞におけるPD−L1陽性率は、完全な応答を達成した患者でも進行性疾患を達成した患者でも大きく異なっていた。完全な応答が得られた患者の前処置した腫瘍におけるPD−L1陽性率は6%〜100%の範囲であり、一方進行性疾患を有する患者の中でのPD−L1染色強度は35%〜90%の範囲であった。したがって、PD−L1染色強度は、完全な応答を達成した患者と疾患が進行した患者とを区別できなかった。興味深いことに、NKTL29は、PD−L1について陽性に染色された腫瘍細胞の6%のみを有したが、ペムブロリズマブから完全な応答を達成した。このPD−L1の低い完全な応答症例とは別に、進行例疾患の4例全例がPD−L1に対して強く染色され、PD−L1に対して陽性に染色された腫瘍細胞は平均69%(範囲:50%〜90%)であった。これは、PD−1遮断療法からの抗腫瘍活性が、ベースラインのPD−L1陽性が低い黒色腫および非小細胞肺がん患者においても観察されたことを報告した臨床試験と一致している。対照的に、本明細書に開示される方法は、PD−L1陽性が低い一部の患者がPD−1遮断に対して良好な反応を有する可能性があることを示す。要約すると、理論に拘束されることなく、これは、当技術分野で知られていることと合わず、当技術分野で示されるような免疫組織化学染色に基づくように、PD−1遮断に対する完全な応答を達成した被験者は、達成しなかった被験者よりもそれらの腫瘍において高いPD−L1陽性と有意に関連するはずである。
再発/難治性ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)ペムブロリズマブ処置患者11例の全ゲノムシークエンシング(WGS)および解析
ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)におけるPD−1遮断療法に対する応答のゲノムバイオマーカーを同定するために、全ゲノムシークエンシングを、続いてペムブロリズマブで処置した11人の患者から得た腫瘍−正常ペアサンプルで行った。ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍および全血または頬スワブを、それぞれ平均深さ66.6xおよび37.5xまでシークエンシングした(表3)。体細胞変異体を呼ぶと、各ペアサンプルに対してMb当たり平均1.15個の一塩基変異体(SNV)とmicroIndelsが得られた。サンプル当たり平均39(範囲:1〜80)の体細胞非サイレントタンパク質コード変異体が同定され、新鮮凍結ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)サンプルの全体エクソームシークエンシングに関する以前の報告(範囲:41〜42)と同等である。合計で10個の遺伝子が反復的に変異していることがわかった(図3)。その中で、完全な応答を達成した患者の初期腫瘍のうち、PD−L1構造的再配列(SR)とJAK3活性化変異(p.A573V)のみが再発し、互いに排他的であった。さらに、PD−L1構造的再配列は、ペムブロリズマブに完全な応答を達成した患者の初期腫瘍7例中4例(57%)で同定された最も頻度の高い体細胞変化である(図1A)。これらのPD−L1構造的再配列は、PD−L1の3’UTRを破壊する染色体間転座(NKTL28およびNKTL31)、縦列重複(NKTL26)ならびに微小逆位(NKTL1)からなる(図1B)。ペムブロリズマブで完全な応答が得られた初発患者、NKTL1のペムブロリズマブ療法前後の例示的なポジトロン放出断層撮影−コンピューター断層撮影(PET−CT)スキャンは、この患者の治療転帰を確認するものである(図1C)。
ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)におけるPD−1遮断療法に対する応答のゲノムバイオマーカーを同定するために、全ゲノムシークエンシングを、続いてペムブロリズマブで処置した11人の患者から得た腫瘍−正常ペアサンプルで行った。ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍および全血または頬スワブを、それぞれ平均深さ66.6xおよび37.5xまでシークエンシングした(表3)。体細胞変異体を呼ぶと、各ペアサンプルに対してMb当たり平均1.15個の一塩基変異体(SNV)とmicroIndelsが得られた。サンプル当たり平均39(範囲:1〜80)の体細胞非サイレントタンパク質コード変異体が同定され、新鮮凍結ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)サンプルの全体エクソームシークエンシングに関する以前の報告(範囲:41〜42)と同等である。合計で10個の遺伝子が反復的に変異していることがわかった(図3)。その中で、完全な応答を達成した患者の初期腫瘍のうち、PD−L1構造的再配列(SR)とJAK3活性化変異(p.A573V)のみが再発し、互いに排他的であった。さらに、PD−L1構造的再配列は、ペムブロリズマブに完全な応答を達成した患者の初期腫瘍7例中4例(57%)で同定された最も頻度の高い体細胞変化である(図1A)。これらのPD−L1構造的再配列は、PD−L1の3’UTRを破壊する染色体間転座(NKTL28およびNKTL31)、縦列重複(NKTL26)ならびに微小逆位(NKTL1)からなる(図1B)。ペムブロリズマブで完全な応答が得られた初発患者、NKTL1のペムブロリズマブ療法前後の例示的なポジトロン放出断層撮影−コンピューター断層撮影(PET−CT)スキャンは、この患者の治療転帰を確認するものである(図1C)。
従って、一実施例において、被験者中のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法が開示されており、この方法は、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、被験者は、少なくとも1つのJAK3活性化体細胞突然変異の存在によって特徴づけられる。別の実施例において、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異は、活性化体細胞突然変異である。さらなる実施例において、1つのJAK3活性化変異が存在する。尚他の実施例において、JAK3活性化突然変異は、p.A573Vである。
従って、一実施例において、本明細書で言及される突然変異は、微小逆位、逆位、転座、縦列反復、または切断点(突然変異)である。別の実施例において、突然変異は、転座、縦列反復(もしくは縦列重複)、または微小逆位である。
NKTL28とNKTL31では、PD−L1のエクソン7が、それぞれ2q24.2に、PD−L1のイントロン6が6p12.2に転座していた(図4)。NKTL26では、縦列重複の右側の切断点はPD−L1の3’UTR内に位置し、左側の切断点は約32 kbp上流にあることが確認された(図4)。この重複事象により、PD−L1の3’UTR破壊型のコピーおよび野生型コピーが得られた(図5)。NKTL1における最終的なPD−L1構造的再配列は、PD−L1の3’UTR内に完全に内在する206bpの微小逆位からなっていた(図4)。これらの身体的変化は、ペムブロリズマブで疾患が進行した4人の患者由来の初期腫瘍では認められなかった。
本発明者らのゲノムパイプラインによる配列解析の他に、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)の既知の再発性変異遺伝子について、人為的な影響を避けるために目視検査がまた実施された。メラノーマにおける免疫チェックポイント遮断に対する耐性と関連することが知られている抗原提示およびインターフェロンγ経路に関連する遺伝子の突然変異は、解析したコホートでは認められない。
ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)におけるPD−L1 3’UTRの調節活性
4つのPD−L1構造的再配列はすべて、206bpにわたりPD−L1の3’UTR内に完全に位置する微小逆位を除いて、PD−L1 3’UTRの全体もしくは一部、またはPD−L1 3’UTR機能を失うことが予測された。PD−L1発現の調節におけるこの微小逆位の機能的意義を決定するために、野生型および変異体(206bpの逆位を有する)PD−L1 3’UTRを、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムにクローン化し、リンパ腫および白血病細胞株、すなわちNK−S1、K−562およびJurkatにトランスフェクトした(図10A)。結果から、野生型PD−L1 3’UTRは、レポータータンパク質のルシフェラーゼ活性を効果的に抑制することができ、同定された微小逆位は、NK−S1、K−562およびJurkat細胞株におけるこの抑制を緩和することができることが示される(P=0.01、P=0.01およびP=0.03、両側t検定;図10B)。PD−L1 3’UTR SRを保有するこれら4つの腫瘍では、中程度から高レベル(範囲:20%〜100%)のPD−L1陽性が観察された(表2)。理論に拘束されることなく、これらの結果は、これらのナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍がPD−L1発現をアップレギュレートすることによって、いかにして免疫監視を回避するかを直接説明するものであると考えられている。
4つのPD−L1構造的再配列はすべて、206bpにわたりPD−L1の3’UTR内に完全に位置する微小逆位を除いて、PD−L1 3’UTRの全体もしくは一部、またはPD−L1 3’UTR機能を失うことが予測された。PD−L1発現の調節におけるこの微小逆位の機能的意義を決定するために、野生型および変異体(206bpの逆位を有する)PD−L1 3’UTRを、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムにクローン化し、リンパ腫および白血病細胞株、すなわちNK−S1、K−562およびJurkatにトランスフェクトした(図10A)。結果から、野生型PD−L1 3’UTRは、レポータータンパク質のルシフェラーゼ活性を効果的に抑制することができ、同定された微小逆位は、NK−S1、K−562およびJurkat細胞株におけるこの抑制を緩和することができることが示される(P=0.01、P=0.01およびP=0.03、両側t検定;図10B)。PD−L1 3’UTR SRを保有するこれら4つの腫瘍では、中程度から高レベル(範囲:20%〜100%)のPD−L1陽性が観察された(表2)。理論に拘束されることなく、これらの結果は、これらのナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍がPD−L1発現をアップレギュレートすることによって、いかにして免疫監視を回避するかを直接説明するものであると考えられている。
PD−L1構造的再配列およびJAK3活性化突然変異はナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)においてクローン性である
PD−L1 3’UTR構造的再配列およびJAK3活性化突然変異からのPD−1遮断に対する応答のメカニズムは未だ解明されていないが、これらの変化のクローン性が、ペムブロリズマブの単剤レジメンから、前処置した腫瘍にPD−L1およびJAK3の変化があった患者における完全な応答を支持できるかどうかを検討した。体細胞の一塩基変異体から、10症例のクローンアーキテクチャの溶液を得ることができた(SciCloneはNKTL1のクローン性溶液を持たなかった)。完全な応答例4例、進行性疾患例1例の計5例に、クローン性構造が認められた(表4および図6)。同定された体細胞PD−L1およびJAK3突然変異は、対応する前処置した腫瘍の創設クローン中に存在した。これらの結果を考慮すると、クローン性解析は、ペムブロリズマブ療法の単剤レジメンから完全な応答を達成した患者における応答の程度を支持するものと考えられる。
PD−L1 3’UTR構造的再配列およびJAK3活性化突然変異からのPD−1遮断に対する応答のメカニズムは未だ解明されていないが、これらの変化のクローン性が、ペムブロリズマブの単剤レジメンから、前処置した腫瘍にPD−L1およびJAK3の変化があった患者における完全な応答を支持できるかどうかを検討した。体細胞の一塩基変異体から、10症例のクローンアーキテクチャの溶液を得ることができた(SciCloneはNKTL1のクローン性溶液を持たなかった)。完全な応答例4例、進行性疾患例1例の計5例に、クローン性構造が認められた(表4および図6)。同定された体細胞PD−L1およびJAK3突然変異は、対応する前処置した腫瘍の創設クローン中に存在した。これらの結果を考慮すると、クローン性解析は、ペムブロリズマブ療法の単剤レジメンから完全な応答を達成した患者における応答の程度を支持するものと考えられる。
免疫療法、特にPD−1遮断療法は、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を含むいくつかのがんの処置に有望であることが示されている。PD−1遮断に対して完全な応答を達成した7名のNKTL患者のうち4名(57%)は、それらの腫瘍におけるPD−L1 3’UTR構造的再配列のためのクローン性構造を有することが示される。PD−L1 3’UTR構造的再配列も最近、患者がペムブロリズマブで完全な応答を達成した卵巣がんの1症例で同定され、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫におけるPD−1遮断療法に対する応答の潜在的バイオマーカーとしての役割をさらに支持した。
また本明細書において開示されるのは、ペムブロリズマブ処置に対するナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に罹患している被験者の応答を決定する方法であり、この方法は、被験者から試料を得るステップ;少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在もしくは非存在を検出するステップを含む。別の実施例において、少なくとも1つのJAK活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在は、被験者が処置に応答することを示す。別の実施例において、処置は、本明細書に開示される化合物または処置である。さらに別の実施例において、処置はペムブロリズマブである。
本明細書中で使用されるように、用語「応答」は、処置に対する感受性と同義的に使用することもできる。用語「感受性」は、何か、例えば疾患が他の何か、例えば、前記疾患に対する処置によって影響を受ける可能性が高い傾向を指す。この作用は、特徴または参照されている処置に依存して、陽性または陰性のいずれかであり得る。例えば、被験者が特定の処置に対して感受性である場合、前記被験者の特定の処置に対する感受性は陽性効果である。用語「感受性」は、例えば、反応性または感受性と交換することができる。
従って、一実施例において、本明細書に開示される方法は、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に罹患している被験者のペムブロリズマブ処置に対する感受性を決定する方法である。
すべてのナチュラルキラー/T細胞リンパ腫は、診断的にEBER+(エプスタイン−バーウイルスの存在を示す)およびエプスタイン−バーウイルス(EBV)タンパク質であり、LMP1はPD−L1を恒常的にアップレギュレートすると考えることができる。理論に拘束されることなく、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫は、本来PD−L1+であるため、PD−1阻害剤に応答すると推測された。実際、以前の臨床試験における再発/難治性ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者は、ペムブロリズマブに対して初期の応答を示した。
従って、一実施例において、被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法が開示されている。別の例において、本方法は、PD−1阻害剤、CD279阻害剤、PD−L1阻害剤、CD274阻害剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される阻害剤を被験者に投与することを含む。さらに別の実施例において、被験者は、PD−1阻害剤、CD279阻害剤、PD−L1阻害剤、CD274阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される阻害剤を投与されることになっている。
また本明細書に開示されているのは、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置するための医薬の製造において本明細書に開示されているような化合物または阻害剤の使用である。
本明細書中で使用される「阻害剤」という用語は、特定の受容体、または関連する受容体の群の活性を阻害または遮断することができる化合物を指す。種々の化合物および薬物は、単一の作用に限定されず、従って、たとえそれらが構造的および/または化学的に異なるとしても、同じ受容体の阻害剤であると考えることができる。すなわち、特定の受容体の阻害は、1つより多い阻害剤が使用される実施例におけるこれらの化合物の特徴である。
したがって、一実施例において、本明細書に開示される阻害剤は、PD−1/PD−L1軸の遮断をもたらす阻害剤である。別の実施例において、阻害剤は、限定されるものではないが、PD−1阻害剤、CD279阻害剤、PD−L1阻害剤、CD274阻害剤、およびそれらの組合せである。さらに別の実施例において、本明細書に開示される方法は、PD−1阻害剤、CD279阻害剤、PD−L1阻害剤、CD274阻害剤およびそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない阻害剤を被験者に投与することを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、最初の感染または疾患の予防的阻害、および腫瘍成長または細菌による感染のような未処置の感染または疾患プロセスの天然の経過を変化させるための治療的介入の両方を指す。また、疾患を処置することは、疾患または病理学的状態が発生し始めた後に、例えば腫瘍の成長を阻害もしくは抑制する、腫瘍を除去する、疾患もしくは病理学的状態の少なくとも1つの徴候もしくは症状を改善する、または病態生理学的プロセスを妨げる、治療的介入を指す。
一実施例において、被験者に投与される処置または化合物は、PD−1/PD−L1軸を妨げる化合物である。つまり、これらの化合物は、処置に対する被験者の応答に影響を及ぼす免疫チェックポイントを標的としている。一実施例では、これらの標的免疫チェックポイントは、共抑制性免疫チェックポイント分子である。別の例において、これらの共阻害性免疫チェックポイント分子は、CTLA−4、CD80/CD86、PD1、PD−L1/PD−L2、CD80、PD−L1、BTLA、HVEM、TIM3、およびGAL9であるが、これらに限定されない。さらなる実施例において、被験者に投与すべき処置または化合物は、PD1/PD−L1遮断療法である。さらに別の例において、PD1/PD−L1遮断療法は、PD−1遮断療法である。
従って、一例において、被験者に投与すべき処置または化合物は、PD−1/PD−L1軸を妨げる化合物である。別の実施例において、被験者に投与すべき処置または化合物は、PD−1を標的とする化合物である。これらの化合物は、限定されるものではないが、ニボルマブ(オプジーボ)、ペムブロリズマブ(キートルダ)、アテゾリズマブ(テセントリク)、アベルマブ(バベンシオ)、デュルバルマブ(イムフィンジ)、ピジリズマブ(Cure Tech)、AMP−224(GlaxoSmithKline)、AMP−514(GlaxoSmithKline)、PDR001(Norvartis)、セミプリマブ(Regeneron and Sanofi)、およびこれらの組合せであり得る。一実施例において、投与すべき化合物は、本明細書に開示されている他の任意の化合物と組み合わせたペムブロリズマブ(キートルダ)である。別の実施例において、化合物は、ペムブロリズマブ(キートルダ)である。
その後、11人の患者中4人が進行し、病死している。これらの進行性症例におけるPD−L1およびJAK3遺伝子の変化は認められなかった。理論に拘束されることなく、この初期の「偽寛解」は、ペムブロリズマブの初回投与により一過性に遮断されたPD−L1をアップレギュレートするエプスタイン−バーウイルス(EBV)などの外因性因子に起因すると考えられる。したがって、腫瘍における高いPD−L1陽性は、必ずしもPD−1遮断に対する良好な応答と同等であるとは限らない。さらに、PD−L1免疫組織化学スコアもコホート内で大きく変動し(6%、2+〜100%、3+)、被験者NKTL25およびNKTL27は共に、前処置した腫瘍に対するPD−L1染色グレードが高いにもかかわらず疾患が進行しており、その結果ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫におけるPD−1遮断に対する応答のバイオマーカーとしてPD−L1陽性単独の有効性に疑問が投げかけられている。PD−L2遺伝子内に再配列は同定されず、PD−L1は構造的再配列に関して常に5’再配列パートナーとして働いた。これは、PD−L1および/またはPD−L2の過剰発現がゲノム増幅、JAK2またはPD−L2転座のような多様なメカニズムによって達成される他の血液悪性腫瘍とは対照的であり(表5)、異なる腫瘍が免疫回避のための別のメカニズムを進化させていることを示唆している。
PD−L1およびJAK3の変化の普及を測定するために、より対になった腫瘍−正常ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)腫瘍32例および対応する末梢血リンパ球について、全ゲノムシークエンシング(WGS)を実施し、その臨床病理学的情報を以下の表6に列挙した。病原性ウイルスが腫瘍細胞中に存在することが知られているため、これらのサンプル中の対応する末梢血中に悪性細胞が存在しないことを、シークエンシングデータをEBVゲノムにマッピングすることによって検証した。11人のペムブロリズマブで処置した患者のコホートと同様に、この延長された32のNKTLサンプルのコホートにおいて、その後のペムブロリズマブ処置を有さなかった;PD−L1もまた、コホートにおいて最も再発的に改変された遺伝子であることが見出された(図7A)。構造的再配列に関しても、PD−L1は最も再配列された遺伝子であることが顕著に明らかになった(図7B)。これらのナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL腫瘍)におけるPD−L1の変化の形態には、PD−L1のゲノム領域内の構造的切断点クラスターが関与しており、症例の25%(32例中8例)に認められた(図7C)。PD−L1の遺伝子座内に見出されたすべての構造的再配列は、Sangerシークエンシング法を用いて検証された(図8)。また、バイオインフォマティクス解析により、TP53、DDX3X、STAT3、FAT4およびJAK3などの遺伝子における再発性の非サイレント短変異体が再同定されており(6.3%、32人中2人)、以前に研究されたコホートと同様の病態が示唆されている。
PD−L1 3’UTR構造的再配列(SR)を有する腫瘍における異常転写物の存在を、決定した。利用可能な全トランスクリプトームシークエンシング(WTS)データを有するPD−L1 SRの各々について、SangerシークエンシングによりPD−L1キメラ転写産物を同定し、検証することが可能であった(図9)。
また本明細書に開示されているのは、本明細書に記載される方法を実施するためのキットである。したがって、一実施例において、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキット、検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含むキットが開示されている。さらに別の実施例において、検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含む、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットが開示されており、プライマーは、JAK3およびPD−L1遺伝子のゲノム領域を濃縮する。
一実施例において、少なくとも一対のプライマーは、本明細書の表8および9に挙げられるようなプライマー対であるが、これに限定されない。別の実施例において、プライマー対は、限定されるものではないが、配列番号1および2、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号7および8、配列番号9および10、配列番号11および12、配列番号13および14、配列番号15および16、配列番号17および18、配列番号19および20、配列番号21および22、配列番号23および24、配列番号25および26、配列番号27および28、配列番号29および30、配列番号31および32、配列番号33および34、配列番号35および36、配列番号37および38、配列番号39および40、配列番号41および42、配列番号43および44、配列番号45および46ならびに配列番号47および48である。さらに別の例において、次世代シークエンシングのための、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットが開示されている。さらに別の例において、本明細書に開示されるキットは、本明細書に開示される方法に従って使用するためのものである。
要約すると、43のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)サンプル(11のサンプルがその後ペムブロリズマブで処置され、32のサンプルが処置されなかった)の全コホートにおいて、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫における高頻度(27.9%、43中12)の体細胞PD−L1 3’UTR構造的再配列が、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫がどのようにして免疫監視を回避できるかを説明できることが示され、それによってこれらの患者をより良好に処置するためにPD−1阻害剤を使用するための基礎が提供される。
記述された完全応答症例における再発JAK3活性化突然変異の存在は、JAK3活性化突然変異を有する単発肺がん患者におけるPD−1遮断の長期的利益を示す報告とも一致する。
全ゲノムシークエンシングデータを用いて、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫におけるPD−1遮断療法に対する応答とゲノム特徴が相関することが示され、患者がゲノムスクリーニングを介してPD−1遮断療法に対してより良好に選択され得ることが示された。
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素(単数)または要素(複数)、制限(単数)または制限(複数)がない場合に適当に実施することができる。従って、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含む(containing)」等の用語は、拡張的にかつ限定されることなく読むものとする。さらに、本明細書に用いられる用語および表現は、記述の用語として使用され、限定されるものではなく、このような用語および表現の使用において、示され、記載された特徴またはその一部の何らかの等価物を除外する意図はなく、特許請求された発明の範囲内で種々変更が可能であると認められる。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されているその中で具体化されている発明の修正および変形は当業者に依拠し得、そのような修正および変形は本発明の範囲内であると考えられることは理解されるべきである。
本願で使用されるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が他に明確に指示しない限り複数の参照を含む。例えば、「遺伝マーカー」という用語は、混合物およびそれらの組合せを含む複数の遺伝マーカーを含む。
本明細書中で使用される用語「約」は、製剤の成分の濃度との関連において、典型的には、記載値の+/5%、より典型的には記載値の+/4%、より典型的には記載値の+/3%、より典型的には、記載値の+/2%、さらにより典型的には記載値の+/1%、さらにより典型的には記載値の+/0.5%を意味する。
本開示全体を通して、特定の実施形態を範囲フォーマットで開示することができる。範囲フォーマットでの説明は単に簡便性および簡潔性のために過ぎず、開示された範囲の範囲に柔軟性のない限界と解釈すべきではないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能なすべての下位範囲ならびに当該範囲内の個々の数値を具体的に開示したものであると考えるべきである。例えば、1〜6などの範囲の説明は、具体的に開示されたサブ範囲、例えば1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、ならびに当該範囲内の個別の数、例えば1、2、3、4、5および6を有するものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
また、ある実施形態は、本明細書中に広く包括的に記載することができる。より狭い種および一般的開示内に入る亜属的群分けの各々も、開示の一部を構成する。これには、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を削除する、但し書きまたは負の限定を有する実施形態の一般的な記述が含まれる。
本発明は、本明細書に広く一般的に記載されている。より狭い種および一般的開示内に入る亜属的群分けの各々も、本発明の一部を構成する。これには、切除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を削除する、但し書きまたは負の限定を有する実施形態の一般的な記述が含まれる。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的な実施例内にある。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がまたそれによって任意の個々の要素またはマーカッシュ群の要素の従属群に関して記載されていることを認識するであろう。
実験の章
以下の実施例は、本発明の態様が実施され得る方法、または本発明の特定の態様の実施に適した調製され得る材料を例示する。
以下の実施例は、本発明の態様が実施され得る方法、または本発明の特定の態様の実施に適した調製され得る材料を例示する。
実施例1−材料と方法
患者と方法
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者11人を、ペムブロリズマブで処置した。RECIST基準を用いて放射線走査により応答を評価した。全ゲノム塩基シークエンシング(WGS)を用いて、すべてのペムブロリズマブ投与前の腫瘍および11人の患者の整合正常値を、分子的にプロファイリングした。
患者と方法
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者11人を、ペムブロリズマブで処置した。RECIST基準を用いて放射線走査により応答を評価した。全ゲノム塩基シークエンシング(WGS)を用いて、すべてのペムブロリズマブ投与前の腫瘍および11人の患者の整合正常値を、分子的にプロファイリングした。
試験設計
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、研究コホートは、シンガポール、中国および香港からのL−アスパラギナーゼベースの化学療法レジメンが無効であった再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を有する患者11人からなる。以前にシークエンシングされなかったNKTL1、NKTL25、NKTL26、NKTL43、NKTL44およびNKTL45を、以前の研究から含めた。患者は、細胞傷害性、CD3ε+およびEBER+表現型を有する2008年の世界保健機関分類に従って、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫と診断された。43人の節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者の初期腫瘍および血液/頬スワブサンプルを採取し、そのうち11人がL−アスパラギナーゼベースの化学療法レジメンに失敗し、その後ペムブロリズマブで処置された。応答判定は、PET/CTまたはCT/MRIまたはEBV PCRの併用を用いて行った。全ゲノムシークエンシングを用いて、ペムブロリズマブ前の腫瘍および整合正常対をすべて分子的にプロファイリングした。応答の継続期間(DoR)は、ペムブロリズマブの開始の日から増悪または死亡の日までを算出した。DoR中央値は、Kaplan−Meier法を用いて推定した。SingHealth(2004/407/F)、National University of Singapore(NUS−IRB−10−250)およびSun Yat−sen University Cancer Center(YB2015−015−01)からの施設内審査委員会が、本試験を承認した。この試験の被験者は全員、書面によるインフォームドコンセントを提出した。また、本研究は、ヘルシンキ宣言を遵守した。
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、研究コホートは、シンガポール、中国および香港からのL−アスパラギナーゼベースの化学療法レジメンが無効であった再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を有する患者11人からなる。以前にシークエンシングされなかったNKTL1、NKTL25、NKTL26、NKTL43、NKTL44およびNKTL45を、以前の研究から含めた。患者は、細胞傷害性、CD3ε+およびEBER+表現型を有する2008年の世界保健機関分類に従って、ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫と診断された。43人の節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者の初期腫瘍および血液/頬スワブサンプルを採取し、そのうち11人がL−アスパラギナーゼベースの化学療法レジメンに失敗し、その後ペムブロリズマブで処置された。応答判定は、PET/CTまたはCT/MRIまたはEBV PCRの併用を用いて行った。全ゲノムシークエンシングを用いて、ペムブロリズマブ前の腫瘍および整合正常対をすべて分子的にプロファイリングした。応答の継続期間(DoR)は、ペムブロリズマブの開始の日から増悪または死亡の日までを算出した。DoR中央値は、Kaplan−Meier法を用いて推定した。SingHealth(2004/407/F)、National University of Singapore(NUS−IRB−10−250)およびSun Yat−sen University Cancer Center(YB2015−015−01)からの施設内審査委員会が、本試験を承認した。この試験の被験者は全員、書面によるインフォームドコンセントを提出した。また、本研究は、ヘルシンキ宣言を遵守した。
節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、本試験の全被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られた。節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫は、細胞傷害性、CD3ε+およびEBER+表現型を有する2008年の世界保健機関分類に従って診断された3。SingHealth(2004/407/F)、National University of Singapore(NUS−IRB−10−250)およびSun Yat−sen University Cancer Center(YB2015−015−01)からの施設内審査委員会が、本試験を承認した。40人の節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫患者の初期の腫瘍および血液サンプルを採取し、そのうち6人はまた、再発または難治性(RR)状態に進行した後にペムブロリズマブで処置された。これらのペムブロリズマブで処置された患者のうち4人はシンガポールから、残りの2人の患者は中国からであった。身体的徴候(例えば末梢血EBV負荷およびPETまたはCTスキャン)の組み合わせを用いて、ペムブロリズマブで処置された患者の臨床応答を判定した。これら6名の患者の中で、新鮮凍結腫瘍は1名の患者について入手可能であり、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織は5名の患者について入手可能であった。全40例の腫瘍−血液サンプルについてWGSデータを作成した。シークエンシングおよびアラインメントの統計量は、表7に見出すことができる。
ゲノムDNA抽出
スナップ凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍組織由来のゲノムDNAおよび全血を、前述のように抽出した。E.Z.N.A.組織DNAキット(Omega Bio−tek)を製造者の指示に従って用いて、頬スワブゲノムDNAを精製した。質および量は、他に記載されているように評価した。
スナップ凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍組織由来のゲノムDNAおよび全血を、前述のように抽出した。E.Z.N.A.組織DNAキット(Omega Bio−tek)を製造者の指示に従って用いて、頬スワブゲノムDNAを精製した。質および量は、他に記載されているように評価した。
NK細胞の単離と活性化
休止期および活性化NK細胞をベースラインとして用い、腫瘍サンプルにおけるPD−L1の相対的発現を比較した。NK細胞単離は、シンガポールの保健科学局から得たヒトアフェレーシス錐体血液を用いて行った。Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare)を用いて、400×gで30分間密度遠心法により末梢血単核細胞を取得した。製造業者のプロトコルに従い、EasySep Human NK Cell Isolation Kit(STEMCELL Technologies)を用いてNK細胞を単離した。フローサイトメトリーによるCD3−およびCD56+発現で測定したところ、NK細胞の純度は90%を超えていた。
休止期および活性化NK細胞をベースラインとして用い、腫瘍サンプルにおけるPD−L1の相対的発現を比較した。NK細胞単離は、シンガポールの保健科学局から得たヒトアフェレーシス錐体血液を用いて行った。Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare)を用いて、400×gで30分間密度遠心法により末梢血単核細胞を取得した。製造業者のプロトコルに従い、EasySep Human NK Cell Isolation Kit(STEMCELL Technologies)を用いてNK細胞を単離した。フローサイトメトリーによるCD3−およびCD56+発現で測定したところ、NK細胞の純度は90%を超えていた。
単離された細胞を、200U/mlのIL−2(Proleukin)を含むかまたは含まない5%熱不活性化ヒト血清(Innova Biosciences)を補充したX−VIVO 15培地(Lonza)に懸濁した。48ウェルプレート上に1×106細胞を播種し、CD25−FITC(クローン:M−A251;BD Biosciences)およびCD69−BV421(クローン:FN50;BioLegend)のアップレギュレーションとしてフローサイトメトリーにより48時間後にNK細胞の活性化を決定した。
NK細胞単離は、シンガポールの保健科学局から入手したヒトアフェレーシス錐体血液を用いて行った。Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare)を用いて、400×gで30分間密度遠心法により末梢血単核細胞を取得した。血小板の除去は、120×gで10分間の緩徐遠心分離により行った。EasySep Human NK Cell Isolation Kit(STEMCELL Technologies)を製造業者のプロトコルに従って用いて、開始細胞濃度1×108細胞/mlでNK細胞を単離した。
単離したNK細胞をLive/Dead Aqua生存性色素(ThermoFisher Scientific)で染色した後、CD3−V500(クローン:UCHT1;BD Biosciences)およびCD56−PeCy7(クローン:B159;BD Biosciences)に特異的なモノクローナル抗体で表面染色し、分離の効率を測定した。フローサイトメトリーによるCD3−CD56+発現で測定したところ、NK細胞の純度は90%を超えていた。
単離された細胞を、200U/mlのIL−2(Proleukin)を含む、または含まない5%熱不活性化ヒト血清(Innova Biosciences)を補充したX−VIVO 15培地(Lonza)に再懸濁した。48ウェルプレート上に1×106細胞を播種し、CD25−FITC(クローン:M−A251;BD Biosciences)およびCD69−BV421(クローン:FN50;BioLegend)のアップレギュレーションとしてフローサイトメトリーにより48時間後にNK細胞の活性化を決定した。
全ゲノムシークエンシング
すべてのシークエンシングライブラリーは、TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。HiSeq 2000またはHiSeq X Ten System(Illumina)上で、それぞれ2x101bpまたは2x151bpとして、末端対シークエンシングを行った。FFPE材料からのゲノムDNAの高い断片化のため、FFPE腫瘍サンプルのためのライブラリー調製の前にサイズ選択ステップを実施した。FFPEサンプルから約200bpの増幅可能なDNA断片をシークエンシングライブラリー構築に使用し、PD−L1遺伝子内のSRの発見に明確に偽陰性を避ける。
すべてのシークエンシングライブラリーは、TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。HiSeq 2000またはHiSeq X Ten System(Illumina)上で、それぞれ2x101bpまたは2x151bpとして、末端対シークエンシングを行った。FFPE材料からのゲノムDNAの高い断片化のため、FFPE腫瘍サンプルのためのライブラリー調製の前にサイズ選択ステップを実施した。FFPEサンプルから約200bpの増幅可能なDNA断片をシークエンシングライブラリー構築に使用し、PD−L1遺伝子内のSRの発見に明確に偽陰性を避ける。
あるいは、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫について、全ゲノムシークエンシング(WGS)を、本研究で記述した腫瘍−正常サンプルの全40対について実施した。すべてのシークエンシングライブラリーは、TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。FFPE材料中のゲノムDNAの高い断片化のため、FFPE腫瘍サンプルのためのライブラリー調製に先立ってサイズ選択ステップを実施した。HiSeq 2000またはHiSeq X Ten System(Illumina)上で、それぞれ2x101bpまたは2x151bpとして、末端対シークエンシングを行った。腫瘍および正常の平均のWGSデータの網羅率は、それぞれ68.9倍および42.2倍である。
全トランスクリプトームシークエンシング
RNA抽出、および質と量の評価は、前述のように行った。シークエンシングライブラリーは、TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo−Zero(Illumina)を用いて調製し、HiSeq 2500、HiSeq 3000またはHiSeq X Ten System(Illumina)上で、それぞれ2x101bp、2x151bpまたは2x151bpの読み取り長で、全トランスクリプトームシークエンシング(WTS)を行った。
RNA抽出、および質と量の評価は、前述のように行った。シークエンシングライブラリーは、TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo−Zero(Illumina)を用いて調製し、HiSeq 2500、HiSeq 3000またはHiSeq X Ten System(Illumina)上で、それぞれ2x101bp、2x151bpまたは2x151bpの読み取り長で、全トランスクリプトームシークエンシング(WTS)を行った。
RNA転写産物の定量と標準化
RNA読み取りは、STARを用いて、hs37d5とEBV−1の組み合わせた参照に2パスモードでアラインメントした。DESeq2により遺伝子数を正規化し、両側解析順位和検定を用いて差次発現における有意性を算出した。統計学的有意性は、p<0.05と考慮した。
RNA読み取りは、STARを用いて、hs37d5とEBV−1の組み合わせた参照に2パスモードでアラインメントした。DESeq2により遺伝子数を正規化し、両側解析順位和検定を用いて差次発現における有意性を算出した。統計学的有意性は、p<0.05と考慮した。
cDNA合成とリアルタイム
SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、利用可能なRNAを有するサンプルについて逆転写を行った。
SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、利用可能なRNAを有するサンプルについて逆転写を行った。
全ゲノムおよび全トランスクリプトームシークエンシング
節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、本研究の節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫検体からWGSデータを作成するために、スナップ凍結腫瘍組織およびFFPE腫瘍組織からのゲノムDNA、および全血を、前述のように抽出した。E.Z.N.A.組織DNAキット(Omega Bio−tek)を製造者の指示に従って用いて、頬スワブゲノムDNAを精製した。質および量は、他に記載されているように評価した。全ゲノムシークエンシングを、本研究で記述したすべての腫瘍および全血または頬スワブサンプルについて実施した。すべてのシークエンシングライブラリーは、TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。FFPE腫瘍サンプルのライブラリー調製前に、サイズ選択ステップを実施した。RNA抽出、ならびに質および量の評価は、前述のように行った22。シークエンシングライブラリーは、Ribo−Zeroを有するTruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。
節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、本研究の節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫検体からWGSデータを作成するために、スナップ凍結腫瘍組織およびFFPE腫瘍組織からのゲノムDNA、および全血を、前述のように抽出した。E.Z.N.A.組織DNAキット(Omega Bio−tek)を製造者の指示に従って用いて、頬スワブゲノムDNAを精製した。質および量は、他に記載されているように評価した。全ゲノムシークエンシングを、本研究で記述したすべての腫瘍および全血または頬スワブサンプルについて実施した。すべてのシークエンシングライブラリーは、TruSeq Nano DNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。FFPE腫瘍サンプルのライブラリー調製前に、サイズ選択ステップを実施した。RNA抽出、ならびに質および量の評価は、前述のように行った22。シークエンシングライブラリーは、Ribo−Zeroを有するTruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina)を用いて調製した。
体細胞変異体の検出とフィルタリング
シークエンシング読み取りは、BWA−MEMを用いてhs37d5ヒト参照ゲノムにアラインメントした。Strelka2およびMuSEを用いて、体細胞短変異体を検出した。その後、短変異体にはwAnnovarによる注釈が付けられた。
シークエンシング読み取りは、BWA−MEMを用いてhs37d5ヒト参照ゲノムにアラインメントした。Strelka2およびMuSEを用いて、体細胞短変異体を検出した。その後、短変異体にはwAnnovarによる注釈が付けられた。
構造的再配列のゲノム解析
すべての下流分析に先立ち、gDNAシークエンシング読み取りを、BWA−MEMを用いてhs37d5ヒト参照ゲノムにアラインメントし、PCR重複物を、Sambambaによりマークした。体細胞構造的再配列(SR)を同定するために、Mantaを、腫瘍−血液対サンプルの整列したgDNA読み取りに適用した。PD−L1の遺伝子領域内の予測されたSRはすべて、Sanger Sequencingで検証した。gDNAシークエンシングデータからの予測されたSRが転写産物をもたらすかどうかを決定するために、PCRに基づく検証およびSangerシークエンシングのためにSuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、利用可能な対応するRNAからcDNAを得た。
すべての下流分析に先立ち、gDNAシークエンシング読み取りを、BWA−MEMを用いてhs37d5ヒト参照ゲノムにアラインメントし、PCR重複物を、Sambambaによりマークした。体細胞構造的再配列(SR)を同定するために、Mantaを、腫瘍−血液対サンプルの整列したgDNA読み取りに適用した。PD−L1の遺伝子領域内の予測されたSRはすべて、Sanger Sequencingで検証した。gDNAシークエンシングデータからの予測されたSRが転写産物をもたらすかどうかを決定するために、PCRに基づく検証およびSangerシークエンシングのためにSuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、利用可能な対応するRNAからcDNAを得た。
構造変異の検出とフィルタリング
DNA読み取りは、BWA−MEMを用いてhs37d5ヒト参照ゲノムにアラインメントし、PCR重複は、Sambambaにより除去した。読み取り対は、それらが予想される方向で、および/または予想される挿入サイズ内で参照ゲノムと整列しなかった場合、不一致としてマークした。読み取りのいずれの末端も参照ゲノムと一致しなかった場合、読み取りにはクリップとしてフラッグが付けられた。
DNA読み取りは、BWA−MEMを用いてhs37d5ヒト参照ゲノムにアラインメントし、PCR重複は、Sambambaにより除去した。読み取り対は、それらが予想される方向で、および/または予想される挿入サイズ内で参照ゲノムと整列しなかった場合、不一致としてマークした。読み取りのいずれの末端も参照ゲノムと一致しなかった場合、読み取りにはクリップとしてフラッグが付けられた。
体細胞構造的再配列(SR)の検出はMantaによって行われ、各候補SRは以下のフィルタリング基準に供された:1)SRは、少なくとも3つの不一致な読み取り対と少なくとも3つのソフトクリッピングされた読み取りによって支持され、すべての支持読み取りの合計は少なくとも10である;2)適合する正常サンプル中に存在する不一致およびソフトクリッピングされた読み取りがゼロである;3)腫瘍および適合する正常サンプルの両方で少なくとも20Xのカバー率;および4)SRは少なくとも1000bpのサイズである。
ゲノム領域内にSRを有する固有サンプル、すなわちSRランドスケープのヒストグラムを、hs37d5の主要染色体に沿って100kbpのステップで1Mbp平均化滑り窓を用いて表にした。推定SRの切断点をBEDPEフォーマットに変換し、SRランドスケープとともにCIRCOSを用いてリンクとして可視化した。
体細胞変異の検出
WGSデータはFreeBayes6(−X−u−C5−m30−q20)を用いて解析し、スコアが30未満の変異体はフィルターで除外した。一塩基変異体は、腫瘍から喚起され、対応する正常なデータではない場合にのみ、体細胞性であると予測される。
WGSデータはFreeBayes6(−X−u−C5−m30−q20)を用いて解析し、スコアが30未満の変異体はフィルターで除外した。一塩基変異体は、腫瘍から喚起され、対応する正常なデータではない場合にのみ、体細胞性であると予測される。
体細胞一塩基変異体およびインデルの検出
WGSデータの体細胞一塩基変異体とインデルは、FreeBayesを用いて喚起された。スコアが30未満の候補変異体は、フィルターで除外した。変異体は、腫瘍から喚起された場合にのみ体細胞性であり、対応する正常なデータではないと予測された。
WGSデータの体細胞一塩基変異体とインデルは、FreeBayesを用いて喚起された。スコアが30未満の候補変異体は、フィルターで除外した。変異体は、腫瘍から喚起された場合にのみ体細胞性であり、対応する正常なデータではないと予測された。
腫瘍クローン性の解析
SciCloneを用いて、腫瘍のクローン性構造を解析した。CANVASを用いて、各腫瘍のコピー数およびヘテロ接合性情報の消失を解析し、これをSciCloneによるクローン性解析の入力として用いた。
SciCloneを用いて、腫瘍のクローン性構造を解析した。CANVASを用いて、各腫瘍のコピー数およびヘテロ接合性情報の消失を解析し、これをSciCloneによるクローン性解析の入力として用いた。
PCRとSangerシークエンシング
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、PCR条件およびシークエンシングに関する詳細が、以前に記載されていた。プライマーはPrimer3ソフトウェアを用いて設計し、ペムブロリズマブで処置したNKTL患者11人の発見コホートについて配列を表6に挙げる。Sanger配列をhs37参照ゲノムにアラインメントし、BLATで確認した。あるいは、後にペムブロリズマブで処置されなかったNKTL患者32人の普及コホートについても、プライマー配列を表7に列挙する。
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、PCR条件およびシークエンシングに関する詳細が、以前に記載されていた。プライマーはPrimer3ソフトウェアを用いて設計し、ペムブロリズマブで処置したNKTL患者11人の発見コホートについて配列を表6に挙げる。Sanger配列をhs37参照ゲノムにアラインメントし、BLATで確認した。あるいは、後にペムブロリズマブで処置されなかったNKTL患者32人の普及コホートについても、プライマー配列を表7に列挙する。
組織学的研究とスコア化
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に対して、抗PD−L1ウサギモノクローナル抗体(SP263、Ventana)を用いてPD−L1 IHC解析を行った。PD−L1陽性は、細胞膜で陽性に染色された腫瘍細胞のパーセンテージとして評価された。あるいは、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、PD−L1発現を細胞膜での染色として評価し、陽性腫瘍細胞のパーセンテージおよび染色強度に基づいてスコア化した。以下の等級付けを用いた:0、染色なし、1+、弱、2+中程度および3+強染色。同じ病理医が、すべてのPD−L1 IHC染色を再検討した。この試験で使用したサンプルについて入手可能なHスコアを、表10に含める。
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に対して、抗PD−L1ウサギモノクローナル抗体(SP263、Ventana)を用いてPD−L1 IHC解析を行った。PD−L1陽性は、細胞膜で陽性に染色された腫瘍細胞のパーセンテージとして評価された。あるいは、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、PD−L1発現を細胞膜での染色として評価し、陽性腫瘍細胞のパーセンテージおよび染色強度に基づいてスコア化した。以下の等級付けを用いた:0、染色なし、1+、弱、2+中程度および3+強染色。同じ病理医が、すべてのPD−L1 IHC染色を再検討した。この試験で使用したサンプルについて入手可能なHスコアを、表10に含める。
細胞系および構築物
K−562とJurkat細胞系統はATCCから購入し、NK−S1は自家で発生させた。LGC標準は、K−562およびJurkat細胞株を認証した。Jurkat細胞を、10%FBS(HyClone)を補充したRPMI 1640(Gibco)中に維持し、K−562およびNK−S1を、10%FBS(HyClone)、10%ウマ血清(Gibco)および2mM L−グルタミン(Gibco)を補充したDMEM(Gibco)中で成長させた。細胞を5%CO2の存在下で37℃で成長させ、MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza)を用いてマイコプラズマ汚染についてルーチンにチェックした。
K−562とJurkat細胞系統はATCCから購入し、NK−S1は自家で発生させた。LGC標準は、K−562およびJurkat細胞株を認証した。Jurkat細胞を、10%FBS(HyClone)を補充したRPMI 1640(Gibco)中に維持し、K−562およびNK−S1を、10%FBS(HyClone)、10%ウマ血清(Gibco)および2mM L−グルタミン(Gibco)を補充したDMEM(Gibco)中で成長させた。細胞を5%CO2の存在下で37℃で成長させ、MycoAlert Mycoplasma Detection Kit(Lonza)を用いてマイコプラズマ汚染についてルーチンにチェックした。
節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、ATCCおよび院内NK−S1細胞株由来のK−562およびJurkat細胞株を用いて、PD−L1の3’UTR内で認められた最小の構造的再配列の調節効果を研究コホートで検討した。
SNK6細胞株由来の野生型PD−L1 3’UTR(ENST00000381573.8)を、psiCHECK−2ベクター(Promega)のXhoIおよびNotI部位にクローン化した。サンプルNKTL1で同定された再配列を再現する部分的に逆転した3’UTRについて、突出を有する3個の個々の片を、野生型サンプル(SNK6)から増幅し、PCRにより一緒に連結した。Q5 High−Fidelity 2X Master Mix(New England Biolabs)を用いてクローニングを行った。全長野生型および突然変異体PD−L1 3’UTRをクローン化するために使用されるすべてのクローニングプライマーを、表11に記載する。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、K−562およびJurkatについて、それぞれ5×104細胞および6×104細胞を48ウェルプレート上に3つ1組で播種し、Lipofectamine 3000試薬(Invitrogen)を用いて250ngプラスミドDNAでトランスフェクトした。NK−S1細胞については、Neon Transfection System(Invitrogen)を用いて、2×105細胞を1μgプラスミドDNAで24ウェルプレート上に3つ1組で電気穿孔した。使用したパルスパラメータは、以下であった:電圧1300、幅10、および番号3。あるいは、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫について、K−562細胞について、2.5x105細胞を48ウェルプレート上に3つ1組で播種し、Lipofectamine 3000試薬(Invitrogen)を用いて250ngプラスミドDNAでトランスフェクトした。NK−S1およびJurkat細胞について、2.5×105細胞を、Neon Transfection System(Invitrogen)を用いて1μgプラスミドDNAで24ウェルプレート上に3つ1組で電気穿孔した。
再発または難治性(RR)ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫については、K−562およびJurkatについて、それぞれ5×104細胞および6×104細胞を48ウェルプレート上に3つ1組で播種し、Lipofectamine 3000試薬(Invitrogen)を用いて250ngプラスミドDNAでトランスフェクトした。NK−S1細胞については、Neon Transfection System(Invitrogen)を用いて、2×105細胞を1μgプラスミドDNAで24ウェルプレート上に3つ1組で電気穿孔した。使用したパルスパラメータは、以下であった:電圧1300、幅10、および番号3。あるいは、節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫について、K−562細胞について、2.5x105細胞を48ウェルプレート上に3つ1組で播種し、Lipofectamine 3000試薬(Invitrogen)を用いて250ngプラスミドDNAでトランスフェクトした。NK−S1およびJurkat細胞について、2.5×105細胞を、Neon Transfection System(Invitrogen)を用いて1μgプラスミドDNAで24ウェルプレート上に3つ1組で電気穿孔した。
48時間後、細胞を、Passive Lysis Buffer(Promega)で溶解した。発光は、Dual−Luciferase Reporter Assay System(Promega)とGloMax−Multi+ Detection System(Promega)を用いて測定した。Renillaルシフェラーゼ活性をFireflyルシフェラーゼ活性で分割し、結果を空ベクター対照(模擬)に標準化した。統計学的有意性は、両側t検定により算出した。統計学的有意性は、P<0.05と考慮した。すべての実験を、少なくとも2回繰り返した。
データの可用性
43のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)−正常/血液対のWGSデータおよび28のNKTLの全トランスクリプトームシークエンシング(WTS)データは、研究アクセッションコード:EGAS00001002420の下でヨーロッパゲノムアーカイブ(EGA)に寄託されている。
43のナチュラルキラー/T細胞リンパ腫(NKTL)−正常/血液対のWGSデータおよび28のNKTLの全トランスクリプトームシークエンシング(WTS)データは、研究アクセッションコード:EGAS00001002420の下でヨーロッパゲノムアーカイブ(EGA)に寄託されている。
Claims (17)
- 被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法であって、治療上有効な量のペムブロリズマブを被験者に投与することを含み、前記被験者が少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在によって特徴づけられる方法。
- ペムブロリズマブ処置に対するナチュラルキラー/T細胞リンパ腫に罹患している被験者の応答を決定する方法であって、
− 前記被験者から試料を得るステップ;
− 少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するステップ
を含み、
少なくとも1つのJAK活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在は、前記被験者がペムブロリズマブ処置に応答することを示す、
方法。 - 前記被験者にPD−1/PD−L1軸を妨げる化合物を投与する、請求項3に記載の方法。
- 前記化合物が、ニボルマブ(オプジーボ)、ペムブロリズマブ(キートルダ)、アテゾリズマブ(テセントリク)、アベルマブ(バベンシオ)、デュルバルマブ(イムフィンジ)、ピジリズマブ、AMP−224、AMP−514、PDR001、セミプリマブ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記JAK3活性化突然変異が、M511I、A572V、A573V、R657Q、V722I、V674A、L857P、R403H、Q501H、E958K、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記JAK3活性化突然変異がA572Vである、請求項5に記載の方法。
- 前記PD−L1構造的再配列がPD−L1遺伝子における突然変異である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記突然変異が、挿入、欠失、置換、転座、逆位、微小逆位、重複、縦列反復、切断点(複数可)(突然変異)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記PD−L1遺伝子の前記突然変異が前記PD−L1遺伝子の3’UTRを破壊する、請求項7〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 被験者におけるナチュラルキラー/T細胞リンパ腫を処置する方法であって、PD−1阻害剤、CD279阻害剤、PD−L1阻害剤、CD274阻害剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される阻害剤を被験者に投与することを含む方法。
- ペムブロリズマブの投与をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫が節外ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫が再発および/または難治性ナチュラルキラー/T細胞リンパ腫である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 検出剤、および少なくとも一対のプライマーを含む、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキットであって、前記プライマーがJAK3およびPD−L1遺伝子のゲノム領域を濃縮する、キット。
- 前記少なくとも一対のプライマーが、配列番号1および2、配列番号3および4、配列番号5および6、配列番号7および8、配列番号9および10、配列番号11および12、配列番号13および14、配列番号15および16、配列番号17および18、配列番号19および20、配列番号21および22、配列番号23および24、配列番号25および26、配列番号27および28、配列番号29および30、配列番号31および32、配列番号33および34、配列番号35および36、配列番号37および38、配列番号39および40、配列番号41および42、配列番号43および44、配列番号45および46ならびに配列番号47および48からなる群より選択される、請求項14に記載のキット。
- 次世代シークエンシングのために、少なくとも1つのJAK3活性化突然変異または少なくとも1つのPD−L1構造的再配列の存在または非存在を検出するためのキット。
- 請求項2〜13のいずれか一項の方法による使用のための、請求項14〜16のいずれか一項に記載のキット。
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