CN113453705A

CN113453705A - 鉴定用于癌症治疗的活化性抗原受体(aCAR)/抑制性嵌合抗原受体(iCAR)对的方法

Info

Publication number: CN113453705A
Application number: CN201980078097.9A
Authority: CN
Inventors: Y·萨吉; A·沙比-扬格; G·格罗斯; W·J·吉布森; D·达哈里; M·贝曼
Original assignee: Impat Biology Co ltd
Current assignee: Impat Biology Co ltd
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2021-09-28
Also published as: MX2021003711A; WO2020065406A3; KR20210088559A; CA3114736A1; WO2020065406A2; AU2019348877A1; EP3856236A2; US20200316120A1; JP2022508554A; EP3856236B1; BR112021006100A2; IL282019A

Abstract

本发明提供了一种鉴定靶标对的方法，所述靶标对包含：i)能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其中所述iCAR或pCAR靶标针对靶标细胞外多态性表位，和it)活化性嵌合抗原受体(aCAR)，其中所述aCAR针对蛋白质的靶标非多态性细胞表面表位；以及制造并且在癌症的治疗中使用这样的靶标对的方法。

Description

鉴定用于癌症治疗的活化性抗原受体(aCAR)/抑制性嵌合抗原受体(iCAR)对的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月28日提交的美国临时申请第62/738,895号和2019年5月14日提交的美国临时申请第62/847,830号的优先权，所述申请各自通过引用并入本文。

ASCII表

此专利申请包含一个冗长的表格部分。这些表格的副本与2019年9月27日提交的相应美国专利申请第16/586,730号以及当前案件要求优先权的临时申请同时提交。所述ASCII表创建于2018年9月28日，如下所示：(1)120575-5004-PR aCAR_iCAR_pairs_6_27_18Part 1.txt，66,627,779字节、(2)120575-5004-PR aCAR_iCAR_pairs_6_27_18Part2.txt，99,298,408字节、(3)120575-5004-PR candGenes598_AF10_LOH20.txt，9,310字节、(4)120575-5004-PR extCellAFnLOH1306.txt，94,814字节、(5)120575-5004-PRonlyExtCell1167genes_no filter.txt，18,122字节、(6)120575-5004-PRonlyExtCell3288_no filter.txt，388,102字节。

技术领域

本发明涉及通过过继细胞转移的癌症免疫疗法领域，其采用识别肿瘤细胞表面表达的抗原的活化性嵌合抗原受体(aCAR)、针对相同等位基因变体或其他细胞表面抗原的抑制性CAR(iCAR)和保护性CAR(pCAR)，所述其他细胞表面抗原被正常细胞表达但由于杂合性丧失(LOH)而不被肿瘤表达。

背景技术

毫无疑问，当今癌症免疫疗法中的主要挑战是鉴定专门由肿瘤细胞表达而健康组织不表达的可靶向抗原。T细胞能够根除肿瘤细胞的临床证据来自众多研究，这些研究评价了利用T细胞治疗癌症的高度多样化的方法(Rosenberg和Restifo，2015年)。这些方法采用了带有供体淋巴细胞输注的骨髓移植、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继转移、用通过CAR(Gross和Eshhar，2016a)或T细胞受体(TCR)基因重定向预选抗原预选抗原的T细胞进行治疗、使用免疫检查点抑制剂或主动接种疫苗。其中，使用基因工程改造的T细胞和不同的策略进行主动免疫需要在候选抗原上的预先存在的信息，从而可能产生持久的临床反应，而副作用最小。然而，正如S.Rosenberg最近的一篇综述的标题所述，“Finding suitabletargets is the major obstacle to cancer gene therapy”(Rosenberg，2014年)。

使用嵌合抗原受体(或CAR)使T细胞(或免疫系统的其他杀伤细胞，例如自然杀伤(NK)细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞)以MHC非依赖性方式针对所选抗原基因重定向的概念由Gross和Eshhar在1980年代后期首次提出(Gross等人，1989)。它们是从编码细胞外单链抗体可变片段(scFv)的嵌合基因合成产生的，所述可变片段通过柔性铰链和跨膜经典基序与信号传导组分融合，这些组分包含能够激活T细胞的CD3-ζ或FcRy链的免疫受体酪氨酸活化基序。目前正在数十项临床试验中对CAR进行检验，迄今为止CAR对B细胞恶性肿瘤已显示出特别高的疗效(Dotti等人，2014；Gill和June,2015；Gross and Eshhar,2016a)。CAR-T细胞疗法的安全性在很大程度上取决于其区分肿瘤和健康组织的能力。在临床和临床前研究中已经报道了自身免疫不良反应的重大风险和直接原因是靶抗原在肿瘤外表达所导致的脱肿瘤(off-tumor)的中靶(on-target)毒性(在我们最近的综述中有详细论述(Gross和Eshhar，2016b)和(Klebanoff等人，2016))。关于这种风险，目前在临床上或临床前针对CAR疗法进行测试的共有非突变的细胞表面抗原通常可以根据其组织分布和表达方式分为多个类别：

-严格的肿瘤特异性抗原。也许在这个组中唯一已被临床检验的成员是表皮生长因子受体(EGFRvIII)的变体III，其在胶质母细胞瘤中经常过表达，并且在非小细胞肺癌和前列腺癌、乳腺癌、头颈癌和卵巢癌中也有发现，但在正常组织上未发现。

-在肿瘤和非重要健康组织上表达的表面抗原。这个组中的潜在CAR抗原是主要限于B细胞谱系的分化相关分子。在这些抗原(以及许多临床试验中的靶抗原)中最突出的是CD19，这是一种在B细胞分化中很早获得并参与经由B细胞受体(BCR)的信号转导的泛B细胞标志物。膜前列腺抗原构成这个类别中的另一类抗原。

-典型地由非恶性肿瘤促进细胞表达的抗原。一种这样的抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)，这是一种细胞表面丝氨酸蛋白酶，在各种原发性和转移性癌症中，几乎总是由肿瘤相关成纤维细胞表达。另一种抗原是血管内皮生长因子(VEGF)，在肿瘤血管生成过程中高度表达，且通常在许多重要器官的血管和淋巴内皮细胞上表达。

-与重要健康组织共享的肿瘤相关抗原(TAA)。

目前在临床前和临床研究中评价的大多数其他TAA都由肿瘤过度表达，但也经常在原发的正常组织中以较低的水平存在。

为解决CAR T细胞疗法中自身免疫问题而设计的广泛策略可以分为那些在损伤已经很明显的情况下试图消除或抑制转移的T细胞的策略(反应性措施)和旨在首先就防止潜在损伤的策略(积极措施)(Gross和Eshhar，2016a)。反应性方法通常使用自杀基因，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)和iC9，iC9是一种融合多肽，包括截短的人胱天蛋白酶(caspase)9和突变的FK506结合蛋白。其他方法利用抗体来选择性去除遭受严重破坏的工程化细胞，或如最近证明的那样，利用控制CAR识别部分与细胞内信号传导结构域偶联的异二聚体化小分子剂(Wu等人，2015)。虽然设计了一些主动措施来限制CAR T细胞的体内持久性或功能(例如，使用mRNA电穿孔进行基因递送)，但其他措施则直接解决了增加治疗性CAR的抗原选择性的关键挑战，从而避免损伤非肿瘤组织。其中两个引起特别关注，因为它们可以潜在地扩大可被CAR T细胞安全靶向的肿瘤抗原的范围：

-组合(或“分开的”)抗原识别。虽然真正的肿瘤特异性表面抗原很少，但两种不同抗原的组合却可以定义新的肿瘤特异性标记，所述两种不同的抗原不一定归类为由给定肿瘤共表达的肿瘤相关抗原。将CAR T细胞的活性限制于这样的抗原对提供了关键的安全性量规，并因此扩展了肿瘤特异性靶标的范围，且可具有重要的治疗价值。已经设计了第二代和第三代CAR，通过在CAR内域栓系两个或更多个信号传导部分，以在治疗性T细胞接合单个抗原时为其提供活化和共刺激信号。然而，如果活化和共刺激在各自特异于不同抗原的两个CAR之间在同一T细胞中是分开的，那么全面的反应将需要两个互补信号的协作，这只能在存在两种抗原的情况下才能实现。在若干临床前研究中已经证明了这一原理(Kloss等人，2013；Lanitis等人，2013；Wilkie等人，2012；WO 2016/126608)。

虽然无疑令人着迷，但这种方法仍然需要对活化和共刺激信号两者的幅度进行精确滴定，以达到最佳平衡，从而仅允许有效的中靶的肿瘤上的T细胞反应性。是否可以在临床环境中常规地达到这种平衡仍存在疑问。

最近发布了一种全新的方法，用于将T细胞反应仅限定于表达两种抗原的独特结合的靶细胞(Roybal等人，2016a)。它的核心元件起着“基因开关”的作用，利用了包含Notch在内的几种细胞表面受体的作用方式。在这样的受体与其配体结合后，它经历双重切割，导致其细胞内结构域的释放，所述细胞内结构域易位至细胞核，在细胞核中它起转录因子的作用。这一原理的实施需要将两个基因共同导入效应T细胞。第一个基因组成性地表达并且编码这样的嵌合可切割受体，所述嵌合可切割受体配备有针对第一抗原的识别部分。在靶细胞表面上与该抗原的接合将开启编码针对第二抗原的常规CAR的第二基因的表达。仅当靶细胞也共表达该第二抗原时，它才会被杀伤。

抑制性CAR。当CAR重定向的杀伤细胞的靶抗原被正常组织共享时，发生脱肿瘤反应性。如果该正常组织表达了肿瘤上不存在的另一种表面抗原，则在基因修饰的细胞中共表达靶向该非共享抗原的附加CAR可以防止正常组织导致的T细胞活化，其中该附加CAR包含抑制性信号传导部分。

iCAR具有源自抑制性受体的信号传导结构域，而不是活化结构域(例如FcRy或CD3-ζ)，所述抑制性受体，例如CTLA-4、PD-1或NK抑制性受体，可以拮抗T细胞活化。如果与肿瘤共享候选aCAR抗原的正常组织表达了与肿瘤不共享的另一种表面抗原，则由靶向该非共享抗原的同一T细胞表达的iCAR可以保护正常组织(图1)。

与每个都表达由体细胞重排的基因区段编码的独特的双链TCR的T细胞不同，NK细胞不表达抗原特异性受体。相反，NK细胞表达一系列种系编码的活化和抑制性受体，这些受体分别识别感染细胞和健康细胞的细胞表面上的多个活化和抑制性配体。已经描述了基于NK抑制性受体(例如KIR3DL1)的iCAR的保护能力(US 9,745,368)。KIR3DL1和其他NK抑制性受体通过以快速且全面的方式消除免疫突触而发挥作用。有令人信服的证据表明，单个NK细胞可以仍然保留表达抑制性配体和活化性配体两者的抗性细胞，而杀伤它同时接合的仅表达活化性配体的易感细胞(Abeyweera等人，2011；Eriksson等人，1999；Treanor等人，2006；Vyas等人，2001)。这种精妙的能力是由在每个对应的免疫突触中形成的信号转导分子的不同空间组织所决定的，从而影响细胞溶解颗粒的胞吐作用(关于综述参见(Huse等人，2013))。最近，Fedorov等人(Fedorov等人，2013a；WO 2015/142314)成功地将PD-1和CTLA-4的细胞内结构域用于这个目的。与NK抑制性受体不同，这些iCAR的调节作用影响了整个细胞。然而，这些作用是暂时的，在随后与仅表达aCAR抗原的靶细胞相遇后，允许T细胞完全活化。

通过iCAR和aCAR靶向的抗原的组织分布决定了赋予最大的安全性而不损害临床疗效所需的iCAR的最佳作用方式。例如，如果肿瘤和要保护的正常组织(一种或多种)的解剖部位不相交，则短暂抑制(CTLA-4或PD-1样)可能就足够了。然而，如果这些部位确实重叠，则只有突触限制的抑制作用(例如NK作用方式)将防止治疗性细胞的持续麻痹并允许其有效的杀肿瘤活性。使用iCAR降低中靶脱肿瘤(off-tumor)反应的方法受限于在肿瘤细胞中下调但在正常组织上存在的抗原的严重缺乏。

下一代测序(NGS)允许确定给定肿瘤活检中所有蛋白编码基因的DNA序列(整个基因组的约1％)，并允许将癌症“外显子组”与同一患者的健康组织的“外显子组”(通常来自白细胞)进行比较。外显子组测序可以在活检取出后的几天内完成，而且成本相对较低。同时，转录组分析(RNA-seq)可提供有关由同一细胞样品实际表达的基因的互补信息。

越来越清楚的是，每个单独的肿瘤的突变“景观(landscape)”都是独特的(Lawrence等人，2013；Vogelstein等人，2013)。作为非同义突变的结果，肿瘤细胞可能在一个或多个他或她的HLA产物上向患者的免疫系统呈递一组私有的新肽。的确，近年来，在鉴定肿瘤特异性新表位方面付出了巨大的努力，这些新表位可以被患者自己的CD8或CD4T细胞库识别并用作免疫疗法的靶标(关于综述参见(Blankenstein等人，2015；Van Buuren等人，2014；Heemskerk等人，2013；Overwijk等人，2013；Schumacher和Schreiber，2015))。然而，累积的发现表明，基于新抗原的T细胞免疫疗法在显示较高突变负荷的癌症(例如黑素瘤和肺癌)中更可能有效，但在大多数具有较少突变的癌症中往往未能显示出益处(Savage，2014；Schumacher和Schreiber，2015)。此外，相当大的肿瘤内异质性(Burrell等人，2013)需要同时共同靶向几种抗原，以避免出现突变丧失变体，鉴于有用的免疫原性新肽的缺乏，这一任务变得要求越来越高。

总而言之，鉴定用于通过基因重定向的杀伤细胞的过继转移的癌症免疫疗法的适合靶标的迫切需求仍未得到满足。

发明内容

本发明提供了鉴定抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)/活化性嵌合抗原受体(aCAR)靶标对的方法，所述方法包括：

i)选择能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的iCAR或pCAR，其中iCAR或pCAR靶标针对来自选自由图22中列出的598个基因组成的组的基因的靶标细胞外多态性表位；

ii)选择能够诱导效应免疫细胞活化的aCAR，其中所述aCAR针对选自由图23中列出的49种靶蛋白组成的组的蛋白质的靶标非多态性细胞表面表位；

iii)在细胞群中表达步骤i)的iCAR或pCAR和步骤ii)的aCAR；

iv)对细胞群进行一种或多种测定，其中所述一种或多种测定能够检测防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化和/或检测效应免疫细胞的诱导活化；和

v)基于步骤iv)中的测定结果鉴定iCAR或pCAR/aCAR靶标对。

在一些实施方案中，一种或多种能够检测防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化和/或检测效应免疫细胞的诱导活化的测定选自由以下组成的组：胱天蛋白酶测定(包括胱天蛋白酶-3)、膜联蛋白v(annexinv)-PI染色测定、CD107测定和细胞计数珠阵列(CBA)测定(包括测量IFNγ、IL-2和/或TNFα)。

在一些实施方案中，靶基因位于表现出杂合性丧失(LOH)的染色体区域中，并且其中LOH位置选自由取代、缺失和插入组成的组，或者本文中的靶基因位于表现出表达完全丧失的染色体区域中，其中表达完全丧失是由于选自由取代、缺失和插入组成的组的突变所致。

在一些实施方案中，LOH位置是SNP。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-A基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-B基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-C基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-G基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-E基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-F基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DPA1基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DQA1基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DQB1基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DQB2基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DRB1基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DRB5基因。

在一些实施方案中，如在随同提交的长表格中所提供的，权利要求1所述的iCAR或pCAR配对成组。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自由以下组成的组：乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、皮肤肿瘤、胰腺肿瘤、结直肠肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病、肺肿瘤和神经胶质瘤。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自由以下组成的组：肾上腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、DLBC、乳腺肿瘤、肉瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、膀胱肿瘤和肝肿瘤。

在一些实施方案中，肾上腺肿瘤是肾上腺皮质癌。

在一些实施方案中，肾肿瘤是嫌色细胞肾细胞癌。

在一些实施方案中，黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。

本发明还提供了一种安全效应免疫细胞，其表达(i)本文所述的iCAR或pCAR和(ii)活化性嵌合抗原受体(aCAR)。

在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位。

在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关蛋白，如表1中列出的CAR靶标，在也表达iCAR的肿瘤组织中表达的任何细胞表面蛋白。

在一些实施方案中，非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。

在一些实施方案中，非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：5T4、AFP、AXL、B7H6、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD44v6、CD5、CD7、CD70、CD80、CD89、CDH17、CEA、CLD18、CLEC14a、CLL-1、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、NY-ESO-1、FAP、FHSR、GP100、GPC3、HER2、IL-13R_、IL-13R_2、K-Ras、间皮素、MUC1、MUC-CD、NKG2D配体、NKG2D_配体、PDL1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR-2、生存素、TEM8、TGF、VEGFR2和ALK。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞是自体或通用(同种异体)效应细胞。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR的表达水平高于或等于aCAR的表达水平。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一载体表达，且aCAR由第二载体表达。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR两者都由同一载体表达。

在一些实施方案中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR或pCAR的核苷酸序列的下游。

在一些实施方案中，核苷酸序列包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR或pCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。

在一些实施方案中，病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自A型马鼻炎病毒(ERAV)的E2A以及来自猪捷申病毒1型(PTV1)的P2A。

在一些实施方案中，编码aCAR的核苷酸序列通过柔性接头与iCAR或pCAR连接。

在一些实施方案中，aCAR包含活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。

在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)同源。

在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)例如KIR2DS和KIR3DS同源。

在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与衔接分子例如DAP12同源或者是衔接分子例如DAP12。

在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件同源或者是CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR针对靶标细胞外多态性表位，其中靶标细胞外多态性表位是HLA。

在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位，其中所述肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：EGFR、HER2、间皮素和CEA。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR针对HLA，且aCAR针对或特异性地结合EGFR、HER2、间皮素和/或CEA。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR针对HLA，且aCAR针对或特异性地结合EGFR。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR针对HLA，且aCAR针对或特异性地结合HER2。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR针对HLA，且aCAR针对或特异性地结合间皮素。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR针对HLA，且aCAR针对或特异性地结合CEA。

在一些实施方案中，被安全效应免疫细胞靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌或源自胰腺癌或肺癌的细胞。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。

本发明还提供了一种治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用根据权利要求1至88中任一项所述的表达iCAR和aCAR的安全效应免疫细胞。

本发明还提供了一种治疗患有以基因突变为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述基因突变导致靶基因或靶标细胞外多态性表位基因的表达完全丧失，所述方法包括向患者施用根据权利要求1至88中任一项所述的安全效应免疫细胞。

本发明还提供了编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。

本发明还提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

本发明还提供了核酸序列或核酸序列组合物，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

本发明还提供了编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列或核酸序列组合物，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

本发明还提供了编码aCAR或其部分的核酸序列或核酸序列组合物，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

本发明还提供了核酸序列或核酸序列组合物，其包含：1)编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，和2)编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

本发明还提供了核酸序列或核酸序列组合物，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

本发明还提供了核酸序列或核酸序列组合物，其包含：1)编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

本发明还提供了编码iCAR和aCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。

本发明还提供了包含本文所述的核酸或核酸序列组合物的载体。

在一些实施方案中，载体组合物包含：

1)第一表达载体，其包含如权利要求93或94中任一项所述的核酸，和

2)第二表达载体，其包含如权利要求96或97中任一项所述的核酸。

本发明还提供了包含本文所述的核酸或核酸序列组合物的安全效应细胞。

本发明还提供了包含本文所述的载体或载体组合物的效应细胞。

附图说明

图1显示了iCAR的概念(摘自(Fedorov等人，2013a)。

图2显示了aCAR/pCAR分子设计和作用方式。不管是否表达aCAR抗原，pCAR与其在正常细胞上的抗原的结合都预期产生快速RIP，并将多肽分解为3个独立的片段。

图3A-C显示了在编码HLA I类基因座的染色体区域中经历LOH的肿瘤样品的百分比。A.HLA-G、B.HLA-A、C.ZNRD1，来自TCGA数据库的肿瘤类型。肾嫌色细胞癌[KICH]、肾上腺皮质癌[ACC]、胰腺腺癌[PAAD]、肉瘤[SARC]、肾脏肾乳头状细胞癌[KIRP]、食管癌[ESCA]、肺鳞状细胞癌[LUSC]、肾脏肾透明细胞癌[KIRC]、膀胱尿路上皮癌[BLCA]、卵巢浆液性囊腺癌[OV]、胸腺瘤[THYM]、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌[CESC]、头颈鳞状细胞癌[HNSC]、乳腺浸润癌[BRCA]、胃腺癌[STAD]、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBC]、多形性胶质母细胞瘤[GBM]、结肠腺癌[COAD]、直肠腺癌[READ]、肺腺癌[LUAD]、睾丸生殖细胞肿瘤[TGCT]、间皮瘤[MESO]、胆管癌[CHOL]、子宫癌肉瘤[UCS]、皮肤皮肤黑素瘤[SKCM]、子宫体内膜癌[UCEC]、脑低级神经胶质瘤[LGG]、前列腺腺癌[PRAD]、肝脏肝细胞癌[LIHC]、甲状腺癌[THCA]、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤[PCPG]、急性髓性白血病[LAML]、葡萄膜黑素瘤[UVM]

图4显示了HLA-A相对于基因组中所有其他蛋白编码基因的表达。每个基因的值反映了从GTEX(gtexportal.org)获得的组织中位数的平均RPKM值

图5显示了实施例5中用于分析跨癌症的HLA蛋白杂合性丧失的提议的工作流程。

图6显示了使用ABSOLUTE处理的拷贝数数据的pancan12数据集中的LOH频率。线代表频率的95％二项式置信区间。

图7显示了在HLA-A中观察到的LOH的类型。在588例HLA-A LOH中，没有一个涉及HLA-A基因内的断点。

图8显示了涵盖HLA-A的缺失的长度分布(以碱基对计)。这些缺失的很大一部分大于染色体6p的长度。

图9显示了相对的具有HLA-A的LOH的患者分数与阈值为-0.1的绝对(ABSOLUTE)拷贝数数据之间的相关性。

图10A-10C显示了跨32种癌症的HLA-A、HLA-B和HLA-C的LOH率的比较，揭示了LOH的几乎相同的模式。

图11显示了针对染色体6p缺失分选的AML拷贝数概况的IGV屏幕截图。蓝色表示缺失，红色表示扩增。没有HLA-A的缺失。

图12显示了对于所有SNP经历LOH的葡萄膜黑素瘤肿瘤的比例。

图13提供了TCGA研究缩写(也可在https://gdc.cancer.gov/resources-tcga-users/tcga-code-tables/tcga-study-abbreviations获得)。

图14描绘了与在染色体17上编码的肿瘤抑制蛋白TP53相邻的染色体区域的丢失。被鉴定为iCAR靶标的染色体17上编码的基因可用于治疗患者RC001。

图15提供了iCAR和aCAR构建体的示意图。

图16提供了关于通过ELISA测量的IL-2分泌的数据。iCAR在与表达iCAR靶标的靶细胞相互作用后特异性地抑制IL-2分泌。

图17显示正如通过CBA测量，iCAR在与表达iCAR靶标的靶细胞相互作用后特异性地抑制IL-2分泌。

图18显示了通过表达CD19的靶细胞的CD19 aCAR Jurkat-NFAT的特异性活化。

图19显示了CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR Jurkat-NFAT中NFAT活化的特异性抑制。

图20显示了在不同的E/T比下对NFAT活化的特异性抑制。

图21A-I提供了图15的iCAR和aCAR构建体的序列。图21A是CD19 aCAR_IRES_RFP_P2A_Puro-DNA序列(SEQ ID NO:1)。图21B是CD19 aCAR蛋白序列(SEQ ID NO:2)。图21C是RFP蛋白序列(SEQ ID NO:3)。图21D是嘌呤霉素抗性蛋白序列(SEQ ID NO:4)。图21E是CD20iCAR_IRES_GFP_P2A_Hygro-DNA序列(SEQ ID NO:5)。图21F是CD20 iCAR蛋白序列(SEQ IDNO:6)。图21G是潮霉素抗性蛋白序列(SEQ ID NO:8)。图21H是HLA-A2 iCAR_IRES_GFP_P2A_Hygro-DNA序列(SEQ ID NO:9)。图21I是HLA-A2 iCAR蛋白序列(SEQ ID NO:10)。图21J是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；CTLA4(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1074(SEQ ID NO:11)。图21K是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；LAG-3(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,143(SEQ ID NO:12)。图21L是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；2B4(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,269(SEQ ID NO:13)。图21M是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；BTLA(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,293(SEQ ID NO:14)。图21N是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；KIR2DL2(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,185(SEQ ID NO:15)。图21O是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；KIR2DL3(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,164(SEQ ID NO:16)。图21P是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；KIR2DL2(信号结构域)-970-1221(SEQ ID NO：17)。图21Q是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；BTLA(信号结构域)-970-1302(SEQ ID NO:18)。图21R是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；CTLA4(信号结构域)-970-1092(SEQ ID NO:19)。图21S是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；CSK(信号结构域)-970-1734(SEQ ID NO:20)。图21T是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；CTLA4(信号结构域)-1306-1428(SEQ ID NO:21)。图21U是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；LAG3(信号结构域)-1306-1467(SEQ ID NO:22)。图21V是iCARDNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；2B4(信号结构域)-1306-1665(SEQID NO:23)。图21X是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；CD300LF(信号结构域)-1306-1644(SEQ ID NO:24)。图21Y是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；BTLA(信号结构域)-1306-1428(SEQ ID NO:25)。图21Z是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；LAIR1(信号结构域)-1306-1608(SEQ ID NO:26)。图21AA是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；TIGIT(信号结构域)-1306-1551(SEQ ID NO:27)。图21AB是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；VISTA(信号结构域)-1306-1593(SEQ ID NO:28)。图21AC是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1信号传导-970-1260；GC接头-1261-1305；Ly9(信号结构域)-1306-1842(SEQ ID NO:29)。图21AD是iCAR DNA序列CD8 SP-1-63；Myc标签-64-93；PSMA scFV-94-867；PD1铰链-868-944；PD1 TM-945-1007；PD1(信号结构域)-1008-1299(SEQ ID NO:30)。图21AE是iCAR和aCAR DNA序列CD8 SP 1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV 94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1(信号传导)-970-1260；IRES-1264-1850；CD8 SP-1857-1916；FLAG标签-1917-1940；CD19 scFV-1941-2666；CD8铰链-2667-2801；CD8 TM-2802-2873；41BB-2874-2999；CD3z-3000-3335(SEQ ID NO:31)。图21AF是iCAR和aCAR DNA序列，序列为iCARDNA序列CD8 SP 1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV 94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；IRES-973-1559；CD8 SP-1566-1625；FLAG标签-1626-1649；CD19 scFV-1650-2375；CD8铰链-2376-2510；CD8 TM-2511-2582；41BB-2583-2708；CD3z 2709-3044(SEQ IDNO:32)。图21AG是iCAR和aCAR DNA序列CD8 SP 1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV 94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1(信号传导)-970-1260；P2A-1261-1326；CD8SP-1327-1351；FLAG标签-1352-1410；CD19 scFV-1411-2136；CD8铰链-2137-2271；CD8 TM-2272-2343；41BB-2344-2469；CD3z 2470-2805(SEQ ID NO:33)。图21AH是iCAR DNA序列CD8SP 1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969(SEQID NO:34)。图21AI是iCAR DNA序列CD8 SP 1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV-94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1(信号传导)-970-1260(SEQ ID:35)。图21AJ是iCARDNA序列CD8 SP 1-63；Myc标签-64-93；HLA-A2 scFV 94-828；PD1铰链-829-906；PD1 TM-907-969；PD1(信号传导)-970-1260；GS接头-1261-1305；PD1(信号传导)1306-1596(SEQID:36)。图21AK是aCAR DNA序列CD8信号肽1-63；Flag标签64-87；CD19 scFV 88-813；CD8铰链814-948；CD8 TM 949-1020；CD28 1021-1677；CD3z 1678-2013(SEQ ID:37)。图21AL是aCAR DNA序列CD8 SP-核苷酸1-63；Myc标签-核苷酸64-93；scFV EGFR 94-816；CD8铰链817-951；CD8 TM 952-1023；41BB 1024-1149；CD3z 1150-1485(SEQ ID:38)。图21AM是CAR氨基酸序列EGFR aCAR(基于西妥昔单抗scFv)(SEQ ID:39)。图21AN是CAR氨基酸序列EGFRaCAR(基于帕尼单抗scFv)(SEQ ID:40)。图21AO是CAR氨基酸序列EGFR aCAR(基于尼妥珠单抗scFv)(SEQ ID:41)。图21AP是CAR氨基酸序列EGFR aCAR(基于耐昔妥珠单抗scFv)(SEQID:42)。图21AQ是aCAR氨基酸序列EGFR aCAR(基于C10scFv)(SEQ ID:43)。图21AR是基于曲妥珠单抗scFv的aCAR氨基酸序列HER2 aCAR(SEQ ID:44)。图21AS是基于帕妥珠单抗scFv的aCAR氨基酸序列HER2 aCAR(SEQ ID:45)。图21AT是iCAR氨基酸序列人源化HLA-A2scFv-IgG-VKA17/VH1-3(SEQ ID 46)。图21AU是iCAR氨基酸序列人源化HLA-A2scFv-IgG-VKA17/VH1-69(SEQ ID 47)。图21AV是iCAR氨基酸序列人源化HLA-A2scFv-IgGVKA18/VH1-3(SEQID 48)。图21AW是iCAR氨基酸序列人源化HLA-A2scFv-IgG VKA18/VH1-69(SEQ ID 49)。

图22提供了598个iCAR靶标的列表。

图23提供了49个aCAR靶标的列表。

图24提供了27个肿瘤类型的列表。

图25提供了关于免疫学体外概念验证(PoC)的图。通过mRNA电穿孔表达aCAR(CD19)/iCAR(HLA-A2)构建体(PoC)。

图26提供了显示CD107a方案的示意图。

图27提供了关于门控策略控制的数据。效/靶(E/T)

图28提供了显示在存在Raji-A2的情况下以1:1比率表达两种CAR的效应T细胞被抑制了50％的数据。

图29提供了关于测试不同的aCAR/iCAR比对CD107a的抑制程度的影响的数据。

图30提供了显示关于效/靶(E/T)比为2:1、aCAR(1ug)和iCAR(5ug)1至5比率、EP T细胞的数据；显示了关于aCAR/iCAR比对CD107a抑制程度的进一步数据。

图31提供了与图30相同实验的另外的数据，显示了关于效/靶(E/T)比为2:1、aCAR(2ug)和iCAR(2、4、10ug)、EP T细胞的数据；显示了关于aCAR/iCAR比对CD107a抑制程度的进一步数据。

图32提供了显示当与iCAR共表达时CD19-CAR的表达较低的数据。

图33提供了显示抑制作用取决于aCAR/iCAR比的数据。抑制百分比＝100*(1-(具有Raji-A2的T细胞中的CD107a/具有Raji的T细胞的CD107a))。

图34提供了显示胱天蛋白酶-3方案的示意图。

图35提供了显示在时间过程实验中的E/T比的数据(靶细胞＝Raji；效应细胞＝aCAR EP T细胞)。

图36提供了显示在时间过程实验中的E/T比的数据(靶细胞＝Raji；效应细胞＝空白EP T细胞)。

图37提供了显示时间和E/T比对胱天蛋白酶-3活化程度影响的数据。

图38提供了有关测试aCAR/iCAR比、E/T比和时间对抑制胱天蛋白酶-3的影响的数据。

图39提供了显示在3小时时在Raji和Raji-A2细胞中的E/T比率比较的数据。E/T＝1；共孵育3小时。具有1μg的aCAR和1μg的iCAR或1aCAR和5μg iCAR的T细胞EP。

图40提供了显示对于E/T＝1在aCAR/iCAR比为5时的显著杀伤抑制作用的数据。

图41提供了显示在1小时时不同aCAR/iCAr比的比较的数据。E/T＝5，1小时。

图42提供了显示在1小时时不同aCAR/iCAr比的比较的数据。E/T＝2，1小时。

图43提供了显示在1小时时不同aCAR/iCAr比的比较的数据。E/T＝1，1小时。

图44提供了显示HLA-A2 iCAR在不同的E/T比时赋予特定保护的数据。

图45提供了显示通过iCAR对抑制胱天蛋白酶的供体作用的数据。E/T比2:1或1:1、aCAR(1μg)和iCAR(5μg)、EP T细胞。

图46提供了显示对于供体3的不同aCAR/iCAr比的比较的数据。E/T比2:1或1:1、aCAR(1μg)和iCAR(5μg)、EP T细胞、供体3。

图47提供了显示供体3细胞显现出对背景水平的显著抑制的数据。

图48提供了显示对于供体5的不同aCAR/iCAr比的比较的数据。E/T比2:1或1:1、aCAR(1μg)和iCAR(5μg)、EP T细胞、供体5。

图49提供了显示类似于供体3的供体5细胞显现出对背景水平的显著抑制的数据。

图50提供了用于设计另外的构建体(以便进一步优化CAR)的方案，所述构建体由以下元件组成：信号肽、scFv、铰链、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

图51提供了显示在iCAR和aCAR之间的比率增加时Raji-A2的保护作用增强的数据。

图52提供了显示在广泛的E/T比范围内iCAR提供保护作用的数据

图53提供了显示与用aCAR mRNA和iCAR mRNA电穿孔的T细胞共培养的靶细胞的胱天蛋白酶3表达的数据。Raji-V是用Violet CellTrace标记的Raji细胞。Raji-A2V是用Violet CellTrace标记的Raji-A2细胞。

图54提供了显示在仅用aCAR或用不同aCAR:iCAR比的双CAR电穿孔的T细胞中的IFNg分泌和计算的抑制百分比的数据。将T细胞与不同的靶细胞共培养，并计算IFNg和抑制百分比。当aCAR:iCAR比为1:5时，观察到对T细胞的最大抑制作用。

图55提供了显示与肿瘤细胞或“脱肿瘤”细胞共培养的电穿孔T细胞的IFNg和TNFa分泌的数据。数据证明在用“脱肿瘤”细胞刺激后在用aCAR和iCAR两者电穿孔的T细胞中IFNg和TNFa细胞因子分泌的特异性降低。使用以下公式计算抑制百分比(表100)：抑制％＝100x[1-(RAJI-A2浓度/RAJI浓度)]。

图56提供了显示CD107a表达的抑制百分比的数据

图57提供了显示当分别共培养或混合在一起时，表达双CAR(aCAR和iCAR)的T细胞从“脱靶”细胞中识别肿瘤细胞的数据

具体实施方式

I.介绍

关于A.G.Knudson在1971年提出的肿瘤抑制基因(TSG)的革命性概念(KnudsonJr.,1971)，Devilee、Cleton-Jansen和Cornelisse在其题目为“自Knudson以来”(Devilee等人，2001)的论文的开篇中提到：“许多出版物都记录了多种肿瘤中许多不同染色体上的LOH，暗示了多个TSG的存在。Knudson的二次打击假说预测，这些LOH事件是使TSG的两个等位基因失活中的第二步”。Lengauer、Kinzler和Vogelstein在其关于人癌症的遗传不稳定性的开创性综述(Lengauer等人，1998)中写道：“核型研究显示，大多数癌症丧失或增加了染色体，且分子研究表明，核型数据实际上低估了这种变化的真实程度。杂合性的丧失，即，在肿瘤中母本或父本等位基因的丧失，是普遍存在的，且通常伴随着相反等位基因的获得。例如，肿瘤可能失去母本染色体8，而复制父本染色体8，使细胞具有正常的染色体8核型，但具有异常的染色体8“等位基因型”。结肠、乳腺、胰腺或前列腺的“平均”癌症可能会丧失25％的其等位基因，而肿瘤丧失了多于一半的其等位基因并不罕见。”此后，在许多报告中，这些观察结果得到了加强，并扩展到几乎所有人癌症，包括几乎所有的癌(关于综述，参见(McGranahan等人，2012))。现在已经明确地确定几乎所有的单个肿瘤都表现出全染色体、整个染色体臂或大小不同的亚染色体区域的多种丧失。正在快速开发新的算法(例如，Sathirapongsasuti等人，2011)，用于基于外显子组序列数据确定任何给定细胞样品中的LOH谱。虽然目前统计偏差可能会质疑某些解释的有效性(Teo等人，2012)，但这样的算法可能改善和替代大多数在NGS之前的时代为此目的而采用的用于建立LOH谱的其他方法。

可以在同一组织的癌变前细胞中检测到早期LOH事件，而在周围正常细胞中检测不到(Barrett等人，1999)。LOH是不可逆的，且事件只能累积，因此肿瘤异质性反映了整个肿瘤进展过程中丧失的累积。虽然可能产生在后期LOH事件中不同的肿瘤亚克隆，但在给定患者中存在由癌变前细胞、假定的肿瘤干细胞和所有肿瘤亚克隆共享的最小LOH特征预期将成为规则。从这种“树干”LOH模式产生的分支仍然会产生有限的部分重叠的特征集，所述特征一起覆盖了同一患者的所有肿瘤细胞。

总体LOH事件的必然结果是位于缺失的染色体物质上的所有其他基因的伴随丧失，并且这些基因天然地包含许多编码跨膜蛋白的基因。关于它们的身份，已经编制了3,702种不同的人细胞表面蛋白(“表面蛋白组”)的目录(Da Cunha等人，2009)。约42％的表面蛋白组(surfaceome)基因的表达显示宽的组织分布，而约85个基因由所有被检组织组织表达，这是管家基因的标志。这些基因是候选基因，其不同的多态性变体可以用作本发明的iCAR和aCAR的靶标。

最近，Bausch-Fluck等人(Bausch-Fluck等人，2015)应用了他们的化学蛋白质组学细胞表面捕获技术来鉴定41种人细胞类型中1492种细胞表面糖蛋白的组合集。预期表面蛋白组的很大一部分将被任何给定肿瘤表达，各自表现出独特特征。发现与所有其他基因相比，编码细胞表面蛋白的基因在其编码区中稍微更富集单核苷酸多态性(SNP)(Da Cunha等人，2009)。与改变肽序列(非同义)的SNP相比，更罕见的多态性框内插入和缺失进一步影响变体的数量，并可能对多肽产物施加更稳健的结构效应。典型的基因组总共含有10,000至12,000个具有非同义变体的位点和190-210个框内插入/缺失(Abecasis等人，2010；Auton等人，2015)。这些变体在基因组中不是均匀分布的，因为高度多态的基因诸如HLA基因座(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)或某些G蛋白偶联受体(GPCR)基因(Lee等人，2003；Rana等人，2001)创建了独特的变体“热点”。LOH相关热点的另一层源于某些染色体或不同癌症中染色体臂(例如，小细胞肺癌中的3p和17p(Lindblad-Toh等人，2000)、结直肠癌中的17p和18q(Vogelstein等人，1989)、乳腺癌中的17q和19(Li等人，2014；Wang等人，2004)、黑素瘤中的9p(Stark和Hayward，2007)、胶质母细胞瘤中的10q(Ohgaki等人，2004年)以及更多)的频繁丧失。

表面蛋白中的等位基因变异的很大一部分会影响相应基因产物的细胞外部分，从而可能产生独特的等位基因限制性表位，其原理上可以通过高度特异性mAb识别并与其他变体区分开。已有充分的文献证明，可以分离出区分同一蛋白的仅在单个氨基酸上有所不同的两个变体的mAb(参见，例如以出色的特异性识别Ras癌基因的点突变产物的mAb的早期实例(Carney等人，1986))。有趣的是，已证明对蛋白表位中单个氨基酸互换具有特异性的两个mAb可以使用结构上与其重链和轻链V基因库不同的可变区(Stark和Caton，1991)。最近，Skora等人(Skora等人，2015)报告了肽特异性scFv的分离，其可区分源自突变的KRAS和EGFR蛋白及其野生型对应物的HLA-I结合的新肽，两种情况下均以一个氨基酸而不同。

综上所述，肿瘤细胞出现了独特的抗原性特征，可以使它们与个体患者全身的所有其他细胞明确区分。它包括由等位基因变体编码的所有跨膜蛋白，这些等位基因变体由于LOH而在肿瘤细胞表面不存在，但在起源癌组织或表达这些基因的其他组织的正常细胞上存在。自然地，除真正的管家基因外，每个受LOH影响的基因都将以独特的组织分布模式来表征。这些基因中的大多数预期不会直接参与肿瘤发生或转化表型的维持，并且从这个意义上讲，它们的丧失具有“乘客”性质。

上面提出的基本原理认为，对于几乎所有肿瘤，独特的分子特性不可避免地由LOH形成，标志着在正常细胞上存在的许多多态性表面结构的缺乏。将个体肿瘤的这种假定特征转变为抗原表位的可靶向集合需要可实行的免疫学策略，用于将对特定的“缺乏”的识别转化为能够触发靶细胞杀伤的活化提示。重要的是，在这一策略的未来临床实施中，并入安全装置以确保严格避免中靶的脱肿瘤的反应性将非常有利。

本发明通过在每个治疗性杀伤细胞中共表达单个基因对来解决这一挑战。这个对中的一个伴侣编码活化性CAR(aCAR)，而另一个编码保护性CAR(pCAR)或抑制性CAR(iCAR)。

II.选择定义

如本文所用的术语“核酸分子”是指DNA或RNA分子。

术语“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性，所述特定核苷酸序列用作模板，用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其他聚合物和大分子。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生一种蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。两条编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列)以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。

除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包含内含子。

术语“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。

术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

如本文所用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与要表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括掺入了重组多核苷酸的本领域中所有已知的载体，例如粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用的术语“基因组变体”是指与相同基因组位置处的参考或共有序列相比，在测序样品中在基因组水平上的至少一个核苷酸变化。

如本文所用的关于变体的术语“相应的参考等位基因”意指与变体在相同基因组位置的参考或共有序列或核苷酸。

如本文所用的关于蛋白质的术语“细胞外结构域”意指细胞膜外部的蛋白质区域。

如本文所用的术语“杂合性丧失”或“LOH”意指在体细胞中两个染色体的一个拷贝中，染色体物质例如完整染色体或其一部分的丧失。

如本文所用的关于变体或参考等位基因的术语“序列区”意指从变体位置的上游开始并在下游终止的序列，其可以被翻译成可被抗体识别的“表位肽”。

如本文所用的术语“CAR”是指与来自例如T细胞或NK细胞的细胞免疫功能受体或衔接分子共享结构和功能特性的嵌合多肽。CAR包括TCAR和NKR-CAR。在与同源抗原结合后，CAR可以使其所处的细胞毒性细胞活化或失活，或调节细胞的抗肿瘤活性或以别的方式调节细胞的免疫应答。

如本文在细胞外结构域的上下文中使用的术语“特异性结合”，所述细胞外结构域例如与多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合的scFv，是指scFv与一个等位基因变体的相对结合，并且它不能与相同多态性细胞表面表位的相应的不同等位基因变体结合。由于这取决于亲合力(T细胞上CAR拷贝的数量、靶细胞(或要保护的细胞)表面上抗原分子的数量)以及所用的特异性CAR的亲和力，所以功能限定将会是：特异性scFv将在ELISA中针对其特异的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体提供显著信号，或者在FACS测定中用展示scFv的CAR转染的细胞将清楚地被多态性细胞表面表位的单个等位基因变体标记，而使用相同多态性细胞表面表位的相应的不同等位基因变体的相同测定不会产生任何可检测信号。

本文所用的术语“治疗”是指获得期望的生理作用的手段。就部分或完全治愈疾病和/或归因于所述疾病的症状而言，所述作用可以是治疗性的。该术语是指抑制疾病，例如阻止其发展；或改善疾病，例如引起疾病消退。

如本文所用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指希望对其进行诊断、预测或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如，人。

短语“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”包括本发明所述的表达至少一种如本文所述的iCAR或pCAR的细胞。在一些实施方案中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”能够施用于受试者。在一些实施方案中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”进一步表达如本文所述的aCAR。在一些实施方案中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”进一步表达如本文所述的iCAR或pCAR。.在一些实施方案中，“安全效应免疫细胞”或“安全效应细胞”进一步表达如本文所述的iCAR或pCAR和如本文所述的aCAR。

可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。载体必须是“可接受的”，其意义为与组合物的其他成分相容并且对其接受者无害。

短语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指有效实现特定生物学结果的如本文所述的化合物、制剂、物质或组合物的量。

载体、给药方式、剂型等的下列示例被列为已知的可能性，从中可以选择用于本发明的载体、给药方式、剂型等。然而，本领域普通技术人员将理解，应当首先测试所选的任何给定的制剂和给药方式以确定其达到期望的结果。

给药方法包括但不限于肠胃外，例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下、粘膜(例如口服、鼻内、含服、阴道、直肠、眼内)、鞘内、局部和皮内途径。给药可以是全身性的或局部的。在一些实施方案中，药物组合物适于口服给药。

术语“载体”是指与活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。药物组合物中的载体可包括粘合剂，例如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮或聚维酮)、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，例如海藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，例如硬脂酸镁或十二烷基硫酸钠；和助流剂，例如胶体二氧化硅。

如本文所用的术语“外周血单核细胞(PBMC)”是指具有圆形核的任何血细胞，例如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。从血液中分离PBMC的方法对本领域技术人员是显而易见的。一个非限制性实例是使用ficoll(一种分离血液层的亲水性多糖)从全血中提取这些细胞，其中单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层，或通过白细胞去除术，制备白细胞浓缩物，将缺乏红细胞和白细胞的血浆返回给供体。

如本文所用的术语“癌症”定义为其特征在于异常细胞快速且不受控制地生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包含但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、胶质瘤等。

III.CAR-T系统：iCAR、pCAR和aCAR

应该强调的是，本发明提供了一种新途径，使得能够特异性地靶向肿瘤细胞，同时保持正常细胞安全。本文提出的概念用于鉴定iCAR(或pCAR或保护性CAR)的新靶标，这些靶标被定义为包含多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，由于它们所在的染色体区域的LOH而从肿瘤细胞丧失，但在正常组织上表达。由于多态性变异，有可能区分两个等位基因并且仅靶向肿瘤细胞中丢失的等位基因。此外，靶抗原本身不一定是肿瘤抑制基因，或预测与癌症有关的基因，因为它被选择为处于因LOH而丧失的区域中，因此可以简单地与这样的基因连锁。这在概念上与迄今为止在癌症治疗中采用或建议的靶向肿瘤相关抗原或在肿瘤处下调的抗原而不论多态性的方法不同。通过如本文所述通过iCAR和/或pCAR的共表达赋予正常细胞保护，本方法还提供了aCAR选择的增宽，所述选择超过肿瘤相关抗原。

所述区别是至关重要的，因为LOH是一种基因组事件，其导致肿瘤中特定变体的完全丧失，极少有机会重新获得丧失的等位基因。如果LOH事件在肿瘤发展的非常早期发生，则它确保在所有源自初始癌前组织的肿瘤细胞(包括转移性肿瘤)中的一致靶特征。另外，LOH几乎发生在所有类型的癌症中，并且因此可以依赖这一概念作为开发与所有这些癌症类型相关的标志物的通用工具。由于LOH事件在某种程度上是随机的，因此本发明进一步为每位个体癌症患者提供个性化肿瘤标志物的选择，其根据为在该患者中发生的特定LOH事件。执行这个概念所依赖的工具aCAR和iCAR是熟知的，并且可以使用本领域熟知的如例如WO 2015/142314和US 9,745,368中所教导的方法容易地制备，将两篇专利都通过引用并入本文，如同在此完全公开一样。

根据一种策略，每个给定对中的两个CAR特异性地识别对于患者为杂合的同一靶基因的不同等位基因变体的产物。基本原理如下：aCAR靶向选定细胞表面蛋白的等位基因变体，所述细胞表面蛋白由给定的肿瘤细胞表达且不受LOH影响，而pCAR或iCAR靶向由于LOH而从这些肿瘤细胞丧失的同一基因的等位基因变体所编码的产物。在表达所述基因的个体患者的其他正常组织中，两个等位基因都存在并且已知具有同等功能，也就是说，在所有组织中都是双等位基因表达(与可能表现出随机单等位基因表达的其他基因形成对比(Chess，2012；Savova等人，2016)。在一种情况下，两个CAR靶向位于蛋白质产物上相同位置的两个相关表位，它们相差一个或仅几个氨基酸。在另一种情况下，aCAR靶向相同蛋白质上的非多态性表位，而pCAR或iCAR是等位基因特异性的。在这种情况下，在正常细胞上aCAR表位的密度通常比iCAR或pCAR表位的密度高两倍。在一些实施方案中，单个核酸载体编码aCAR和iCAR或pCAR两者。

另一种策略利用管家基因的蛋白质产物作为pCAR或iCAR靶标。由于根据定义这些基因在身体所有细胞上表达，因此它们是pCAR或iCAR的安全靶标。即，如果pCAR或iCAR靶向对于给定患者中为杂合的管家基因的膜产物，则除了由于LOH而丧失这个等位基因的肿瘤细胞之外，体内所有细胞都将受到保护。这一策略允许aCAR靶基因产物与pCAR或iCAR靶基因产物解偶联。实际上，aCAR靶标则可以是由肿瘤表达的任何非多态性表位。这一策略的一种变化是利用靶向非多态性肿瘤相关抗原的已知aCAR(例如在临床使用中的aCAR或在临床试验中处于检验中的aCAR)与针对一种基因的膜产物的iCAR或pCAR联合，所述基因对于给定患者是杂合的并且至少在肿瘤起源组织中表达并且优选地在表达aCAR靶抗原的其他重要正常组织中表达。

遵循允许将aCAR靶抗原与iCAR/pCAR靶抗原解偶联的相同原理，后者不应该一定是管家基因的产物。在一些实施方案中，iCAR和/或pCAR是其表达模式足够宽的任何基因的产物，以便保护除了肿瘤之外还表达aCAR靶抗原的重要正常组织。作为推论，正如关于管家基因所主张的，aCAR抗原可以是由肿瘤表达的任何非多态性表位，而不限于已知的“肿瘤相关抗原”，这一考虑因素可以大大扩展候选aCAR靶标的列表。一般而言，对于管家基因和非管家基因两者，这样的正常重要组织的身份和表达水平将用作这样的候选aCAR靶标的优先次序的重要标准。

必须注意确保由iCAR传输的抑制信号相对于aCAR信号严格且永久地占优势，并且在iCAR和aCAR之间不发生交叉识别。iCAR的优势保证杀伤细胞与表达两个等位基因的正常细胞相遇后其活化将被阻止。然而，这种默认的制动在与肿瘤细胞接合后不会起作用：在没有其靶抗原的情况下，iCAR不会传递抑制信号，因此发动预期的aCAR介导的细胞活化以及随后的肿瘤细胞溶解。

iCAR技术可基于免疫检查点。就这一点而言，论证(Fedorov等人，2013b；WO 2015/142314)表明，PD-1和CTLA-4的调控元件当作为iCAR信号传导组分并入时具有强大的T细胞抑制能力，这令人鼓舞，但这些观察的普遍性最近受到质疑(Chicaybam和Bonamino，2014，2015)。此外，尽管尚未完全了解由这些检查点蛋白触发的精确分子途径，但它们的接合会通过近端机制和远端机制两者抑制T细胞活化，使T细胞对伴随的活化刺激无反应(Nirschl和Drake，2013)。因此，尽管通过PD-1和CTLA-4 iCAR保证的失活状态确实是暂时的和可逆的(Fedorov等人，2013b)，但它不允许在表达iCAR靶标和aCAR靶标两者的组织中的T细胞活化。相反，NK抑制性受体相对于活化性受体的优势确保通过空间而不是时间机制使健康细胞免受NK细胞的攻击。(Long等人，2013)。有令人信服的证据表明，单个NK细胞可以保留表达抑制性配体和活化性配体两者的抗性细胞，而杀伤它同时接合的仅表达活化性配体的易感细胞。这种精妙的能力是由在每个对应的免疫突触中形成的信号转导分子的不同空间组织所决定的，从而影响细胞溶解颗粒的胞吐作用(例如，Abeyweera等人，2011；Eriksson等人，1999；Treanor等人；2006；Vyas等，2001；US 9,745,368)。

如上文解释的，基于iCAR所主张的控制的策略取决于iCAR活性相对于aCAR活性的优势。在一些实施方案中，本发明提供了这种类型的iCAR，在本文中称为pCAR('保护性CAR，参见图2)，其被设计为以突触选择性的方式在CAR T细胞中起作用，并保证相对于共表达的aCAR的完全优势。在一些实施方案中，本发明提供的iCAR是在本文中称为保护性CAR(pCAR)的这种特定类型的iCAR。

在一些实施方案中，本发明的pCAR整合了两个技术成就。首先，通过将它们在遗传上置于两个不同的多肽产物上，pCAR允许将aCAR的活化部分(FcRγ/CD3-ζ)与识别单元和共刺激元件(例如CD28、4-1BB、CD134(OX40、GITR、IL2Rβ和STAT3-结合基序(YXXQ))解偶联。这些元件的重新偶联对于aCAR功能是必需的，这只有通过添加异二聚体化药物才能发生，所述药物可以桥接分别掺入到每个多肽上的对应结合位点(图2B)。Wu等人最近报道了通过异二聚体化药物桥接相似分开的识别和活化部分来重构全功能CAR。(Wu等人，2015)。为此目的，这些作者使用了FK506结合蛋白结构域(FKBP，104个氨基酸)和FKBP-雷帕霉素结合结构域的T2089L突变体(FRB，89个氨基酸)，它们在雷帕霉素类似物AP21967存在下发生异二聚体化(下文方案I)。这种药物具有的免疫抑制活性比雷帕霉素低1000倍(Bayle等人，2006；Graef等人，1997；Liberles等人，1997)，并且可商购(ARGENTTM，调节异二聚体化试剂盒，ARIAD)。在一些实施方案中，通过口服施用所述药物。

方案I.AP21967的结构

其次，将pCAR识别单元和缺失的活化结构域分别移植到RIP控制的受体的跨膜结构域的两个表面上，所述受体含有两个膜内切割位点(图2A)。pCAR与其抗原的结合将触发编码的多肽的双重切割：首先通过细胞外去整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员去除细胞外结构域，并且然后通过细胞内γ-分泌酶释放出pCAR的细胞内结构域。预计该第一次切割事将件破坏截短的aCAR获得其缺失的活化元件的功能性、膜锚定的构型的能力，从而获得一种操作模式(图2C)。最近，在开发新的基因开关时利用了这一原理，所述基因开关设计为限制CAR T细胞活性，以便应用Notch受体(Morsut等人，2016；Roybal等人，2016b)或上皮细胞粘附分子(EpCAM，Pizem,Y.，发明人指导下的理学硕士论文)这两种经过充分研究的通过RIP起作用的受体同时识别肿瘤细胞上的两种不同抗原。在这些研究中，基于RIP的CAR与一种抗原的结合使基因工程化的细胞内结构域释放，所述结构域转位至细胞核，它在细胞核开启第二种CAR的表达。不同的是，本发明仅利用这个过程在保护性抗原存在下消除任何潜在的aCAR活性。在一些实施方案中，第一次切割事件破坏截短的aCAR获得其缺失的活化元件的功能性、膜锚定的构型的能力，从而获得一种操作模式。

预计上述提议的作用模式将发挥局部作用，从而仅有位于同一突触中的aCAR会受到影响，并且不再能够有效地结合其抗原并形成免疫突触。结果，即使当aCAR与大量非肿瘤细胞可能发生多种相互作用时，也预期它们仅是瞬时的和无功能的，从而使这些细胞完全能够进行进一步相互作用。

由于aCAR的功能完全取决于pCAR的存在，因此pCAR相对于其aCAR对应物的优势是这个系统固有的。由于缺乏活化结构域，给定T细胞中pCAR的相对短缺会使aCAR失去功能。在一些实施方案中，由于缺乏活化结构域，给定T细胞中pCAR的短缺使aCAR失去功能。

至关重要的是，识别结构域和活化结构域两者都定位在质膜上(Wu等人，2015)。因此，将活化结构域与质膜分离的第二次切割将使这个结构域失去功能并阻止不需要的细胞活化。在一些实施方案中，识别结构域和活化结构域两者都定位在质膜上。在一些实施方案中，第二次切割使活化结构域与质膜分离并且使这个结构域失去功能并阻止不需要的细胞活化。

将aCAR和pCAR设计为通过互斥机制起作用。pCAR经历切割的能力并不依赖抑制性信号传导的强度，因此将不会发生信号传导结果的完成。只要将pCAR切割，无论其与对应抗原的相互作用的相对亲合力如何，aCAR都无法起作用，这是保证另一个关键安全水平的方案。

在一些实施方案中，哺乳动物组织是人组织，并且在其他实施方案中，相关哺乳动物正常组织是自其发展为肿瘤的正常组织。

在一些实施方案中，效应免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞或者细胞因子诱导的杀伤细胞。

在一些实施方案中，所述能够抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与免疫检查点蛋白例如选自由以下组成的组的免疫检查点蛋白的信号转导元件同源：PD1；CTLA4；BTLA；2B4；CD160；CEACAM，例如CEACAM1；KIR，例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94-NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)；干扰素基因刺激蛋白(STING)；含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的蛋白质，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)，以及腺苷受体(例如A2aR)。在一些实施方案中，免疫检查点蛋白是负免疫调节剂。在一些实施方案中，负免疫调节剂选自由以下组成的组：2B4、LAG-3和BTLA-4。

在一些实施方案中，免疫检查点蛋白是自然杀伤细胞抑制性受体，例如KIR，比如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3；或白细胞Ig样受体，比如LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8；以及CD94-NKG2A，一种与CD94形成异二聚体并含有2个ITIM的C型凝集素受体。

在US 9,745,368中已经描述了制备和使用iCAR中的杀伤细胞受体的方法，将该专利通过引用并入本文，如在本文中充分公开一样。

在一些实施方案中，将以上实施方案中任一项的细胞外结构域通过柔性铰链和跨膜经典基序与所述细胞内结构域融合。

i.靶鉴定：aCAR、iCAR和pCAR

基于具有细胞外多态性表位的候选基因的鉴定，本发明提供了鉴定aCAR、iCAR和/或pCAR靶标的方法。在一些实施方案中，aCAR可以针对在肿瘤组织上表达的任何细胞外蛋白。在一些实施方案中，aCAR靶标进一步在非肿瘤组织上表达，并且iCAR靶标也在非肿瘤组织上表达但在肿瘤组织上不表达。

在一些实施方案中，鉴定候选基因的方法包括首先确定该基因编码包含细胞外多态性表位的跨膜蛋白。在一些实施方案中，鉴定候选基因的方法还包括确定该基因具有至少两个表达的等位基因。在一些实施方案中，这些等位基因表现出至少一个等位基因变异。在一些实施方案中，等位基因变异包括，例如，一个或多个SNP的存在，插入和/或缺失。在一些实施方案中，发现的基因的等位基因变异引起相对于蛋白质的细胞外区域中的参考序列的氨基酸改变。在一些实施方案中，基因位于经历杂合性丧失(LOH)的染色体区域中。在一些实施方案中，基因位于在癌症中经历杂合性丧失(LOH)的染色体区域中。在一些实施方案中，基因位于经历遗传突变使得表达完全丧失的染色体区域中。在一些实施方案中，表达完全丧失的原因是由于突变所致的一个等位基因的丧失和由于LOH所致的第二等位基因的丧失。在一些实施方案中，表达完全丧失的原因是由于突变所致的两个等位基因的丧失。在一些实施方案中，表达完全丧失的原因是由于LOH所致的两个等位基因的丧失。在一些实施方案中，基因在肿瘤类型的起源组织中表达，其中发现相应的区域经历了LOH。在一些实施方案中，基因至少在表达aCAR的一种或多种组织中表达。在一些实施方案中，iCAR或pCAR靶标在表达aCAR的重要器官细胞中表达。

在一些实施方案中，基于具有至少一个细胞外多态性表位的基因的鉴定来选择用于iCAR和/或pCAR的靶标，并且其中所述基因具有至少两个表达的等位基因。在一些实施方案中，基于具有位于经历杂合性丧失的染色体区域中的基因的鉴定来选择用于iCAR和/或pCAR的靶标。在一些实施方案中，基于具有位于经历癌症中的杂合性丧失的染色体区域中的基因的鉴定来选择用于iCAR和/或pCAR的靶标。在一些实施方案中，计算理论SNP的评分并确定阈限。例如，如果仅32％的SNP在染色体上具有肿瘤抑制基因，则具有肿瘤抑制基因的百分等级将为0.68。此外，例如，如果等位基因具有的次要等位基因分数为0.49(其中0.5是最高可能值)，则百分等级将为0.99。如果LOH率为0.10，并且75％的SNP具有比这更多的LOH，则百分等级将为0.25。如果跨组织表达值的标准偏差与包含该SNP的基因的中值之比为1.3，且这优于90％的其他基因，则百分等级为0.9。那么该SNP的总评分将为0.68*0.99*0.25*0.9＝0.15。在一些实施方案中，该LOH候选评分可以用作确定候选基因是否是适合的iCAR或pCAR靶标的一种方法。在一些实施方案中，可以基于该LOH评分来选择靶标。在一些实施方案中，确定候选基因适合作为iCAR或pCAR靶标。LOH候选者基于大于0.4的LOH候选评分。

在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自具有至少一个细胞外多态性表位的基因。在一些实施方案中，靶标是位于染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21、染色体22或染色体X的基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体1上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体2上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体3上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体4上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体5上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体6上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体6上并且包含HLA靶标。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标是HLA-A2，

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体7上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体8上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体9上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体10上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体11上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体12上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体13上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体14上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体15上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体16上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体17上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体18上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体19上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体20上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体21上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体22上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体X上。在一些实施方案中，用于iCAR和/或pCAR的靶标选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方案中，用于治疗癌症的aCAR针对或特异性地结合在肿瘤组织上表达的任何膜蛋白，只要iCAR在其中表达靶蛋白的每个正常组织上表达即可。在一些实施方案中，aCAR可以特异性地结合或针对肿瘤相关蛋白、肿瘤相关抗原和/或临床试验中的抗原、表1中列出的CAR靶标，以及根据本申请中列出的标准，在靶结合方面iCAR可以与之匹配或配对的在肿瘤组织中表达的任何细胞表面蛋白。在一些实施方案中，只要iCAR在与aCAR相同的组织中或在任何重要组织中表达但在肿瘤细胞中丧失，则aCAR可以是具有细胞外结构域的任何表达的蛋白质。在一些实施方案中，用于治疗癌症(例如以上所述的任何一种癌症类型)的aCAR针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，aCAR、iCAR和/或pCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。在一些实施方案中，用于治疗癌症的aCAR针对或特异性地结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。在一些实施方案中，aCAR、iCAR和/或pCAR靶标是表1中列出的抗原。

表1.包括在ClinicalTrials.gov中注册的试验中评价的一些抗原在内的CAR靶抗原

表2：其他CAR靶抗原

ii.识别部分：aCAR、iCAR和pCAR

本发明还提供了被设计为提供与靶标特异性结合的识别部分。所述识别部分允许指导aCAR、iCAR和/或pCAR的特异性的和靶向的结合。在一些实施方案中，被设计为提供与靶标的特异性结合的识别部分提供与细胞外多态性表位的特异性结合。在一些实施方案中，识别部分是aCAR、iCAR和/或pCAR的细胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，细胞外结构域包含抗体、其衍生物或片段，例如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单域抗体，例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)。在一些实施方案中，细胞外结构域包含抗体模拟物，例如亲和体(affibody)分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；抗运载蛋白(anticalin)；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和单抗体(monobody)。在一些实施方案中，细胞外结构域包含适体。

通常，可以使用任何相关技术来设计赋予aCAR和pCAR或iCAR与其靶标特异性结合的识别部分。例如，构成这个iCAR-aCAR文库的识别部分可以源自理想地选自组合展示文库的主识别部分库，从而：

-共同地，选择的识别部分靶向位于所有22个人常染色体的两个臂的每个臂上的一系列基因的细胞表面产物。相邻基因之间的距离越短，覆盖范围就越完全，因此使用的通用性就越大。

-对于每个选择的基因，分离出一组等位基因特异性识别部分，每个都允许在人群体中普遍存在的不同等位基因变体之间进行严格区分。靶向的变体的数量越多，可以提供给患者的治疗基因对的数量就越多。

给定的等位基因产物可以在一位患者中成为潜在的pCAR或iCAR靶标，而在包含相同等位基因的另一位患者中成为有用的aCAR靶标，这取决于每种情况下的特定LOH模式。因此，当鉴定出适合的识别部分基因时，每个基因将被移植到pCAR或iCAR和aCAR基因支架上。因此，期望针对同一基因的等位基因变体的所有识别部分都具有相似范围的结合亲和力。在这样一组给定的识别部分中，可以将pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对的所有可能组合预组装，以便保证在整个群体中该基因的潜在等位基因组成的最大覆盖范围。

在一些实施方案中，患者对于主要等位基因和次要等位基因是杂合的，其产物由于非同义SNP或较不常见的插入缺失而在沿编码的多肽的单个位置中不同。在一些其他实施方案中，患者对于两个次要等位基因是杂合的，这两个次要等位基因在两个分开的位置中与主要等位基因不同。取决于个体患者中涉及所述基因的特定LOH事件，给定的变体表位可以在一位患者中用作iCAR靶标，而在另一位患者中用作aCAR靶标。在一些实施方案中，可以用作iCAR靶标的变体表位不是主要等位基因变体。在一些实施方案中，可以用作iCAR靶标的变体表位是次要等位基因。

变体特异性mAb(比如说，对由次要等位基因'a'编码的表位特异的mAb)的鉴定是本领域熟知的，并且原理上类似于针对任何常规抗原决定簇的mAb的鉴定，并且可通常最好地通过重组抗体scFv文库的高通量筛选来完成，例如利用噬菌体(Barbas等人，2004)、核糖体(Hanes等人，1997)或酵母(Chao等人，2006)展示技术。用于文库筛选的抗原可以是跨越两个等位基因之间的变异位置的合成肽(长度典型地为15-20个氨基酸或更多)、可商购的或由在这个领域经营的许多公司之一定制合成的重组全长多肽或者甚至是凭借在不表达这个等位基因的相同细胞上进行差减步骤后的基因转染(例如，对编码作为模板克隆的全长cDNA的mRNA进行电穿孔，用于在pGEM4Z/A64载体中进行体外mRNA转录(Boczkowski等人，2000))以高水平表达所述等位基因变体的整个细胞。这些方法是熟知的，并描述于例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)，Green and Sambrook,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Antibodies:A Laboratory Manual(第二版)，由Edward A编辑，Greenfield,2012 CSH laboratory press；Using Antibodies,A laboratory manual，由Harlow和David Lane编辑，1999 CSH laboratory press。

根据定义，由主要等位基因('A')编码的相应表位(在相同位置)产生独特的抗原决定簇，所述抗原决定簇在单个氨基酸的同一性(SNP)或长度(插入缺失；例如，插入或缺失)方面与由'a'产生的抗原决定簇不同。原理上，通过相同或其他抗体展示筛选技术鉴定的一组不同的mAb可以识别这个决定簇。两组已鉴定的mAb的每组中的不同成员区分两个表位或变体的能力(例如，第一组的抗体结合等位基因“a”而不是“A”的产物以及第二组的Ab相反地结合“A”而不是“a”)可以使用常规结合测定(例如ELISA或流式细胞术(Skora等人，2015))或其他细胞染色技术来确定。可替代地，一旦鉴定出结合“a”不结合“A”的Ab并确定了其蛋白质序列，就能潜在地使用计算方法来预测结合“A”但不结合“a”的“互补”抗体scFv的序列。对于这样的计算方法，参见例如(Sela-Culang等人，2015a,b)。

在一些实施方案中，例如关于HLA-I类基因座基因HLA-A、HLA-B和HLA-C作为靶基因，存在许多可用的等位基因特异性单克隆抗体，例如但不限于，在实施例3中列出的抗体。

在一些实施方案中，用于产生识别部分的靶标包含至少一个细胞外多态性表位。在一些实施方案中，靶标是位于染色体1、染色体2、染色体3、染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染色体21、染色体22或染色体X上的基因的产物。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体1的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体1的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体2的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体2的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体3的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体3的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体4的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体4的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体5的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体5的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体6的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体6的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体7的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体7的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体8的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体8的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体9的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体9的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体10的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体10的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体11的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体11的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体12的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体12的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体13的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体13的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体14的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体14的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体15的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体15的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体16的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体16的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体17的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体17的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体18的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体18的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体19的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体19的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体20的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体20的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体21的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体21的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体22的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体22的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自染色体X的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于aCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自染色体X的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性。在一些实施方案中，用于iCAR或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

可以容易地从相关杂交瘤中克隆编码这些抗体的可变区的序列，并用于构建编码针对任何期望靶标的scFv的基因，所述scFv包括例如针对特定HLA I类等位基因表位变体的scFv，并且所述序列适合于使用广泛可用的工具将其掺入CAR构建体中，所述工具如在例如以下文献中所公开的：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)，Green andSambrook,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Antibodies:A Laboratory Manual(第二版)，由Edward A编辑，Greenfield,2012 CSH laboratory press；UsingAntibodies,A laboratory manual，由Harlow和David Lane编辑，1999 CSH laboratorypress。

本发明提供了一种数据库，其包含在肿瘤细胞中由于LOH而丧失的多态性变体的DNA序列，并且这些DNA序列编码细胞表面产物，其中所述DNA序列上的变异导致编码的蛋白质的细胞外结构域中氨基酸序列的变异。信息是从向公众开放的几个数据库中检索得到的，例如TCGA，可在国家公共卫生研究院TCGA数据门户(https://gdc.cancer.gov/)上获得，其尤其提供了可以用于推断在多种肿瘤类型中的基因的相对拷贝数的数据，以及可在用于TCGA数据的cbio门户http://www.cbioportal.org上获得(Cerami等人，2012，Gao等人，2013)；外显子组整合联合(Exome Aggregation Consortium，ExAC)数据库(exac.broadinstitute.org，Lek等人，2016)，其尤其提供了不同群体中SNP变体的等位基因频率；基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEX)数据库v6p(dbGaPAccession phs000424.v6.p1)(https://gtexportal.org/home,Consortium GT.Human genomics,2015)，其包括基因的组织表达数据；以及提供蛋白质的结构信息的数据库，例如人蛋白图谱(Uhlen等人，2015)；细胞表面蛋白质图谱(Bausch-Fluck等人，2015)，N-糖基化细胞表面蛋白的基于质谱的数据库，以及UniProt数据库(www.uniprot.org/downloads)。

本发明还提供了用于对经历LOH的编码表达的细胞表面蛋白的基因进行全基因组鉴定的方法。鉴定的基因必须满足以下标准：1)所述基因编码跨膜蛋白-因此具有在细胞表面上表达的部分以允许iCAR或pCAR结合；2)所述基因具有至少两个表达的等位基因(在至少一个检查的种族人群中)；3)针对该基因发现的等位基因变异引起在蛋白质的细胞外区域中相对于参考序列的氨基酸改变；4)所述基因位于在癌症中经历LOH的染色体区域中；5)所述基因在其中相应区域被发现经历LOH的肿瘤类型的起源组织中表达。

原理上，可以通过本领域已知的任何方法而不是仅通过数据库挖掘来鉴定适合于编码iCAR或pCAR结合的靶标的上述基因。例如，LOH的概念不是新的，有关特定肿瘤中的特定基因、染色体或基因组/染色体区域的LOH信息已在文献中发表，因此候选基因可从现有出版物中获得。可替代地，可以通过与染色体标志物(例如微卫星探针)的全基因组杂交(Medintz等人，2000,Genome Res.2000年8月；10(8):1211-1218)或通过任何其他适合的方法(Ramos和Amorim,2015,J.Bras.Patol.Med.Lab.51(3):198-196)找到这样的信息。

类似地，关于等位基因变体的信息可公开地在各种数据库中获得，并且也可容易地针对个性化案例通过疑似区域的基因组测序而获得。而且，如上所述，关于蛋白质结构和表达模式的信息可公开获得且容易取得。

因此，由于关于许多基因和SNP的各种标准的信息是可公开获得的，并且用于检索它的技术通常是已知的，因此本申请的主要新颖之处在于使用LOH作为用于选择iCAR或pCAR识别的靶标的标准，以及基于在特定患者中丧失的特定等位基因进行个性化治疗的概念。

作为非限制性实例，根据本发明发现HLA基因，包括处于变化频率的非经典的HLA-I和HLA-II基因(例如，HLA-A、HLA-B HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-K和/或HLA-L)的LOH在许多肿瘤类型中是相对频繁的事件(参见图10A-C)，这将使这些基因成为出于本发明的目的用作iCAR/pCAR识别的靶标的良好候选者。

在缺乏pCAR或iCAR靶标的情况下，在任何健康基本组织中的正常细胞上的aCAR靶标的识别都是有害的，并被严格禁止。在这方面，此处提出的pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对的概念构成了故障安全活化开关，如：i)不表达所选基因的细胞(在aCAR和pCAR或iCAR靶向相同基因的不同产物的情况下)由于缺乏aCAR靶抗原而将不被靶向；ii)表达该相同基因的正常细胞将共表达两个等位基因，并且由于pCAR或iCAR的优势而将不被靶向；iii)在pCAR或iCAR靶向多态性管家基因的产物的情况下，则体内所有细胞将受到保护；以及iv)仅有表达aCAR靶标但不表达pCAR或iCAR靶标的肿瘤细胞将被攻击。在一些实施方案中，在缺乏pCAR或iCAR靶标的情况下，对在任何健康基本组织中的正常细胞上的aCAR靶标的识别将是有害的。在一些实施方案中，不表达所选基因的细胞(在aCAR和pCAR或iCAR靶向同一基因的不同产物的情况下)由于缺乏aCAR靶抗原而将不被靶向。在一些实施方案中，表达该相同基因的正常细胞将共表达两个等位基因，并且由于pCAR或iCAR的优势而将不被靶向。在一些实施方案中，当pCAR或iCAR靶向多态性管家基因的产物时，则体内所有细胞将受到保护。在一些实施方案中，仅有表达aCAR靶标但不表达pCAR或iCAR靶标的肿瘤细胞将被攻击。在一些实施方案中，表达aCAR/iCAR对靶标两者或aCAR/pCAR对靶标两者的细胞将受到保护。

如上所强调的，根据本发明，抑制性信号相对于活化信号必须具有永久的优势。因此，有必要确保在缺乏iCAR伴侣的情况下，在任何时候在给定的杀伤细胞中均不表达aCAR基因。这可以通过将这些iCAR-aCAR基因对串联组装成单链产物或通过基于例如内部核糖体进入位点或几种病毒自切割2A肽之一的适合双顺反子模态来实现。正如报道的有关双顺反子表达的大量数据所表明的那样，iCAR基因将始终位于其aCAR伴侣的上游，以保证有利的化学计量。另一个选项是通过用两个独立的构建体转染或转导杀伤细胞将杀伤细胞工程化为表达aCAR和iCAR或pCAR两者，其中每个构建体编码aCAR或iCAR/pCAR。当然，当使用pCAR-aCAR基因对时这不是问题。在一些实施方案中，抑制性信号相对于活化信号占优势。在某些实施方案中，aCAR和iCAR或pCAR在同一细胞中同时表达。

保证iCAR优势的另一个吸引人的选项是将aCAR识别部分与其活化/共刺激部分分离，使得两个实体只能在异二聚化体小分子存在下组装成一个功能受体。最近证明了在抗肿瘤CAR的背景下通过精确的时间、剂量和位置来严格控制这种分开的受体的操作状态的能力(Wu等人，2015)。

另外，对于掺入到所选iCAR设计的细胞内部分中的iCAR信号传导元件的特定组成，预期的优势也可能是所固有的，它应该与所选aCAR平台的信号强度“竞争”。这种能力还将受到两个识别部分对于它们的对应靶表位(经过如上处理)的相对亲和力以及它们的相互作用的总体亲合力的影响。关于后者，所提出的策略既保证了有利的iCAR/aCAR化学计量，又保证了它们的对应靶表位在正常细胞上的平衡分布。再次，当使用pCAR-aCAR基因对时这不是问题。

为了进一步保证安全性，可以采用目前在CAR和TCR免疫疗法领域中实施的其他常规手段，例如使用自杀基因或使用mRNA电穿孔进行瞬时表达。

虽然LOH经常使细胞仅留下给定基因的一个等位基因，但它经常伴随着其余染色体或染色体部分的重复，从而导致“拷贝数中性”-LOH(Lo等人，2008；O'Keefe等人，2010；Sathirapongsasuti等人，2011)。在这些情况下，表位丧失变体的出现需要两个独立的事件，并因此可能性较小。即使在其中仅保留靶等位基因的单一拷贝的“拷贝数丧失”LOH的情况下，在基因修饰细胞的不同部分中表达若干个pCAR-aCAR或iCAR-aCAR对，也将防止突变逃逸的出现。但是，由于单拷贝基因可能变得至关重要，因此其功能丧失的可能性将大大降低。

鉴于以上所述，在一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，其中iCAR包含与多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合的细胞外结构域和包含抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，所述多态性细胞表面表位由于杂合性丧失(LOH)在哺乳动物肿瘤细胞中不存在但至少在相关哺乳动物正常组织的所有细胞上或在表达aCAR的重要器官上存在。

在一些实施方案中，多态性细胞表面表位是由肿瘤抑制基因或与肿瘤抑制基因遗传连锁的基因编码的抗原的一部分，因为这样的基因很可能在肿瘤中由于LOH而丧失。另外，多态性细胞表面表位可以是由通常位于在癌细胞中经常经历LOH的染色体或染色体臂(例如但不限于染色体臂3p、6p、9p、10q、17p、17q或18q或染色体19)上的基因编码的抗原的一部分。可以容易地在本文所述的相关数据库中鉴定这些表位。

在一些实施方案中，多态性细胞表面表位属于管家基因产物，例如未分类的AP2S1、CD81、GPAA1、LGALS9、MGAT2、MGAT4B、VAMP3；细胞粘附蛋白CTNNA1 NM_001903、CTNNB1、CTNNBIP1 NM_020248、CTNNBL1 NM_030877、CTNND1 NM_001085458δ连环蛋白；通道和转运蛋白ABCB10 NM_012089、ABCB7 NM_004299、ABCD3 NM_002857、ABCE1 NM_002939、ABCF1 NM_001090、ABCF2 NM_005692、ABCF3 NM_018358、CALM1[1][7]钙调蛋白捕捉(grasps)钙离子、MFSD11 NM_024311，与MSFD10又名TETRAN或四环素转运蛋白样蛋白相似[1]、MFSD12 NM_174983、MFSD3 NM_138431、MFSD5 NM_032889、SLC15A4 NM_145648、SLC20A1 NM_005415、SLC25A11[1]线粒体酮戊二酸/苹果酸载体蛋白、SLC25A26 NM_173471、SLC25A28 NM_031212、SLC25A3 NM_002635、SLC25A32 NM_030780、SLC25A38 NM_017875、SLC25A39 NM_016016、SLC25A44 NM_014655、SLC25A46 NM_138773、SLC25A5 NM_001152、SLC27A4 NM_005094、SLC30A1 NM_021194、SLC30A5 NM_022902、SLC30A9 NM_006345、SLC35A2 NM_005660、SLC35A4 NM_080670、SLC35B1 NM_005827、SLC35B2 NM_178148、SLC35C2 NM_015945、SLC35E1 NM_024881、SLC35E3 NM_018656、SLC35F5 NM_025181、SLC38A2 NM_018976、SLC39A1 NM_014437、SLC39A3 NM_144564、SLC39A7 NM_006979、SLC41A3 NM_017836、SLC46A3 NM_181785、SLC48A1 NM_017842、受体ACVR1 NM_001105，类似于ACVRL1 TGFβ受体家族朗-奥-韦综合征(Rendu-Osler-Weber syndrome)、ACVR1B NM_004302、CD23[1]FCER2低亲和力IgE受体(凝集素)；以及参与RNA剪接的HLA/免疫球蛋白/细胞识别组BAT1(又名DDX39B)、BSG Basigin免疫球蛋白超家族、细胞外金属蛋白酶、MIF巨噬细胞迁移抑制因子和/或TAPBP[维基百科]。在一些实施方案中，管家基因是I型HLA、G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道或受体酪氨酸激酶，优选为HLA-A、HLA-B、HLA-C。在一些实施方案中，管家基因是HLA-A。在一些实施方案中，管家基因是HLA-B。在一些实施方案中，管家基因是HLA-C。

可以使用任何相关技术来设计赋予aCAR和pCAR或iCAR与其靶标特异性结合的识别部分。在一些实施方案中，细胞外结构域包含(i)抗体、其衍生物或片段，例如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单域抗体，例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；(ii)抗体模拟物，例如亲和体(affibody)分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；抗运载蛋白(anticalin)；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和单抗体(monobody)；或(iii)适体。优选地，细胞外结构域包含ScFv。

在一些实施方案中，aCAR包含与抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合的细胞外结构域。在一些实施方案中，aCAR细胞外结构域与表位结合，所述表位是肿瘤相关抗原表位。在一些实施方案中，aCAR细胞外结构域与表位结合，所述表位为相关肿瘤和正常组织的细胞所共享的肿瘤相关抗原的表位，并且，细胞内结构域包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。在一些实施方案中，用于治疗癌症的aCAR针对或特异性地结合在肿瘤组织上表达的任何膜蛋白，只要iCAR靶标在其中表达靶向的aCAR蛋白的每个正常组织上表达即可。在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。在一些实施方案中，aCAR与CD19结合。在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合CD19的非多态性细胞表面表位。

在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：5T4、AFP、AXL、B7H6、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD44v6、CD5、CD7、CD70、CD80、CD89、CDH17、CEA、CLD18、CLEC14a、CLL-1、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、NY-ESO-1、FAP、FHSR、GP100、GPC3、HER2、IL-13R_、IL-13R_2、K-Ras、间皮素、MUC1、MUC-CD、NKG2D配体、NKG2D_配体、PDL1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR-2、生存素、TEM8、TGF、VEGFR2和ALK。

在一些实施方案中，iCAR针对或特异性地结合抗原的单个等位基因变体，所述抗原不包括肝配蛋白受体(例如，EPHA 7)和紧密连接蛋白(claudin)。在一些实施方案中，iCAR针对或特异性地结合由HLA基因(HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因)的单个等位基因变体编码的表位。

iii.细胞内结构域：aCAR、iCAR和pCAR

本发明还提供了作为aCAR、iCAR和/或pCAR的一部分的细胞内结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含至少一种信号转导元件。在一些实施方案中，细胞内结构域包含抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。

通常，可以使用任何相关技术来工程化信号转导元件，所述信号转导元件赋予aCAR和pCAR或iCAR诱导细胞功能的能力，包括例如抑制效应免疫细胞或活化或共刺激效应免疫细胞的能力。

在一些实施方案中，所述至少一种信号转导元件能够抑制效应免疫细胞。在一些实施方案中，能够抑制效应免疫细胞的所述至少一种信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源。在一些实施方案中，免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：PD1、CTLA4、BTLA、2B4、CD160、CEACAM(包括例如CEACAM1)；KIR(包括例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94)、NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)；干扰素基因刺激蛋白(STING)；含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的蛋白质、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)，以及腺苷受体(例如A2aR)。在一些实施方案中，免疫检查点蛋白是负免疫调节剂。在一些实施方案中，负免疫调节剂选自由以下组成的组：2B4、LAG-3和BTLA-4。

在一些实施方案中，信号转导元件能够活化或共刺激效应免疫细胞。在一些实施方案中，信号转导元件是活化结构域。在一些实施方案中，信号转导元件是共刺激结构域。在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)、活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体或衔接分子和/或共刺激信号转导元件同源。在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)同源。在一些实施方案中，ITAM来自包括但不限于CD3ζ或FcRγ链的蛋白质。在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)同源。在一些实施方案中，KIR包括例如但不限于KIR2DS和KIR3DS。在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与衔接分子同源。在一些实施方案中，衔接分子包括例如但不限于DAP12。在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的信号转导元件与共刺激信号转导元件同源。在一些实施方案中，共刺激信号转导元件来自包含但不限于CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)和/或GITR的蛋白质。在一些实施方案中，aCAR包含信号转导元件。

在一些实施方案中，将细胞外结构域通过柔性铰链和跨膜经典基序与所述细胞内结构域融合。

在一些实施方案中，pCAR的使用允许将aCAR的活化部分(FcRγ/CD3-ζ)与识别单元和共刺激元件(例如，CD28、4-1BB)解偶联。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:38的4-1BB序列(1024-1149)可被SEQ ID NO:37的CD28信号传导结构域(1021-1677)代替。在一些实施方案中，在遗传上将这些元件置于两个不同的多肽产物上。这些元件的重新偶联对于aCAR功能是必需的，这只有通过添加异二聚体化药物才能发生，所述药物可以桥接分别掺入到每个多肽上的对应结合位点。

iCAR具有源自抑制性受体的信号传导结构域，而不是活化结构域(例如FcRy或CD3-ζ)，所述抑制性受体可以拮抗T细胞活化。在一些实施方案中，iCAR具有源自抑制性受体的信号结构域，所述抑制性受体可以拮抗T细胞活化。在一些实施方案中，iCAR信号传导结构域源自抑制性受体，包括例如但不限于CTLA-4、PD-1或NK抑制性受体。

iv.CAR-T载体构建(aCAR；iCAR；pCAR)

在一些实施方案中，aCAR由第一核酸载体编码，而iCAR或pCAR由第二核酸载体编码。在一些实施方案中，aCAR由第一核酸载体编码，而iCAR或pCAR由第二核酸载体编码。在一些实施方案中，aCAR由第一核酸载体编码，而iCAR或pCAR由第二核酸载体编码。在一些实施方案中，编码iCAR或pCAR的核苷酸序列在第二载体上。

在一些实施方案中，本发明提供了一种载体，其包含如以上实施方案中任一项所定义的本发明的核酸分子，以及与所述核酸分子可操作地连接的至少一个控制元件，例如启动子。

在一些实施方案中，载体是慢病毒(LV)载体。在一些实施方案中，LV载体是可商购的LV载体。在一些实施方案中，LV载体包括但不限于pLVX-Puro、pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro、pLVx-EF1a-IRES(TAKARA)和/或pcLV-EF1a(Sirion)。在一些实施方案中，LV载体是pLVX-Puro。在一些实施方案中，LV载体是pLVX-IRES-Puro/Neo/Hygro。在一些实施方案中，LV载体是pLVx-EF1a-IRES(TAKARA)。在一些实施方案中，LV载体是pcLV-EF1a(Sirion)。

在一些实施方案中，载体包含EF1启动子。在一些实施方案中，载体包含CMV启动子。在一些实施方案中，载体包含PGK启动子。在一些实施方案中，载体包含CD8铰链。在一些实施方案中，载体包含CD28 TM和41BB共刺激结构域。

在一些实施方案中，载体还包含包括编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子，所述aCAR包含特异性地结合抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域，以及包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享。

在一些实施方案中，由载体中包含的核酸编码的aCAR的细胞外结构域特异性地结合抗原的非多态性细胞表面表位，而iCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

在一些实施方案中，由载体中包含的核酸编码的iCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合包括例如HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因在内的HLA基因的单个等位基因变体；或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体。

在一些实施方案中，由载体中包含的核酸编码的aCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，aCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方案中，由载体中包含的核酸编码的iCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合包括例如HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因在内的HLA基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且由载体中包含的核酸编码的aCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，aCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的aCAR的至少一种信号转导元件与以下所述同源：例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)；活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜结构域，其包含带正电荷的氨基酸残基或带正电荷的侧链，或例如KIR2DS和KIR3DS的活化性KIR跨膜结构域，或诸如DAP12的衔接分子；或例如CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共刺激信号转导元件。在一些实施方案中，SEQID NO:38的4-1BB序列(1024-1149)可被SEQ ID NO:37的CD28信号传导结构域(1021-1677)代替。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一载体表达，且aCAR由第二载体表达。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR两者都由同一载体表达。

在一些实施方案中，载体的核苷酸序列包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。一般而言，编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列可以是任何先后顺序，但是在特定实施方案中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR的核苷酸序列的下游。

在一些实施方案中，编码aCAR和iCAR的核苷酸序列被编码在单个载体上。在一些实施方案中，载体包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR的核苷酸序列的下游。在一些实施方案中，核苷酸序列包含位于编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。在一些实施方案中，载体的核苷酸序列包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。在一些实施方案中，病毒自切割2A肽包括但不限于：来自明脉扁刺蛾病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自A型马鼻炎病毒(ERAV)的E2A和/或来自猪捷申病毒1型(PTV1)的P2A。在一些实施方案中，病毒自切割2A肽是来自明脉扁刺蛾病毒(TaV)的T2A。在一些实施方案中，病毒自切割2A肽是来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A。在一些实施方案中，病毒自切割2A肽是来自A型马鼻炎病毒(ERAV)的E2A。在一些实施方案中，病毒自切割2A肽是来自猪捷申病毒1型(PTV1)的P2A。

在一些实施方案中，载体包含编码通过柔性接头与所述iCAR连接的组成性aCAR的核苷酸序列。

通过例如RNA转染或通过掺入适合在真核细胞或病毒载体中复制和/或转录的质粒中，可用本文所述的适当核酸分子转染免疫细胞。在一些实施方案中，载体选自逆转录病毒或慢病毒载体。

也可以使用逆转录病毒载体和适合的包装线的组合，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知几种产生兼向性病毒的细胞系，包括PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.BioI.5:431-437)；PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Bioi.6:2895-2902)；和CRIP(Danos等人，(1988)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。可替代地，可以使用非兼向性性颗粒，例如用VSVG、RD 114或GAL V包膜假型化的颗粒。通过与生产细胞直接共培养，例如通过Bregni等人(1992)Blood 80:1418-1422的方法，或与单独的病毒上清液或与浓缩的载体原种一起培养，例如通过Xu等人(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes等人，(1992)J Clin.Invest.89:1817的方法，可以进一步转导细胞。

在另一方面，本发明提供了制备根据本发明如上文限定的能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，所述方法包括：(i)从至少一个已知变体数据库中检索蛋白质编码基因的人基因组变体的列表；(ii)通过以下步骤过滤在(i)中检索到的变体的列表：(a)选择与相应的参考等位基因相比，导致对应的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列变异的变体，(b)选择其中氨基酸序列变异是在编码的蛋白质的细胞外结构域中的基因的变体，(c)选择至少在一种肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的基因的变体，和(d)选择至少在根据(c)的其中它们经历LOH的至少一种肿瘤的起源组织中表达的基因的变体，从而获得具有在对应的基因所编码的蛋白质中的细胞外结构域中的氨基酸序列变异的变体的列表，所述对应的基因在至少一种肿瘤中由于LOH而丧失并且至少在至少一种肿瘤的起源组织中表达；(iii)限定包含来自(ii)中获得的列表的至少一个单个变体的序列区，亚克隆并表达所述包含至少一个单个变体的序列区以及包含相应的参考等位基因的序列区，从而获得对应的表位肽；(iv)选择iCAR结合结构域，其与(iii)中获得的克隆的序列区所编码的表位肽或与相应的参考等位基因所编码的表位肽特异性地结合；以及(vii)制备如上文限定的iCAR，其中每个iCAR包含如(iv)中限定的iCAR结合结构域。

在一些实施方案中，所选择的基因的候选变体在某种肿瘤类型中经历至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的LOH。

在一些实施方案中，选择的每个变体的次要等位基因频率在至少一个群体中等于或超过1％、2％、3％、4或5％。

在另一方面，本发明涉及两种或更多种核酸分子的组合，其中每种核酸分子包含编码受控的效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子是单个连续核酸分子的一部分或形成单个连续核酸分子，或每种核酸分子包含两个或更多个单独的核酸分子，其中受控的效应免疫活化系统指导效应免疫细胞杀伤由于杂合性丧失(LOH)而丧失了一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞，并保留相关正常组织的细胞，并且其中(a)第一成员包含活化性嵌合抗原受体(aCAR)多肽，所述活化性嵌合抗原受体(aCAR)多肽包含第一细胞外结构域，所述第一细胞外结构域与抗原的非多态性细胞表面表位或与不同的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合，并且所述非多态性或多态性细胞表面表位是肿瘤相关抗原或被相关的异常和正常哺乳动物组织的细胞共享；和(b)第二成员包含调控多肽，所述调控多肽包含第二细胞外结构域，所述第二细胞外结构域与异常哺乳动物组织由于LOH而不表达的但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合。

在一些实施方案中，第一成员选自：(a)组成性aCAR，其还包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件；以及(b)条件性aCAR，其还包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含异二聚体化小分子的结合位点的第一成员和任选的至少一种共刺激信号转导元件，但是缺乏活化性信号转导元件；并且，第二成员是：(c)抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其还包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件；或(d)保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其还包含细胞外调节区，所述细胞外调节区包含脱落酶(sheddase)的底物；包含膜内切割蛋白酶的底物的跨膜经典基序；以及细胞内结构域，所述细胞内结构域包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件和异二聚体化小分子的结合位点的第二成员。

在一些实施方案中(i)iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性地结合与aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体；(ii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单个等位基因变体；或(iii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性地结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同多态性细胞表面表位的不同的单个等位基因变体。

在一些pCAR实施方案中，脱落酶的底物是去整合素和金属蛋白酶(ADAM)或β-分泌酶1(BACE1)的底物。在一些实施方案中，底物形成细胞外结构域的一部分，并且包含Lin12/Notch重复序列和ADAM蛋白酶切割位点。

人们普遍认为，没有预测ADAM切割的一致序列基序，但是Caescu等人(Caescu等人，2009)在表3中公开了大量ADAM10和/或ADAM17底物序列，特此将其通过引用并入本文，如同在此完全公开一样，并且可以将其用作本发明的pCAR中的ADAM的底物。在一些实施方案中，ADAM底物序列是淀粉样前体蛋白、BTC、CD23、胶原蛋白、DII-1、埃博拉糖蛋白、E-钙粘蛋白、EGF、上皮调节蛋白、Fas配体、生长激素受体、HB-EGF、II型白细胞介素-1受体、IL-6受体、L-选择素、N-钙粘蛋白、Notch、p55TNF受体、p75TNF受体、Pmel17、朊病毒蛋白、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶Z、TGF-α、TNF或TR的那些序列(Caescu等人，2009)。

在本发明的pCAR中使用ADAM10切割序列可能是有利的，因为ADAM 10以相当高的水平组成性地存在于例如淋巴细胞上。与ADAM10相反，在未刺激的细胞上仅检测到低水平的近缘的TACE/ADAM17。通过刺激迅速诱导T细胞胚细胞上的ADAM17表面表达(Ebsen等人，2013)。

Hemming等人(Hemming等人，2009)报道，在底物与非底物中未鉴定出预测BACE1切割的一致序列基序，但是在表1中公开了具有BAC1切割序列的大量BACE1底物，特此其通过引用并入本文，如同在此完全公开一样，并且可以将其用作本发明的pCAR中BACE1的底物。

在一些pCAR实施方案中，膜内切割蛋白酶的底物是SP2、γ-分泌酶、信号肽肽酶(spp)、spp样蛋白酶或菱形蛋白酶的底物。

Rawson等人(Rawson，2013)公开SP2底物具有至少一个2型跨膜螺旋，并且在SP2底物中包括螺旋去稳定基序，例如Asp-Pro基序。该论文在表1中公开了许多具有SP2切割序列的SP2底物，特此将其通过引用并入本文，如同在此完全公开一样，并且可以将其用作本发明的pCAR中的SP2的底物。

Haapasalo和Kovacs(Haapasalo和Kovacs，2011)教导，淀粉样β蛋白前体(AβPP)是早老素(PS)依赖性γ-分泌酶(PS/γ-分泌酶)的底物，并且已经发现至少90种另外的蛋白质通过该该酶复合物而经历相似的蛋白水解。γ-分泌酶底物具有一些共同特征：大多数底物蛋白是I型跨膜蛋白；PS/γ-分泌酶介导的γ样切割(相应于AβPP中的&切割，其释放AICD)发生在跨膜结构域和胞质结构域的边界处或边界附近。&样切割位点位于富含赖氨酸和/或精氨酸残基的一段疏水性氨基酸序列的侧翼。似乎PS/γ-分泌酶切割不依赖于切割位点处或其附近的特定氨基酸靶序列，而是可能依赖于跨膜结构域的构象状态。Haapasalo和Kovacs在表1中公开了γ-分泌酶底物的列表，特此将其切割序列通过引用并入本文，如同在此完全公开一样，并且可以将其用作本发明的pCAR中的γ-分泌酶的底物。

Voss等人(Voss等人，2013)教导，对于GxGD天冬氨酰蛋白酶类(spps)，以底物内的一级序列元件为基础的共有切割位点迄今为止尚无记载。膜蛋白的跨膜结构域优先采用α螺旋确认，其中其肽键很难被蛋白酶接触。为了使跨膜结构域对膜内蛋白水解敏感，因此假定需要通过螺旋去稳定氨基酸来降低其α-螺旋含量。与这个假定一致，各种信号肽已显示含有在其h区内的螺旋去稳定氨基酸，这严重影响了它们通过SPP的蛋白水解过程。另外，信号肽的h区内的极性残基可能影响通过SPP的切割，例如，各种HCV株的信号肽内的丝氨酸和半胱氨酸残基对于SPP切割是至关重要的。这些极性残基是否也只是影响信号肽的螺旋含量，或者具体地羟基或巯基是否为触发被SPP切割所必需，尚未完全了解。类似地，当降低Bri2跨膜结构域的α-螺旋含量时，SPPL2b对Bri2跨膜结构域的切割显著增加。有趣的是，在基于磷脂的环境中，具有推定的螺旋去稳定能力的四个残基中只有一个氨基酸残基显著降低了Bri2跨膜结构域的α-螺旋含量。这表明α-螺旋跨膜结构域的去稳定化不只是由某些氨基酸残基引起的，而是这些氨基酸的背景和位置决定了其螺旋去稳定的可能性，并因此决定了跨膜结构域对通过SPP/SPPL的膜内蛋白水解的可及性。Voss等人进一步在表1中公开了spp和spp样底物的列表，特此将其切割序列通过引用并入本文，如同在此完全公开一样，并且可以将其用作本发明的pCAR中的spp的底物。

Bergbold等人(Bergbold和Lemberg，2013)教导，对于菱形蛋白酶，已经提出了两种不同的底物识别模型。在第一个模型中，底物肽主链的构象柔性与将膜浸入菱形活性位点附近相结合足以提供特异性。对于特征明确的果蝇属(Drosophila)底物Spitz，已证明甘氨酸-丙氨酸基序可用作螺旋断裂，其允许跨膜结构域展开到菱形活性位点中。第二种模型表明，菱形蛋白酶主要识别围绕切割位点的特定序列，而跨膜螺旋去稳定残基仅仅是一些底物所需的次要特征。尚未鉴定具体序列。Bergbold等人在表3中公开了菱形蛋白酶底物的列表，特此将其切割序列通过引用并入本文，如同在此完全公开一样，并且可以将其用作本发明的pCAR中的菱形蛋白酶的底物。

鉴于以上所述，由于在大多数情况下尚未建立针对膜内切割蛋白酶的共有基序，并且由于鉴定膜内切割蛋白酶底物的测定是本领域熟知的，如上文引用的文献所述，pCAR可以包含像这样鉴定的氨基酸序列，并且可以还包含跨膜螺旋去稳定残基。

在一些实施方案中，底物形成跨膜经典基序的一部分，并且与Notch、ErbB4、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、肝配蛋白B2、淀粉样蛋白前体蛋白或CD44的跨膜结构域同源/由其衍生。

在一些实施方案中，其包含编码所述条件性aCAR的作为分开的蛋白质的细胞外结构域和细胞内结构域的核苷酸序列，其中每个结构域独立地与跨膜经典基序融合，并且包含异二聚体化小分子的结合位点的不同成员。

在一些实施方案中，异二聚体化小分子的结合位点的第一和第二成员中的每一者衍生自选自下述的蛋白质：(i)他克莫司(Tacrolimus)(FK506)结合蛋白(FKBP)和FKBP；(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶催化亚基A(CnA)；(iii)FKBP和亲环素；(iv)FKBP和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRB)；(v)促旋酶B(GyrB)和GyrB；(vi)二氢叶酸还原酶(DHFR)和DHFR；(vii)DmrB均二聚结构域(DmrB)和DmrB；(viii)PYL蛋白(又称脱落酸受体和RCAR)和ABI；以及(ix)GAI拟南芥(Arabidopsis thaliana)蛋白(又名赤霉酸不敏感和DELLA蛋白GAI；GAI)和GID1拟南芥蛋白(也称为赤霉素受体GID1；GID1)。

v.iCAR或pCAR和aCAR靶标对

在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR靶标对在安全效应免疫细胞中表达。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR靶标对由在安全效应免疫细胞中表达的核酸序列编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。

在一些实施方案中，EGFR、HER2、间皮素或CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。

在一些实施方案中，EGFR、HER2、间皮素或CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。

在一些实施方案中，EGFR、HER2、间皮素或CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。

在一些实施方案中，EGFR、HER2、间皮素或CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR或其部分由选自由以下组成的组的核酸序列编码：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQID NO:36。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR或其部分由核酸序列编码，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

在一些实施方案中，编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。

在一些实施方案中，编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ IDNO:45。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的核酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了编码iCAR和aCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由选自由以下组成的组的核酸序列编码：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由包含SEQ ID NO:31的核酸序列编码，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由包含SEQ ID NO:32的核酸序列编码，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由包含SEQ ID NO:33的核酸序列编码，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。

1.表达载体

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQID NO:36。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:37。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且，第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQID NO:37。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQID NO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，编码aCAR或其部分的核酸序列包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，编码aCAR或其部分的核酸序列包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，编码aCAR或其部分的核酸序列包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQID NO:41的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

vi.效应细胞的构建

在又另一方面，本发明提供了一种制备安全效应免疫细胞的方法，所述方法包括：(i)用如上文限定的包含编码iCAR或pCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用载体转导所述细胞；或者(ii)用如上文限定的包含编码iCAR或pCAR的核苷酸序列的核酸分子和如上文限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染幼稚效应免疫细胞；或用如上文限定的载体转导效应免疫细胞。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。

在一些实施方案中，用于工程化的免疫细胞包括但不限于T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。在一些实施方案中，用于工程化的免疫细胞包括但不限于Jurkat T细胞、Jurkat-NFAT T细胞和/或外周血单核细胞(PBMC)。

在又另一方面，本发明提供了通过上文所述的本发明的方法获得的安全效应免疫细胞。安全效应免疫细胞可以是表达外源性T细胞受体(TCR)和iCAR或pCAR的重定向的T细胞，其中所述外源性TCR针对抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享，并且iCAR或pCAR如上文限定；或安全效应免疫细胞是重定向的效应免疫细胞，例如表达如上文限定的iCAR或pCAR和aCAR的自然杀伤细胞或T细胞。

在一些实施方案中，安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR或pCAR，所述aCAR包含特异性地结合抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR或pCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。在一些实施方案中，iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原相同的抗原的不同多态性细胞表面表位的单个等位基因变体；或iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同的多态性细胞表面表位区域的不同单个等位基因变体。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的aCAR的细胞外结构域特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，所述靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性结合HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA_DQ或HLA-DR基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且在细胞表面上表达的aCAR的细胞外结构域针对或特异性结合选自表1中列出的抗原(例如但不限于CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且在细胞表面上表达的aCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如但不限于EGFR)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且在细胞表面上表达的aCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如但不限于HER2)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，aCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。

在一些实施方案中，aCAR和iCAR作为分离的蛋白质存在于细胞表面上。

在一些实施方案中，编码iCAR的核苷酸序列在细胞表面上的表达水平高于或等于编码aCAR的核苷酸序列的表达水平。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合至少一个细胞外多态性表位的单个等位基因变体。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，用于aCAR、iCAR和/或pCAR的识别部分提供了针对选自由以下组成的组的基因的基因产物中的至少一个细胞外多态性表位的特异性：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合选自由以下组成的组的基因的单个等位基因变体：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合HLA-A2的单个等位基因变体。在一些实施方案中，在细胞表面上表达的iCAR和/或pCAR的细胞外结构域针对或特异性地结合CD20的单个等位基因变体。在一些实施方案中，iCAR将针对HLA-A2。在一些实施方案中，iCAR将针对CD20。在一些实施方案中，aCAR针对CD19。在一些实施方案中，aCAR针对EGFR。在一些实施方案中，aCAR将针对HER2。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和CD19。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和EGFR。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和HER2。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别包括CD20和CD19。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，表达载体包含编码作为aCAR靶标的EGFR、HER2、间皮素或CEA和作为iCAR靶标的HLA的核酸序列。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码作为aCAR靶标的EGFR、HER2、间皮素或CEA以及作为iCAR靶标的HLA的核酸序列，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌(或源自胰腺癌或肺癌的细胞)。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码作为aCAR靶标的EGFR、HER2、间皮素或CEA以及作为iCAR靶标的HLA的核酸序列，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌(或源自胰腺癌的细胞)。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体编码作为aCAR靶标的EGFR、HER2、间皮素或CEA以及作为iCAR靶标的HLA，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，EGFR 2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，HER2是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，间皮素是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。在一些实施方案中，CEA是aCAR靶标，且HLA是iCAR靶标，并且被靶向的肿瘤/癌症是肺癌(或源自肺癌的细胞)。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，并且所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，并且所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，并且所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，并且所述核酸序列包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的核酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码iCAR和aCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由选自由以下组成的组的核酸序列编码：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由包含SEQ ID NO:31的核酸序列编码，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由包含SEQ ID NO:32的核酸序列编码，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由包含SEQ ID NO:33的核酸序列编码，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含编码iCAR和aCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，来自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和/或SEQ ID NO:33的iCAR或pCAR由第一表达载体中的核酸编码，并且来自SEQ ID NO:31、SEQID NO:32和/或SEQ ID NO:33的aCAR由第二表达载体中的核酸序列编码。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:37。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且，第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列编码包含SEQID NO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:1。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:37。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含一种核酸序列，所述核酸序列编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含SEQ IDNO:38。在一些实施方案中，第一表达载体包含编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；并且第二表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一表达载体编码，且aCAR由第二表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，编码aCAR或其部分的核酸序列包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，编码aCAR或其部分的核酸序列包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，编码aCAR或其部分的核酸序列包含SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，表达载体包含编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在编码aCAR或其部分的核酸序列的一些实施方案中，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

在一些实施方案中，如所定义的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞包含表达载体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR与aCAR由相同的表达载体编码。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由基于双顺反子核酸的表达载体编码。在一些实施方案中，表达载体包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR由选自由以下组成的组的核酸序列编码：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，表达载体包含包括SEQ ID NO:31的核酸序列，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，表达载体包含包括SEQ ID NO:32的核酸序列，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。在一些实施方案中，表达载体包含包括SEQ ID NO:33的核酸序列，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR。

vii.靶细胞的制备

在一些实施方案中，在体外系统中制备和测试靶细胞。在一些实施方案中，将建立体外重组系统，用于测试iCAR和/或pCAR构建体在抑制aCAR针对脱靶细胞的活性中的功能。在一些实施方案中，将产生表达aCAR表位、iCAR表位或两者的靶细胞。在一些实施方案中，将产生表达aCAR表位、pCAR表位或两者的靶细胞。在一些实施方案中，表达aCAR表位的重组细胞将代表中靶的“肿瘤上”(‘on-tumor’)细胞，而表达aCAR和iCAR表位的细胞将代表中靶的“脱肿瘤”(‘off-tumor’)健康细胞。

在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)和CD19。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)和CD19，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、Hela-萤光素酶或Raji)来产生表达HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)、CD19或两者的重组细胞。为了检测重组CD19和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)，并且重组细胞将表达HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)、CD19或两者。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2和CD19。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和CD19，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、Hela-萤光素酶或Raji)来产生表达HLA-A2、CD19或两者的重组细胞。为了检测重组CD19和HLA-A2表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2，并且重组细胞将表达HLA(包括例如HLA-A2)、CD19或两者。

在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)和EGFR。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)和EGFR，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、Hela-萤光素酶或A549或A431或U-87或Fadu或SK-OV-3或NCI-H460或MCF7MDA-MB-231)来产生表达HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)、EGFR或两者的重组细胞。为了检测重组EGFR和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。为了检测重组EGFR和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2，并且重组细胞将表达EGFR、HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)或两者。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2、HLA-A3、HLA-A和EGFR。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和EGFR，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、Hela-萤光素酶或A549或A431或U-87或Fadu或SK-OV-3或NCI-H460或MCF7MDA-MB-231)来产生表达HLA-A2、EGFR或两者的重组细胞。为了检测重组EGFR和HLA-A2表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。为了检测重组EGFR和HLA-A2表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2，并且重组细胞将表达EGFR、HLA-A2或两者。

在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)和HER2。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)和HER2，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、Hela-萤光素酶或A549或A431或U-87或Fadu或SK-OV-3或NCI-H460或MCF7MDA-MB-231)来产生表达HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)、HER2或两者的重组细胞。为了检测重组HER2和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。为了检测重组HER2和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)，并且重组细胞将表达HER2、HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)或两者。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2和HER2。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将分别是HLA-A2和HER2，通过用编码这些基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、Hela-萤光素酶或A549或A431或U-87或Fadu或SK-OV-3或NCI-H460或MCF7MDA-MB-231)来产生表达HLA-A2、HER2或两者的重组细胞。为了检测重组HER2和HLA-A2表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。为了检测重组HER2和HLA-A2表达，将两个基因都与蛋白标签(例如，HA或Flag或Myc等)融合。在一些实施方案中，iCAR/aCAR组将是HLA-A2，并且重组细胞将表达HER2、HLA-A2或两者。

在一些实施方案中，iCAR针对图22中列出的靶基因。在一些实施方案中，aCAR针对或特异性地结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：5T4、AFP、AXL、B7H6、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD44v6、CD5、CD7、CD70、CD80、CD89、CDH17、CEA、CLD18、CLEC14a、CLL-1、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、NY-ESO-1、FAP、FHSR、GP100、GPC3、HER2、IL-13R_、IL-13R_2、K-Ras、间皮素、MUC1、MUC-CD、NKG2D配体、NKG2D_配体、PDL1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR-2、生存素、TEM8、TGF、VEGFR2和ALK。在一些实施方案中，iCAR针对图22中列出的靶基因，并且aCAR针对或特异性地结合选自但不限于以下抗原列表的非多态性细胞表面表位：5T4、AFP、AXL、B7H6、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD44v6、CD5、CD7、CD70、CD80、CD89、CDH17、CEA、CLD18、CLEC14a、CLL-1、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、NY-ESO-1、FAP、FHSR、GP100、GPC3、HER2、IL-13R_、IL-13R_2、K-Ras、间皮素、MUC1、MUC-CD、NKG2D配体、NKG2D_配体、PDL1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR-2、生存素、TEM8、TGF、VEGFR2和ALK。

在一些实施方案中，将包含iCAR/aCAR组的表达载体转染到细胞中。在一些实施方案中，将表达载体转染到细胞中以产生靶效应和脱肿瘤效应。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2AD2A。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，表达载体编码选自由以下组成的组的基因：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方案中，如上限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性地结合肿瘤相关抗原或抗原的细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的至少在肿瘤起源组织中表达的抗原(例如上文列出的那些中的任何一种)的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。在一些实施方案中，在与表达aCAR的组织相同的组织中表达iCAR。在一些实施方案中，aCAR和iCAR是相同基因的不同等位基因。在一些实施方案中，aCAR和iCAR是不同的蛋白质，并且因此是不同的等位基因。

A.体外测定

在一些实施方案中，将使用多种测定来测试iCAR和/或pCAR的作用活性，包括有效性和抑制能力。在一些实施方案中，将在体外和/或体内测试iCAR和/或pCAR的抑制作用。在一些实施方案中，将在体外测试iCAR和/或pCAR的抑制作用。在一些实施方案中，将在体内测试iCAR和/或pCAR的抑制作用。在一些实施方案中，体外测定测量细胞因子分泌和/或细胞毒性效应。在一些实施方案中，体内测定将评价iCAR和/或pCAR对中靶的脱肿瘤的异种移植物的抑制和保护。在一些实施方案中，体内测定将评价iCAR和/或pCAR对中靶的脱肿瘤的组织和/或含病毒器官的抑制和保护。

i.萤光素酶细胞毒性测定

在一些实施方案中，使用萤光素酶细胞毒性测定评价iCAR和/或pCAR。通常，对于萤光素酶细胞毒性测定，将重组靶细胞(可以称为“T”)工程化，以表达萤火虫萤光素酶。在一些实施方案中，可以用编码靶蛋白的DNA转染商业Hela-Luc细胞。可以根据Bright-Glo萤光素酶测定(可从Promega或BPS Biosciences或其他商业供应商购得)进行体外萤光素酶测定。转导的效应(E)T细胞(已用iCAR或pCAR和aCAR或aCAR或模拟CAR两者转导)可与表达HLA-A2、CD19、或CD19和HLA-A2两者、或CD20、或CD20和CD19两者的重组靶细胞孵育24-48小时，以不同的效靶比进行测试。在一些实施方案中，iCAR/aCAR或pCAR/aCAR对包含具有如上所述组分的aCAR、pCAR和/或iCAR中的任何一种。在一些实施方案中，iCAR/aCAR对包含靶向HLA-A2的iCAR和靶向CD19的aCAR。在一些实施方案中，iCAR/aCAR对包含靶向CD20的iCAR和靶向CD19的aCAR。通过使用Bright-Glo萤光素酶系统估计活细胞数量，可以间接量化细胞杀伤。

在一些实施方案中，使用萤光素酶细胞毒性测定评价iCAR和/或pCAR。通常，对于萤光素酶细胞毒性测定，将重组靶细胞(可以称为“T”)工程化，以表达萤火虫萤光素酶。在一些实施方案中，可以用编码靶蛋白的DNA转染商业Hela-Luc细胞。可以根据Bright-Glo萤光素酶测定(可从Promega或BPS Biosciences或其他商业供应商购得)进行体外萤光素酶测定。转导的效应(E)T细胞(已用iCAR或pCAR和aCAR或aCAR或模拟CAR两者转导)可与表达HLA-A2、EGFR、或EGFR和HLA-A2两者、或CD20、或CD20和EGFR两者的重组靶细胞孵育24-48小时，以不同的效靶比进行测试。在一些实施方案中，iCAR/aCAR或pCAR/aCAR对包含具有如上所述组分的aCAR、pCAR和/或iCAR中的任何一种。在一些实施方案中，iCAR/aCAR对包含靶向HLA-A2的iCAR和靶向EGFR的aCAR。在一些实施方案中，iCAR/aCAR对包含靶向CD20的iCAR和靶向EGFR的aCAR。通过使用Bright-Glo萤光素酶系统估计活细胞数量，可以间接量化细胞杀伤。

在一些实施方案中，使用萤光素酶细胞毒性测定评价iCAR和/或pCAR。通常，对于萤光素酶细胞毒性测定，将重组靶细胞(可以称为“T”)工程化，以表达萤火虫萤光素酶。在一些实施方案中，可以用编码靶蛋白的DNA转染商业Hela-Luc细胞。可以根据Bright-Glo萤光素酶测定(可从Promega或BPS Biosciences或其他商业供应商购得)进行体外萤光素酶测定。转导的效应(E)T细胞(已用iCAR或pCAR和aCAR或aCAR或模拟CAR两者转导)可与表达HLA-A2、HER2、或HER2和HLA-A2两者的重组靶细胞孵育24-48小时，以不同的效靶比进行测试。在一些实施方案中，iCAR/aCAR或pCAR/aCAR对包含具有如上所述组分的aCAR、pCAR和/或iCAR中的任何一种。在一些实施方案中，iCAR/aCAR对包含靶向HLA-A2的iCAR和靶向HER2的aCAR。在一些实施方案中，iCAR/aCAR对包含靶向CD20的iCAR和靶向HER2的aCAR。通过使用Bright-Glo萤光素酶系统估计活细胞数量，可以间接量化细胞杀伤。

在一些实施方案中，通过根据iCAR/aCAR表达水平分选转导的T细胞群或通过根据重组靶细胞的靶标表达(包括例如编码至少一种细胞外多态性表位的基因产物的表达)选择重组靶细胞的亚群，可以优化“脱肿瘤”细胞毒性。在一些实施方案中，aCAR、iCAR和/或pCAR靶标是具有细胞外结构域的任何靶标。在一些实施方案中，分选基于CD19、EGFR、HER2或HLA-A2表达水平。

在一些实施方案中，检查iCAR和/或pCAR以确定iCAR转导的T细胞是否可以体外区分“肿瘤上”细胞(例如，肿瘤细胞)和“脱肿瘤”细胞(例如，非肿瘤细胞)。通常，通过检查与比率为1:1的“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞的混合物一起孵育的转导的T细胞的杀伤作用来测试这一点。在一些实施方案中，所述比率为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7或1:8。在仅一个细胞群被工程化为一次表达萤光素酶基因的实施方案中，通过萤光素酶表达可以将肿瘤上重组细胞与“脱肿瘤”重组细胞区分开。使用Bright-Glo荧光素酶测定(Promega)，在共孵育24-48小时之后，可以将杀伤定量。

在一些实施方案中，与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比，iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞表现出低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％和/或约95％的脱肿瘤细胞杀伤。在一些实施方案中，与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比，iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞表现出低约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍的脱肿瘤细胞杀伤。

ii.胱天蛋白酶3

在一些实施方案中，采用胱天蛋白酶3检测测定在体外检查iCAR和/或pCAR，以确定“肿瘤上”细胞(例如肿瘤细胞)和“脱肿瘤”细胞(例如非肿瘤细胞)的凋亡水平。在一些实施方案中，通过针对活化的切割的胱天蛋白酶3的抗体，对细胞毒性淋巴细胞(CTL)诱导的凋亡进行胱天蛋白酶3检测。

通常，CTL杀伤靶细胞的途径之一是通过Fas配体诱导细胞凋亡。CASP3蛋白是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(胱天蛋白酶)家族的成员。典型地，胱天蛋白酶的顺序激活在细胞凋亡的执行阶段中起重要作用，因此，针对胱天蛋白酶3的前胱天蛋白酶3的切割导致构象变化和催化活性的表现。胱天蛋白酶3的切割活化形式可以被单克隆抗体特异性地识别。

在一些实施方案中，可以将转导的T细胞与“肿瘤上”(例如，模拟肿瘤)细胞和“脱肿瘤”细胞(例如，模拟非肿瘤)任一者的重组细胞一起孵育。在一些实施方案中，先前已经用CFSE((5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯))或其他细胞示踪染料(例如CellTraceViolet)标记“肿瘤上”(例如肿瘤)和“脱肿瘤”细胞(例如非肿瘤)的重组细胞。在一些实施方案中，靶细胞与效应细胞的共孵育持续约1小时至6小时、约2小时至约5小时或约2小时至约4小时。在一些实施方案中，通过流式细胞术将靶细胞凋亡定量。可以通过内部染色试剂盒(Miltenyi或BD bioscience)对细胞进行透化和固定，然后用活化的胱天蛋白酶3的抗体(BD bioscience)进行染色。

在一些实施方案中，与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比，iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞诱导出低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％和/或约95％的脱肿瘤细胞凋亡。在一些实施方案中，与用aCAR转导但未用iCAR和/或pCAR转导的T细胞相比，aCAR/iCAR或aCAR/pCAR转导的T细胞诱导出低约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍的脱肿瘤细胞凋亡。

iii.延时显微镜检查

延时显微CTL-

为了识别靶标结合，可以采用iCAR和/或pCAR转导的T细胞的延时显微镜检查。在一些实施方案中，将用报告基因(例如但不限于荧光蛋白，例如mCherry)标记靶细胞。在一些实施方案中，将转导的T细胞与“肿瘤上”或“脱肿瘤”细胞孵育长达5天。在一些实施方案中，可以使用延时显微镜检查将杀伤可视化。在一些实施方案中，将进行使用活细胞数染色和CountBright珠(Invitrogen)的流式细胞术分析，以确定在终点时间的靶细胞数。

在一些实施方案中，为了确定aCAR/iCAR或aCAR/pCAR转导的T细胞是否能在体外识别靶标，将每个重组靶细胞(“肿瘤上”或“脱肿瘤”)用不同的报告蛋白(例如GFP和mCherry)标记。在一些实施方案中，任何报告蛋白对都将起作用，只要报告子对含有两个易于区分的报告子即可。在一些实施方案中，将转导的T细胞(效应细胞)与重组细胞(靶细胞)以1:1的E/T比率共孵育。在一些实施方案中，效靶比(E/T)包括但不限于16:1、12:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1或1:1。在一些实施中，然后通过显微镜成像检查细胞命运。

iv.细胞因子释放

可以检查细胞因子释放，以便确定T细胞活化。在一些实施方案中，将iCAR/aCAR和/或pCAR/aCAR转导的T细胞与重组靶细胞一起孵育，并且，例如通过根据BioLegend的ELISA MAXTM Deluxe Set试剂盒测量细胞培养上清液中的细胞因子分泌或通过对产生细胞因子的T细胞的百分比进行流式细胞术分析，针对一种或多种细胞因子将细胞因子产生定量。对于流式细胞术分析，通常采用Golgi停止剂来阻止细胞因子的分泌。在一些实施方案中，在将转导的T细胞与靶细胞孵育6小时和18小时至24小时之后，通过内部染色试剂盒(Miltenyi)透化并固定T细胞，并用针对T细胞标志物(CD3和CD8)的抗体以及针对一种或多种细胞因子的抗体进行染色。在一些实施方案中，细胞因子包括但不限于IL-2、INFγ和/或TNFα。

v.CD107a染色

还可以检查CD107a的染色，以便确定转导的T细胞的细胞溶解活性。通常，可以通过CD107a(一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1))的表面表达来鉴定T细胞的脱颗粒，并且已证明LAMP-1的表面表达与CD8 T细胞的细胞毒性相关。此外，该分子位于溶酶体的腔侧。典型地，在活化后，CD107a被转移到活化淋巴细胞的细胞膜表面。而且，CD107a在细胞表面瞬时表达，并通过内吞途径迅速重新内化。因此，虽然不受理论的束缚，通过在细胞刺激过程中的抗体染色和通过添加莫能菌素(monensin)(例如，以防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后降解)，使得CD107a检测最大化。

在一些实施方案中，将aCAR/iCAR和/或aCAR/pCAR转导的T细胞与靶细胞孵育约6小时至约24小时，并检查CD8 T细胞上的CD107a表达。在一些实施方案中，靶细胞仅表达被aCAR识别的一种靶蛋白(如在肿瘤细胞中)，或者靶细胞表达被aCAR和iCAR识别的两种靶蛋白(如在正常细胞中)。在一些实施方案中，在莫能菌素存在下，将iCAR和/或pCAR转导的转导T细胞与靶细胞孵育约6小时至约24小时，并且在CD8 T细胞上表达CD107a，随后使用针对T细胞表面标志物(例如CD3和CD8)的缀合抗体和针对CD107a的缀合抗体进行流式细胞术。

vi.通过ELISA将分泌的细胞因子定量

在一些实施方案中，在将表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR两者的转导的T细胞(Jurkat或原代T细胞)与在其细胞表面上表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR抗原两者的修饰的靶细胞共培养后，收集条件培养基，并通过细胞因子ELISA测量细胞因子的浓度。在一些实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、INFγ和/或TNFα。在一些实施方案中，细胞因子选自由IL-2组成的组。在一些实施方案中，细胞因子选自由INFγ组成的组。在一些实施方案中，细胞因子选自由TNFα组成的组。在一些实施方案中，证明在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞的情况下，降低了约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。

vii.通过细胞计数珠阵列(CBA)测定测量细胞因子分泌

使用细胞计数珠阵列(CBA)测量多种可溶性细胞内蛋白质，包括细胞因子、趋化因子和生长因子。在一些实施方案中，用在其细胞表面上表达iCAR和aCAR两者或aCAR或iCAR靶抗原的修饰的靶细胞刺激经aCAR或aCAR和iCAR构建体两者转导的T细胞(原代T细胞或Jurkat细胞)(效应细胞)。在一些实施方案中，效靶比范围为20:1至1:1。在一些实施方案中，效靶比范围为20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1。在一些实施方案中，在共孵育数小时后，效应细胞产生并分泌指示其效应子状态的细胞因子。在一些实施方案中，收集反应的上清液，并通过多重CBA测定测量分泌的IL-2并将其定量。

在一些实施方案中，证明在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞与表达两种靶抗原的靶细胞共孵育的情况下，相比于相同的效应细胞与仅表达一个靶标的靶细胞共孵育产生的IL-2分泌，降低了约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，证明在双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞与表达两种靶抗原的靶细胞共孵育时的IL-2分泌，相比于相同的效应细胞与仅表达一个靶标的靶细胞共孵育产生的IL-2分泌，降低了约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在一些实施方案中，降低了86％。在一些实施方案中，aCAR是CD19 aCAR。在一些实施方案中，iCAR是HLA-A2 iCAR。在一些实施方案中，iCAR是CD20 iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是CD19 aCAR和HLA-A2 iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是CD19 aCAR和CD20 iCAR。在一些实施方案中，aCAR是EGFR aCAR。在一些实施方案中，iCAR是HLA-A2 iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是EGFR aCAR和HLA-A2 iCAR。在一些实施方案中，aCAR是HER2 aCAR。在一些实施方案中，iCAR是HLA-A2iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是HER2 aCAR和HLA-A2 iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是HER2 aCAR和CD20 iCAR。

在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是CD19 aCAR和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对是EGFR aCAR和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)iCAR。在一些实施方案中，aCAR/iCAR对将是HER2 aCAR和HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)iCAR。

viii.通过CD107a染色测量的T细胞脱颗粒测定

在一些实施方案中，可以通过CD107a(一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1))的表面表达来鉴定T细胞的脱颗粒。在一些实施方案中，已证明LAMP-1的表面表达与CD8 T细胞的细胞毒性相关。在一些实施方案中，颗粒化(CD107a)是杀伤潜力的标志物。

B.体内测定

在一些实施方案中，对iCAR/aCAR和/或iCAR/pCAR对进行体内有效性测试。在一些实施方案中，用肿瘤细胞通过静脉内接种NOD/SCID/γc-或相似的小鼠。在一些实施方案中，肿瘤细胞是经工程化表达萤火虫萤光素酶的CD19阳性NALM 6(ATCC，人B-ALL细胞系)细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞是EGFR和HER2阳性细胞系A549、A431、Fadu、SK-OV-3、U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460(ATCC细胞系)细胞，其被工程化为表达萤火虫萤光素酶和/或GFP或mCherry或其他报告子。在一些实施方案中，为了建立“中靶”细胞和“脱肿瘤”细胞和/或在它们之间进行区分，可以将NALM 6、A549、A431、Fadu、SK-OV-3、U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460工程化为表达iCAR和/或pCAR表位，从而代表健康细胞。在一些实施方案中，iCAR和/或pCAR表位包含至少一种细胞外多态性表位。在一些实施方案中，iCAR和/或pCAR表位来自HLA(包括例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5)。在一些实施方案中，iCAR和/或pCAR表位来自HLA-A2。可以在这些测定中使用的其他细胞包括但不限于Raji或任何其他重组细胞系。在一些实施方案中，这样的测定可以在PDX(患者来源的异种移植物)模型中进行。

为了进行测定，将小鼠分为研究组；一组将注射NALM 6、A549、A431、Fadu、SK-OV-3和/或U-87、MCF7、MDA-MB-231、NCI-H460细胞，而另一组将注射表达iCAR表位的相应的NALM-6、A549、A431、Fadu、SK-OV-3、U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460。几天后，将小鼠通过静脉内输注用aCAR、aCAR/iCAR转导的T细胞，并且将对照组输注未转导的T细胞或不予输注T细胞。处死小鼠，并将根据总通量将肿瘤负荷定量。

根据所述测定的一个实施方案，为了测试表达iCAR和/或pCAR构建体的T细胞是否能在同一生物体内在体内区分靶细胞和脱靶细胞，向小鼠注射“肿瘤上”/“脱肿瘤”的NALM-6、A549、A431、Fadu、SK-OV-3、U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460细胞的1:1混合物，然后注射表达单独的aCAR或表达aCAR和iCAR两者的转导的T细胞。关于这个实施方案，在处死小鼠后，将通过流式细胞术针对两种标志物CD19和iCAR表位分析在脾和骨髓中的“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞中的存在。关于另一个实施方案，在处死小鼠后，将通过流式细胞术分析两种标志物EGFR和iCAR表位在脾和骨髓中的“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞中的存在。关于一个另外的实施方案，将通过流式细胞术针对两种标志物HER2和iCAR表位分析在脾和骨髓中的“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞中的存在。

i.人异种移植小鼠模型中的体内CTL测定

在一些实施方案中，为了测试表达aCAR和iCAR构建体两者的T细胞是否区分同一生物体内的靶细胞和“脱靶”细胞，并有效杀伤靶细胞同时保留“脱靶”细胞，将通过体内CTL测定进行评估。

在一些实施方案中，将用iCAR或aCAR或iCAR和aCAR两者转导的T细胞静脉注射到幼稚的NOD/SCID/γc-或相似的小鼠中，并在长达几个小时后，注射表达iCAR、aCAR或两者的靶细胞。在一些实施方案中，将用不同浓度(高、中和低)的CFSE/CPDE或相似的细胞示踪染料标记这些靶标，这将允许它们之间的进一步区分。在一些实施方案中，如实施例5中所述，将计算特异性杀伤的百分比。

ii.人异种移植小鼠模型中的肿瘤生长动力学

在一些实施方案中，肿瘤细胞表达iCAR靶标、aCAR靶标或两者。在一些实施方案中，aCAR肿瘤细胞系可以是CD19阳性NALM6(ATCC，人BALL细胞系)，或者是EGFR或HER2阳性细胞系A549、A431、Fadu、SK-OV-3 U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460(ATCC细胞系)。在一些实施方案中，表达aCAR和iCAR两者的肿瘤细胞(即“脱肿瘤”细胞)是NALM 6、A549、A431、Fadu、SK-OV-3 U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460，将其工程化为表达iCAR表位(例如HLA-A2)，从而代表健康细胞。在一些实施方案中，还可以将NALM 6和NALM 6-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶，GFP，mCHerry)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将A549和A549-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将A431和A431-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将Fadu和Fadu-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将SK-OV-3和SK-OV-3-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将NCI-H460和NCI-H460-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可将U-87和U-87-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将MCF7和MCF7-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将MDA-MB-231和MDA-MB-231-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。在一些实施方案中，还可以将NCI-H460和NCI-H460-HLA-A2工程化为表达报告基因(例如，萤火虫萤光素酶)，以便于检测。

在一些实施方案中，将通过机械手段(卡尺)以及还通过使用体内成像系统(IVIS)测量肿瘤体积来进行监测。在一些实施方案中，可以将肿瘤负荷定量，并且可以通过FACS分析浸润的T细胞群。

iii.转基因小鼠模型中的毒性和肿瘤生长动力学

在一些实施方案中，也将使用表达人aCAR和iCAR靶标的转基因小鼠来确定转导的T细胞的功效。在一些实施方案中，系统将允许我们监测功效和毒性问题。

C.体内用途：治疗、生物标志物

在又另一方面，本发明提供了一种为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，所述方法包括(i)从受试者获得肿瘤活检；(ii)从受试者获得正常组织样品，例如PBMC；以及(iii)鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，从而为受试者鉴定出个性化生物标志物。

在一些实施方案中，生物标志物用于定制受试者的治疗，因此所述方法还包括治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中癌症的步骤，包括向患者施用如上限定的效应免疫细胞，其中iCAR是针对(iii)中鉴定的单个等位基因变体。在一些实施方案中，本发明提供了一种为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，所述方法包括(i)从受试者获得肿瘤活检；(ii)从受试者获得正常组织样品，例如PBMC；(iii)基于LOH候选评分，鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，其中等位基因变体被鉴定为受试者的个性化生物标志物。

在一个另外的方面，本发明提供了一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用如上限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

在一个相似的方面，本发明提供了一种降低患有以LOH为特征的肿瘤的受试者中的肿瘤负荷的方法，所述方法包括向患者施用如上限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上或至少在表达aCAR的重要组织上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

在另一个相似的方面，本发明提供了一种提高治疗患有以LOH为特征的肿瘤的受试者的存活率的方法，所述方法包括向患者施用如上限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

在又一个另外的方面，本发明物涉及一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者、降低其肿瘤负荷或提高其存活率的如上限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

在又一个另外的方面，本发明涉及一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收如上文限定的限定iCAR的至少一种核酸分子和如上文限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子、或如上文限定的至少一种载体，其中iCAR包含特异性地结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包含特异性地结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收安全重定向效应免疫细胞的至少一个群；以及(v)向所述癌症患者施用(iv)的安全重定向免疫效应细胞的至少一个群。

在一个相似的方面，本发明提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的安全重定向免疫效应细胞的至少一个群，其中所述安全重定向免疫细胞通过以下步骤获得：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收如上文限定的限定iCAR的至少一种核酸分子和如上文限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子、或如上文限定的至少一种载体，其中iCAR包含特异性地结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包含特异性地结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收安全重定向效应免疫细胞的至少一个群。

在提及涉及癌症治疗或用于癌症治疗的安全免疫效应细胞的上述实施方案中任一项的一些实施方案中，(i)iCAR的细胞外结构域特异性地结合与aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体；(ii)所述iCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单个等位基因变体；或(iii)所述iCAR的细胞外结构域特异性地结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同多态性细胞表面表位的不同的单个等位基因变体。

在一些实施方案中，与包括向癌症患者施用表达(iii)的aCAR但缺乏(iii)的iCAR的免疫效应细胞的至少一个群的治疗相比，所述治疗导致降低的中靶脱肿瘤反应性。

在一些实施方案中，如上限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性地结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的或管家蛋白的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。

在一些实施方案中，如上限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性地结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的或管家蛋白(例如HLA基因(包括例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR))的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。

在一些实施方案中，如上限定的用于治疗癌症的安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性地结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的至少在肿瘤起源组织中表达的抗原(例如HLA-A)的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。

在一些实施方案中，施用多于一个免疫效应细胞群，并且不同的群表达对不同基因产物的细胞表面表位具有特异性结合的不同的aCAR和iCAR对。

在一些实施方案中，在治疗癌症的方法中使用的安全效应免疫细胞选自T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。在一些实施方案中，安全效应免疫细胞是自体或通用(同种异体)效应细胞。在一些实施方案中，在上文限定的任何一种治疗癌症的方法中使用的iCAR是针对其上存在aCAR的靶抗原的患者的所有组织，其中aCAR的靶抗原是抗原的非多态性细胞表面表位或存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，并且所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享。

在一些实施方案中，癌症选自急性髓性白血病[LAML]、肾上腺皮质癌[ACC]、膀胱尿路上皮癌[BLCA]、脑低级胶质瘤[LGG]、乳腺浸润癌[BRCA]、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌[CESC]、胆管癌[CHOL]、结肠腺癌[COAD]、食管癌[ESCA]、多形性胶质母细胞瘤[GBM]、头颈鳞状细胞癌[HNSC]、肾嫌色细胞癌[KICH]、肾脏肾透明细胞癌[KIRC]、肾脏肾乳头状细胞癌[KIRP]、肝脏肝细胞癌[LIHC]、肺腺癌[LUAD]、肺鳞状细胞癌[LUSC]、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBC]、间皮瘤[MESO]、卵巢浆液性囊腺癌[OV]、胰腺腺癌[PAAD]、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤[PCPG]、前列腺腺癌[PRAD]、直肠腺癌[READ]、肉瘤[SARC]、皮肤皮肤黑素瘤[SKCM]、胃腺癌[STAD]、睾丸生殖细胞肿瘤[TGCT]、胸腺瘤[THYM]、甲状腺癌[THCA]、子宫癌肉瘤[UCS]、子宫体内膜癌[UCEC]、葡萄膜黑素瘤[UVM]。

在一些实施方案中，用于治疗癌症的iCAR和/或pCAR是本文所述的任何iCAR和/或pCAR。在一些实施方案中，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的iCAR和/或pCAR针对或特异性地结合HLA基因(包括例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR)、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体，或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体。在一些实施方案中，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的iCAR针对或特异性地结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的aCAR针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的iCAR针对或特异性地结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的aCAR针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如EGFR)的非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的iCAR针对或特异性地结合HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-C基因的单个等位基因变体或针对表8中列出的基因的单个等位基因变体；并且，用于治疗癌症(例如上述任何一种癌症类型)的aCAR针对或特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如HER2)的非多态性细胞表面表位。

对于口服给药，药物制剂可以呈液体形式，例如溶液、糖浆或混悬剂，或者可以作为在使用前用水或其他适合的溶媒复原的药物产品存在。这样的液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂来制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性溶媒(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，其通过常规手段用药学上可接受的赋形剂来制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法将片剂包衣。

可适当地将口服给药制剂配制为给予活性化合物的控制释放。

对于口腔给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

可以将组合物配制成用于通过注射(例如通过推注或连续输注)进行肠胃外给药。注射用制剂可以呈现为单位剂量形式，例如在添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可采取诸如这样的形式：在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液或乳剂，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。可替代地，活性成分在使用前可呈粉末形式，以便用适合的溶媒(例如无菌无热原水)加以构成。

组合物也可以配制成直肠组合物，例如像含有常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂。

对于通过吸入给药，使用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体，从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾剂的形式方便地递送根据本发明的用途的组合物。在加压气溶胶的情况下，通过提供阀门来递送经计量的量，可以确定剂量单位。可以将用于在吸入器或吹入器中使用的例如明胶构成的胶囊及药筒配制为含有所述化合物与适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

为了清楚起见，并且绝不限制本教导的范围，除非另外指出，否则表示数量、百分比或比例以及本文引用的其他数值的所有数字在所有情况下均应解释为术语“约”在其之前。因此，本说明书中叙述的数字参数是近似值，其可以根据期望的结果而变化。例如，可以根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释每个数值参数。

如本文所用，术语“约”意指也包括高于或低于指示值的10％或更低的值。

示例性实施方案集合1

在一些实施方案中，本发明的方法提供了以下示例性实施方案。

1.一种核酸分子，其包含编码能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)的核苷酸序列，其中所述iCAR或pCAR包含与多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合的细胞外结构域和包含抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，所述多态性细胞表面表位由于杂合性丧失(LOH)在哺乳动物肿瘤细胞中不存在但至少在相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述多态性细胞表面表位属于管家基因产物，例如HLA基因、G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道或受体酪氨酸激酶，优选为HLA-A、HLA-B或HLA-C；或是选自表8的基因的多态性细胞表面表位。

3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述细胞外结构域包含(i)抗体、其衍生物或片段，例如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单域抗体，例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)；(ii)抗体模拟物，例如亲和体(affibody)分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；抗运载蛋白(anticalin)；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和单抗体(monobody)；或(iii)适体。

4.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述哺乳动物组织是人组织，并且所述相关哺乳动物正常组织是自其发展为肿瘤的正常组织。

5.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述效应免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。

6.如权利要求1所述的核酸分子，其中能够抑制效应免疫细胞的所述至少一种信号转导元件与免疫检查点蛋白的信号转导元件同源。

7.如权利要求6所述的核酸分子，其中所述免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：PD1；CTLA4；BTLA；2B4；CD160；CEACAM，例如CEACAM1；KIR，例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LIR1、LIR2、LIR3、LIR5、LIR8和CD94-NKG2A；LAG3；TIM3；T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)；干扰素基因刺激蛋白(STING)；含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的蛋白质、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)，以及腺苷受体(例如A2aR)。

8.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述细胞外结构域通过柔性铰链和跨膜经典基序与所述细胞内结构域融合。

9.一种载体，其包含如权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，以及与所述核酸分子可操作地连接的至少一个控制元件，例如启动子。

10.如权利要求9所述的载体，还包含包括编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子，所述aCAR包含特异性地结合抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域，以及包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享。

11.如权利要求10所述的载体，其中所述aCAR的细胞外结构域特异性地结合抗原的非多态性细胞表面表位，而iCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

12.如权利要求10或11所述的载体，其中所述aCAR的细胞外结构域特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19、EGFR或HER2)的非多态性细胞表面表位。

13.如权利要求10所述的载体，其中活化或共刺激效应免疫细胞的所述至少一种信号转导元件与以下所述同源：例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)；活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DS和KIR3DS，或衔接分子，例如DAP12；或例如CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)或CD134(OX40)的共刺激信号转导元件。

14.如权利要求10所述的载体，其中所述核苷酸序列包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间的内部核糖体进入位点(IRES)。

15.如权利要求14所述的载体，其中编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR的核苷酸序列的下游。

16.如权利要求10所述的载体，其中所述核苷酸序列包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。

17.如权利要求16所述的载体，其中所述病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自A型马鼻炎病毒(ERAV)的E2A和来自猪捷申病毒1型(PTV1)的P2A。

18.如权利要求10所述的载体，其包含编码通过柔性接头与所述iCAR连接的所述组成性aCAR的核苷酸序列。

19.一种制备如权利要求1至8中限定的能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，所述方法包括：

(i)从至少一个已知变体数据库中检索蛋白质编码基因的人基因组变体的列表；

(ⅱ)通过以下步骤过滤在(i)中检索到的变体的列表：

(a)选择与相应的参考等位基因相比，导致对应的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列变异的变体，

(b)选择其中氨基酸序列变异是在编码的蛋白质的细胞外结构域中的基因的变体，

(c)选择至少在一种肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的基因的变体，和

(d)选择至少在根据(c)的其中它们经历LOH的至少一种肿瘤的起源组织中表达的基因的变体，从而获得具有在对应的基因所编码的蛋白质中的细胞外结构域中的氨基酸序列变异的变体的列表，所述对应的基因在至少一种肿瘤中由于LOH而丧失并且至少在至少一种肿瘤的起源组织中表达；

(iii)限定包含来自(ii)中获得的列表的至少一个单个变体的序列区，亚克隆并表达所述包含至少一个单个变体的序列区以及包含相应的参考等位基因的序列区，从而获得对应的表位肽；

(iv)选择iCAR结合结构域，其与(iii)中获得的克隆的序列区所编码的表位肽或与相应的参考等位基因所编码的表位肽特异性地结合；和

(vii)制备如权利要求1至8中任一项限定的iCAR，其中每个iCAR包含如(iv)中限定的iCAR结合结构域。

20.如权利要求19所述的方法，其中每个变体的次要等位基因频率等于或超过1％、2％、3％、4％或5％。

21.一种制备安全效应免疫细胞的方法，所述方法包括：(i)用如权利要求1至8中任一项所述的包含编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用如权利要求9所述的载体转导所述细胞；或者(ii)用如权利要求1至8中任一项所述的包含编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子和如权利要求10至13中任一项限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染幼稚效应免疫细胞；或用如权利要求10至18中任一项所述的载体转导效应免疫细胞。

22.一种通过如权利要求21所述的方法获得的安全效应免疫细胞。

23.如权利要求22所述的安全效应免疫细胞，所述安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性地结合抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。

24.如权利要求22或23所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR的细胞外结构域特异性地结合选自表1中列出的抗原(例如CD19、EGFR或HER2)的非多态性细胞表面表位。

25.如权利要求22所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR和所述iCAR作为分离的蛋白质存在于细胞表面上。

26.如权利要求22所述的安全效应免疫细胞，其中编码iCAR的所述核苷酸序列的表达水平高于或等于编码aCAR的核苷酸序列的表达水平。

27.一种为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，所述方法包括

(i)从受试者获得肿瘤活检；

(ii)从受试者获得正常组织样品，例如PBMC；

(iii)鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，

从而为受试者鉴定出个性化生物标志物。

28.一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用如权利要求22所述的效应免疫细胞，其中所述iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

29.一种如权利要求22所述的效应免疫细胞在治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的用途，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

30.用于如权利要求29所述的用途的安全效应免疫细胞，其中，与包括向癌症患者施用表达(iii)的aCAR但缺乏(iii)的iCAR的免疫效应细胞的至少一个群的治疗相比，所述治疗导致降低的中靶脱肿瘤反应性。

31.用于如权利要求29所述的用途的安全效应免疫细胞，所述安全效应免疫细胞在其表面上表达aCAR和iCAR，所述aCAR包含特异性地结合肿瘤相关抗原或抗原的非多态性细胞表面表位的细胞外结构域，所述iCAR包含特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的至少在肿瘤起源组织中表达的抗原的或管家蛋白(例如HLA-A)的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的细胞外结构域。

32.用于如权利要求28所述的用途的安全效应免疫细胞，其为自体或通用(同种异体)效应细胞。

33.用于如权利要求28至32中任一项所述的用途的安全效应免疫细胞，其选自T细胞、自然杀伤细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞。

34.两种或更多种核酸分子的组合，其中每种核酸分子包含编码受控的效应免疫细胞活化系统的不同成员的核苷酸序列，所述核酸分子形成单个连续核酸分子或包含两个或更多个单独的核酸分子，其中所述受控的效应免疫活化系统指导效应免疫细胞杀伤由于杂合性丧失(LOH)而丧失了一个或多个染色体或其部分的肿瘤细胞，并保留相关正常组织的细胞，并且其中

(a)第一成员包含活化性嵌合抗原受体(aCAR)多肽，所述活化性嵌合抗原受体(aCAR)多肽包含第一细胞外结构域，所述第一细胞外结构域与抗原的非多态性细胞表面表位或与不同的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合，并且所述非多态性或多态性细胞表面表位是肿瘤相关抗原或被相关的异常和正常哺乳动物组织的细胞共享；并且

(b)第二成员包含调控多肽，所述调控多肽包含第二细胞外结构域，所述第二细胞外结构域与异常哺乳动物组织由于LOH而不表达的但存在于相关哺乳动物正常组织的所有细胞上的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合。

35.如权利要求34所述的组合，其中所述第一成员选自：

(a)组成性aCAR，其还包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件；和

(b)条件性aCAR，其还包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含异二聚体化小分子的结合位点的第一成员和任选的至少一种共刺激信号转导元件，但是缺乏活化性信号转导元件；并且，第二成员是：

(c)抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其还包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件；或

(d)保护性嵌合抗原受体(pCAR)，其还包含细胞外调节区，所述细胞外调节区包含脱落酶(sheddase)的底物；包含膜内切割蛋白酶的底物的跨膜经典基序；以及细胞内结构域，所述细胞内结构域包含活化和/或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件和异二聚体化小分子的结合位点的第二成员。

36.如权利要求34或35所述的组合，其中：

(i)所述iCAR或pCAR的细胞外结构域特异性地结合与aCAR的细胞外结构域所结合的抗原不同的抗原的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体

(ii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性地结合与所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同抗原的不同多态性细胞表面表位的单个等位基因变体；或

(iii)所述pCAR或iCAR的细胞外结构域特异性地结合所述aCAR的细胞外结构域所结合的相同多态性细胞表面表位的不同的单个等位基因变体。

37.如权利要求34所述的组合，其中脱落酶的所述底物是去整合素和金属蛋白酶(ADAM)或β-分泌酶1(BACE1)的底物。

38.如权利要求37所述的组合，其中所述底物形成细胞外结构域的一部分，并且包含Lin 12/Notch重复序列和ADAM蛋白酶切割位点。

39.如权利要求34所述的组合，其中膜内切割蛋白酶的所述底物是SP2、y-分泌酶、信号肽肽酶(spp)、spp样蛋白酶或菱形蛋白酶的底物。

40.如权利要求39所述的组合，其中所述底物形成跨膜经典基序的一部分，并且与Notch、ErbB4、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、肝配蛋白B2、淀粉样蛋白前体蛋白或CD44的跨膜结构域同源/由其衍生。

41.如权利要求34所述的组合，其包含编码所述条件性aCAR的作为分开的蛋白质的细胞外结构域和细胞内结构域的核苷酸序列，其中每个结构域独立地与跨膜经典基序融合，并且包含异二聚体化小分子的结合位点的不同成员。

42.如权利要求34所述的组合，其中异二聚化小分子的所述结合位点的所述第一和第二成员中的每一个均衍生自选自以下的蛋白质：

(i)他克莫司(Tacrolimus)(FK506)结合蛋白(FKBP)和FKBP；

(ii)FKBP和钙调神经磷酸酶催化亚基A(CnA)；

(iii)FKBP和亲环素；

(iv)FKBP和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRB)；

(v)促旋酶B(GyrB)和GyrB；

(vi)二氢叶酸还原酶(DHFR)和DHFR；

(vii)DmrB均二聚结构域(DmrB)和DmrB；

(viii)PYL蛋白(又称脱落酸受体和RCAR)和ABI；

(ix)GAI拟南芥蛋白(又名赤霉酸不敏感和DELLA蛋白GAI；GAI)和GID1拟南芥蛋白(也称为赤霉素受体GID1；GID1)。

示例性实施方案集合2

在一些方面，本发明提供了一种鉴定用于制备能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)的靶标的方法，其中所述靶标通过一种方法加以鉴定，所述方法包括：

(i)鉴定具有至少两个表达的等位基因的基因，其编码包含细胞外多态性表位的蛋白质；

(ii)确定至少一个表达的等位基因相对于细胞外多态性表位参考序列在细胞外多态性表位序列中表现出氨基酸序列改变；

(iii)确定所述基因位于在肿瘤类型中经历杂合性丧失(LOH)的染色体区域中；以及

(iv)确定所述基因在发现其中染色体区域经历了LOH的肿瘤类型的起源组织中表达。

在一些实施方案中，LOH位置选自由取代、缺失和插入组成的组。在一些实施方案中，LOH位置是SNP。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-K、HLA-L、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA_DQ或HLA-DR基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-A基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-B基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-C基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-G基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-E基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-F基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-K基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-L基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DM基因。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DO基因。在一些实施方案中，细胞外多态性表位是HLA-DP基因。在一些实施方案中，细胞外多态性表位是HLA_DQ基因。在一些实施方案中，细胞外多态性表位是HLA-DR基因。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体1上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PTGFRN、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体2上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体3上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体4上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体5上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体6上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体7上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体8上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体9上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体10上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体11上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体12上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体13上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体14上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体15上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体16上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体17上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体18上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体19上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体20上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体21上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体22上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因位于染色体X上。在一些实施方案中，包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自由以下组成的组：肾上腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、DLBC、乳腺肿瘤、肉瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、膀胱肿瘤和肝肿瘤。在一些实施方案中，肾上腺肿瘤是肾上腺皮质癌。在一些实施方案中，肾肿瘤是嫌色细胞肾细胞癌。在一些实施方案中，黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。

本发明还提供了安全效应细胞。在一些实施方案中，本发明提供了一种安全效应免疫细胞，其表达(i)根据权利要求1至46中任一项所述的iCAR或pCAR和(ii)活化性嵌合抗原受体(aCAR)。

在一些实施方案中，如权利要求47所述的安全效应免疫细胞，其中aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位。在一些实施方案中，由于iCAR或pCAR的保护作用，aCAR可以针对在癌细胞上表达的任何表面蛋白。

在一些实施方案中，非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIX Igκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1、MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，iCAR或pCAR的表达水平高于或等于aCAR的表达水平。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，iCAR或pCAR由第一载体表达，且aCAR由第二载体表达。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，iCAR或pCAR和aCAR两者都由同一载体表达。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，编码aCAR的核苷酸序列在编码iCAR或pCAR的核苷酸序列的下游。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，核苷酸序列包含在编码aCAR的核苷酸序列和编码iCAR或pCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自A型马鼻炎病毒(ERAV)的E2A以及来自猪捷申病毒1型(PTV1)的P2A。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，编码aCAR的核苷酸序列通过柔性接头与iCAR或pCAR连接。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，aCAR包含活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)同源。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)例如KIR2DS和KIR3DS同源。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与衔接分子例如DAP12同源或者是衔接分子例如DAP12。

在安全效应免疫细胞的一些实施方案中，活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件同源或者是CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件。

本发明还提供了一种治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用表达如本文所述的iCAR的安全效应免疫细胞。

在一些实施方案中，本发明还提供了一种治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用如本文所述的安全效应免疫细胞。

在一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的核苷酸序列，其中iCAR包含与多态性细胞表面表位的单个等位基因变体特异性地结合的细胞外结构域和包含抑制效应免疫细胞的至少一种信号转导元件的细胞内结构域，所述多态性细胞表面表位由于杂合性丧失(LOH)在哺乳动物肿瘤细胞中不存在但至少在相关哺乳动物正常组织的所有细胞上和重要器官上存在。在一些实施方案中，iCAR或pCAR靶标在正常表达aCAR靶标的所有细胞上表达。在一些实施方案中，iCAR或pCAR靶标在表达aCAR的重要器官细胞中表达。

在一个另外的方面，本发明提供了一种载体，其包含如本文限定的本发明的核酸分子，以及与所述核酸分子可操作地连接的至少一个控制元件，例如启动子。

在另一方面，本发明提供了一种制备根据本发明如本文限定的能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的方法，所述方法包括：(i)从至少一个已知变体数据库中检索蛋白质编码基因的人基因组变体的列表；(ii)通过以下步骤过滤在(i)中检索到的变体的列表：(a)选择与相应的参考等位基因相比，导致对应的基因所编码的蛋白质的氨基酸序列变异的变体，(b)选择其中氨基酸序列变异是在编码的蛋白质的细胞外结构域中的基因的变体，(c)选择至少在一种肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的基因的变体，和(d)选择至少在根据(c)的其中它们经历LOH的至少一种肿瘤的起源组织中表达的基因的变体，从而获得具有在对应的基因所编码的蛋白质中的细胞外结构域中的氨基酸序列变异的变体的列表，所述对应的基因在至少一种肿瘤中由于LOH而丧失并且至少在至少一种肿瘤的起源组织中表达；(iii)限定包含来自(ii)中获得的列表的至少一个单个变体的序列区，亚克隆并表达所述包含至少一个单个变体的序列区以及包含相应的参考等位基因的序列区，从而获得对应的表位肽；(iv)选择iCAR结合结构域，其与(iii)中获得的克隆的序列区所编码的表位肽或与相应的参考等位基因所编码的表位肽特异性地结合；以及(vii)制备如本文限定的iCAR，其中每个iCAR包含如(iv)中限定的iCAR结合结构域。

在又另一个方面，本发明提供了制备安全效应免疫细胞的方法，所述方法包括：(i)用如本文限定的包含编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子转染针对肿瘤相关抗原的TCR工程化效应免疫细胞，或用本文限定的载体转导所述细胞；或者(ii)用如本文限定的包含编码iCAR的核苷酸序列的核酸分子和如本文限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的核酸分子转染幼稚效应免疫细胞；或用如本文限定的载体转导效应免疫细胞。

在又另一方面，本发明提供了通过如本文所述的本发明的方法获得的安全效应免疫细胞。安全效应免疫细胞可以是表达外源性T细胞受体(TCR)和iCAR的重定向的T细胞，其中所述外源性TCR针对抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，其中所述表位是肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享，并且iCAR如本文限定；或安全效应免疫细胞是重定向的效应免疫细胞，例如表达如本文限定的iCAR和aCAR的自然杀伤细胞或T细胞。

在一个另外的方面，本发明提供了一种为患有以LOH为特征的肿瘤的受试者选择个性化生物标志物的方法，所述方法包括(i)从受试者获得肿瘤活检；(ii)从受试者获得正常组织样品，例如外周血单个核细胞(PBMC)；以及(iii)鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体，从而为受试者鉴定出个性化生物标志物。

在一个另外的方面，本发明提供了一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用如本文限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。

在又一个另外的方面，本发明物涉及一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者的如本文限定的效应免疫细胞，其中iCAR针对编码由于杂合性丧失(LOH)在肿瘤细胞中不存在但至少在患者的相关哺乳动物正常组织(包括患者的重要器官在内)的所有细胞上存在的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体。在一些实施方案中，iCAR或pCAR在正常表达aCAR靶标的所有细胞上表达。在一些实施方案中，iCAR或pCAR在表达aCAR的重要器官细胞中表达。

在又一个另外的方面，本发明涉及一种用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收如本文限定的限定iCAR的至少一种核酸分子和如本文限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子、或如本文限定的至少一种载体，其中iCAR包含特异性地结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包含特异性地结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收安全重定向效应免疫细胞的至少一个群；以及(v)向所述癌症患者施用(iv)的安全重定向免疫效应细胞的至少一个群。

在一个相似的方面，本发明提供了用于治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的安全重定向免疫效应细胞的至少一个群，其中所述安全重定向免疫细胞通过以下步骤获得：(i)鉴定或接收鉴定由于LOH而不被肿瘤细胞表达但被正常组织细胞表达的多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，(ii)鉴定或接收鉴定抗原的非多态性细胞表面表位或多态性细胞表面表位的单个等位基因变体的信息，其中所述表位是所述癌症患者中的肿瘤相关抗原或至少被相关肿瘤和正常组织的细胞共享；(iii)选择或接收如本文限定的限定iCAR的至少一种核酸分子和如本文限定的包含编码aCAR的核苷酸序列的至少一种核酸分子、或如本文限定的至少一种载体，其中iCAR包含特异性地结合(i)的细胞表面表位的细胞外结构域，并且aCAR包含特异性地结合(ii)的细胞表面表位的细胞外结构域；(iv)通过用(iii)的核酸分子转染效应免疫细胞或用(iii)的载体转导效应免疫细胞来制备或接收安全重定向效应免疫细胞的至少一个群。

长表格

本专利申请包含一个冗长的表格部分。这些表格的副本与2019年9月27日提交的相应美国案件以及当前案件要求优先权的临时申请同时提交。

实施例

关于实施例，采用以下术语。

当采用术语“染色体”时，这通常是指SNP所在的染色体。对于SNP分析，位置是指SNP的基因组位置(组装GRCh37.p13)。snp_id在使用时是指dbSNP rs ID(在存在的情况下)。

术语“ref”是指参考核苷酸等位基因。术语“alt”是指替代核苷酸等位基因。

术语“质量”是指来自外显子组整合联合(ExAC)的质量评分。术语“过滤器_状态”是指来自ExAC的过滤器信息。

术语“等位基因_频率”是指来自ExAC的全局等位基因频率。术语“最大_等位基因_频率”是指最常见的替代等位基因的全局等位基因频率(通常，仅当SNP在相同位点具有多于两个替代等位基因时才有意义，且无论如何这通常都意味着测序错误)。

术语“het_等位基因_计数”是指ExAC中杂合子的参与者数。术语“AFR_AF”是指来自非洲基因组的次要等位基因频率。术语“AMR_AF”是指拉丁美洲基因组中的次要等位基因频率。术语“EAS_AF”是指东亚基因组中的次要等位基因频率。术语“FIN_AF”是指芬兰基因组中的次要等位基因频率。术语“NFE_AF”是指非芬兰-欧洲基因组中的次要等位基因频率。术语“OTH_AF”是指其他基因组中的次要等位基因频率。术语“SAS_AF”是指南亚基因组中的次要等位基因频率。

术语“最大_AF”是指在ExAC中分类的群体中的最大次要等位基因频率(0.5是允许的最大等位基因频率)。

术语“基因”是指SNP落入其中的基因的HUGO符号。

术语“hgnc_ID”是指SNP落入其中的基因的HUGO基因命名委员会数字ID。

术语“后果”是指SNP对翻译的蛋白质产物的影响。可以是以下几种之一，包括：错义_变体，移码_变体，框内_缺失，终止_获得。

术语“蛋白质_后果”报告了氨基酸取代及其在参考蛋白质转录物上的位置(例如p.Arg482Gln)。

术语“aa_受影响”是指受影响的氨基酸在共有蛋白质转录物上的数字位置。

术语“等位基因_1”是指由参考等位基因编码的氨基酸。

术语“等位基因_2”是指由替代等位基因编码的氨基酸。

术语“sift_评分”是指通过SIFT算法对氨基酸取代的预测功能作用的评分和解释。使用版本sift5.2.2。评分范围为0-1。低分意味着氨基酸取代更可能被容忍。

术语“polyphen_评分”是指通过polyphen算法对氨基酸取代的预测功能作用的评分和解释。使用PolyPhen(v2.2.2)。评分范围为0-1。低分意味着氨基酸取代更可能有害。

术语“polyphen_数字”是指从polyphen算法中提取的仅有数字评分。

术语“蛋白质_结构域_受影响”是指基于以下算法的预测蛋白质结构域：Gene3D、hmmpanther、Prosite。

术语“BLOSUM_评分”是指基于来自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62的BLOSUM62矩阵的氨基酸取代的评分。负分表示在演化中随着时间的推移发生频率较低的氨基酸取代(更可能影响蛋白质功能)。

术语“等位基因_1_一_字母”是指参考氨基酸等位基因的一个字母氨基酸代码。

术语“等位基因_2_一_字母”是指替代氨基酸等位基因的一个字母氨基酸代码。

术语“单_等位基因_表达”是指SNP落入的基因在人中是否经历单等位基因表达。由Savova等人建立的数据库用于这个注释7。这个列中的1表示基因表现出单等位基因表达。这个列中的0表示基因在Savova等人的数据库中未表现出单等位基因表达。这个列中的NA表示基因在Savova等人的文章中未被注释。

术语“细胞外”是指SNP是否落在受影响的蛋白质的细胞外结构域中。这个列中的1表示SNP在细胞外结构域中，而0则表示不在细胞外结构域中。Uniprot用于注释蛋白质结构域。

术语“Pdb_id”是指受影响的蛋白质的蛋白质数据库ID(如果存在的话)。在存在许多蛋白质数据库条目的情况下，则仅包括第一个ID。

术语“aa_背景_21aa_等位基因_1”是指在共有蛋白质序列上围绕SNP氨基酸的21个氨基酸的窗口。该序列由共有蛋白质序列前面部分中的10个氨基酸组成。进行检查以确保参考氨基酸在受影响的位置处与共有蛋白质序列匹配。如果这两个氨基酸不相同，则该条目显示为“基于共有同工型的与uniprot fasta的差异”。

术语“aa_背景_21aa_等位基因_2：与上面相同的氨基酸窗口，但是将氨基酸等位基因2插入中间。

术语“gtex_平均：跨组织的平均基因表达(以RPKM计)。这由来自GTEX的跨组织的RPKM中值的平均值组成。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么这个条目中报告的值将是3.33。

术语“gtex_最小：跨所有组织的组织的最低基因表达。这个值源自跨所有组织的基因表达的中值列表。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么这个条目中报告的值将是2。

术语“gtex_最大：跨所有组织的组织的最高基因表达。这个值源自跨所有组织的基因表达的中值列表。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么这个条目中报告的值将是5。

术语“gtex_std_dev：给定基因的跨组织的基因表达值的标准偏差。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么这个条目中报告的值将是1.5。

术语“细胞_表面_蛋白质_图谱：用于是否将该蛋白质注释为细胞表面蛋白质图谱中的膜蛋白的二进制标记(wlab.ethz.ch/cspa/)。1表示该基因在这个数据库中被注释为膜蛋白。

术语“人_蛋白质_图谱_膜_蛋白质：用于是否将该蛋白质注释为人蛋白质图谱中的膜蛋白的二进制标记(https://www.proteinatlas.org/)。1表示该基因在这个数据库中被注释为膜蛋白。

术语“亚细胞_图谱_蛋白质组_膜_蛋白质：用于是否将该蛋白质注释为蛋白组的亚细胞图谱中的膜蛋白的二进制标记(http://science.sciencemag.org/content/early/2017/05/10/science.aal3321/)。1表示该基因在这个数据库中被注释为膜蛋白。

术语“n_膜_数据库_w_基因：具有注释为基因在细胞膜上表达的基因的数据库总数。最大值＝3，最小值＝0。

术语“膜_蛋白质_调用：对包含该基因的膜数据库数量的文本解释。如果该基因包含在一个数据库中，则调用为“低置信度”膜蛋白。如果该基因包含在两个数据库中，则调用为“中等置信度”膜蛋白。如果该基因包含在三个数据库中，则调用为“高置信度”膜蛋白。

术语“比率_gtex_std_dev_与_平均：跨组织基因表达的标准偏差与跨组织平均基因表达的比率。例如，如果给定基因的值是肺(中值)＝3、乳房(中值)＝2、胰腺(中值)＝5，那么这个条目中报告的值将是1.5/3.33＝0.45。这意味着对跨组织表达的均匀性的量度。低值表示该基因被均匀表达。高值表明该基因倾向于在一些组织而不在其他组织中表达。

术语“普遍_表达：基因是否似乎被普遍表达的二进制标记。如果gtex_平均>10,gtex_最小，则认为基因被普遍表达。术语“>1”，且比率_gtex_std_dev_与_平均<1。这个列中的1表示所讨论的基因符合这些标准。

术语“疾病：在电子表格的这一行中针对LOH数据分析的疾病的TCGA条形码。

术语“平均_表达_在_组织”：被分析组织中的平均基因表达。几种组织分类可以映射到单个TCGA肿瘤类型。在文件“tcga_疾病_组织_查找.txt”中给出了从GTEX中的组织到TCGA肿瘤类型的映射。以下给出了代表性样品：

tcga_疾病	gtex_组织
		Acc	肾上腺
blca	膀胱
		brca	乳房...乳腺组织
cesc	宫颈...内宫颈，宫颈...外宫颈

术语“平均_表达_在_其他_组织：在除被分析组织外的所有其他组织中的平均基因表达。例如，如果被分析基因是PSMA(前列腺特异性基因)，那么当分析的肿瘤类型是PRAD(前列腺腺癌)时，这个值将非常低。

术语“科恩氏_d：科恩氏d(Cohen’s d)是在被分析组织相对于所有其他组织中的表达的分离的量度。这意味着这个基因在被分析组织中独特表达程度的量度。高的科恩氏d表明这个基因在被分析组织中独特表达，因此可能是好的aCAR靶标。

术语“比例_w_LOH_相对：被分析肿瘤类型中显示出LOH证据的肿瘤比例。调用暗示LOH的基因组区段的阈值为-0.1(以相对拷贝数单位计)。区段的相对拷贝数是肿瘤中的拷贝数信号除以匹配正常中的拷贝数信号的对数。这些数据是从cbio门户获得的，并且该技术已在第1部分中进行了验证。

术语“CI_95_低_相对：在这个基因座处经历LOH的肿瘤比例上的95％置信区间的下边界。R中的prop.test函数用于此计算。此函数使用Yates连续性校正来计算二项式置信区间。

术语“CI_95_高_相对：在这个基因座处经历LOH的肿瘤比例上的95％置信区间的上边界。R中的prop.test函数用于此计算。此函数使用Yates连续性校正来计算二项式置信区间。

术语“mutsig_命中_在_chr：作为癌症驱动基因的通过统计学显著性(q值<0.25)的与SNP在相同染色体上的基因。使用Mutsig 2.0算法。格式为“基因符号，q＝q值；基因符号2，……”

术语“tsg_在_chr_突变_在_疾病：用于通过mutsig的统计学显著性的基因之一是否是肿瘤抑制基因的二进制指示变量。用于这个注释的肿瘤抑制基因的列表是由Vogelstein等人9发表的表格中的列表。这个列中的1表示该基因被注释为肿瘤抑制基因。

术语“标志_tsg_在_chr_突变的_在_疾病：用于在被分析肿瘤类型中鉴定为显著突变并且与SNP在相同染色体上的基因中的任何一个是否为“标志”肿瘤抑制基因的二进制指标变量。“标志”肿瘤抑制基因是少数经过充分验证的更有可能在肿瘤发展早期突变的肿瘤抑制基因。这些基因是：TP53、PTEN、APC、MLL3、MLL2、VHL、CDKN2A和RB1。这个列中的1表示这些标志TSG之一与所讨论的SNP存在于同一条染色体上，并且在被分析肿瘤类型中显著突变。

术语“gistic_缺失_n_峰”：SNP所落在的染色体上的GISTIC峰的数量。较高的数字表明(松散地)存在更多的驱动这条染色体上的遗传物质丧失的选择力。

术语“gistic_缺失_最佳_q_值：SNP所落在的染色体上基因组丧失的最低GISTICq值。极低的q值表明存在使染色体上某处的基因组物质丧失的显著的选择压力。

术语“比例_的_患者_符合的：在肿瘤中具有i)SNP的种系杂合性和ii)SNP的LOH的患者的估计比例。具有SNP的种系杂合性的患者比例的估计假定符合Hardy-Weinberg平衡，使用等式杂合子比例＝2pq。其中p是SNP的全局等位基因分数，并且q＝1-p。

术语“比例_的_患者_符合_最大_种族_靶向的：在肿瘤中具有i)SNP的种系杂合性和ii)SNP的LOH的患者的估计比例。具有SNP的种系杂合性的患者比例的估计假定符合Hardy-Weinberg平衡，使用等式杂合子比例＝2pq。其中p是SNP的最大群体限制性等位基因分数，并且q＝1-p。例如，在一些情况下，使用的群体可能是非洲人，而在一些情况下可能是南亚人。

术语“累积_评分：量化SNP是iCAR靶标的良好候选者的程度的评分。评分范围从0到理论1。有关此评分的计算的更多信息，请参见标题为“对候选SNP进行排名的累积评分”的部分。

实施例1.跨癌症的HLA基因的LOH率评估

简介：

提出了一种治疗策略来解决由癌细胞中基因组丧失引起的脆弱性。所提出的策略使用活化性CAR T细胞(aCAR)和抑制性CAR T细胞(iCAR)的组合，以更安全地靶向已经丧失编码细胞膜蛋白的对于母本和父本等位基因而言为杂合的基因组区段(即，多态性蛋白质编码改变)的肿瘤。

如果iCAR的靶标仅由非肿瘤组织表达，则iCAR可以降低CAR-T疗法的脱肿瘤毒性，而不降低抗肿瘤功效。当iCAR抗原由已在肿瘤细胞中缺失的基因组的一部分编码时，就会发生其中iCAR靶标仅由非肿瘤细胞表达的这种情况。具有高度多态性并且已知在所有细胞上表达的一个基因家族是HLA。

HLA蛋白几乎被哺乳动物细胞普遍表达，其允许将非自身抗原呈递给免疫系统的细胞。HLA基因还倾向于定量地高表达，使其更适合于治疗靶向。HLA基因的RNA表达高于基因组中99.3％的其他蛋白质编码基因(图4)。HLA基因的平均组织表达及其基因组位置包含在表3以及在CD-ROM上随附的长表格中。

本部分的目的是鉴定其中HLA基因经历频繁缺失的癌症类型。次要分析包括尝试鉴定在HLA基因座处的基因组丧失的驱动基因。

我们执行了一项详细计划，用于鉴定具有驱动HLA基因的频繁拷贝丧失的选择压力的癌症(图5)。

使用ABSOLUTE数据，跨肿瘤类型的HLA丧失的频率：

我们使用了经ABSOLUTE算法处理过的TCGA的拷贝数概况，以评估HLA-A的等位基因丧失率的真实(ground-truth)估计。可公开获得的ABSOLUTE分段拷贝数数据是从(https://www.synapse.org/#！Synapse:syn1710464.2)¹下载的。ABSOLUTE算法输出单个癌症基因组内每个等位基因区段的整数拷贝水平。在丧失染色体6的单拷贝的情况下(包含HLA基因座)，则等位基因拷贝数将是：保留的区段为1，并且丧失的区段为0。在杂合性拷贝中性丧失的情况下，则保留的区段将具有拷贝数2，而丧失的区段将具有拷贝数0。通过ABSOLUTE处理的可公开获得的拷贝数数据可用于12种肿瘤类型(表4)。与其他肿瘤类型相比，肺鳞状细胞癌(LUSC)具有最高的HLA-A LOH频率(图6)。子宫/子宫内膜癌(UCEC)在所有可评估的肿瘤中具有最低的HLA-A LOH频率(由于未获得ABSOLUTE数据，因此不包括AML样本)。在HLA-A基因的588个缺失中，没有一个具有基因内断点(图7)。HLA-A基因的大多数缺失涵盖了染色体的大部分(图8)。虽然未获得AML样本的ABSOLUTE拷贝数数据，但手动检查这些样本中的相对拷贝数数据并未显示缺失(图11)。

相比于ABSOLUTE拷贝数数据的相对拷贝数数据的验证：

我们试图获得可公开获得的尽可能多的肿瘤类型的LOH频率。然而，这些数据尚未经ABSOLUTE处理，并且有待通过ABSOLUTE处理的原始数据也不可公开获得。相反，我们使用了来自TCGA的32种肿瘤类型的相对拷贝数数据(图13)。这些数据是从cbioportal(cbioportal.org/data_sets.jsp)下载的。相对拷贝数数据获自肿瘤样品的AffymetrixSNP 6.0阵列。

为了确定是否可以从相对拷贝数数据中获得LOH的准确估计，我们用已经具有来自ABSOLUTE的LOH数据的肿瘤的相对数据计算出LOH的比率。这些数据由分段的拷贝数文件组成。每个区段都分配有相对拷贝率。拷贝率定义为肿瘤中的信号密度相比于匹配的正常对照中的信号密度的比率的对数(在Affymetrix阵列中)。相对于匹配的对照(通常来自外周血)归一化有助于移出任何种系拷贝数变体，避免被误认为是体细胞的。如果该基因组区段的相对拷贝数低于给定阈值，则认为该区段经历了基因组丧失。例如，如果区段321的相对拷贝数为-0.4，并且拷贝丧失的阈值为-0.3，则可以说区段321经历了拷贝丧失，并且由于我们缺乏直接等位基因信息，因此可以说也已经经历LOH。

我们首先尝试确定用于将相对拷贝数区段标记为已经历LOH的最佳拷贝数截止值。在相对拷贝数的截止值为-0.1的情况下，LOH的ABSOLUTE和相对拷贝数估计的一致性最高(表5和图9)。这个阈值也恰好是在TCGA Tumorscape门户(http://portals.broadinstitute.org/tcga/home)中被TCGA拷贝数组用来限定拷贝丧失的阈值。相对数据与ABOSLUTE数据中具有HLA-A LOH的个体的分数之间的相关性为0.55。这种合理的高度相关性使我们能够利用可用的相对拷贝数数据对所有肿瘤类型进行分析。

使用相对拷贝数数据在跨32种肿瘤类型中具有HLA-LOH的患者的分数。

针对可从TCGA获得的所有32种肿瘤计算具有HLA-A的LOH的患者比例(图10A；COAD和READ一起分析)。具有最高HLA-A LOH率的肿瘤是肾嫌色细胞癌。具有最低HLA-A LOH率的肿瘤是葡萄膜黑素瘤(表6)。为确保我们在这些分析中得出的LOH率对基因组位置的小扰动具有鲁棒性，我们分析了HLA-A上游和下游基因的LOH率，以查看它们的HLA-LOH率是否与HLA-A相似。正如预期，上游和下游基因HLA-G和ZNRD1的LOH率分别与HLA-A的完全相同。(图3A-C)。这些数据表明，HLA-A LOH调用对基因组位置的小偏差具有鲁棒性。然后，我们试图确定与HLA-A相比，其他HLA基因(A、B、C)是否具有相似的LOH率。这些基因都落入染色体6p的1.3Mb区域内。在基因组距离上，这是一个小的区域。我们对HLA-B和HLA-C重复了HLA-A分析。在分析的32种肿瘤中，所有三种HLA基因之间的LOH模式几乎相同(图10A-C)。

对HLA-A LOH率增加选择压力

瘤内基因组异质性是最近认识到的至今被分析的几乎所有人癌症的特征^2,3。靶向仅存在于一部分肿瘤细胞中的基因改变的疗法可能只影响包含所述改变的肿瘤细胞。如果抗原没有被克隆删除，则靶向不存在于肿瘤细胞上的抗原的iCAR策略可能保护一些肿瘤细胞免受aCAR攻击。因此，我们尝试鉴定其中HLA基因可能经历克隆性LOH的肿瘤。在进化早期发生的LOH很可能是由肿瘤起始和/或维持中的选择力驱动的。因此，我们以三种方式寻找在染色体6(具有HLA基因座)上的肿瘤抑制因子。首先，我们在评估的每种肿瘤类型中寻找在染色体6上显著突变的基因⁴。电子表格在“chr6_mutsig_sig_基因”列下报告了在染色体6上具有显著突变的基因。

其次，我们寻找显著缺失的基因的区域，其预示可能缺失的肿瘤抑制因子。我们使用在这些数据上运行的GISTIC2.0的结果。电子表格报告了在染色体6上的GISTIC缺失峰的数量(q<0.25)，以及这些缺失峰的最低q值。通常，GISTIC缺失峰越多并且q值越低，则选择压力越强。但是，也可能有这样一种情况：其中一个非常强的GISTIC峰占优势，并且峰的数量将很小，但是驱动基因显著性是肯定的。一般而言，最低q值应该与给定染色体上存在肿瘤抑制驱动基因最强相关。

第三，我们将在每种肿瘤中显著突变的一组基因与一系列已知的肿瘤抑制基因重叠，以确定是否有任何突变的基因可能驱动染色体6的丧失⁵。我们能够鉴定出具有可能的突变驱动基因的两种肿瘤类型。在肾上腺皮质癌中，DAXX基因显著突变(q＝.0571)，并且在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，TNFAIP3基因显著突变(q＝0.00278)。DAXX编码组蛋白伴侣，其突变与肾上腺皮质癌中较长的端粒相关⁶。TNFAIP3编码NF-κB信号传导的负调节因子。这个基因在DLBCL中发生的突变已证明因此而增进了NF-κB信号传导⁷。

表3.分析基因组基因座的LOH。基因组坐标在hg19人基因组组装中。

表4.具有ABSOLUTE数据的肿瘤类型

表5.通过相对拷贝数数据与ABSOLUTE拷贝数数据的LOH率的相关性(皮尔逊)。阈值为-0.1的相关峰。

表6.TCGA数据集中所有32种癌症的LOH的数量和比率。

基于上文，我们得出结论，HLA区LOH是许多肿瘤中的常见事件，然而LOH的百分比随肿瘤类型的不同而不同。因此，HLA基因是iCAR靶标的良好候选者。

实施例1的参考文献：

1.Zack TI，Schumacher SE，Carter SL，Cherniack AD，Saksena G，Tabak B，Lawrence MS，Zhsng CZ，Wala J，Mermel CH，Sougnez C，Gabriel SB，Hernandez B，ShenH，Laird PW，Getz G，Meyerson M，Beroukhim R.Pan-cancer patterns of somatic copynumber alteration.Nature genetics.2013；45：1134-1140

2.Giboson WJ，Hoivik EA，Halle MK，Taylor-Weiner A，Cherniack AD，Berg A，Holst F，Zack TI，Werner HM，Staby KM，Rosenberg M，Stefansson IM，Kusonmano K，Chevalier A，Mauland KK，Trovik J，Krakstad C，Giannakis M，Hodis E，Woie K，BjorgeL，Vintermyr OK，Wala JA，Lawrence MS，Getz G，Carter SL，Beroukhim R，SalvesenHB.The genomic landscape and evolution of endometrial carcinoma progressionand abdominopelvic metastasis.Nature genetics.2016；48：848-855

3.Gerlinger M，Rowan AJ，Horswell S，Math M，Larkin J，Endesfelder D，Gronroos E，Martinez P，Matthews N，Stewart A，Tarpey P，Varela I，Phillimore B，Begum S，McDonald NQ，Butler A，Jones D，Raine K，Latimer C，Santos CR，Nohadani M，Eklund AC，Spencer-Dene B，Clark G，Pickering L，Stamp G，Gore M，Szallasi Z，Downward J，Futreal PA，Swanton C.Intratumor heterogeneity and branchedevolution revealed by multiregion sequencing.The New England journal ofmedicine.2012；366：883-892

4.Lawrence MS，Stojanov P，Mermel CH，Robinson JT，Garraway LA，Golub TR，Meyerson M，Gabriel SB，Lander ES，Getz G.Discovery and saturation analysis ofcancer genes across 21 tumour types.Nature.2014；505：495-501

5.Vogelstein B，Papadopoulos N，Velculescu VE，Zhou S，Diaz LA，Jr.，Kinzler KW.Cancer genome landscapes.Science.2013；339：1546-1558

6.Zheng S，Cherniack AD，Dewal N，Moffitt RA，Danilova L，Murray BA，Lerario AM，Else T，Knijnenburg TA，Ciriello G，Kim S，Assie G，Morozova O，AkbaniR，Shih J.Hoadley KA，Choueiri TK，Waldmann J，Mete O，Robertson AG，Wu HT，RaphaelBJ，Shao L，Meyerson M，Demeure MJ，Beuschlein F，Gill AJ，Sidhu SB，Almeida MQ，Fragoso M，Cope LM，Kebebew E，Habra MA，Whitsett TG，Bussey KJ，Rainey WE，Asa SL，Bertherat J，Fassnacht M，Wheeler DA，Cancer Genome Atlas Research N，Hammer GD，Giordano TJ，Verhaak RGW.Comprehensive pan-genomic characterization ofadrenocortical carcinoma.Cancer cell.2016；29：723-736

7.Compagno M，Lim WK，Grunn A，Nandula SV，Brahmachary M，Shen Q，BertoniF，Ponzoni M，Scandurra M，Califano A，Bhagat G，Chadburn A，Dalla-Favera R，Pasqualucci L.Mutations of multiple genes cause deregulation of nf-kappab indiffuse large b-cell lymphoma.Nature.2009；459：717-721

实施例2.经历杂合性丧失的编码表达的细胞表面蛋白的种系等位基因的全基因组鉴定

简介：

如果iCAR的靶标仅由非肿瘤组织表达，则抑制性CAR-T细胞可以降低CAR-T疗法的脱肿瘤毒性，而不降低抗肿瘤功效。其中iCAR靶标仅由非肿瘤细胞表达的这种情况是：其中iCAR抗原由已在肿瘤细胞中缺失的基因组的一部分编码。工作流程的这个部分的目标是鉴定这样的等位基因。

等位基因鉴定：

我们使用外显子组整合联合(ExAC)数据库作为分析的输入(exac.broadinstitute.org)。ExAC数据库是来自各种人群水平测序研究的外显子组的汇编，总计60,706个外显子组¹。ExAC含有关于每个变体的信息，包括与替代等位基因相比的参考等位基因计数的数目(等位基因频率)。等位基因频率信息扩展到数据库中的亚群，如在表7中详细说明。

以下过滤器应用于ExAC数据库中的变体：i)变体必须影响编码的蛋白质的氨基酸组成；ii)变体必须在表6中的至少一个群体中具有大于0.05(5％)的次要等位基因频率。该分析纠正了次要等位基因的等位基因分数大于0.5(50％)的情况。如果在一个位点观察到多于三个等位基因，则使用最普遍的取代(这些位点通常是测序错误的位点，并且应该被谨慎解释)。

如果任何SNP产生以下任何变体类别，则将SNP视为对蛋白质组成有影响：“错义_变体”、“框内_缺失”、“开始_丧失”、“终止_得到”、“框内_插入”、“终止_保持_变体”、“移码_变体”、“终止_丧失”、“编码_序列_变体”、“蛋白质_改变_变体”。以9,362,319个变体开始分析，并且29,904个变体通过了这两个过滤器。这些变体落入10,302个基因。与这两个过滤器匹配的所有等位基因均被包括在该分析中。

表达的基因的鉴定：

我们使用基因型-组织表达(GTEX)数据库v6p(dbGaP登录号phs000424.v6.p1)来鉴定在各种组织类型中表达的基因(https://gtexportal.org/home/)²。GTEX数据库由来自多种健康组织类型的8,555个人样品的RNA测序组成。从这个数据库获得几个注释。首先，我们确定了每个基因跨所有组织的平均表达。通过取每组织的中值表达数据并计算跨组织的这些值的平均值来计算每个基因的平均表达。这些数据是从文件GTEx_Analysis_v6p_RNA-seq_RNA-SeQCv1.1.8_gene_median_rpkm.gct中获得的，其可在https://gtexportal.org/home/datasets获取。

还包括对应于每种肿瘤类型的每个基因的平均表达。为了获得这些数据，我们创建了肿瘤类型到对应正常组织的映射。例如，将用来自GTEX的胰腺组织注释胰腺癌TCGA数据。在一些情况下，映射更为近似。例如，胶质母细胞瘤表达数据的映射来自GTEX中注释为脑的所有组织。附有一个带有这些映射的表格(标题为tcga_disease_tissue_lookup.txt)。计算了几种量度来评估每种组织/肿瘤类型中每个基因的同质性或过表达。对于每种肿瘤类型，计算科恩氏D评分，以便建立该基因可能的过表达。在特定组织中过表达的基因可能是良好的aCAR靶标。相反，我们测量了跨组织的基因表达的标准偏差，并将其与跨所有组织的平均表达进行了比较。当这个比率低时，该基因在所有组织中均匀表达。在所有组织中均匀表达的基因可能是更好的iCAR靶标。

如果一个基因满足以下标准，则该基因被称作“普遍表达”：(i)跨组织的平均表达大于10RPKM。(ii)最少表达的组织的RPKM大于1。(iii)跨组织中值RPKM的标准偏差相比于平均RPKM之比小于1。只有1,092个基因被注释为普遍表达。

仅基于UniProt注释来选择候选物。对于跨膜蛋白，通常可以明确预测在细胞外的蛋白质区段。

表8呈现了通过上述方法鉴定的1167个良好候选基因的列表，所述候选基因具有根据染色体位置分选的细胞外多态性表位。当同样应用等位基因频率(AF)>10％和LOH>20％的过滤器时，有598个基因。参见图22。

等位基因注释

等位基因对蛋白质功能的影响：

对于仅有效识别丧失了膜蛋白的一个等位基因的癌细胞的iCAR，该蛋白质的结构将会基于被编码的等位基因而充分不同。采取了几种量度将每种SNP对生成的蛋白质的影响定量。首先，在“后果”列中报告了报告的SNP变体类别(例如，错义、无义)。在“蛋白质_后果”列(例如p.Arg482Gln)中包括对共有蛋白质翻译的影响。SIFT算法试图预测蛋白质变体是否将对蛋白质结构具有影响，并从而发挥作用⁶。评分的范围可以是从0(有害)到1(良性)。对于可获得评分的每个SNP，SIFT评分(版本sift5.2.2)均包括在内。例如，对于移码突变不可获得评分。还使用PolyPhen(v2.2.2)对变体可能影响蛋白质结构和功能的可能性做出预测。Polyphen算法以与SIFT相反的方式报告评分，评分0对应于良性，且评分1对应于有害。

引起结构改变的氨基酸取代概率的一种经典量度是使用BLOSUM62取代矩阵。我们从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ToolBox/C_DOC/lxr/source/data/BLOSUM62下载了BLOSUM62矩阵。将每个SNP用与其取代对应的BLOSUM62评分加以注释。

将等位基因分类为落入蛋白质的细胞外部分：

对于识别等位基因的iCAR，等位基因必须落在蛋白质的细胞外部分上。对于每个SNP，我们提取了在共有翻译中受影响的氨基酸的位置，并将其与在Uniprot数据库中注释为细胞外的结构域进行比较。Uniprot数据库是从www.uniprot.org/downloads下载的。由于缺乏对所有蛋白质结构域的表征，许多假阴性是可能的。1167个基因中共有3288个SNP被注释为细胞外(表8)。应用AF和LOH过滤器，在598个基因中有1306个SNP(表13)。

SNP的肽背景的注释：

当尝试生成识别这些序列的抗体时，被分析等位基因的肽背景可能很重要。作为参考，我们包括由SNP编码的氨基酸之前和侧翼的10个氨基酸(总共21个氨基酸序列)。将uniprot数据库用于共有氨基酸序列。我们注释了其中uniprot数据库序列与预测位置上任一SNP所编码的氨基酸不匹配的任何冲突，从而不包括任何错误序列。可以将这21个氨基酸序列用作B细胞表位预测程序(例如Beppred)的输入。

癌症特异性注释：

经历LOH的肿瘤的比例

寻找其肿瘤会受益于提出的疗法的患者将需要这样的iCAR靶标，所述iCAR靶标将是在大部分肿瘤中经历杂合性丧失(LOH)的SNP。从cbio癌症基因组学门户http://www.cbioportal.org/下载区段拷贝数文件⁸。作为实例，图12中显示了对于所有SNP经历LOH的葡萄膜黑素瘤肿瘤的比例。

在包含候选SNP的染色体上的潜在驱动基因改变

基因组靶向疗法的耐药性的一种可能机制是预期的基因组改变之一是否仅存在于一部分癌细胞中。试图鉴定可能在肿瘤发展的最早阶段存在的靶标的一种机制是鉴定每种肿瘤的驱动基因事件。肿瘤抑制基因失活的最频繁的机制是突变和随后的未突变染色体的LOH。我们试图找到驱动基因，特别是在每种肿瘤类型中可能经历这个过程的肿瘤抑制基因(TSG)。我们在此分析中使用了在所有肿瘤上运行的MUTSIG 2.0的结果，以鉴定在每种肿瘤类型中显著突变的基因。我们注释了显著突变的基因之一是否被包括在“标志”肿瘤抑制基因列表中，所述“标志”肿瘤抑制基因包括TP53、PTEN、APC、MLL3、MLL2、VHL、CDKN2A、RB1。最后，如果一系列驱动基因、TSG和“标志”TSG与SNP落在同一染色体上，则将它们注释到SNP上。

虽然随后经历LOH的驱动基因的突变是可以标记可能在肿瘤进化早期发生的事件的一种机制，但另一种机制是含有肿瘤抑制基因的基因组区段的局部缺失。我们使用GISTIC算法来鉴定以高于平均的比率经历基因组缺失的DNA区域。GISTIC算法鉴定沿染色体臂的具有统计显著性的“峰”，这表明在这些区域上存在负选择压力。对于每个SNP，我们记录了SNP落在的染色体上的缺失峰的数量。我们还记录了任何这些峰的最低q值。较低的q值表明较强的选择压力。

对候选SNP进行排名的累积评分：

为了给候选SNP提供连续“评分”，我们结合了应该与更好的SNP候选物相关联的几种不同的指标。评分由以下各项的百分等级的乘积组成：

1.具有在该SNP的LOH的肿瘤比例(越高越好)，2.等位基因的流行率(越高越好)，3.跨组织的表达值的标准偏差与中值的比率(越低越好，更一致)，4.染色体上是否有肿瘤抑制基因(有比没有好)。

为了说明这一点，我们将计算理论SNP的评分。如果仅32％的SNP在染色体上具有肿瘤抑制基因，则具有肿瘤抑制基因的百分等级将为0.68。如果等位基因具有的次要等位基因分数为0.49(其中0.5是最高可能值)，则百分等级将为0.99。如果LOH率为0.10，并且75％的SNP具有比这更多的LOH，则百分等级将为0.25。如果跨组织表达值的标准偏差与包含该SNP的基因的中值之比为1.3，且这优于90％的其他基因，则百分等级为0.9。那么该SNP的总评分将为0.68*0.99*0.25*0.9＝0.15。

具有大于0.4的评分的任何SNP都被认为是“等级命中”。

表8.示例性iCAR靶标

表9-应用AF和LOH过滤器之后的598个基因

实施例2的参考文献：

1.Lek M，Karczewski KJ，Minikel EV，Samocha KE，Banks E，Fennell T，O′Donnell-Luria AH，Ware JS，Hill AJ，Cummings BB，Tukiainen T，Bimbaum DP，KosmickiJA，Duncan LE，Estrada K，Zhao F，Zou J，Pierce-Hoffman E，Berghout J，Cooper DN，Deflaux N，DePristo M，Do R，Flannick J，Fromer M，Gauthier L，Goldstein J，Gupta N，Howrigan D，Kiezun A，Kurki MI，Moonshine AL，Natarajan P，Orozco L，Peloso GM，Poplin R，Rivas MA，Ruano-Rubio V，Rose SA，Ruderfer DM，Shakir K，Stenson PD，Stevens C，Thomas BP，Tiao G，Tusie-Luna MT，Weisburd B，Won HH，Yu D，Altshuler DM，Ardissino D，Boehnke M，Danesh J，Donnelly S，Elosua R，Florez JC，Gabriel SB，GetzG，Glatt SJ，Hultman CM，Kathiresan S，Laakso M，McCarroll S，McCarthy MI，McGovernD，McPherson R，Ncale BM，Palotie A，Purcell SM，Saleheen D，Scharf JM，Sklar P，Sullivan PF，Tuomilehto J，Tsuang MT，Watkins HC，Wilson JG，Daly MJ，MacArthur DG，Exome Aggregation C.Analysis of protein-coding genetic variation in 60，706humans.Nature.2016；536：285-291

2.Consortium GT.Human genomics.The genotype-tissue expression(gtex)pilot analysis：Multitissue gene regulation in humans.Science.2015；348：648-660

3.

6.Ng PC，Henikoff S.Sift：Predicting amino acid changes that affectprotein function.Nucleic acids research.2003；31：3812-3814

7.

8.Cerami E，Gao J，Dogrusoz U，Gross BE，Sumer SO，Aksoy BA，Jacobsen A，Byrne CJ，Heuer ML，Larsson E，Antipin Y，Reva B，Goldberg AP，Sander C，SchultzN.The cbio cancer genomics portal：An open platform for exploringmultidimensional cancer genomics data.Cancer discovery.2012；2：401-404

实施例3.用于验证KICH样品中HLA LOH的DNA测序分析

文库制备和测序

目的-基于计算机模拟分析，选择KICH癌症作为第一种肿瘤类型，用于HLA LOH预测的湿验证。目的是基于源自正常组织的DNA来鉴定每位患者的HLA基因型，并且然后分析癌症组织中的HLA同种异型，以试图鉴定HLA等位基因之一的丧失。

为此，确定了源自6个冷冻匹配的KICH样品(正常和癌症)RC-001-RC003、TNEABA1l、TNEABNWE、2rDFRAUB、2RDFRNQG、IOWT5AVJ、IOWT5N74的DNA的HLA同种异型。另外，还分析了两个DNA匹配的样品OG-001-OG-002(正常和癌症)。制备DNA文库，进行序列分析，以便鉴定样品的HLA分型。从6个冷冻匹配的KICH样品(正常和肿瘤)提取DNA，并按如下所述制备文库。

TruSight HLA测序文库是使用

HLA v2测序小组(Illumina,SanDiego,California,U.S.A.)在Genotypic Technology Pvt.Ltd.,Bangalore,India制备的。

简言之，使用TruSight HLA测序试剂盒中提供的引物生成HLA扩增子。在琼脂糖凝胶上确认扩增子，然后使用试剂盒中提供的Aample纯化珠提纯(cleanup)扩增子。通过标签化(Tagmentation)反应将扩增子归一化和片段化。标签化(Tagmentation)后，合并每个单独的样品的不同扩增子，并进行富集PCR。使用Nextera XT Index试剂盒v2(Illumina)在富集PCR期间对样品进行条形码编码。使用样品纯化珠纯化最终的PCR产物，然后对文库进行质量控制检查。使用Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)对文库进行定量，并在Agilent生物分析仪上分析其片段大小分布。

Illumina接头序列：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG

[i5,i7]-独特的双指标序列，用于鉴定样品特异性测序数据

下表描绘了上述样品的HLA基因型。

如下所示，我们可以根据分析推断丧失的等位基因，例如，患者#RC001表现出在肿瘤样品中的HLA-A30等位基因丧失，并成为HLA-32半合子；患者#RC003在肿瘤样品中丧失了HLA-1，并成为HLA-30半合子。鉴定出的丧失等位基因将决定每位患者的相关iCAR。在肿瘤样品被正常细胞污染的情况下，在此方法中会显示明显的HLA等位基因缺失。

表10：匹配的KICH样品的HLA基因型

x-无变体读段

外显子组测序

除了HLA测序外，我们还进行了外显子组测序以确认HLA-LOH并鉴定另外的跨基因组的LOH事件。

使用FastQC对Illumina配对末端原始读段(150X2，HiSeq)进行质量检查。通过Trim Galore软件处理Illumina原始读段，以使用最小读取长度50bp和最低碱基质量30的参数进行接头剪切和低质量碱基修整。使用Bowtie2将处理过的读段与人参考基因组(hg19)进行比对。然后处理每个样品的比对.bam文件，以获取最终的PCR重复去除的.bam文件，并使用Qualimap检查比对质量。

使用SAMtools和BCFtools鉴定变体。在这种情况下，进行联合基因分型以鉴定每对样品(正常和肿瘤的每个对)中的变体。因此，为每个对生成合并的.vcf。使用>20的读取深度阈值和>30的映射质量，从这些合并的.vcf文件中的每个文件鉴定出潜在的变体。根据过滤的合并的.vcf的每个对，生成有关样品的.vcf文件。使用Variant Studio，对过滤的变体进一步注释基因、蛋白质变化和变异影响。

下表描述了上述样品的染色体丧失程度。RC001、RC002和RC003表现出广泛的染色体(包括编码HLA基因的染色体6在内)的丧失，因此，对于这些样品，HLA可以用作iCAR靶标，另外，还有许多在染色体1、2、3、4(对于RC002)、5、6、8(对于RC003)、9(RC001，RC002)、10(RC001，RC003)、11(RC003)、13(RC001，RC003)、14(RC002)、17(RC001，RC003)、19(RC001)、21(RC001，RC003)、22(RC001，RC002)上编码的其他靶标。

表11：染色体丧失

Chr

RC001

RC002

RC003

OG001

OG002

2RD

IOW

TNE

1

++

2

++

+

++

+

3

++

+

4

++

5

++

6

++

+

++

+

7

8

++

9

++

10

++

11

++

12

+

13

++

14

+

15

+

16

17

++

18

19

++

20

21

++

22

++

+约50％的细胞的LOH(染色体丧失)

++几乎100％的细胞的LOH(染色体丧失)

对于RC001，图14描绘了与在染色体17上编码的肿瘤抑制蛋白TP53相邻的染色体区域的丢失。被鉴定为iCAR靶标的染色体17上编码的基因可用于治疗患者RC001。

缩写：ADP，二磷酸腺苷；ALL，急性淋巴细胞白血病；AML，急性髓细胞性白血病；APRIL，增殖诱导配体；BAFF，TNF家族的B细胞活化因子；BCMA，B细胞成熟抗原；BCR，B细胞受体；BM，骨髓；CAIX，碳酸酐酶IX；CAR，嵌合抗原受体；CEA，癌胚抗原；CLL，慢性淋巴细胞白血病；CNS，中枢神经系统；CSPG4，硫酸软骨素蛋白聚糖4；DC，树突细胞；ECM，细胞外基质；EGFR，表皮生长因子受体；EGFRvIII，EGFR的变体III；EphA2，产生促红细胞生成素的肝细胞癌A2；FAP，成纤维细胞活化蛋白；FR-α，叶酸受体-α；GBM，多形性胶质母细胞瘤；GPI，糖磷脂酰肌醇；H&N，头和颈；HL，霍奇金淋巴瘤；Ig，免疫球蛋白；L1-CAM，L1细胞粘附分子；MM，多发性骨髓瘤；NB，神经母细胞瘤；NF-KB，核因子-KB；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NK，自然杀伤细胞；NKG2D-L，NKG2D配体；PBMC，外周血单核细胞；PC，浆细胞；PLL，幼淋巴细胞白血病；PSCA，前列腺干细胞抗原；PSMA，前列腺特异性膜抗原；RCC，肾细胞癌；ROR1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1；TCL，T细胞白血病/淋巴瘤；Th2，辅助性T细胞2；TNBC，三阴性乳腺癌；TNFR，肿瘤坏死因子受体；VEGFR-2，血管内皮生长因子2。

参考文献：

Abecasis，G.R.，Altshuler，D.，Auton，A.，Brooks，L.D.，Durbin，R.M.，Gibbs，R.A.，Hurlcs，M.E.，and McVean，G.A.(2010).A map of human genome variation frompopulation-scale sequencing.Nature 467，1061-1073.

Abeyweera，T.P.，Merino，E.，and Huse，M.(2011).Inhibitory signalingblocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction innatural killer cells.J.Cell Biol.192，675-690.

Auton，A.，Abecasis，G.R.，Altshuler，D.M.，Durbin，R.M.，Bentley，D.R.，Chakravarti，A.，Clark，A.G.，Donnelly，P.，Eichler，E.E.，Flicek，P.，et al.(2015).Aglobal reference for human genetic variation.Nature 526，68-74.

Barbas，Carlos F.，Dennis R.Burton，Jamie K.Scott，G.J.S.2004.Phagedisplay：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Bausch-Fluck，D.，Hofmann，A.，Bock，T.，Frei，A.P.，Cerciello，F.，Jacobs，A.，Moest，H.，Omasits，U.，Gundry，R.L.，Yoon，C.，et al.(2015).A mass spectromctric-derived cell surface protein atlas.PLoS One 10.

Bayle，J.H.，Grimley，J.S.，Stankunas，K.，Gestwicki，J.E.，Wandless，T.J.，andCrabtree，G.R.(2006).Rapamycin analogs with differential binding specificitypermit orthogonal control of protein activity.Chem.Biol.13，99-107.

Bergbold，N.，and Lemberg，M.K.(2013).Emerging role of rhomboid familyproteins in mammalian biology and disease.Biochim.Biophys.Acta 1828，2840-2848.

Blankenstein，T.，Leisegang，M.，Uckert，W.，and Schreiber，H.(2015).Targeting cancer-specific mutations by T cell receptor genetherapy.Curr.Opin.Immunol.33，112-119.

Boczkowski，D.，S.K.Nair，J.H.Nam，H.K.Lyerly，and E.Gilboa.2000.Inductionof tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cellstransfected with messenger RNA amplified from tumor cells.Cancer Res 60：1028-34.

Barrett，M.T.，Sanchez，C.A.，Prevo，Burrell，R.A.，McGranahan，N.，Bartek，J.，and Swanton，C.(2013).The causes and consequences of genetic heterogeneity incancer evolution.Nature 501，338-345.

Van Buuren，M.M.，Calis，J.J.A.，and Schumacher，T.N.M.(2014).Highsensitivity of cancer exome-based CD8 T cell neo-antigenidentification.Oncoimmunology 3.

Caeseu，C.I.，Jesehke，G.R.，and Turk，B.E.(2009).Active-site determinantsof substrate recognition by the metalloproteinases TACE andADAM10.Biochem.J.424，79-88.

Camey，W.P.，Petit，D.，Hamer，P.，Der，C.J.，Finkel，T.，Cooper，G.M.，Lefebvre，M.，Mobtaker，H.，Delellis，R.，and Tischler，A.S.(1986).Monoclonal antibodyspecific for an activated RAS protein.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，7485-7489.

Cerami E，et al.The cbio cancer genomics portal：An open platform forexploring multidimensional cancer genomics data.Cancer discover.2012；2：401-404.

Chao，G.，W.L.Lau，B.J.Hackel，S.L.Sazinsky，S.M.Lippow，andK.D.Wittrup.2006.Isolating and engineering human antibodies using yeastsurface display.Nat.Protoc.1.

Chess，A.(2012).Mechanisms and consequences of widespread randommonoallelic expression.Nat.Rev.Genet.13，421-428.

Chieaybam，L.，and Bonamino，M.H.(2014).Abstract 2797：Construction andvalidation of an activating and inhibitory chimerie antigen receptor(CAR)system.Cancer Res.74，2797-2797.

Chicaybam，L.，and Bonamino，M.H.(2015).Abstract 3156：Construction andvalidation of an activating and inhibitory chimeric antigen receptor(CAR)system.Cancer Res.75，3156-3156.

Consortium GT.Human genomics.The genotype-tissue expression(gtex)pilot analysis：Multitissue gene regulation in humans.Science.2015；348：648-660.

Da Cunha，J.P.C.，Galante，P.A.F.，De Souza，J.E.，De Souza，R.F.，Carvalho，P.M.，Ohara，D.T.，Moura，R.P.，Oba-Shinja，S.M.，Marie，S.K.N.，Silva Jr.，W.A.，et al.(2009).Bioinformatics construction of the human cell surfaceome.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106，16752-16757.

Devilee，P.，Cleton-Jansen，A.-M.，and Comelisse，C.J.(2001).Ever sinceKnudson.Trends Genet.17，569-573.

Dotti，G.，Gottschalk，S.，Savoldo，B.，and Brenner，M.K.(2014).Design anddevelopment of therapies using chimeric antigen receptor-expressing Tcells.Immunol.Rev.257，107-126.

Ebsen，H.，

A.，Kabelitz，D.，and Janssen，O.(2013).Differentialsurface expression of ADAM10 and ADAM17 on human T lympho cytes and tumorcells.PLoS One 8，e76853.

Eriksson，M.，Leitz，G.，

E.，Axner，O.，Ryan，J.C.，Nakamura，M.C.，andSentman，C.L.(1999).Inhibitory receptors alter natural killer cellinteractions with target cells yet allow simultaneous killing of susceptibletargets.J.Exp.Med.190，1005-1012.

Fedorov，V.D.，Themeli，M.，and Sadelain，M.(2013a).PD-1-and CTLA-4-basedinhibitory chimeric antigen receptors(iCARs)divert off-target immunotherapyresponses.Sci.Transl.Med.5，215ra172.

Fedorov，V.D.，Themeli，M.，and Sadelain，M.(2013b).PD-l-and CTLA-4-basedinhibitory chimeric antigen receptors(iCARs)divert off-target immunotherapyresponses.In Science Translational Medicine，(Affiliation：Center for CellEngineering，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)，New York，NY 10065，United States；Affiliation：Tri-Institutional MSTP Program(MSKCC，RockefellerUniversity，Weill-Comell Medical College)，New York，NY 10065，Un)，.

Feenstra，M.，Veltkamp，M.，van Kuik，J.，Wiertsema，S.，Slootweg，P.，van denTweel，J.，de Weger，R.，and Tilanus，M.(1999).HLA class 1 expression andchromosomal deletions at 6p and 15q in head and neck squamous cellcarcinomas.Tissue Antigens 54，235-245.

Gao J.et al，Integrative analysis of complex cancer genomics andclinical profiles using the cBio Portal.Sci Signal.20132；6(269)

Gill，S.，and June，C.H.(2015).Going viral：chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies.Immunol.Rev.263，68-89.

Gordon，W.R.，Zimmerman，B.，He，L.，Miles，L.J.，Huang，J.，Tiyanont，K.，McArthur，D.G.，Aster，J.C.，Perrimon，N.，Loparo，J.J.，et al.(2015).MechanicalAllostery：Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation ofNotch.Dev.Cell 33，729-736.

Graef，I.A.，Holsinger，L.J.，Diver，S.，Schreiber，S.L.，and Crabtree，G.R.(1997).Proximity and orientation underlie signaling by the non-receptortyrosine kinase ZAP70.EMBO J.16，5618-5628.

Gross，G.，and Eshhar，Z.(2016a).Therapeutic Potential of T-CellChimeric Antigen Receptors in Cancer Treatment：Counteracting Off-TumorToxicities for Safe CAR T-Cell Therapy.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2016.56：59-83.

Gross，G.，and Eshhar，Z.(2016b).Therapeutic Potential of T CellChimeric Antigen Receptors(CARs)in Cancer Treatment：Counteracting Off-TumorToxicities for Safe CAR T Cell Therapy.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56，59-83.

Gross，G.，Waks，T.，and Eshhar，Z.(1989).Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-typespecificity.Proc Natl Acad Sci U S A 86，10024-10028.

Haapasalo，A.，and Kovacs，D.M.(2011).The many substrates of presenilin/y-secretase.J.Alzheimers.Dis.25，3-28.

Hanes，J.，and A.Plückthun.1997.In vitro selection and evolution offunctional proteins by using ribosome display.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94.

Heemskerk，B.，Kvistborg，P.，and Schumacher，T.N.M.(2013).The cancerantigenome.EMBO J.32，194-203.

Hemming，M.L.，Elias，J.E.，Gygi，S.P.，and Selkoe，D.J.(2009).Identification of beta-secretase(BACE1)substrates using quantitativeproteomics.PLoS Orne 4，e8477.

Huse，M.，Catherine Milanoski，S.，and Abeyweera，T.P.(2013).Buildingtolerance by dismantling synapses：inhibitory receptor signaling in naturalkiller cells.Immunol.Rev.251，143-153.

Jiménez，P.，Cantón，J.，Collado，A.，Cabrera，T.，Serrano，A.，Real，L.M.，García，A.，Ruiz-Cabello，F.，and Garrido，F.(1999).Chromosome loss is the mostfrequent mechanism contributing to HLA haplotype loss in humantumors.Int.J.Cancer 83，91-97.

Klebanoff，C.A.，Rosenberg，S.A.，and Restifo，N.P.(2016).Prospects forgene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers.Nat.Med.22，26-36.

Kloss，C.C.，Condomines，M.，Cartellieri，M.，Bachmann，M.，and Sadelain，M.(2013).Combinatorial antigen recognition with balanced signaling promotesselective tumor eradication by engineered T cells.Nat.Biotechnol.31，71-75.

Knudson Jr.，A.G.(1971).Mutation and cancer：statistical study of retinoblastoma.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.68，820-823.

Lanitis，E.，Poussin，M.，Klattenhoff，A.W.，Song，D.，Sandaltzopoulos，R.，June，C.H.，and Powell Jr，D.J.(2013).Chimeric antigen receptor T cells withdissociated signaling domains exhibit focused anti-tumor activity withreduced potential for toxicity.Cancer Immunol.Res.1，10.1158/2326-6066.CIR-13-0008.

Lawrence，M.S.，Stojanov，P.，Polak，P.，Kryukov，G.V，Cibulskis，K.，Sivachenko，A.，Carter，S.L.，Stewart，C.，Mermel，C.H.，Roberts，S.A.，et al.(2013).Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associatedgenes.Nature 499，214-218.

Lee，A.，Rana，B.K.，Schiffer，H.H.，Schork，N.J.，Brann，M.R.，Insel，P.A.，andWeiner，D.M.(2003).Distribution analysis of nonsynonymous polymorphisms withinthe G-protein-coupled receptor gene family.Genomics 81，245-248.

Lek M，et al.，Exome Aggregation C.Analysis of protein-coding geneticvariation in 60，706humans.Nature.2016；536：285-291.

Lengauer，C.，Kinzler，K.W.，and Vogelstein，B.(1998).Geneticinstabilities in human cancers.Nature 396，643-649.

Li，H.，Yang，B.，Xing，K.，Yuan，N.，Wang，B.，Chen，Z.，He，W.，and Zhou，J.(2014).A preliminary study of the relationship between breast cancermetastasis and loss of heterozygosity by using exome sequencing.Sci.Rep.4.

Liberlos，S.D.，Diver，S.T.，Austin，D.J.，and Schreiber，S.L.(1997).Inducible gene expression and protein translocation using nontoxic ligandsidentified by a mammalian three-hybrid screen.Proc.Natl.Acad.Sci.94，7825-7830.

Lindblad-Toh，K.，Tanenbaum，D.M.，Daly，M.J.，Winchester，E.，Lui，W.-O.，Villapakkam，A.，Stanton，S.E.，Larsson，C.，Hudson，T.J.，Johnson，B.E.，et al.(2000).Loss-of-heterozygosity analysis of small-cell lung carcinomas using single-nucleotide polymorphism arrays.Nat.Biotechnol.18，1001-1005.

Lo，K.C.，Bailey，D.，Brukhardt，T.，Gardina，P.，Turpaz，Y.，and Cowell，J.K.(2008).Comprehensive analysis of loss of heterozygosity events inglioblastoma using the 100K SNP mapping arrays and comparison with copynumber abnormalities defined by BAC array comparative genomichybridizatiou.Genes Chromosom.Cancer 47，221-237.

Long，E.O.，Sik Kim，H.，Liu，D.，Peterson，M.E.，and Rajagopalan，S.(2013).Controlling natural killer cell responses：Integration of signals foractivation and inhibition.Annu.Rev.Immunol.31，227-258.

Maleno，I.，López-Nevot，M.A.，Cabrera，T.，Salinero，J.，and Garrido，F.(2002).Multiple mechanisms generate HLA class I altered phenotypes inlaryngeal carcinomas：high frequency of HLA haplotype loss associated withloss of heterozygosity in chromosome region 6p21.CancerImmunol.Immunother.51，389-396.

Maleno，I.，Cabrera，C.M.，Cabrera，T.，Pace，L.，López-Nevot，M.A.，Collado，A.，Ferrón，A.，and Garrido，F.(2004).Distribution of HLA class I alteredphenotypes in colorectal carcinomas：high frequency of HLA haplotype lossassociated with loss of heterozygosity in chromosome region6p21.Immunogenetics 56，244-253.

Maleno，I.，Romero，J.M.，Cabrera，T.，Paco，L.，Aptsiauri，N.，Cozar，J.M.，Tallada，M.，López-Nevot，M.A.，and Garrido，F.(2006).LOH at 6p21.3 region and HLAclass I altered phenotypes in bladder carcinomas.Immunogenetics 58，503-510.

Maleno，I.，Aptsiauri，N.，Cabrera，T.，Gallego，A.，Paschen，A.，López-Nevot，M.A.，and Garrido，F.(2011).Frequent loss of heterozygosity in theβ2-microglobulin region of chromosome 15 in primary human tumors.Immunogenetics63，65-71.

McGranahan，N.，Burrell，R.A..Endesfelder，D.，Novelli，M.R.，and Swanton，C.(2012).Cancer chromosomal instability：Therapeutic and diagnosticchallenges.EMBO Rep.13，528-538.

Morsut，L.，Roybal，K.T.，Xiong，X.，Gordley，R.M.，Coyle，S.M.，Thomson，M.，andLim，W.A.(2016).Engineering Customized Cell Sensing and Response BehaviorsUsing Synthetic Notch Receptors.Cell 164，780-791.

Ng PC，Henikoff S.Sift：Predicting anino acid changes that affectprotein function.Nucleic acids research.2003；31：3812-3814.

Nirschl，C.J.，and Drake，C.G.(2013).Molecular pathways：Coexpression ofimmune checkpoint molecules：Signaling pathways and implications for cancerimmunotherapy.Clin.Cancer Res.19，4917-4924.

O’Keefe，C.，McDevitt，M.A.，and Maciejewski，J.P.(2010).Copy neutral lossof heterozygosity：A novel chromosomal lesion in myeloid malignancies.Blood115，2731-2739.

Ohgaki，H.，Dessen，P.，Jourde，B.，Horstmann，S.，Nishikawa，T.，Di Patre，P.-L.，Burkhard，C.，Schüer，D.，Probst-Hensch，N.M.，Maiorka，P.C.，et al.(2004).Geneticpathways to glioblastoma：a population-based study.Cancer Res.64，6892-6899.

Overwijk，W.W.，Wang，E.，Marincola，F.M.，Rammensee，H.G.，and Restifo，N.P.(2013).Mining the mutanome：developing highly personalized Immunotherapiesbased on mutational analysis of tumors.J.Immunother.Cancer 1，11.

Rana，B.K.，Shiina，T.，and Insel，P.A.(2001).Genetic variations andpolymorphisms of G protein-coupled receptors：functional and therapeutic implications.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41，593-624.

Rawson，R.B.(2013).The site-2 protease.Biochim.Biophys.Acta 1828，2801-2807.

Rosenberg，S.A.(2014).Finding suitable targets is the major obstacleto cancer gene therapy.Cancer Gene Ther.21，45-47.

Rosenberg，S.A.，and Restifo，N.P.(2015).Adoptive cell transfer aspersonalized immunotherapy for human cancer.Science 348，62-68.

Roybal，K.T.，Rupp，L.J.，Morsut，L.，Walker，W.J.，McNally，K.A.，Park，J.S.，and Lim，W.A.(2016a).Precision Tumor Recognition by T Cells With CombinatorialAntigen-Sensing Circuits.Cell.

Roybal，K.T.，Rupp，L.J.，Morsut，L.，Walker，W.J.，McNaily，K.A.，Park，J.S.，and Lim，W.A.(2016b).Precision Tumor Recognition by T Cells With CombinatorialAntigen-Sensing Circuits.Cell 164，770-779.

Sathirapongsasuti，J.F.，Lee，H.，Horst，B.A.J.，Brunner，G.，Cochran，A.J.，Binder，S.，Quackenbush，J.，and Nelson，S.F.(2011).Exome sequencing-based copy-number variation and loss of heterozygosity detection：ExomeCNV.Bioinformaties27，2648-2654.

Savage，P.A.(2014).Tumor antigenicity revealed.Trends Immunol.35，47-48.

Savova，V.，Chun，S.，Sohail，M.，McCole，R.B.，Witwicki，R.，Gai，L.，Lenz，T.L.，Wu，C.-T.，Sunyaev，S.R.，and Gimelbrant，A.A.(2016).Genes with monoallelicexpression contribute disproportionately to genetic diversity inhumans.Nat.Genet.48，231-237.

Schumacher，T.N.，and Schreiber，R.D.(2015).Neoantigens in cancerimmunotherapy.Science(80-.).348，69-74.

Sela-Culang，I.，Y.Ofran，and B.Peters.2015a Antibody specific epitopeprediction-Emergence of a new paradigm.Curr.Opin.Virol.11.

Sela-Culang，I.，S.Ashkenazi，B.Peters，and Y.Ofran.2015b.PEASE：Predicting B-cell epitopes utilizing antibody sequence.Bioinformatics 31.

Skora，A.D.，Douglass，J.，Hwang，M.S.，Tam，A.J.，Blosser，R.L.，Gabelli，S.B.，Cao，J.，Diaz，L.A.，Papadopoulos，N.，Kinzler，K.W.，et al.(2015).Generation ofMANAbodies specific to HLA-restricted epitopes encoded by somatically mutatedgenes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112，9967-9972.

Stark，M.，and Hayward，N.(2007).Genome-wide loss of heterozygosity andcopy number analy sis in melanoma using high-density single-nucleotidepolymorphism arrays.Cancer Res.67，2632-2642.

Stark，S.E.，and Caton，A.J.(1991).Antibodies that are specific for asingle amino acid interchange in a protein epitope use structurally distinctvariable regions.J.Exp.Med.174，613-624.

Teo，S.M.，Pawitan，Y.，Ku，C.S.，Chia，K.S.，and Salim，A.(2012).Statisticalchallenges associated with detecting copy number variations with next-generation sequencing.Bioinformatics 28，2711-2718.

Thul PJ，et al.A subcellular map of the human proteome.Science.2017；356.

Treanor，B.，Lanigan，P.M.P.，Kumar，S.，Dunsby，C.，Munro，I.，Auksorius，E.，Culley，F.J.，Purbhoo，M.A.，Phillips，D.，Neil，M.A.A.，et al.(2006).Microclustersof inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killercell immunological synapses.J.Cell Biol.174，153-161.

Uhlen M，et al.Tissue-based map of the human proteome.Science.2015；347：1260419.

Vogelstein，B.，Fearon，E.R.，Kern，S.E.，Haamilton，S.R.，Preisinger，A.C.，Nakamura，Y.，and White，R.(1989).Allelotype of colorectal carcinomas.Science(80-.).244，207-211.

Vogelstein，B.，Papadopoulos，N.，Velculescu，V.E.，Zhou，S.，Diaz Jr.，L.A.，and Kinzler，K.W.(2013).Cancer genome landscapes.Science(80-.).340，1546-1558.

Voss，M.，

B.，and Fluhrer，R.(2013).Mechanism，specificity，andphysiology of signal peptide peptidase(SPP)and SPP-likeproteases.Biochim.Biophys.Acta 1828，2828-2839.

Vyas，Y.M.，Mehta，K.M.，Morgan，M.，Maniar，H.，Burros，L.，Jung，S.，Burkhardt，J.K.，and Dupont，B.(2001).Spatial organization of signal transductionmolecules in the NK cell immune synapses during MHC class I-regulatednoncytolytic and cytolytic interactions.J.Immunol.167，4358-4367.

Wang，Z.C.，Lin，M.，Wei，L.-J.，Li，C.，Miron，A.，Lodeiro，G.，Harris，L.，Ramaswamy，S.，Tanenbaum，D.M.，Meyerson，M.，et al.(2004).Loss of heterozygosityand its correlation with expression profiles in subclasses of invasive breastcancers.Cancer Res.64，64-71.

Wilkie，S.，Van Schalkwyk，M.C.I.，Hobbs，S.，Davies，D.M.，Van，D.S.，Pereira，A C.P.，Burbridge，S.E.，Box，C.，Eccles，S，A.，and Maher，J.(2012).Dual tapeting ofErbB2 and MUC in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered toprovide complementary signaling.J.Clin.Immunol.32，1059-1070.

Wu，C.-Y.，Roybal，K.T.，Puchner，E.M.，Onuffer，J.，and Lim，W.A.(2015).Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gatedchimeric receptor.Science(80-.).350，aab4077.

Yeung，J.T.，Hamilton，R.L.，Ohnishi，K.，Ikeura，M.，Potter，D.M.，Nikiforova，M.N.，Ferrone，S.，Jakacki，R.I.，Pollack，I.F.，and Okada，H.(2013).LOH in the HLAclass I region at 6p21 is associated with shorter survival in newly diagnosedadult glioblastoma.Clin.Cancer Res.19，1816-1826.

实施例4.在蛋白质水平的LOH验证

通过使用等位基因特异性抗体进行正常细胞与肿瘤细胞样品的差异染色，可以在蛋白质水平上检测LOH。例如，可以使用对患者的HLA同种异型特异的商业HLA抗体来进行癌症样品中HLA-LOH的验证。下表12详述了可以使用的可获得的等位基因特异性抗体的实例。

如以下IHC方案中所述进行样品的免疫组织化学(IHC)染色。

表12：等位基因特异性抗HLA抗体

IHC方案

冷冻的组织样品-

通常将冷冻的组织固定在基于福尔马林的溶液中，并包埋在OCT(最佳切割温度化合物)中，使得能够进行样品的冷冻切片。将OCT中的组织在-80oC下保持冷冻。切片前，将冷冻块从-80oC中取出，在低温恒温器腔室中平衡，然后切成薄片(通常5-15μm厚)。将切片在组织学载玻片上封片。可将载玻片储存在-20oC至-80oC下。在IHC染色之前，将载玻片在室温(RT)下解冻10-20min。

石蜡包埋的组织-

将组织包埋在甲醛固定液中。在添加石蜡之前，通过在RT下以特定的次数和持续时间逐步浸入渐增浓度的乙醇(70％、90％、100％)和二甲苯中使组织脱水。然后，将组织包埋在石蜡中。

将石蜡包埋的组织在切片机中切成5-15μm厚的切片，漂浮在56oC水浴中，并在组织载玻片上封片。可以在RT下保持载玻片。

在IHC染色之前，石蜡包埋的切片需要复水步骤。复水-通过浸入二甲苯中(2X10min)，然后降低乙醇浓度(100％X 2，每次10min，95％乙醇-5min，70％乙醇-5min，50％乙醇-5min)在dH2O中冲洗，从而将切片复水。

免疫荧光检测：

方案：

1.在洗涤缓冲液(PBSX1)中将载玻片复水10min。沥干洗涤缓冲液。

2.进行抗原修复-如果需要(热诱导抗原修复或酶促修复)。

3.对于细胞内抗原，进行透化-将载玻片在PBSX1中的0.1％triton X-100中在RT下孵育10min。

4.封闭-将组织在封闭缓冲液中在RT下封闭30min。封闭缓冲液取决于检测方法，通常为在PBSX1中的5％动物血清或在PBSX1中的1％BSA

5.一抗-根据抗体制造商的说明，在孵育缓冲液(例如，1％BSA，在PBS中的1％驴血清，其他孵育缓冲液也可以使用)中稀释一抗。将组织在稀释的一抗中在4oC下孵育过夜。一抗可以是如上文详述的单克隆抗HLA-A、抗HLA-B或抗HLA-C等位基因特异性抗体。

·如果使用了缀合的一抗，则避光，然后继续执行步骤8。

·作为阴性对照，仅用孵育缓冲液孵育组织，不使用一抗。

·另外，对实验中使用的单克隆抗体进行同种型匹配的对照。

·

6.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3X 5-15min。

7.二抗-根据抗体制造商的说明在孵育缓冲液中稀释二抗。将组织在稀释的二抗中在RT下孵育30-60min。避光。

8.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3X 5-15min。

9.DAPI染色-稀释DAPI孵育缓冲液(～300nM-3μM)。向每个切片加入300μl的DAPI溶液。在RT下孵育5-10min。

10.洗涤-用X1PBS洗涤载玻片一次。

11.用抗褪色封固剂进行封片。

12.保持载玻片避光。

13.使用荧光显微镜将载玻片可视化。

显色检测：

方案：

2.进行抗原修复-如果需要-参见上文。

3.对于HRP试剂，用甲醇中的3.0％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性至少15min。

4.通过将切片浸入dH2O中5min来洗涤切片。

5.对于细胞内抗原，进行透化-将载玻片在PBSX1中的0.1％triton X-100中在RT下孵育10min。

6.封闭-将组织在封闭缓冲液中在RT下封闭30min。封闭缓冲液取决于检测方法，通常为在PBSX1中的5％动物血清或在PBSX1中的1％BSA。

7.一抗-根据抗体制造商的说明，在孵育缓冲液(例如，1％BSA，在PBS中的1％驴血清，其他孵育缓冲液也可以使用)中稀释一抗。将组织在稀释的一抗中在4℃下孵育过夜。

8.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3X 5-15min。

9.二抗-将组织在HRP缀合的二抗中在RT下孵育30-60min。

10.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片3X 5-15min。

11.根据制造商指南添加ABC-HRP试剂。在RT下孵育60min。

12.根据制造商指南制备DAB溶液(或其他色原)，并应用于组织切片。显色反应使表位位点转变成褐色(通常几秒钟-10分钟)。当信号强度适合成像时，继续下一个步骤。

13.洗涤-在洗涤缓冲液中洗涤载玻片-3X 5-15min。

14.在dH2O中洗涤载玻片-2X 5-15min。

15.核染色-加入苏木精溶液。在RT下孵育5min。

16.使组织切片脱水-95％乙醇-2X 2min。100％乙醇-2X 2min。二甲苯-2X 2min。

17.用抗褪色封固剂进行封片

18.使用明场照明将载玻片可视化。

实施例5.CAR-T的设计和构建

研究目的是创建一种将抑制CAR-T疗法的中靶“脱肿瘤”效应的合成受体。在此程度上，建立了由活化性和抑制性CAR组成的CAR构建体文库。

第一组构建体包含针对HLA I型序列(HLA-A2)的抑制性CAR和针对肿瘤抗原(CD19、EGFR或HER2)的活化性CAR。为了概念证明的目的而使用的下一组构建体包含针对CD19、EGFR或HER2的活化性CAR序列和针对CD20的抑制性CAR序列。将构建针对通过未来生物信息学分析鉴定的靶抗原的其他构建体。将根据提出的标准(示例性标准包含但不限于靶标表达模式、靶标表达水平、抗原性等)对靶标候选物进行优先排序。

设计iCAR构建体并使用商业DNA合成进行iCAR构建体的合成。将PD-1的跨膜结构域和细胞内结构域直至第一个注释的细胞外结构域(氨基酸145-288)融合至HLA-A2 scFv(编码HLA-A2的DNA序列，从杂交瘤BB7.2中检索到(ATCC目录号：HB-82)，产生抗HLA-A2)下游。

将设计具有CTLA4(氨基酸161-223)或具有源自另外的负免疫调节剂(例如2B4、LAG-3和BTLA-4)的其他序列的构建体，并将其信号传导序列融合至HLA-A2 scFv下游。

对于iCAR检测和分选，通过IRES序列将报告基因(例如，eGFP)整合至iCAR序列下游，并且随后是被P2A序列分开的抗生素抗性基因(即，潮霉素)，如图15中展示。

对于aCAR构建体，将CD19 scFV、EGFR scFV或HER2 scFV与第二代CAR构建体融合，所述第二代CAR构建体由CD8铰链序列、随后的CD28跨膜和41BB共刺激1和CD3ζ组成。还将设计和构建由其他信号传导或结构元件(例如CD28铰链、CD28信号传导结构域或CD28和41BB信号传导结构域两者)组成的另外的aCAR构建体。对于aCAR检测和分选，通过IRES序列将报告基因RFP整合到aCAR序列下游，随后是被P2A序列分开的抗生素抗性基因(嘌呤霉素抗性)(图15)。

将aCAR和iCAR序列两者克隆到慢病毒转移载体中，然后使用HEK-293T包装细胞将其用于病毒颗粒生产。

为了确保iCAR蛋白在每个转导的T细胞表面上表达，将产生编码iCAR和aCAR两者的双顺反子病毒构建体。优选地，将在IRES序列上游编码iCAR序列。将通过将iCAR和aCAR克隆到IRES上游或下游来测试表达水平的差异，并通过RT qPCR和FACS测量表达水平。另外，还将测试实现双顺反子表达的2A序列，并确定这些序列上游和下游的基因的表达水平。如上所述，将使用病毒载体来生成病毒颗粒。

可以通过RNA电穿孔将aCAR和iCAR序列引入到PBMC中。为此，将aCAR和iCAR序列两者都亚克隆到pGEM-4Z载体中，使得能够实现mRNA体外转录。将CD19 aCAR和HLA-A2 iCARmRNA进一步电穿孔到PBMC中。将EGFR aCAR和HLA-A2 iCAR mRNA进一步电穿孔到PBMC中。将HER2 aCAR和HLA-A2 iCAR mRNA进一步电穿孔到PBMC中。

为了生成编码iCAR和aCAR两者的双顺反子转录物，设计并合成了另外的构建体，并将DNA序列克隆到能够实现体外转录的克隆载体中。这两个CAR序列被IRES(载体IDPL93)或P2A(载体ID PL96)分开。另外，还制备了缺乏抑制性信号结构域的对照iCAR序列(载体ID PL65，PL94)。为了进一步优化CAR，还根据图50A和图50B设计了由以下元件组成的另外的构建体：信号肽、scFv、铰链、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

将所有序列克隆到pGEM-4Z中，将转录的mRNA进行比较，随后将其电穿孔到pBMC中，并在与靶细胞和脱肿瘤细胞共培养后进行分析。

除了上面列出的不同iCAR构建体之外，还合成了具有CD28和CD3ζ信号传导结构域的CD19 aCAR，并将其亚克隆到pGEM-4z(载体ID PL95)中。

除了上面列出的不同iCAR构建体之外，将合成具有CD28和CD3ζ信号传导结构域的EGFR aCAR，并将其亚克隆到pGEM-4z中。

除了上面列出的不同iCAR构建体之外，将合成具有CD28和CD3ζ信号传导结构域的HER2 aCAR，并将其亚克隆到pGEM-4z中。

下面包括已制备的各种iCAR和aCAR序列：

SEQ ID NO:11

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

CTLA4(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1074

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGCATCGGCAACGGCACCCAAATCTACGTGATCGACCCAGAGCCCTGCCCTGACAGCGATTTCCTGCTGTGGATTCTGGCCGCCGTGAGCAGCGGCCTGTTCTTTTATTCCTTTCTGCTGACCGCCGTGTCTCTGAGCAAGATGCTGAAGAAGCGGTCTCCTCTGACCACAGGCGTGGGCGTGAAGATGCCCCCTACAGAGCCCGAGTGTGAGAAGCAGTTCCAGCCATACTTTATCCCCATCAATTGA

SEQ ID NO:12

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

LAG-3(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,143

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCTGGGCGCCGCCGTGTACTTCACCGAGCTGAGCAGCCCTGGCGCCCAGCGGTCCGGCAGGGCCCCAGGCGCCCTGCCTGCCGGCCACCTGCTGCTGTTTCTGATCCTGGGCGTGCTGTCTCTGCTGCTGCTGGTGACAGGCGCCTTCGGCTTTCACCTGTGGCGGAGACAGTGGCGGCCCAGGCGCTTCTCTGCCCTGGAGCAGGGCATCCACCCACCTCAGGCACAGAGCAAGATCGAGGAGCTGGAGCAGGAGCCAGAGCCAGAGCCTGAACCTGAGCCAGAGCCTGAACCCGAGCCAGAGCCTGAGCAGCTGTGA

SEQ ID NO:13

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

2B4(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,269

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGAGTTCCGGTTTTGGCCCTTCCTGGTCATCATCGTGATCCTGTCTGCCCTGTTCCTGGGCACCCTGGCCTGCTTTTGCGTGTGGCGGAGAAAGCGGAAGGAGAAGCAGAGCGAGACCTCCCCCAAGGAGTTCCTGACAATCTACGAGGACGTGAAGGATCTGAAGACAAGGCGCAACCACGAGCAGGAGCAGACCTTTCCTGGCGGCGGCTCTACAATCTATAGCATGATCCAGTCCCAGAGCAGCGCCCCCACCAGCCAGGAGCCTGCCTACACACTGTATTCTCTGATCCAGCCTAGCAGAAAGTCTGGCAGCCGGAAGAGAAACCACTCCCCATCTTTCAATTCCACCATCTACGAAGTGATCGGCAAGTCTCAGCCAAAGGCACAGAACCCAGCAAGGCTGAGCCGCAAGGAGCTGGAGAATTTTGACGTGTATTCCTGA

SEQ ID NO:14

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

BTLA(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,293

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGATGTGAAGAGCGCCTCCGAGAGACCTTCTAAGGACGAGATGGCCAGCCGGCCATGGCTGCTGTACAGACTGCTGCCACTGGGAGGACTGCCTCTGCTGATCACCACATGCTTCTGTCTGTTTTGCTGTCTGCGGAGACACCAGGGCAAGCAGAACGAGCTGTCCGATACCGCCGGCAGGGAGATCAATCTGGTGGACGCCCACCTGAAGTCTGAGCAGACCGAGGCCAGCACACGCCAGAACTCCCAGGTGCTGCTGTCTGAGACAGGCATCTACGACAATGATCCCGACCTGTGCTTCCGGATGCAGGAGGGCTCTGAGGTGTACAGCAACCCATGTCTGGAGGAGAATAAGCCCGGCATCGTGTATGCCTCCCTGAACCACTCTGTGATCGGACCCAACTCCAGGCTGGCCAGGAATGTGAAGGAGGCCCCTACCGAGTATGCCAGCATCTGCGTGCGGTCCTGA

SEQ ID NO:15

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

KIR2DL2(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,185

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGTCTCCAACCGAGCCCAGCTCCAAGACAGGCAACCCAAGGCACCTGCACATCCTGATCGGCACCAGCGTGGTCATCATCCTGTTCATCCTGCTGTTCTTTCTGCTGCACCGCTGGTGCAGCAACAAGAAGAATGCCGCCGTGATGGACCAGGAGTCCGCCGGCAACAGGACAGCCAATTCCGAGGACTCTGATGAGCAGGACCCCCAGGAGGTGACCTACACACAGCTGAACCACTGCGTGTTTACCCAGCGGAAGATCACAAGACCTTCCCAGAGGCCAAAGACCCCCCCTACAGACATCATCGTGTATGCCGAGCTGCCCAATGCCGAGTCTCGGAGCAAGGTGGTGTCTTGTCCTTGA

SEQ ID NO:16

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

KIR2DL3(铰链+TM+细胞内结构域)-829-1,164

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGTCTCCAACCGAGCCCAGCTCCGAGACAGGCAACCCTAGGCACCTGCACGTGCTGATCGGCACCAGCGTGGTCATCATCCTGTTCATCCTGCTGCTGTTCTTTCTGCTGCACCGGTGGTGCTGTAACAAGAAGAATGCAGTGGTCATGGACCAGGAGCCAGCCGGCAACAGGACCGTGAATAGAGAGGACTCCGATGAGCAGGACCCCCAGGAGGTGACATACGCCCAGCTGAACCACTGCGTGTTTACCCAGAGGAAGATCACACGCCCTTCTCAGCGGCCAAAGACCCCCCCTACAGACATCATCGTGTATACAGAGCTGCCCAATGCCGAGCCTTGA

SEQ ID NO:17

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

KIR2DL2(信号传导结构域)-970-1221

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCCACCGCTGGTGCTCCAACAAGAAGAATGCCGCCGTGATGGACCAGGAGTCTGCCGGCAACAGGACCGCCAATTCTGAGGACAGCGATGAGCAGGACCCCCAGGAGGTGACCTACACACAGCTGAACCACTGCGTGTTCACCCAGCGGAAGATCACAAGACCAAGCCAGAGGCCCAAGACCCCCCCTACAGACATCATCGTGTATGCCGAGCTGCCTAATGCCGAGAGCAGGTCCAAGGTGGTGTCCTGTCCATGA

SEQ ID NO:18

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

BTLA(信号传导结构域)-970-1302

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCCGGAGACACCAGGGCAAGCAGAACGAGCTGAGCGATACCGCCGGCCGGGAGATCAATCTGGTGGACGCCCACCTGAAGTCCGAGCAGACCGAGGCCTCCACAAGACAGAACTCTCAGGTGCTGCTGAGCGAGACAGGCATCTACGACAATGATCCCGACCTGTGCTTCAGGATGCAGGAGGGCAGCGAGGTGTACTCCAACCCCTGTCTGGAGGAGAATAAGCCTGGCATCGTGTATGCCTCTCTGAACCACAGCGTGATCGGCCCAAACTCTAGGCTGGCCCGCAATGTGAAGGAGGCCCCCACCGAGTATGCCTCCATCTGCGTGAGGTCTTGA

SEQ ID NO:19

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

CTLA4(信号传导结构域)-970-1092

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCGCCGTGAGCCTGTCCAAGATGCTGAAGAAGCGGTCTCCTCTGACCACAGGCGTGGGCGTGAAGATGCCCCCTACCGAGCCCGAGTGCGAGAAGCAGTTCCAGCCATACTTTATCCCCATCAACTGA

SEQ ID NO:20

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

CSK(信号传导结构域)-970-1734

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCCTGAAGCTGCTCCAGACCATCGGCAAGGGCGAGTTCGGCGACGTGATGCTGGGCGATTACAGAGGCAACAAGGTGGCCGTGAAGTGCATCAAGAATGACGCAACCGCACAGGCCTTTCTGGCAGAGGCCAGCGTGATGACACAGCTGAGGCACTCCAACCTGGTGCAGCTGCTGGGCGTGATCGTGGAGGAGAAGGGCGGCCTGTACATCGTGACAGAGTATATGGCCAAGGGCAGCCTGGTGGACTACCTGCGGTCCAGAGGCAGGTCTGTGCTGGGAGGCGACTGCCTGCTGAAGTTCAGCCTGGACGTGTGCGAGGCCATGGAGTATCTGGAGGGCAACAATTTTGTGCACCGCGATCTGGCAGCAAGGAACGTGCTGGTGTCTGAGGACAATGTGGCCAAGGTGAGCGATTTCGGCCTGACCAAGGAGGCCAGCTCCACCCAGGACACAGGCAAGCTGCCTGTGAAGTGGACCGCACCAGAGGCCCTGAGGGAGAAGAAGTTCTCTACAAAGAGCGACGTGTGGTCCTTTGGCATCCTGCTGTGGGAAATCTACTCTTTTGGCAGAGTGCCATATCCCAGAATCCCCCTGAAGGACGTGGTGCCTCGGGTGGAGAAGGGCTACAAGATGGACGCACCAGATGGATGCCCACCTGCCGTGTATGAAGTGATGAAGAATTGTTGGCACCTGGATGCAGCAATGAGGCCCAGCTTCCTCCAGCTGAGGGAGCAGCTGGAGCACATCAAGACACACGAGCTGCACTGA

SEQ ID NO:21

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

CTLA4(信号传导结构域)-1306-1428

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGCCGTGAGCCTGTCCAAGATGCTGAAGAAGCGGTCTCCTCTGACCACAGGCGTGGGCGTGAAGATGCCCCCTACCGAGCCCGAGTGCGAGAAGCAGTTCCAGCCATACTTTATCCCCATCAACTGA

SEQ ID NO:22

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

LAG3(信号传导结构域)-1306-1467

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCACCTGTGGCGGAGACAGTGGCGGCCCAGGCGCTTCAGCGCCCTGGAGCAGGGCATCCACCCACCTCAGGCACAGTCCAAGATCGAGGAGCTGGAGCAGGAGCCAGAGCCAGAGCCTGAACCTGAGCCAGAGCCTGAACCCGAGCCAGAGCCTGAGCAGCTGTGA

SEQ ID NO:23

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

2B4(信号传导结构域)-1306-1665

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTTGGCGGAGAAAGCGGAAGGAGAAGCAGAGCGAGACCTCCCCCAAGGAGTTCCTGACAATCTACGAGGACGTGAAGGATCTGAAGACCAGGCGCAACCACGAGCAGGAGCAGACCTTTCCTGGCGGCGGCTCTACAATCTATAGCATGATCCAGTCCCAGAGCAGCGCCCCCACCTCTCAGGAGCCTGCCTACACACTGTATTCTCTGATCCAGCCTAGCCGGAAGTCTGGCAGCCGGAAGAGAAACCACTCCCCATCTTTCAATTCCACAATCTACGAAGTGATCGGCAAGTCTCAGCCAAAGGCACAGAACCCAGCAAGGCTGAGCCGCAAGGAGCTGGAGAATTTTGACGTGTATTCCTGA

SEQ ID NO:24

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

CD300LF(信号传导结构域)-1306-1644

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTTGGCGGATGATGAAGTACCAGCAGAAGGCCGCCGGAATGTCTCCAGAGCAGGTGCTCCAGCCCCTGGAGGGCGACCTGTGCTATGCCGACCTGACCCTCCAGCTGGCCGGCACAAGCCCACAGAAGGCAACCACAAAGCTGAGCAGCGCCCAGGTGGACCAGGTGGAGGTGGAGTACGTGACCATGGCCTCCCTGCCTAAGGAGGACATCTCCTATGCCTCTCTGACCCTGGGCGCCGAGGATCAGGAGCCTACATACTGTAACATGGGCCACCTGTCTAGCCACCTGCCAGGAAGGGGACCAGAGGAGCCTACCGAGTATAGCACAATCTCCAGACCCTGA

SEQ ID NO:25

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

BTLA(信号传导结构域)-1306-1428

SEQ ID NO:26

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

LAIR1(信号传导结构域)-1306-1608

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCACAGGCAGAACCAGATCAAGCAGGGACCACCTCGCAGCAAGGACGAGGAGCAGAAGCCACAGCAGAGGCCCGACCTGGCAGTGGATGTGCTGGAGAGAACCGCCGATAAGGCCACAGTGAATGGCCTGCCCGAGAAGGACAGGGAGACCGATACATCCGCCCTGGCCGCCGGCAGCTCCCAGGAGGTGACCTACGCCCAGCTGGACCACTGGGCACTGACCCAGAGGACAGCCAGAGCCGTGTCTCCTCAGAGCACCAAGCCAATGGCCGAGTCTATCACCTACGCCGCCGTGGCCAGACACTGA

SEQ ID NO:27

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

TIGIT(信号传导结构域)-1306-1551

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCTGACCCGGAAGAAGAAGGCCCTGCGCATCCACAGCGTGGAGGGCGACCTGAGGAGAAAGTCCGCCGGCCAGGAGGAGTGGAGCCCATCCGCCCCCTCCCCCCCTGGCTCTTGCGTGCAGGCAGAGGCAGCACCTGCCGGCCTGTGCGGCGAGCAGCGGGGCGAGGACTGTGCCGAGCTGCACGATTACTTCAACGTGCTGTCTTATAGGAGCCTGGGCAATTGTTCTTTCTTTACCGAGACAGGCTGA

SEQ ID NO:28

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

VISTA(信号传导结构域)-1306-1593

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTTACAAGCAGAGGCAGGCAGCCAGCAACAGGAGAGCCCAGGAGCTGGTGAGGATGGACTCCAACATCCAGGGCATCGAGAATCCAGGATTCGAGGCCTCTCCACCTGCACAGGGCATCCCTGAGGCAAAGGTGCGGCACCCACTGAGCTATGTGGCACAGAGGCAGCCTAGCGAGTCCGGCCGCCACCTGCTGTCTGAGCCCAGCACCCCTCTGTCCCCACCAGGACCAGGCGACGTGTTCTTCCCCTCCCTGGACCCTGTGCCAGATTCTCCCAATTTTGAAGTGATCTGA

SEQ ID NO:29

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV-94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1信号传导-970-1260

GS接头-1261-1305

Ly9(信号传导结构域)-1306-1842

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTAAGCGGAAGGGCAGATGCTCCGTGCCAGCCTTCTGTAGCTCCCAGGCAGAGGCACCCGCCGACACCCCAGAGCCTACAGCCGGCCACACCCTGTACTCCGTGCTGTCTCAGGGCTATGAGAAGCTGGATACCCCACTGAGGCCTGCAAGGCAGCAGCCAACCCCCACAAGCGACTCTAGCTCCGATTCCAACCTGACCACAGAGGAGGACGAGGATCGGCCCGAGGTGCACAAGCCTATCTCCGGCAGGTACGAGGTGTTCGACCAGGTGACACAGGAGGGAGCAGGACACGATCCTGCACCAGAGGGCCAGGCCGACTACGATCCAGTGACACCCTATGTGACCGAGGTGGAGTCTGTGGTGGGCGAGAACACCATGTACGCCCAGGTGTTCAACCTCCAGGGCAAGACACCCGTGAGCCAGAAGGAGGAGTCTAGCGCCACCATCTATTGCAGCATCAGGAAGCCACAGGTGGTGCCCCCTCCACAGCAGAACGACCTGGAGATCCCTGAGAGCCCAACCTACGAGAACTTCACCTGA

SEQ ID NO:30

CD8 SP-1-63

Myc标签-64-93

PSMA scFV-94-867

PD1铰链-868-944

PD1 TM-945-1007

PD1(信号传导)-1008-1299

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGGCACTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGAGGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTGAAGCCAGGCACAAGCGTGCGGATCTCCTGCAAGACCTCTGGCTACACCTTCACAGAGTATACCATCCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGTCCCTGGAGTGGATCGGCAACATCAATCCCAACAATGGCGGCACCACATACAACCAGAAGTTTGAGGACAAGGCCACCCTGACAGTGGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTATATGGAGCTGAGGAGCCTGACCTCCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGCGCCGCCGGATGGAATTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGACATCGTGATGACACAGTCCCACAAGTTTATGTCTACCAGCGTGGGCGATCGCGTGTCTATCATCTGTAAGGCCAGCCAGGACGTGGGCACCGCCGTGGATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCCTCTACAAGGCACACCGGCGTGCCCGACAGATTCACAGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCACCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGATTATTTCTGTCAGCAGTACAATTCCTATCCTCTGACATTTGGCGCCGGCACCATGCTGGACCTGAAGAGGGCTGCCGCCACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGTGA

SEQ ID NO:31

CD8 SP 1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV 94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1(信号传导)-970-1260

IRES-1264-1850

CD8 SP-1857-1916

FLAG标签-1917-1940

CD19 scFV-1941-2666

CD8铰链-2667-2801

CD8 TM-2802-2873

41BB-2874-2999

CD3z-3000-3335

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGTGACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCTGAATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

SEQ ID NO:32

CD8 SP 1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV 94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

IRES-973-1559

CD8 SP-1566-1625

FLAG标签-1626-1649

CD19 scFV-1650-2375

CD8铰链-2376-2510

CD8 TM-2511-2582

41BB-2583-2708

CD3z 2709-3044

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCTGAATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

SEQ ID NO:33

CD8 SP 1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV 94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1(信号传导)-970-1260

P2A-1261-1326

CD8 SP-1327-1351

FLAG标签-1352-1410

CD19 scFV-1411-2136

CD8铰链-2137-2271

CD8 TM-2272-2343

41BB-2344-2469

CD3z 2470-2805

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGtTCCGGCGCGACAAACTTTAGCTTGCTGAAGCAAGCTGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

SEQ ID NO:34

CD8 SP 1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV 94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGA

SEQ ID NO:35

CD8 SP 1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV 94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1(信号传导)-970-1260

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGTGA

SEQ ID NO:36

CD8 SP 1-63

Myc标签-64-93

HLA-A2 scFV 94-828

PD1铰链-829-906

PD1 TM-907-969

PD1(信号传导)-970-1260

GS接头-1261-1305

PD1(信号传导)1306-1596

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCTTATCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGGCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGATGGATCTACCCAGGCGACGGCTCCACACAGTATAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACACTGACCGCCGATAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTTTGCGCCAGGGAGGGCACATACTATGCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCTAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGCAGCGACGTGCTGATGACCCAGACACCACTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGATCCTCTCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCCAAGCTGCTGATCTATAAGGTGTCTAATCGGTTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCAGAGGATCTGGGCGTGTACTATTGTTTCCAGGGCTCCCACGTGCCACGCACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGACCGAGAGGAGAGCAGAGGTGCCCACAGCACACCCATCTCCAAGCCCTAGGCCAGCAGGACAGTTCCAGACCCTGGTGGTGGGAGTGGTGGGAGGCCTGCTGGGCTCTCTGGTGCTGCTGGTGTGGGTGCTGGCCGTGATCTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGGGTGGCGGTGGCTCAGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTTGCAGCAGGGCCGCCCGCGGCACCATCGGCGCCAGGCGCACAGGCCAGCCTCTGAAGGAGGACCCTTCCGCCGTGCCAGTGTTCTCTGTGGACTACGGCGAGCTGGATTTTCAGTGGCGGGAGAAAACCCCAGAGCCACCTGTGCCCTGCGTGCCTGAGCAGACCGAGTATGCCACAATCGTGTTTCCATCCGGAATGGGCACAAGCTCCCCTGCAAGGAGAGGCAGCGCCGACGGACCACGGTCCGCCCAGCCACTGCGGCCCGAGGATGGCCACTGTTCTTGGCCCCTGTGA

SEQ ID NO:37

CD8信号肽1-63

Flag标签64-87

CD19 scFV 88-813

CD8铰链814-948

CD8 TM 949-1020

CD28 1021-1677

CD3z 1678-2013

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTCTCAGGCTGCTCTTGGCTCTCAACTTATTCCCTTCAATTCAAGTAACAGGAAACAAGATTTTGGTGAAGCAGTCGCCCATGCTTGTAGCGTACGACAATGCGGTCAACCTTAGCTGCAAGTATTCCTACAATCTCTTCTCAAGGGAGTTCCGGGCATCCCTTCACAAAGGACTGGATAGTGCTGTGGAAGTCTGTGTTGTATATGGGAATTACTCCCAGCAGCTTCAGGTTTACTCAAAAACGGGGTTCAACTGTGATGGGAAATTGGGCAATGAATCAGTGACATTCTACCTCCAGAATTTGTATGTTAACCAAACAGATATTTACTTCTGCAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

SEQ ID NO:38

CD8 SP-核苷酸1-63.

Myc标签-核苷酸64-93

scFV EGFR 94-816

CD8铰链817-951

CD8 TM 952-1023

41BB 1024-1149

CD3z 1150-1485

ATGGCACTGCCAGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCCAGACCCGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGGACATCCTGCTGACCCAGTCCCCAGTGATCCTGAGCGTGTCCCCAGGAGAGCGGGTGAGCTTCAGCTGCCGGGCCTCCCAGTCTATCGGCACCAATATCCACTGGTATCAGCAGAGGACAAACGGCTCCCCTCGCCTGCTGATCAAGTATGCCAGCGAGTCCATCTCTGGCATCCCATCTAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGTCTATCAATAGCGTGGAGTCCGAGGACATCGCCGATTACTATTGCCAGCAGAACAATAACTGGCCCACCACATTTGGCGCAGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGAGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCCGGACCAGGCCTGGTGCAGCCTAGCCAGTCCCTGTCTATCACCTGTACAGTGTCTGGCTTCAGCCTGACCAACTACGGAGTGCACTGGGTGCGGCAGTCTCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGAGCGGAGGCAATACAGACTATAACACCCCTTTTACATCCAGACTGTCTATCAATAAGGATAACAGCAAGTCCCAGGTGTTCTTTAAGATGAATAGCCTCCAGTCCAACGACACCGCCATCTACTATTGTGCCAGAGCCCTGACATACTATGATTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCGCCACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

SEQ ID NO:39

EGFR aCAR(基于西妥昔单抗scFv)

MALPVTALLLPLALLLHAARPDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSADYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:40

EGFR aCAR(基于帕尼单抗scFv)

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSDYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:41

EGFR aCAR(基于尼妥珠单抗scFv)

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQIGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSSDYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:42

EGFR aCAR(基于耐昔妥珠单抗scFv)

MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYGSTPLTFGGGTKAEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSSYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:43

EGFR aCAR(基于C10scFv)

MALPVTALLLPLALLLHAARPQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLSAISGLQPEDEAYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTLSSYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:44

基于曲妥珠单抗scFv的HER2 aCAR

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:45

基于帕妥珠单抗scFv的HER2 aCAR

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:46

人源化HLA-A2scFv-IgG-VKA17/VH1-3

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTLVTVSSVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:47

人源化HLA-A2scFv-IgG-VKA17/VH1-69

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTLVTVSSVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:48

人源化HLA-A2scFv-IgG VKA18/VH1-3

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTLVTVSSVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:49

人源化HLA-A2scFv-IgG VKA18/VH1-69

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTLVTVSSVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

实施例6.效应细胞的生产

为了研究iCAR构建体对调节CD19CAR活化的影响，构建了重组Jurkat效应细胞，如下表15中详细说明。使用逆转录连接蛋白(retronectin)包被的(Takara)慢病毒载体结合的板或在凝聚胺(polybrene)存在下转导Jurkat(ATCC TIB152)、CD4+T细胞系和Jurkat-NFAT(购自BPS Biosciences的Jurkat细胞系，其被工程化为在NFAT反应元件控制下表达萤火虫萤光素酶蛋白)。使转导的细胞进一步经受抗生素选择，以产生表13中所述的细胞系。选择后，使细胞经受流式细胞术分析，以验证在每个构建体上编码的报告蛋白的表达。

表13-重组效应细胞系

另外，用编码aCAR、iCAR或两者的病毒颗粒以不同的感染复数(MOI)转导从健康供体获得的外周血来源的活化T细胞。可以利用基于报告基因表达的FACS选择来分选和选择表达不同水平的aCAR、iCAR或两者的细胞群。

同样，用从上述载体转录的mRNA电穿孔从健康供体获得的外周血来源的活化T细胞。用aCAR mRNA、iCAR mRNA或不同摩尔比的这两者以及对照mRNA电穿孔细胞。电穿孔后，通过FACS分析来确定CAR表达。

实施例7.靶细胞的制备

建立体外重组系统，用于测试iCAR构建体在抑制aCAR针对脱靶细胞的活性中的功能。为此目的，产生了表达aCAR表位、iCAR表位或两者的靶细胞。表达aCAR表位的重组细胞代表“中靶”(‘on-target’)的“肿瘤上”(‘on-tumor’)细胞，而表达aCAR表位和iCAR表位两者的细胞代表“中靶”(‘on-target’)的“脱肿瘤”(‘off-tumor’)健康细胞。

由于我们的第一个iCAR/aCAR组是分别基于HLA-A2和CD19的，因此通过用编码这些的基因的表达载体转染细胞系(例如，Hela、ATCC CRM-CCL-2、Hela-萤光素酶-GenTargetSCO32-Bsd或Raji-ATCC CCL-86)来产生表达HLA-A2或CD19或两者的重组细胞。

为了检测重组HLA A-2表达，插入Myc标签。对于由CD20iCAR/CD19 aCAR组成的第二个iCAR/aCAR组，构建了表达CD20或CD19或两者的重组细胞(在表14中详述了靶细胞)。

表14-靶细胞系

测定-

已进行了iCAR的抑制作用的体外测试，并将进一步进行其体内测试。

在体外测定中，我们专注于测量细胞因子分泌和细胞毒性作用，而在体内，我们将评价双重iCAR/aCAR构建体根除肿瘤以及抑制和保护表达aCAR靶标和iCAR靶标两者的“脱肿瘤”细胞的功效。将使用小鼠模型(例如异种移植物)进行研究。通过使用报告基因将T细胞分选为iCAR/aCAR双阳性，我们可以限制缺乏iCAR的T细胞污染结果。作为iCAR阻断活性的阴性对照，我们可以使用缺乏scFv结构域或信号传导结构域的CAR转导的T细胞(即模拟转导)。

实施例8.体外测定

萤光素酶细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定

将使用工程化为表达萤火虫萤光素酶和一种或两种CAR靶抗原的上述Hela-Luc重组靶细胞进行测定。将根据Bright-Glo萤光素酶测定制造商的方案(Promega)进行体外萤光素酶测定，并以生物发光作为读数。

T细胞(用aCAR和pCAR两者或iCAR和aCAR两者或aCAR或缺乏胞质结构域(Pdel)的aCAR和iCAR或模拟CAR转导或者mRNA电穿孔)将与表达HLA-A2或CD19或HLA-A2和CD19两者或CD20或CD20和CD19两者的重组靶细胞以不同的效靶比一起孵育24-48小时。将用Bright-Glo萤光素酶系统将细胞杀伤定量。

通过根据iCAR/aCAR表达水平对转导的T细胞群进行分选，或通过根据重组靶细胞的CD19、HLA-A2或CD20表达水平选择其亚群，从而可以优化“脱肿瘤”细胞毒性。为了测试iCAR转导的T细胞能否在体外区分“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞，我们将测试与1:1或更高的比率的“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞的混合物一起孵育的转导的T细胞的杀伤作用。通过萤光素酶表达将“肿瘤上”重组细胞与“脱肿瘤”重组细胞区分开(在给定的时间，仅一个细胞群将被工程化为表达萤光素酶基因)。在共孵育24-48小时之后，将杀伤定量。

胱天蛋白酶3活性测定-通过抗活化的胱天蛋白酶3(CASP3)检测CTL诱导的凋亡。

细胞毒性T细胞杀伤靶细胞的途径之一是通过Fas配体诱导细胞凋亡。胱天蛋白酶的顺序激活在细胞凋亡的执行阶段中起重要作用。针对胱天蛋白酶3的前原胱天蛋白酶3的切割成导致构象变化和催化活性的表现。胱天蛋白酶3的切割活化形式可以被单克隆抗体特异性地识别。将转导的或mRNA电穿孔的T细胞与“肿瘤上”或“脱肿瘤”重组细胞或“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞的混合物共培养1-3小时。当将靶细胞群混合时，细胞群之一先前已用细胞示踪染料(例如CellTrace Violet或CFSE)染色。在将细胞透化后，用内部染色试剂盒(例如BD bioscience)固定并用抗CD3染色以排除T细胞(CD3-细胞被门控)，通过特异性抗体染色(BD bioscience)检测活化的CASP3，并通过流式细胞术检测凋亡靶细胞并将其定量。将用不同摩尔比的iCAR/aCAR(1:1；1:2.5；1:5)或仅用aCAR电穿孔的T细胞与“肿瘤上”(“Raji”)或“脱肿瘤”(“Raji-A2”或“Raji-HLA-A2”)细胞以1:1的比率共培养，并在CASP3染色后测量细胞毒性。图52显示了当iCAR和aCAR之间的比率增加时Raji-A2的保护作用增加。iCAR对“脱肿瘤”细胞的保护作用与iCAR/aCAR的摩尔比增加相关。与仅用aCAR mRNA电穿孔的T细胞相比，用aCAR和iCAR mRNA两者电穿孔的T细胞表现出对Raji靶细胞的细胞毒性下降，这可归因于与单独电穿孔时aCAR的表达水平相比，aCAR和iCAR mRNA两者电穿孔的T细胞膜上aCAR的表达降低。通过一系列效靶比(E/T)以及源自不同健康供体的PBMC，可以证明对“脱肿瘤”细胞的保护作用。

以E/T比1、2和5将表达aCAR或aCAR和iCAR(1:5)的效应T细胞与Raji或Raji-A2共培养。可以对所有的E/T比证明显著的保护作用(图52)。空白电穿孔T细胞显示出在每个E/T比的非特异性杀伤的背景。图52显示了iCAR在广泛的E/T比范围内提供保护作用。在图52中，还证明了当“脱肿瘤”细胞与肿瘤细胞混合时对“脱肿瘤”细胞的保护作用。Raji肿瘤细胞或Raji-A2：将Raji“脱肿瘤”用Violet CellTrace标记，并且制备了四种细胞混合物：标记的Raji-A2与未标记的Raji(1:1比)；未标记的Raji-A2与标记的Raji(1:1比)；标记的Raji与未标记的Raji(1:1)；标记的Raji-A2与未标记的Raji-A2(1:1)。以效靶比1:1将每种混合物与先前用aCAR和iCAR mRNA电穿孔的T细胞一起培养。

共培养3小时后，将细胞用抗胱天蛋白酶3和抗CD3染色。表达胱天蛋白酶3的靶细胞(CD3阴性细胞)在每种细胞混合物中的百分比在图53中给出。

图53显示了与用aCAR mRNA和iCAR mRNA电穿孔的T细胞共培养的靶细胞的胱天蛋白酶3表达。Raji-V是用Violet CellTrace标记的Raji细胞。Raji-A2V是用VioletCellTrace标记的Raji-A2细胞。

延时显显微镜检查CTL

转导的或mRNA电穿孔的T细胞将与“肿瘤上”或“脱肿瘤”细胞孵育长达5天。将使用延时显微镜检查将杀伤可视化。可替代地，将进行使用活细胞数染色和CountBright珠(Invitrogen)的流式细胞术分析，以确定在终点时间的靶细胞数。

为了证明aCAR/iCAR转导的T细胞在体外识别靶标中的有效性，将每个重组靶细胞(“肿瘤上”或“脱肿瘤”)用不同的报告蛋白(例如GFP和mCherry)标记。转导的T细胞(效应细胞)将与表达一种或两种靶抗原的重组细胞(靶细胞)的混合物以不同的E/T比共孵育。将通过显微镜检查成像来追踪每个细胞系的命运。

细胞因子释放

在T细胞活化后，细胞分泌细胞因子，所述细胞因子可以被量化并用于评价T细胞活化和抑制。通过流式细胞术或通过经由ELISA或细胞计数珠阵列(CBA)测量培养基中分泌的蛋白质，可以进行细胞因子的细胞内检测。

通过ELISA将分泌的细胞因子定量

在将表达iCAR或aCAR或aCA和iCAR两者的转导的T细胞(Jurkat或原代T细胞)与在其细胞表面上表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR抗原两者的修饰的靶细胞共培养后，收集条件培养基，并通过细胞因子ELISA(IL-2、INFγ和或TNFα)，根据制造商的说明(例如BioLegened或类似的)，以及通过细胞计数珠阵列(Miltenyi或类似的)测量细胞因子的浓度。

通过IL-2 ELISA测量的iCAR特异性抑制

将Jurkat CD19 aCAR和Jurkat CD19 aCAR/HLA-A2 iCAR效应细胞与Raji、Raji-HLA-A2和Thp1靶细胞共培养，并收集相应的上清液通过ELISA测量IL-2，如图16A中所示。Jurkat CD19-aCAR/HLA-A2-iCAR与表达CD19的Raji靶细胞(“肿瘤”)一起孵育显示出IL-2分泌，然而这些效应细胞与表达CD19和HLA-A2两者的Raji-HLA-A2靶细胞(“脱肿瘤”)一起孵育导致IL-2分泌的超过80％的抑制。相反，当将CD19 aCAR Jurkat细胞与Raji或Raji-HLA-A2靶细胞一起孵育时，IL-2分泌未受影响(图16B)。这个结果与下文所述的其他测定一起表明iCAR构建体特异性地保护正常细胞(“脱肿瘤”)的能力，所述正常细胞表达在肿瘤细胞上不表达的抗原。

通过流式细胞术将细胞因子释放定量

表达iCAR或aCAR或不同摩尔比的aCAR和iCAR两者的转导的或mRNA电穿孔的T细胞(Jurkat或原代T细胞)与重组靶细胞(在其细胞表面上表达iCAR或aCAR或aCAR和iCAR靶抗原两者)共培养4-24小时，然后经受高尔基(Golgi)转运阻断剂(例如布雷菲德菌素A(Brefeldin A)、莫能菌素)，以使细胞因子在细胞内积累。然后将T细胞通过内部染色试剂盒(例如BD Bioscience)进行透化和固定，用抗CD3和抗CD8抗体并且针对INFγ染色(也可以进行针对另外的细胞因子的染色，即，IL-2、TNFα)。

图54证明了在用表达两种抗原的靶细胞刺激后，用aCAR和iCAR两者电穿孔的T细胞中IFNg表达的特异性降低。效靶比为2:1。aCAR:iCAR比率在这些组之间不同。如所示，当aCAR:iCAR比率为1:5时获得最大抑制。

通过细胞计数珠阵列(CBA)测定测量细胞因子分泌

使用细胞计数珠阵列(CBA)测量多种可溶性细胞内蛋白质，包括细胞因子、趋化因子和生长因子。

用在其细胞表面上表达iCAR和aCAR两者或aCAR或iCAR靶抗原的修饰的靶细胞刺激经aCAR或aCAR和iCAR构建体两者或mRNA转导的或电穿孔的T细胞(原代T细胞或Jurkat细胞)(效应细胞)(图17A)。共孵育数小时后，效应细胞产生并分泌指示其效应子状态的细胞因子。收集反应的上清液，并通过多重CBA测定测量分泌的IL-2、TNFa和IFNg并将其定量。

如图17B中所示，证明了与表达两种靶抗原的靶细胞共培养的aCAR/iCAR转导的Jurkat T细胞的IL-2分泌的特异性抑制。证明了当双CAR(aCAR/iCAR)转导的细胞与表达两种靶抗原的靶细胞共孵育时，与相同效应细胞与仅表达一种靶标的靶细胞共孵育产生的IL-2分泌相比，IL-2分泌降低了86％。

图55显示了与肿瘤细胞或“脱肿瘤”细胞共培养的电穿孔T细胞的IFNg和TNFa分泌。图55证明在用“脱肿瘤”细胞刺激后在用aCAR和iCAR两者电穿孔的T细胞中IFNg和TNFa细胞因子分泌的特异性降低。用以下公式计算抑制百分比(表15)：抑制％＝100x[1-(RAJI-A2浓度/RAJI浓度)]。

表15.基于CBA测定的抑制百分比的计算

NFAT活化测定

为了确定通过NFAT活化测量的T细胞活化，用aCAR和iCAR的不同组合转导Jurkat-NFAT细胞，如表13中详细说明。将表达CD19aCAR、HLA-A2 iCAR或两者的效应Jurkat-NFAT细胞系与表达CD19(Raji细胞“中靶”)、CD19和HLA-A2两者(Raji-HLA-A2“脱肿瘤”)或HLA-A2(Thp1“脱肿瘤”)的靶细胞共培养，如表14中所述。作为阳性对照，在触发NFAT信号传导所需的钙释放的PMA和离子霉素存在下刺激效应细胞。在37℃下孵育16小时之后，根据制造商的说明使用BPS Biosciences试剂盒“一步萤光素酶测定系统”将萤光素酶定量。如预期的，在表达CD19的Raji细胞系存在下，表达CD19-CAR构建体的Jurkat NFAT细胞系被特异性地活化，而当这些细胞与不表达CD19的Thp1细胞系共培养时，未显示活化(图18)。

HLA-A2 iCAR对CD19 aCAR诱导的NFAT活化的抑制作用可见于图19中。与由仅表达CD19的Raji细胞诱导的活化相比，当与表达CD19和HLA-A2的Raji-HLA-A2共孵育时，表达CD19 aCAR和HLA-A2 iCAR两者的Jurkat-NFAT细胞系被特异性地抑制。相比之下，仅表达CD19-CAR的Jurkat-NFAT细胞系被Raji和Raji-A2细胞系两者相似地活化。在这些条件下，计算出NFAT活化的抑制为约30％(图19)。

测试了不同E/T比的作用。以10:1、5:1、1:1的E/T比重复测定几次。在图20中给出的结果表明，以更高的E/T比可以获得增强的抑制作用。结果表示为来自每个效应细胞系和“脱肿瘤”靶细胞共培养的平均发光值与来自和“中靶”呈递细胞共培养的平均值之比。如所示，当与表达CD19和HLA-A2蛋白的Raji-HLA-A2共孵育时，表达CD19aCAR和HLA-A2 iCAR两者的Jurkat-NFAT细胞系被特异性地抑制，然而，当这个细胞系与仅表达CD19的Raji细胞系共培养时，未检测到抑制作用。相反，表达CD19 aCAR的Jurkat-NFAT细胞系被同等地活化，而不论与其共培养的表达CD19的靶细胞系(Raji或Raji-HLA-A2)如何。

通过CD107a染色测量的T细胞脱颗粒测定

可以通过CD107a(一种溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1))的表面表达来鉴定T细胞的脱颗粒。已证明LAMP-1的表面表达与CD8 T细胞的细胞毒性相关。该分子位于溶酶体的腔侧。在活化后，CD107a被转移到活化淋巴细胞的细胞膜表面。CD107a在细胞表面瞬时表达，并通过内吞途径迅速重新内化。因此，通过在细胞刺激过程中的抗体染色和通过添加莫能菌素和布雷菲德菌素(以防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后降解)，使得CD107a检测最大化。

颗粒化(CD107a)作为杀伤潜力的标志物。溶细胞性T细胞最关键的功能是杀伤靶细胞的能力。细胞毒性CD8+T淋巴细胞通过两个主要途径介导靶细胞的杀伤：穿孔素-颗粒酶介导的凋亡活化和fas-fas配体介导的凋亡诱导。这些途径的诱导取决于从应答的CD8+T细胞释放溶细胞颗粒。脱颗粒是穿孔素-颗粒酶介导的杀伤的先决条件，并且是由应答的抗原特异性CD8+T细胞介导的即时溶解功能所需的。细胞毒性不需要由效应CD8+T细胞从头合成蛋白质；而是，位于细胞质内的预先形成的溶解颗粒以极化方式向靶细胞释放。溶解颗粒是膜结合的分泌性溶酶体，其含有由各种蛋白质(包括穿孔素和颗粒酶)组成的致密核心。颗粒核心被含有许多溶酶体相关膜糖蛋白(LAMP)的脂质双层包围，所述膜糖蛋白包括CD107a(LAMP-1)、CD107b(LAMP-2)和CD63(LAMP-3)。在脱颗粒过程中，溶解颗粒膜与活化的CD8+T细胞的质膜合并，然后将颗粒的内容物释放到CD8+T细胞与靶细胞之间的免疫突触中。作为这个过程的结果，包含CD107a、CD107b和CD63糖蛋白的颗粒膜被掺入到应答的CD8+T细胞的质膜中。CD107a和CD107b在活化T细胞的细胞表面上的高水平表达需要脱颗粒，因为脱颗粒抑制剂(例如秋水仙碱)大大降低CD107a和CD107b的细胞表面表达。重要的是，这些蛋白质在静息T淋巴细胞表面上很少发现。因此，用针对CD107a和CD107b的抗体标记应答细胞并通过流式细胞术测量其表达可以直接鉴定脱颗粒CD8+T细胞(Betts和Koup，2004)。

实验设置：

将以不同比率的aCAR或iCAR+aCAR/mRNA电穿孔的PBMC(效应细胞)与在其细胞表面上表达iCAR+aCAR或aCAR抗原的靶细胞共培养。在共孵育4小时期间，效应细胞脱颗粒，并在其细胞表面上检测到CD107a。该表达是瞬时的，并且CD107a通过内吞途径迅速重新内化。因此，通过在细胞刺激过程中进行抗体染色以及通过添加含有莫能菌素(Cytofix/Cytoperm BD BD554715)(以防止内吞的CD107a抗体复合物的酸化和随后降解)的高尔基停止试剂，可以使CD107a检测最大化。之后4个小时，如上所述将细胞固定和透化，并针对CD8标志物和INFγ染色。针对CD8染色的原因是脱颗粒仅与细胞毒性细胞有关。针对INFγ染色的原因是它充当用CD107染色的特异性的阳性对照。最后，通过FACS分析细胞，并将表达CD107a的CD8 T细胞的百分比定量。将“脱靶”细胞的保护计算为抑制百分比100*(1-(与Raji-A2一起培养的T细胞中的CD107a/与Raji一起培养的T细胞中的CD107a))。图56提供了显示iCAR表达能够以剂量依赖性方式保护“脱肿瘤”细胞的数据。在aCAR与iCAR的比率为1:5时观察到最高的保护作用，并达到CD107a表达的抑制百分比的84％(图56)。

测试双CAR T细胞(同时表达aCAR和iCAR的T细胞)混合在一起时是否能够识别靶细胞。将对照T细胞(仅EP)、仅表达aCAR的T细胞或表达双CAR的T细胞(iCAR和aCAR之间的比率为5:1)与仅Raji、仅Raji-A2或Raji和Raji-A2的1:1混合物一起孵育。与仅有Raji的条件相比，Raji和Raji-A2的1:1混合物包括一半量的Raji细胞。仅表达aCAR的T细胞在所有条件下均被相似地活化。阴性对照T细胞在任一条件下均未活化。另一方面，双CAR T细胞在Raji存在下显示出活化，在Raji-A2存在下无显著活化，并且在Raji和Raji-A2的1:1混合物存在下显示出中间活化，这表明双CAR仅通过Raji细胞活化，Raji-A2的存在并没有降低对Raji细胞的效力(图57)。

实施例9.体内模型

人异种移植小鼠模型中的体内CTL测定

为了测试表达aCAR和iCAR构建体两者的T细胞是否能区分同一生物体内的靶细胞和“脱靶”细胞，并有效杀伤靶细胞同时保留“脱靶”细胞，将通过体内CTL测定进行评估。

用iCAR或aCAR或iCAR和aCAR两者转导的T细胞将被静脉注射至幼稚NOD/SCID/γc-或相似的小鼠。数小时后，将注射表达iCAR、aCAR或两者的靶细胞。将这些靶标用允许它们之间进一步区分的不同浓度(高、中和低)的CFSE/CPDE或相似的细胞示踪染料标记。注射靶标后18小时，处死小鼠，收获脾脏，并通过FACS评估特定靶标的消除。将根据以下公式计算特异性杀伤的百分比：

人异种移植小鼠模型中的肿瘤生长动力学

将用肿瘤细胞接种NOD/SCID/γc-或相似的小鼠。接种可以是i.p/i.v.或s.c.。肿瘤细胞将表达iCAR靶标、aCAR靶标或两者。一种可能的aCAR肿瘤细胞系的实例可以是CD19阳性NALM 6(ATCC，人BALL细胞系)。可能的aCAR肿瘤细胞系的其他实例可以是EGFR和HER2阳性细胞系A549、A431、Fadu、SK-OV-3、U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460(ATCC细胞系)。表达aCAR和iCAR两者的肿瘤细胞(即，“脱肿瘤”细胞)的实例是NALM 6，将其工程化为表达iCAR表位(例如HLA-A2)，从而代表健康细胞。表达aCAR和iCAR两者的肿瘤细胞(即，“脱肿瘤”细胞)的一个另外的实例是A549、A431、Fadu、SK-OV-3、U-87、MCF7、MDA-MB-231和/或NCI-H460中的任何一种，将其工程化为表达iCAR表位(例如HLA-A2)，从而代表健康细胞。

NALM 6和NALM 6-HLA-A2；A549和A549-HLA-A2；A431和A431-HLA-A2；Fadu和Fadu-HLA-A2；SK-OV-3和SK-OV-3-HLA-A2；或NCI-H460和NCI-H460-HLA-A2也可工程化为表达报告基因(例如萤火虫萤光素酶)，以便于检测。将小鼠分为几个研究组，接种所有可能的靶细胞组合。作为示例，一组将注射NALM 6细胞，而另一组将注射表达iCAR表位的NALM-6。几天后，当已经建立肿瘤时，将对小鼠静脉内输注用aCAR或aCAR/iCAR或iCAR转导的T细胞。另外，还将包括未转导的T细胞、无T细胞或没有信号传导结构域的转导的T细胞的对照组。将监测小鼠直到肿瘤达到实验终点，即最大允许肿瘤体积。将通过机械手段(卡尺)以及还通过使用体内成像系统(IVIS)测量肿瘤体积来进行监测。在终点日，将处死小鼠，将肿瘤负荷定量，并通过FACS分析浸润的T细胞群。为了测试表达iCAR构建体的T细胞是否能区分同一生物体内的靶细胞和“脱靶”细胞，我们将对小鼠注射几个比率的“肿瘤上”/“脱肿瘤”NALM-6细胞的几种可能的混合物，随后注射表达单独的aCAR或表达aCAR和iCAR两者的转导的T细胞。在处死小鼠后，将通过流式细胞术针对两种标志物CD19和iCAR表位分析在脾和骨髓中的“肿瘤上”和“脱肿瘤”细胞中的存在。

转基因小鼠模型中的毒性和肿瘤生长动力学

也将使用表达人aCAR和iCAR靶标的转基因小鼠来确定转导的T细胞的功效。在这些设置下，小鼠具有完整功能的免疫系统，并且iCAR/aCAR转导的T细胞的潜在毒性可被评价。CAR构建体将含有与人抗原匹配的scFv，而信号传导结构域将被修饰为活化或抑制鼠T细胞。这种模型的一个实例是仅表达人HLA-A2分子同时所有其他蛋白质只来自鼠类的HHD-HLA-A2小鼠。在这种情况下，CD19 aCAR的scFv将针对鼠CD19同源物。将使用缺乏HLA分子的人靶细胞(例如LCL 721.221细胞或

CRL-2369^TM或相似的细胞)。靶标将被修饰为表达鼠CD19。这个系统将允许监测功效和毒性问题。

mAb产生

选择在不同肿瘤中鉴定的几对保存的和丧失的等位基因变体，并且它们的多肽产物将用于利用mAb生产技术来产生变体特异性mAb。候选mAb的区分能力将通过双重染色和流式细胞术实验或免疫组织化学进行测定，如通过与表达选定等位基因的重组细胞系结合来确定。

实施例10.ACAR/ICAR对的鉴定

aCAR/iCAR对的鉴定

在鉴定潜在的iCAR靶标之后，我们接下来建立一系列的潜在的aCAR/iCAR对，其中优选的对将是在靶组织中高表达aCAR靶标同时在非靶组织中高表达iCAR靶标的那些对。为了这个目的，使用GTEX数据库分析每种iCAR和aCAR候选抗原的组织表达。aCAR靶标源自对临床开发的aCAR靶标及其匹配的癌症适应症的文献综述，而iCAR靶标则源自上述分析。

考虑到这一点，用几个指标注释每个三合一的iCAR-aCAR-肿瘤类型：

(i)其中表达aCAR靶标的组织的数量

(ii)其中表达iCAR靶标的组织的数量

(iii)其中表达iCAR高于表达aCAR的组织的数量(无表达阈值)

(iv)其中表达iCAR高于表达aCAR并且aCAR表达高于背景水平的组织的数量。

在所有这些情况下，表达的阈值为1RPKM，接近GTEX数据库中的背景噪声水平。

我们总共鉴定出71,910个三合一的iCAR-aCAR-肿瘤类型(如随同提交的长表格中提供)，相应于598个单独的iCAR基因靶标(参见图22)、49个aCAR基因靶标(参见图23)和27种肿瘤类型(参见图24)。

在对各种特征(如未满足的医疗需求、抗原活性和抑制意义)进行文献综述后，将进一步确定靶标的优先次序。

实施例11.另外的ACAR/ICAR对的鉴定

分析了若干个iCAR靶标与若干个aCAR靶标的配对，用于治疗若干适应症，例如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肺癌和乳腺癌。选择的aCAR是EGFR、Her2、CEACAM5和间皮素。除HLA-A2之外，选择的iCAR为CDH11、CDH5、CLDN8、DCC、DCSH1、FAT4、GGT1、GGT5、ITGA3、ITGA9、PTPRG、ROBO2和TUSC5。最终的配对列表在下面的表16中列出。

表16.根据适应症的新的iCAR与选择的aCAR配对。

表17.表16的缩写

已在Jurkat稳定系-NFAT活化中经由IL-2分泌证实了HLA-A2iCAR的保护作用。

杀伤测定：已证明CD8+T细胞是需要的。

可以通过以下方式施用CAR：

·病毒转导-正在进行校准到PBMC中

·mRNA电穿孔-完成校准到PBMC中

电穿孔的PBMC用于胱天蛋白酶和CD107杀伤测定中

在这些测定中证明了>80％的特定保护作用。

输出：通过以下项证明靶细胞杀伤：

·胱天蛋白酶3

·膜联蛋白-PI

输出：通过以下项证明效应细胞活化：

·CD107测定

·CBA(细胞计数珠阵列测定)-IFNγ、IL-2、TNFα

进一步的研究将检验aCAR和iCAR构建体的稳定性和动力学。

另外的研究将证明使用来自不同供体的PBMC的特定保护作用。另外的研究将校准病毒转导。已经并且将继续进行编码aCAR和iCAR两者的病毒载体的进一步构建。

实施例12：双等位基因表达验证

为了检查和验证选择的iCAR候选基因的两个等位基因的表达，对有关样品中的RNA-Seq实验的可用数据集进行了检查。首先，使用GEO(NCBI)门户来鉴定具有可用RNA-Seq数据的匹配的肿瘤-正常样品的大型(>20个样本)数据集。从SRA(NCBI)下载原始测序数据(fastq)，并使用BWA-GATK管线分析每个样本，产生总的变体调用。

对于iCAR候选列表中的每个SNP，提取变异调用以及每个样本的读段分布(支持参考等位基因的读段数和支持替代等位基因的读段数)。比较在肿瘤-正常对之间的替代等位基因的百分比所代表的读段分布，使得能够鉴定显示明显的SNP杂合性的正常样本，随后鉴定哪些匹配的肿瘤样本显示是否明显偏离杂合性而朝向针对参考等位基因或替代等位基因的纯合性。

新的iCAR候选基因的双等位基因表达证据的概述

基于生物信息学分析，鉴定并且然后成立了一组具有1000多个用于iCAR靶向的潜在候选基因，以鉴定短列表的iCAR候选基因的双等位基因表达的进一步证据，这是成为在具有两个等位基因的正常组织上表达的iCAR的先决条件。为了这个目的，我们首先浏览了GEO数据库(位于万维网ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，所述数据库针对肿瘤-正常RNA-Seq实验的大型(>20个样本)数据集。然后，从SRA(位于万维网ncbi.nlm.nih.gov/sra)下载有关样本集的原始测序数据(fastq)。

利用BWA，将原始数据用于通过将读段与参考基因组比对，随后使用GATK从每个样本的生成的BAM文件中直接调用变体。最后，针对iCAR候选基因列表中的每个SNP提取以下数据：

·变体调用(基因型，杂合的或纯合的)

·每个样本的读段分布(支持参考等位基因的读段数；支持替代等位基因的读段数)

·肿瘤-正常对的读段分布(替代等位基因％)

总结RNA-seq实验的每个数据集的发现，一起提取显示明显的SNP杂合调用的正常样本的数量以及具有明显的杂合调用偏离的匹配的肿瘤样本的数量，所述偏离实际上支持肿瘤样本中的杂合性丧失。

在万维网ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE50760可获得结肠癌RNA-Seq的大量结果，包括匹配的正常、原发性CRC和转移的18个三联体。

在18个正常样本中，我们能鉴定出CDH11(p.Thr255Met)、CLDN8(p.Ser151Pro)、GGT1(p.Val272Ala)、GGT5(p.Lys330Arg)和PTPRG(p.Gly574Ser)的双等位基因表达的高质量证据。无论样本来源如何，针对FAT4和ICOSLG以较低的可靠性鉴定了双等位基因表达的进一步证据。为了探索LOH证据，正在进行匹配的肿瘤样本中变体细胞的评估。

实施例13：另外的ICAR候选基因

实施例13-另外的iCAR候选基因

我们用关键词“癌症易感性”搜索了ClinVar，并对移码/无义/剪接位点致病突变进行过滤。该搜索在63个基因中产生>5000个ClinVar条目。这63个基因与Uniprot中的60个人蛋白质条目匹配。

在基因本体论的细胞区室注释中搜索“质膜”产生16个蛋白质条目，其中4个是跨膜蛋白-BMPR1A、CDH1、PTCH1、TMEM127。

所有标题和章节名称均只是出于清楚和参考的目的使用，并且不应认为以任何方式限制。举例来说，本领域的技术人员将了解视情况根据本文所述的本发明的精神和范围组合来自不同标题和章节的各个方面是有用的。

本文中引用的所有参考文献均在此以引用的方式整体并入本文中以达成所有目的，其并入程度如同特定并且个别地指示出于所有目的，每个单个的公布或专利或专利申请以引用的方式整体并入一般。

如本领域的技术人员所显而易见，可以在不脱离本申请的精神和范围下对本申请进行许多修改和变化。本文所述的特定实施方案和实施例只是为了举例而提供，并且本申请只受随附权利要求的条款以及权利要求所授权的等效物的完整范围限制。

Claims

1.一种鉴定抑制性嵌合抗原受体(iCAR)或保护性嵌合抗原受体(pCAR)/活化性嵌合抗原受体(aCAR)靶标对的方法，所述方法包括：

i)选择能够防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化的iCAR或pCAR，其中所述iCAR或pCAR靶标针对来自选自由图22中列出的598个基因组成的组的基因的靶标细胞外多态性表位；以及

ii)选择能够诱导效应免疫细胞活化的aCAR，其中所述aCAR针对选自由图23列出的49种靶蛋白组成的组的蛋白质的靶标非多态性细胞表面表位；

iii)在细胞群中表达步骤i)的所述iCAR或pCAR和步骤ii)的所述aCAR；

v)基于步骤iv)中的测定结果鉴定iCAR或pCAR/aCAR靶标对。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种能够检测防止或减弱效应免疫细胞的不希望的活化和/或检测效应免疫细胞的诱导活化的测定选自由以下组成的组：胱天蛋白酶测定(包括胱天蛋白酶-3)、膜联蛋白v-PI染色测定、CD107测定和细胞计数珠阵列(CBA)测定(包括测量IFNγ、IL-2和/或TNFα)。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶基因位于表现出杂合性丧失(LOH)的染色体区域中，并且其中所述LOH位置选自由取代、缺失和插入组成的组，或者本文中的靶基因位于表现出表达完全丧失的染色体区域中，其中所述表达完全丧失是由于选自由取代、缺失和插入组成的组的突变所致。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述LOH位置是SNP。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA基因。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-G、HLA-E、HLA-F、HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1或HLA-DRB5基因。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-A基因。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-B基因。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-C基因。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-G基因。

11.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-E基因。

12.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-F基因。

13.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DPA1基因。

14.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DQA1基因。

15.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DQB1基因。

16.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DQB2基因。

17.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DRB1基因。

18.如权利要求6所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因是HLA-DRB5基因。

19.如权利要求6所述的方法，其中如在随同提交的长表格中所提供的，权利要求1所述的iCAR或pCAR配对成组。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA4、ADAM30、AQP10、ASTN1、C1orf101、CACNA1S、CATSPER4、CD101、CD164L2、CD1A、CD1C、CD244、CD34、CD46、CELSR2、CHRNB2、CLCA2、CLDN19、CLSTN1、CR1、CR2、CRB1、CSF3R、CSMD2、ECE1、ELTD1、EMC1、EPHA10、EPHA2、EPHA8、ERMAP、FCAMR、FCER1A、FCGR1B、FCGR2A、FCGR2B、FCGR3A、FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5、FCRL6、GJB4、GPA33、GPR157、GPR37L1、GPR88、HCRTR1、IGSF3、IGSF9、IL22RA1、IL23R、ITGA10、KIAA1324、KIAA2013、LDLRAD2、LEPR、LGR6、LRIG2、LRP8、LRRC52、LRRC8B、LRRN2、LY9、MIA3、MR1、MUC1、MXRA8、NCSTN、NFASC、NOTCH2、NPR1、NTRK1、OPN3、OR10J1、OR10J4、OR10K1、OR10R2、OR10T2、OR10X1、OR11L1、OR14A16、OR14I1、OR14K1、OR2AK2、OR2C3、OR2G2、OR2G3、OR2L2、OR2M7、OR2T12、OR2T27、OR2T1、OR2T3、OR2T29、OR2T33、OR2T34、OR2T35、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2W3、OR6F1、OR6K2、OR6K3、OR6K6、OR6N1、OR6P1、OR6Y1、PDPN、PEAR1、PIGR、PLXNA2、PTCH2、PTCHD2、PTGFRN、PTPRC、PTPRF、PVRL4、RHBG、RXFP4、S1PR1、SCNN1D、SDC3、SELE、SELL、SELP、SEMA4A、SEMA6C、SLAMF7、SLAMF9、SLC2A7、SLC5A9、TACSTD2、TAS1R2、TIE1、TLR5、TMEM81、TNFRSF14、TNFRSF1B、TRABD2B、USH2A、VCAM1和ZP4。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCG5、ALK、ASPRV1、ATRAID、CD207、CD8B、CHRNG、CLEC4F、CNTNAP5、CRIM1、CXCR1、DNER、DPP10、EDAR、EPCAM、GPR113、GPR148、GPR35、GPR39、GYPC、IL1RL1、ITGA4、ITGA6、ITGAV、LCT、LHCGR、LRP1B、LRP2、LY75、MARCO、MERTK、NRP2、OR6B2、PLA2R1、PLB1、PROKR1、PROM2、SCN7A、SDC1、SLC23A3、SLC5A6、TGOLN2、THSD7B、TM4SF20、TMEFF2、TMEM178A、TPO和TRABD2A。

22.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ACKR2、ALCAM、ANO10、ATP13A4、BTLA、CACNA1D、CACNA2D2、CACNA2D3、CASR、CCRL2、CD200、CD200R1、CD86、CD96、CDCP1、CDHR4、CELSR3、CHL1、CLDN11、CLDN18、CLSTN2、CSPG5、CX3CR1、CXCR6、CYP8B1、DCBLD2、DRD3、EPHA6、EPHB3、GABRR3、GP5、GPR128、GPR15、GPR27、GRM2、GRM7、HEG1、HTR3C、HTR3D、HTR3E、IGSF11、IL17RC、IL17RD、IL17RE、IL5RA、IMPG2、ITGA9、ITGB5、KCNMB3、LRIG1、LRRC15、LRRN1、MST1R、NAALADL2、NRROS、OR5AC1、OR5H1、OR5H14、OR5H15、OR5H6、OR5K2、OR5K3、OR5K4、PIGX、PLXNB1、PLXND1、PRRT3、PTPRG、ROBO2、RYK、SEMA5B、SIDT1、SLC22A14、SLC33A1、SLC4A7、SLITRK3、STAB1、SUSD5、TFRC、TLR9、TMEM108、TMEM44、TMPRSS7、TNFSF10、UPK1B、VIPR1和ZPLD1。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANTXR2、BTC、CNGA1、CORIN、EGF、EMCN、ENPEP、EPHA5、ERVMER34-1、EVC2、FAT1、FAT4、FGFRL1、FRAS1、GPR125、GRID2、GYPA、GYPB、KDR、KIAA0922、KLB、MFSD8、PARM1、PDGFRA、RNF150、TENM3、TLR10、TLR1、TLR6、TMEM156、TMPRSS11A、TMPRSS11B、TMPRSS11E、TMPRSS11F、UGT2A1和UNC5C。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM19、ADRB2、BTNL3、BTNL8、BTNL9、C5orf15、CATSPER3、CD180、CDH12、CDHR2、COL23A1、CSF1R、F2RL2、FAM174A、FAT2、FGFR4、FLT4、GABRA6、GABRG2、GPR151、GPR98、GRM6、HAVCR1、HAVCR2、IL31RA、IL6ST、IL7R、IQGAP2、ITGA1、ITGA2、KCNMB1、LIFR、LNPEP、MEGF10、NIPAL4、NPR3、NRG2、OR2V1、OR2Y1、OSMR、PCDH12、PCDH1、PCDHA1、PCDHA2、PCDHA4、PCDHA8、PCDHA9、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHGA1、PCDHGA4、PDGFRB、PRLR、SEMA5A、SEMA6A、SGCD、SLC1A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC23A1、SLC36A3、SLC45A2、SLC6A18、SLC6A19、SLCO6A1、SV2C、TENM2、TIMD4和UGT3A1。

25.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：BAI3、BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTNL2、CD83、DCBLD1、DLL1、DPCR1、ENPP1、ENPP3、ENPP4、EPHA7、GABBR1、GABRR1、GCNT6、GFRAL、GJB7、GLP1R、GPR110、GPR111、GPR116、GPR126、GPR63、GPRC6A、HFE、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F、HLA-G、IL20RA、ITPR3、KIAA0319、LMBRD1、LRFN2、LRP11、MAS1L、MEP1A、MICA、MICB、MOG、MUC21、MUC22、NCR2、NOTCH4、OPRM1、OR10C1、OR12D2、OR12D3、OR14J1、OR2B2、OR2B6、OR2J1、OR2W1、OR5V1、PDE10A、PI16、PKHD1、PTCRA、PTK7、RAET1E、RAET1G、ROS1、SDIM1、SLC16A10、SLC22A1、SLC44A4、TAAR2、TREM1、TREML1和TREML2。

26.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AQP1、C7orf50、CD36、CDHR3、CNTNAP2、DPP6、EGFR、EPHA1、EPHB6、ERVW-1、GHRHR、GJC3、GPNMB、GRM8、HUS1、HYAL4、KIAA1324L、LRRN3、MET、MUC12、MUC17、NPC1L1、NPSR1、OR2A12、OR2A14、OR2A25、OR2A42、OR2A7、OR2A2、OR2AE1、OR2F2、OR6V1、PILRA、PILRB、PKD1L1、PLXNA4、PODXL、PTPRN2、PTPRZ1、RAMP3、SLC29A4、SMO、TAS2R16、TAS2R40、TAS2R4、TFR2、THSD7A、TMEM213、TTYH3、ZAN和ZP3。

27.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM18、ADAM28、ADAM32、ADAM7、ADAM9、ADRA1A、CDH17、CHRNA2、CSMD1、CSMD3、DCSTAMP、FZD6、GPR124、NRG1、OR4F21、PKHD1L1、PRSS55、SCARA3、SCARA5、SDC2、SLC10A5、SLC39A14、SLC39A4、SLCO5A1、TNFRSF10A和TNFRSF10B。

28.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA1、AQP7、ASTN2、C9orf135、CA9、CD72、CNTNAP3B、CNTNAP3、CRB2、ENTPD8、GPR144、GRIN3A、IZUMO3、KIAA1161、MAMDC4、MEGF9、MUSK、NOTCH1、OR13C2、OR13C3、OR13C5、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13F1、OR1B1、OR1J2、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L6、OR1L8、OR1N1、OR1N2、OR1Q1、OR2S2、PCSK5、PDCD1LG2、PLGRKT、PTPRD、ROR2、SEMA4D、SLC31A1、TEK、TLR4、TMEM2和VLDLR。

29.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC2、ADAM8、ADRB1、ANTXRL、ATRNL1、C10orf54、CDH23、CDHR1、CNNM2、COL13A1、COL17A1、ENTPD1、FZD8、FGFR2、GPR158、GRID1、IL15RA、IL2RA、ITGA8、ITGB1、MRC1、NRG3、NPFFR1、NRP1、OPN4、PCDH15、PKD2L1、PLXDC2、PRLHR、RET、RGR、SLC16A9、SLC29A3、SLC39A12、TACR2、TCTN3、TSPAN15、UNC5B和VSTM4。

30.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：AMICA1、ANO1、ANO3、APLP2、C11orf24、CCKBR、CD248、CD44、CD5、CD6、CD82、CDON、CLMP、CRTAM、DCHS1、DSCAML1、FAT3、FOLH1、GDPD4、GDPD5、GRIK4、HEPHL1、HTR3B、IFITM10、IL10RA、KIRREL3、LGR4、LRP4、LRP5、LRRC32、MCAM、MFRP、MMP26、MPEG1、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、MS4A4A、MS4A6A、MTNR1B、MUC15、NAALAD2、NAALADL1、NCAM1、NRXN2、OR10A2、OR10A5、OR10A6、OR10D3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10Q1、OR10S1、OR1S1、OR2AG1、OR2AG2、OR2D2、OR4A47、OR4A15、OR4A5、OR4C11、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C46、OR4C5、OR4D6、OR4A8P、OR4D9、OR4S2、OR4X1、OR51E1、OR51L1、OR52A1、OR52E1、OR52E2、OR52E4、OR52E6、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52L1、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52W1、OR56B1、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AK2、OR5AR1、OR5B17、OR5B3、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5I1、OR5L2、OR5M11、OR5M3、OR5P2、OR5R1、OR5T2、OR5T3、OR5W2、OR6A2、OR6T1、OR6X1、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8D1、OR8D2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J2、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR8U1、OR9G1、OR9G4、OR9Q2、P2RX3、PTPRJ、ROBO3、SIGIRR、SLC22A10、SLC3A2、SLC5A12、SLCO2B1、SORL1、ST14、SYT8、TENM4、TMEM123、TMEM225、TMPRSS4、TMPRSS5、TRIM5、TRPM5、TSPAN18和ZP1。

31.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANO4、AVPR1A、BCL2L14、CACNA2D4、CD163、CD163L1、CD27、CD4、CLEC12A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC4C、CLEC7A、CLECL1、CLSTN3、GPR133、GPRC5D、ITGA7、ITGB7、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRF1、KLRF2、LRP1、LRP6、MANSC1、MANSC4、OLR1、OR10AD1、OR10P1、OR2AP1、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6C4、OR6C6、OR6C74、OR6C76、OR8S1、OR9K2、ORAI1、P2RX4、P2RX7、PRR4、PTPRB、PTPRQ、PTPRR、SCNN1A、SELPLG、SLC2A14、SLC38A4、SLC5A8、SLC6A15、SLC8B1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B7、SLCO1C1、SSPN、STAB2、TAS2R10、TAS2R13、TAS2R14、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R31、TAS2R42、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R7、TMEM119、TMEM132B、TMEM132C、TMEM132D、TMPRSS12、TNFRSF1A、TSPAN8和VSIG10。

32.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP4B、ATP7B、FLT3、FREM2、HTR2A、KL、PCDH8、RXFP2、SGCG、SHISA2、SLC15A1、SLITRK6和TNFRSF19。

33.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ADAM21、BDKRB2、C14orf37、CLEC14A、DLK1、FLRT2、GPR135、GPR137C、JAG2、LTB4R2、MMP14、OR11G2、OR11H12、OR11H6、OR4K1、OR4K15、OR4K5、OR4L1、OR4N2、OR4N5、SLC24A4和SYNDIG1L。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ANPEP、CD276、CHRNA7、CHRNB4、CSPG4、DUOX1、DUOX2、FAM174B、GLDN、IGDCC4、ITGA11、LCTL、LTK、LYSMD4、MEGF11、NOX5、NRG4、OCA2、OR4F4、OR4M2、OR4N4、PRTG、RHCG、SCAMP5、SEMA4B、SEMA6D、SLC24A1、SLC24A5、SLC28A1、SPG11、STRA6、TRPM1和TYRO3。

35.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP2C2、CACNA1H、CD19、CDH11、CDH15、CDH16、CDH3、CDH5、CNGB1、CNTNAP4、GDPD3、GPR56、GPR97、IFT140、IL4R、ITFG3、ITGAL、ITGAM、ITGAX、KCNG4、MMP15、MSLNL、NOMO1、NOMO3、OR2C1、PIEZO1、PKD1、PKD1L2、QPRT、SCNN1B、SEZ6L2、SLC22A31、SLC5A11、SLC7A6、SPN、TMC5、TMC7、TMEM204、TMEM219和TMEM8A。

36.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCC3、ACE、AOC3、ARL17B、ASGR2、C17orf80、CD300A、CD300C、CD300E、CD300LF、CD300LG、CHRNB1、CLEC10A、CNTNAP1、CPD、CXCL16、ERBB2、FAM171A2、GCGR、GLP2R、GP1BA、GPR142、GUCY2D、ITGA2B、ITGA3、ITGAE、ITGB3、KCNJ12、LRRC37A2、LRRC37A3、LRRC37A、LRRC37B、MRC2、NGFR、OR1A2、OR1D2、OR1G1、OR3A1、OR3A2、OR4D1、OR4D2、RNF43、SCARF1、SCN4A、SDK2、SECTM1、SEZ6、SHPK、SLC26A11、SLC5A10、SPACA3、TMEM102、TMEM132E、TNFSF12、TRPV3、TTYH2和TUSC5。

37.如权利要求5所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：APCDD1、CDH19、CDH20、CDH7、COLEC12、DCC、DSC1、DSG1、DSG3、DYNAP、MEP1B、PTPRM、SIGLEC15和TNFRSF11A。

38.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABCA7、ACPT、BCAM、C19orf38、C19orf59、C5AR1、CATSPERD、CATSPERG、CD22、CD320、CD33、CD97、CEACAM19、CEACAM1、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CLEC4M、DLL3、EMR1、EMR2、EMR3、ERVV-1、ERVV-2、FAM187B、FCAR、FFAR3、FPR1、FXYD5、GFY、GP6、GPR42、GRIN3B、ICAM3、IGFLR1、IL12RB1、IL27RA、KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIRREL2、KISS1R、LAIR1、LDLR、LILRA1、LILRA2、LILRA4、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LINGO3、LPHN1、LRP3、MADCAM1、MAG、MEGF8、MUC16、NCR1、NOTCH3、NPHS1、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR1I1、OR2Z1、OR7A10、OR7C1、OR7D4、OR7E24、OR7G1、OR7G2、OR7G3、PLVAP、PTGIR、PTPRH、PTPRS、PVR、SCN1B、SHISA7、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC8、SIGLEC9、SLC44A2、SLC5A5、SLC7A9、SPINT2、TARM1、TGFBR3L、TMC4、TMEM91、TMEM161A、TMPRSS9、TNFSF14、TNFSF9、TRPM4、VN1R2、VSIG10L、VSTM2B和ZNRF4。

39.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ABHD12、ADAM33、ADRA1D、APMAP、ATRN、CD40、CD93、CDH22、CDH26、CDH4、FLRT3、GCNT7、GGT7、JAG1、LRRN4、NPBWR2、OCSTAMP、PTPRA、PTPRT、SEL1L2、SIGLEC1、SIRPA、SIRPB1、SIRPG、SLC24A3、SLC2A10、SLC4A11、SSTR4和THBD。

40.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CLDN8、DSCAM、ICOSLG、IFNAR1、IFNGR2、IGSF5、ITGB2、KCNJ15、NCAM2、SLC19A1、TMPRSS15、TMPRSS2、TMPRSS3、TRPM2和UMODL1。

41.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：CACNA1I、CELSR1、COMT、CSF2RB、GGT1、GGT5、IL2RB、KREMEN1、MCHR1、OR11H1、P2RX6、PKDREJ、PLXNB2、SCARF2、SEZ6L、SSTR3、SUSD2、TMPRSS6和TNFRSF13C。

42.如权利要求1所述的方法，其中所述包含细胞外多态性表位的基因选自由以下组成的组：ATP6AP2、ATP7A、CNGA2、EDA2R、FMR1NB、GLRA4、GPR112、GUCY2F、HEPH、P2RY10、P2RY4、PLXNA3、PLXNB3、TLR8、VSIG4和XG。

43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、皮肤肿瘤、胰腺肿瘤、结直肠肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病、肺肿瘤和神经胶质瘤。

44.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：肾上腺肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、DLBC、乳腺肿瘤、肉瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、膀胱肿瘤和肝肿瘤。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述肾上腺肿瘤是肾上腺皮质癌。

46.如权利要求44所述的方法，其中所述肾肿瘤是嫌色细胞肾细胞癌。

47.如权利要求44所述的方法，其中所述黑素瘤是葡萄膜黑素瘤。

48.一种安全效应免疫细胞，其表达(i)根据权利要求1至46中任一项所述的iCAR或pCAR和(ii)活化性嵌合抗原受体(aCAR)。

49.如权利要求48所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位。

50.如权利要求48所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关蛋白，如表1中列出的CAR靶标，在也表达iCAR的肿瘤组织中表达的任何细胞表面蛋白。

51.如权利要求50所述的安全效应免疫细胞，其中所述非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD10、CD7、CD49f、CD56、CD74、CAIXIgκ、ROR1、ROR2、CD30、LewisY、CD33、CD34、CD38、CD123、CD28、CD44v6、CD44、CD41、CD133、CD138、NKG2D-L、CD139、BCMA、GD2、GD3、hTERT、FBP、EGP-2、EGP-40、FR-α、L1-CAM、ErbB2,3,4、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、间皮素、c-MET、PSMA、CEA、kRas、MAGE-A1、MUC1 MUC16、PDL1、PSCA、EpCAM、FSHR、AFP、AXL、CD80、CD89、CDH17、CLD18、GPC3、TEM8、TGFB1、NY-ESO-1、WT-1和EGFR。

52.如权利要求50所述的安全效应免疫细胞，其中所述非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：5T4、AFP、AXL、B7H6、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD44v6、CD5、CD7、CD70、CD80、CD89、CDH17、CEA、CLD18、CLEC14a、CLL-1、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、NY-ESO-1、FAP、FHSR、GP100、GPC3、HER2、IL-13R_、IL-13R_2、K-Ras、间皮素、MUC1、MUC-CD、NKG2D配体、NKG2D_配体、PDL1、PSCA、PSMA、ROR1、ROR-2、生存素、TEM8、TGF、VEGFR2和ALK。

53.如权利要求48至52中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞是自体或通用(同种异体)效应细胞。

54.如权利要求48至53中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞。

55.如权利要求48至54中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR的表达水平高于或等于所述aCAR的表达水平。

56.如权利要求48至55中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR由第一载体表达，且所述aCAR由第二载体表达。

57.如权利要求48至56中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR和所述aCAR两者都由同一载体表达。

58.如权利要求57所述的安全效应免疫细胞，其中编码所述aCAR的核苷酸序列在编码所述iCAR或pCAR的核苷酸序列的下游。

59.如权利要求57所述的安全效应免疫细胞，其中所述核苷酸序列包含在编码所述aCAR的核苷酸序列和编码所述iCAR或pCAR的核苷酸序列之间的病毒自切割2A肽。

60.如权利要求59所述的安全效应免疫细胞，其中所述病毒自切割2A肽选自由以下组成的组：来自明脉扁刺蛾病毒(TaV)的T2A、来自口蹄疫病毒(FMDV)的F2A、来自A型马鼻炎病毒(ERAV)的E2A和来自猪捷申病毒1型(PTV1)的P2A。

61.如权利要求57所述的安全效应免疫细胞，其中编码所述aCAR的核苷酸序列通过柔性接头与所述iCAR或pCAR连接。

62.如权利要求48至60中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR包含活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件。

63.如权利要求62所述的安全效应免疫细胞，其中活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与例如CD3ζ或FcRγ链的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)同源。

64.如权利要求62所述的安全效应免疫细胞，其中活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与活化性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)例如KIR2DS和KIR3DS同源。

65.如权利要求62中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与衔接分子例如DAP12同源或者是衔接分子例如DAP12。

66.如权利要求62所述的安全效应免疫细胞，其中活化或共刺激效应免疫细胞的至少一种信号转导元件与CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件同源或者是CD27、CD28、ICOS、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)或GITR的共刺激信号转导元件。

67.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR针对靶标细胞外多态性表位，其中所述靶标细胞外多态性表位是HLA。

68.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述aCAR针对或特异性地结合肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位，其中所述肿瘤相关抗原或非多态性细胞表面表位选自由以下组成的组：EGFR、HER2、间皮素和CEA。

69.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR针对HLA，且所述aCAR针对或特异性地结合EGFR、HER2、间皮素和/或CEA。

70.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR针对HLA，且所述aCAR针对或特异性地结合EGFR。

71.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR针对HLA，且所述aCAR针对或特异性地结合HER2。

72.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR针对HLA，且所述aCAR针对或特异性地结合间皮素。

73.如权利要求48至66中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述iCAR或pCAR针对HLA，且所述aCAR针对或特异性地结合CEA。

74.如权利要求67至82中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中被所述安全效应免疫细胞靶向的肿瘤/癌症是胰腺癌或肺癌或源自胰腺癌或肺癌的细胞。

75.如权利要求48至83中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分。

76.如权利要求48至84中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分。

77.如权利要求48至85中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中所述安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

78.如权利要求48至84中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中所述安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

79.如权利要求48至85中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中所述安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

80.如权利要求48至84中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，并且其中所述安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

81.如权利要求48至84中任一项所述的安全效应免疫细胞，其中所述安全效应免疫细胞包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR和aCAR两者。

82.一种治疗患有以LOH为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用根据权利要求1至88中任一项所述的表达iCAR和aCAR的安全效应免疫细胞。

83.一种治疗患有以基因突变为特征的肿瘤的患者中的癌症的方法，所述基因突变导致靶基因或靶标细胞外多态性表位基因的表达完全丧失，所述方法包括向患者施用根据权利要求1至88中任一项所述的安全效应免疫细胞。

84.一种编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。

85.一种编码aCAR或其部分的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

86.一种核酸序列或核酸序列组合物，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

87.一种编码iCAR或pCAR或其部分的核酸序列或核酸序列组合物，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。

88.一种编码aCAR或其部分的核酸序列或核酸序列组合物，其中所述核酸序列编码选自由以下组成的组的氨基序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。

89.一种核酸序列或核酸序列组合物，其包含：1)编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，和2)编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

90.一种核酸序列或核酸序列组合物，其编码：1)iCAR或pCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；和2)编码选自由以下组成的组的氨基序列的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45，其中所述核酸序列编码aCAR或其部分。

91.一种核酸序列或核酸序列组合物，其包含：1)编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49，其中所述核酸序列编码iCAR或pCAR或其部分，和2)aCAR或其部分，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38。

92.一种编码iCAR和aCAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。

93.一种载体，其包含如权利要求93至101中任一项所述的核酸或核酸序列组合物。

94.一种载体组合物，其包含：

1)第一表达载体，其包含如权利要求93或96中任一项所述的核酸，和

2)第二表达载体，其包含如权利要求94或97中任一项所述的核酸。

95.一种安全效应细胞，其包含如权利要求93至101中任一项所述的核酸或核酸序列组合物。

96.一种安全效应细胞，其包含如权利要求102或103中任一项所述的载体或载体组合物。