WO2016175275A1 - Ｐｄ－ｌ１（ｃｄ２７４）の異常を指標としたｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１阻害剤の治療効果予測方法 - Google Patents

Ｐｄ－ｌ１（ｃｄ２７４）の異常を指標としたｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１阻害剤の治療効果予測方法 Download PDF

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圭亮 片岡
賢吾 竹内
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the therapeutic effect of a PD-1 / PD-L1 inhibitor such as an anti-PD-1 antibody by examining the presence or absence of a PD-L1 gene abnormality in tumor cells.
  • PD-1 / PD-L1 inhibitors are effective for various malignant tumors including metastatic malignant melanoma, renal cancer, lung cancer and Hodgkin's disease.
  • nivolumab an anti-PD-1 monoclonal antibody
  • PD-1 / PD-L1 inhibitors have already been shown to be effective in many malignant tumors, but some include malignant tumors with low response rates. However, even in such tumors, there is a possibility that some cases have PD-L1 structural abnormality and high expression associated therewith. However, no useful method has been established to select cases where PD-1 / PD-L1 inhibitors may be effective.
  • the present invention aims to provide an effective method for predicting the therapeutic effect of a PD-1 / PD-L1 inhibitor. Furthermore, we will develop a platform to select and treat cases where these inhibitors are likely to be effective even in tumors where PD-1 / PD-L1 inhibitors have not been used.
  • the present inventors conducted an exhaustive gene analysis of adult T-cell leukemia / lymphoma (adult T-cell leukemia / lymphoma: ATL) (RNA sequence ⁇ 57 cases, whole genome sequence 11 cases). It was clarified that PD-L1 (CD274) structural abnormality exists in%. This structural abnormality includes all structural abnormalities such as deletion, tandem duplication, inversion, and translocation, and 3'UTR deletion is common to all. It was. Furthermore, in all cases with structural abnormalities, a significant increase in PD-L1 mRNA was observed in all cases, and an increase in PD-L1 protein expression on the cell surface was also observed by flow cytometry.
  • the present inventors have found that the effect of a PD-1 / PD-L1 inhibitor can be determined and evaluated using the 3'UTR deletion of the PD-L1 gene as an index, and the present invention has been completed. I came to let you.
  • the present invention is as follows.
  • the genomic abnormality related to the effectiveness of the PD-1 / PD-L1 inhibitor is an abnormality of the PD-L1 gene related to enhanced expression of the PD-L1 (CD274) gene .
  • PD-L1 protein in tumor cells collected from a subject is stained by immunohistochemical staining using an anti-C-terminal antibody against PD-L1 and an anti-N-terminal antibody against PD-L1, and anti-PD-L1 If staining is observed with an N-terminal antibody, but staining is not observed with an anti-C-terminal antibody against PD-L1, it is evaluated that a PD-1 / PD-L1 inhibitor is effective in treating the subject [2 ]the method of.
  • the malignant tumor is from the group consisting of adult T-cell leukemia / lymphoma, stomach cancer, colon cancer, bladder cancer, cervical cancer, kidney cancer, lung adenocarcinoma, cutaneous malignant melanoma and B-cell lymphoma Any one of [1] to [11] is selected. [13] The method according to any one of [1] to [11], wherein the malignant tumor is selected from the group consisting of esophageal cancer, head and neck cancer, and endometrial cancer. [14] The method of any one of [1] to [13], wherein the PD-1 / PD-L1 inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • PD-L1 is highly expressed due to structural abnormality of the PD-L1 gene in various malignant tumors. That is, we have identified gene abnormalities in various malignant tumors that exceed the normal expectations of PD-L1, which is the center of immune checkpoints, and the resulting fusion gene with the non-coding region.
  • anti-PD-1 / PD-L1 inhibitors are overwhelmingly effective in the preclinical study (mouse model) and Hodgkin's disease, the only known PD-L1 constitutive activation due to genomic abnormalities.
  • anti-PD-1 / PD-L1 inhibitors are expected to be extremely effective in patients with PD-L1 structural abnormalities and are expected to be promising biomarkers Is done. Therefore, genetic abnormalities directly linked to highly effective treatments are extremely promising as targets for clinical tests.
  • the therapeutic effects of PD-1 / PD-L1 inhibitors may be predicted by detecting PD-L1 structural abnormalities .
  • the tumors for which PD-1 / PD-L1 inhibitors are not currently used there is a possibility that PD-1 / PD-L1 inhibitors may be effective when PD-L1 gene abnormalities are present, The possibility of establishing a new treatment method is expected by selecting such cases.
  • the indication disease can be efficiently expanded by conducting a clinical trial using the structural abnormality of PD-L1 as an index. This may extend to not only malignant tumors for which indications are currently approved or under consideration, but also to malignant tumors that are not fully effective as a whole.
  • CD274 overexpression is induced
  • CD274 high expression accompanying CD274 3'UTR abnormality induces apoptosis in PD-1-expressing T cells.
  • the protocol of the experiment which evaluates the influence which CD274 high expression accompanying CD274 3'UTR abnormality has on tumorigenicity.
  • the present invention evaluates and determines the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor in the patient using as an index a genomic abnormality related to the effectiveness of the PD-1 / PD-L1 inhibitor in a malignant tumor patient.
  • evaluation and determination are also referred to as prediction.
  • PD-L1 is also referred to as CD274, B7-H1.
  • a genomic abnormality related to the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor refers to the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor when the abnormality is observed in the genome of a malignant tumor patient.
  • An anomaly that rises examples include an abnormality of chromosome 9p24.1 where the PD-L1 gene is present and an abnormality of the PD-L1 gene.
  • Such an abnormality is also referred to as a structural abnormality (SV) of the PD-L1 gene.
  • SV structural abnormality
  • abnormal expression of PD-L1 can be caused in tumor cells of patients with malignant tumors.
  • Genomic abnormalities related to the effectiveness of PD-1 / PD-L1 inhibitors include structural amplification such as gene amplification (tandem plicationduplication), deletion (deletion), inversion (inversion), and translocation. Including abnormalities and copy number such as amplification / deletion / uniparental disomy, and qualitative (deletion of 3'UTR) and quantitative abnormalities of expression products and transcripts.
  • Abnormal expression of PD-L1 in tumor cells means that it is increased compared to that of healthy individuals or compared to PD-L1 gene expression in tumor cells in which no abnormality of PD-L1 gene is observed.
  • the expression of PD-L1 is 5 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, more preferably 50 times or more at the mRNA or protein level.
  • the living body has an anti-tumor immune function in which T cells attack tumor cells, but PD-1 (Programmed cell death 1) in which PD-L1 ligand expressed in tumor cells is expressed in T cells Upon binding, cell death of T cells is induced and antitumor immune function is suppressed.
  • the PD-1 / PD-L1 inhibitor inhibits the antitumor immune function of T cells from being suppressed by inhibiting the binding between PD-L1 of tumor cells and PD-1 of T cells.
  • Examples of PD-1 / PD-L1 inhibitors include anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies.
  • nivolumab As anti-PD-1 / PD-L1 antibodies used as cancer therapeutics, nivolumab (Nivolumab ), MPDL3280A, pembrolizumab (MK-3475), MEDI4736, MSB0010718C, Pidilizumab, MEDI0680, and the like.
  • PD-1 / PD-L1 inhibitors are highly effective in patients with high expression of PD-L1 in tumor cells and surrounding immune cells. Therefore, there is a possibility that the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor can be determined by measuring the expression level of PD-L1. For example, the expression of PD-L1 in tumor cells can be confirmed by immunostaining, but the evaluation of the PD-L1 positive rate by immunostaining was insufficient in sensitivity and specificity.
  • genomic abnormalities in patients with malignant tumors are related to the effectiveness of PD-1 / PD-L1 inhibitors in tumor cells
  • genomic abnormalities are related to increased expression of the PD-L1 gene.
  • the expression of PD-L1 gene in the tumor cells can be measured at the mRNA level or protein level to increase genomic abnormality and PD-L1 gene expression. It can be determined by associating.
  • DNA is isolated from tumor cells, the whole genome is sequenced, and structural abnormalities of the genome such as amplification (tandem ⁇ duplication), inversion, translocation, deletion (deletion) are analyzed, Simultaneously, the total RNA of the tumor cell is sequenced, the expression of the PD-L1 gene is measured, and the relationship between the genomic abnormality and the expression of the PD-L1 gene is analyzed. For example, in many tumor cells with a certain genomic abnormality, when PD-L1 gene expression is increased, the abnormality is associated with increased PD-L1 gene expression and PD-1 / PD-L1 inhibition It can be determined that it is related to the effectiveness of the agent.
  • structural abnormalities of the genome such as amplification (tandem ⁇ duplication), inversion, translocation, deletion (deletion) are analyzed.
  • the total RNA of the tumor cell is sequenced, the expression of the PD-L1 gene is measured, and the relationship between the genomic abnormality and the expression of the PD-
  • the tumor that can be used to evaluate and determine the effectiveness of a PD-L1 / PD-1 inhibitor by the method of the present invention is not limited, and at least adult T-cell leukemia / lymphoma, stomach cancer, colon cancer, bladder cancer, child Examples include cervical cancer, renal cancer, lung adenocarcinoma, cutaneous malignant melanoma, B cell lymphoma, esophageal cancer, head and neck cancer, endometrial cancer and the like. Colorectal cancer also includes colon cancer and rectal cancer.
  • a tumor specimen of a subject suffering from a malignant tumor may be collected and the genomic abnormality of the tumor cells of the specimen may be analyzed.
  • genomic abnormalities related to the effectiveness of PD-1 / PD-L1 inhibitors to be analyzed include the following abnormalities.
  • Genome abnormality with 3'UTR (3 'untranslated region) deletion of PD-L1 gene The PD-L1 gene is present in the 9p24.1 region, and its structural abnormality includes amplification (tandem duplication) and inversion. (Inversion), translocation, and deletion.
  • a deletion in the 3′UTR due to a structural abnormality of the PD-L1 gene high expression of PD-L1 is caused.
  • 3′UTR is a region that plays an important role in mRNA stability and translational regulation, and deletion of this region causes loss of these functions.
  • Deletion of 3′UTR of PD-L1 gene includes complete deletion and partial deletion.
  • examples of copy number abnormality (CNV) in the 9p24.1 region containing the PD-L1 gene include amplification, reduction, and uniparental disomy. Abnormal copy number occurs with structural abnormalities, but when 3'UTR is deficient, high expression of PD-L1 is caused.
  • PD-L1 Part of the PD-L1 gene lacking the 3 'UTR is cleaved in the middle of the exon region, producing a protein different from wild-type PD-L1.
  • PD-L1 consists of three domains, an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain, and the extracellular domain and the transmembrane domain are involved in binding to PD-1. Even when the PD-L1 gene is cleaved in the middle of the exon region, PD-L1 retains the ability to bind to PD-1.
  • PD-L1 has a function of suppressing antitumor immunity as long as it retains the extracellular domain and the transmembrane domain. Therefore, regardless of whether the PD-L1 protein is cleaved or not, tumor cells that are highly expressing the PD-L1 protein due to the genomic abnormality of the PD-L1 gene suppress tumor immunity with the PD-1 / PD-L1 inhibitor. Function can be inhibited. Accordingly, PD-1 / PD-L1 inhibition is effective for the treatment of malignant tumors having a PD-L1 gene genomic abnormality.
  • the base sequence of PD-L1 gene is registered as NM_014143.
  • the nucleotide sequence of 3′UTR of PD-L1 gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • PD-L1 mRNA abnormalities include partial or partial cleavage of the 3 ′ UTR of mRNA and high expression associated therewith. Furthermore, it may be accompanied by a cut after exon 5 or 6. Examples of exon cleavage include cutting of exon 6 and exon 7 as a whole, cutting of exon 7 as a whole, and cutting from the middle of exon 7. In the present invention, such exon cleavage is referred to as the whole or partial cleavage of exon 6 or exon 7. Furthermore, exon 4 and subsequent breaks can occur, ie, exon 5, exon 6 and exon 7 as a whole.
  • An abnormal expression of PD-L1 protein includes high expression.
  • High expression of the PD-L1 protein is associated with structural abnormality of the PD-L1 gene, independent of the amplification of the copy number of the PD-L1 gene.
  • exon 5 or 6 constitutes the intracellular domain of PD-L1 protein, when accompanied by a deletion after exon 4, abnormalities in PD-L1 protein include partial deletion of the intracellular domain.
  • HPV and EBV Epstein-barr virus
  • HPV human papilloma virus
  • HPV human papilloma virus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • HPV human papilloma virus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Analysis of genomic abnormalities related to the effectiveness of PD-1 / PD-L1 inhibitors can be performed using tumor cells collected from patients with malignant tumors and using normal methods for analyzing genomic structural and genetic abnormalities. it can.
  • DNA or RNA is extracted from tumor cells and directly analyzed by known methods such as PCR / Sanger sequencing method, dideoxy method or Maxam-Gilbert method, analysis method by sequence analysis, whole genome sequence, whole exon sequence, target Specific to regions with gene abnormalities such as comprehensive gene analysis methods using next-generation sequencers including sequences, FISH (fluorescence in situ hybridization) methods, copy number analysis methods using SNP arrays, CGH arrays, etc.
  • Hybridization methods using a typical probe or a microarray (DNA chip) to which the probe is immobilized and various methods using primers specific to a region where a gene abnormality exists.
  • Examples of the method using a primer include PCR method, NASBA method, LCR method, SDA method, LAMP method, method using restriction fragment length polymorphism (RFLP), primer extension method (TaqMan (registered trademark) method) and the like.
  • FLX GD
  • FuSeq Illumina
  • the 3'UTR deletion of the PD-L1 gene can be detected by a method using a probe or primer. It can also be detected by RNA sequencing or FISH method.
  • Detection of 3'UTR deletion in mRNA can be performed by calculating the ratio of the transcription amount of exon (exons 1 to 5) and 3'UTR transcription amount of the PD-L1 gene where deletion is not observed. It is.
  • mRNA of exon 1 to 5 of PD-L1 gene for example, exon 3 or exon 4 mRNA and 3'UTR region mRNA is quantified by RNA sequencing or quantitative PCR, and exon 3 or exon 4 expression /
  • the ratio of 3′UTR expression the presence or absence of 3′UTR expression, that is, the presence or absence of 3′UTR deletion can be determined. If the ratio is large, it can be determined that the 3 ′ UTR is missing.
  • Exon 3 expression / 3'UTR expression ratio is large when the ratio of exon 3 expression / 3'UTR expression in tumor cells in which PD-L1 gene abnormality is not observed is large,
  • the ratio of exon 3 expression / 3′UTR expression is not less than a predetermined value, for example, it is 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more.
  • the ratio of exon 4 expression / 3'UTR expression is large when the ratio of exon 4 expression / 3'UTR expression in tumor cells in which PD-L1 gene abnormality is not observed is large.
  • the ratio of exon 4 expression / 3′UTR expression is not less than a predetermined value, for example, it is 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more.
  • PD-L1 gene expression abnormality can be detected by using (semi) quantitative PCR such as RQ-PCR and RT-PCR for PD-L1 mRNA in tumor cells.
  • RQ-PCR is a technique that detects the accumulation of PCR products continuously during the PCR process, thereby allowing easy and accurate quantification in the early exponential phase of PCR.
  • Probes and primers used in the above method hybridize to these sequences under a nucleotide sequence containing a genomic abnormal site related to enhanced expression of the PD-L1 gene, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or stringent conditions. It consists of a nucleotide fragment (preferably a DNA fragment) comprising the sequence obtained, and the number of bases is 5-50, preferably 10-30, more preferably 10-25.
  • the expressed abnormal protein is the PD-L1 protein. It reacts with an antibody against the C-terminal region (anti-C-terminal antibody against PD-L1), but does not react with an antibody against the N-terminal region of the PD-L1 protein (anti-N-terminal antibody against PD-L1).
  • the structural abnormality of the PD-L1 gene can be identified.
  • PD-L1 protein in tumor cells may be stained and visualized using an anti-C-terminal antibody against PD-L1 and an anti-N-terminal antibody against PD-L1 stained with a fluorescent dye or the like. If staining is observed with the anti-N-terminal antibody, but staining is not observed with the anti-C-terminal antibody, it can be determined that there is a structural abnormality in the PD-L1 gene.
  • PD-1 is used for the treatment of the malignant tumor in the subject.
  • / PD-L1 inhibitor can be evaluated and judged as highly likely to be effective.
  • a PD-1 / PD-L1 inhibitor is used to treat the malignant tumor. It is possible to evaluate and determine that there is a high possibility of being effective.
  • the proportion of patients with effective PD-1 / PD-L1 inhibitors varies depending on the malignant tumor.
  • adult T-cell leukemia / lymphoma, stomach cancer, colon cancer, bladder cancer, cervical cancer, kidney cancer, lung cancer, cutaneous malignant melanoma, B-cell lymphoma, esophageal cancer, head and neck cancer In endometrial cancer, it has been found that PD-L1 expression is increased in 3'UTR abnormal cases of transcripts.
  • the effectiveness of the PD-1 / PD-L1 inhibitor can be evaluated and determined by the method of the present invention.
  • the method of the present invention is used to evaluate whether PD-1 / PD-L1 inhibitors are effective for patients suffering from malignant tumors. Can be determined.
  • the proportion of patients with effective PD-1 / PD-L1 inhibitors is high in adult T-cell leukemia, gastric cancer, etc., but may be low in malignant melanoma, lung cancer, renal cancer, and the like.
  • the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor for a patient suffering from a malignant tumor in a malignant tumor with a high proportion of patients for whom a PD-1 / PD-L1 inhibitor is effective Not only can sex be evaluated and determined, but the proportion of patients with effective PD-1 / PD-L1 inhibitors is low, and malignant tumors that have not previously been applied to PD-1 / PD-L1 It becomes possible to evaluate and determine the effectiveness of PD-1 / PD-L1 inhibitors in patients suffering from malignant tumors.
  • the present invention relates to a method for predicting whether a PD-1 / PD-L1 inhibitor is effective for treatment in a subject suffering from a malignant tumor.
  • -A malignant tumor with low L1 inhibitor efficacy detected abnormalities in the genome associated with the effectiveness of PD-1 / PD-L1 inhibitor in tumor cells collected from subjects Is present in a tumor in which the effectiveness of the PD-1 / PD-L1 inhibitor is low, by evaluating that the PD-1 / PD-L1 inhibitor is effective for the treatment of the subject.
  • Also encompassed are methods for expanding the indication of 1 / PD-L1 inhibitors.
  • the method of the present invention evaluates and determines whether a PD-1 / PD-L1 inhibitor is effective for various malignant tumors or individual patients suffering from various malignant tumors. This makes it possible to select a treatment suitable for the patient.
  • Abnormal PD-L1 gene associated with increased expression of PD-L1 gene is observed in tumor cells collected from the subject, and PD-1 / PD-L1 inhibitors are effective in treating malignant tumors in the subject If it is possible to evaluate and determine that there is a high possibility that the subject is an anti-PD-1 monoclonal antibody, an immune check for PD-1 / PD-L1 inhibitors including anti-PD-L1 monoclonal antibodies, etc.
  • a point inhibitor may be administered.
  • the dose varies depending on age, body weight, symptoms, etc., but once a few days, weeks or months, 0.001 mg to 100 mg is administered parenterally such as intravenous injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, etc. Or by oral administration.
  • the inhibitor to be administered may contain a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • the form of the inhibitor is not limited, and examples thereof include oral administration using tablets, capsules, granules, powders, syrups, and parenteral administration using injections, drops, suppositories, sprays, and the like.
  • RNA sequencing using 57 ATL (adult T-cell leukemia) tumor specimens and 11 genome-wide (buccal mucosa) pairs of genomes were performed.
  • RNA of the tumor sample was extracted with RNeasy Mini Kit (QIAGEN), and RINe was measured using Agilent RNA ScreenTape System (Agilent).
  • the library for RNA sequencing was prepared by NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit (New England Biolabs) using RNA of 200-500ng and RINe 7 or more, and the base sequence was determined using HiSeq2000 / 2500.
  • the data is analyzed using an algorithm called Genomon Fusion (http://genomon.hgc.jp/rna/) published by the Human Genome Center of the Institute of Medical Science, the University of Tokyo, to identify and express the fusion gene. It was.
  • the whole genome sequence library was created using WGS “using NEBNext DNA Library Prep Reagent” (New England Biolabs), and the base sequence was determined using HiSeq2000 / 2500.
  • Structural abnormalities are tandem duplication (amplification) (thick diagonal line from upper right to lower left) 3 cases, inversion (inversion) (thin diagonal line from upper left to lower right) 3 cases, translocation (translocation) (white) 3 cases, deletion (Deletion) (thin diagonal line from upper right to lower left) There were 2 cases and various.
  • CD274 was remarkably expressed in most cases.
  • CD274 consists of 7 exons, and 3'UTR occupies most of exon 7.
  • FIG. 5 The base sequence at the bottom of FIG. 5 is the sequence of the transcript in the case of structural abnormality (+) (Miya26). Wild type CD274 is transcribed up to the 3 'end of exon 6, but thereafter it is linked to the intron region of the CBLB gene on chromosome 3 (the boxed area). In that region, it contains a stop codon (TGA in italics), polyA signal sequence (AATAAA: sequence necessary for polyA binding, underlined part), and polyA sequence (double underlined part). This result indicates that the alternative transcript formed by CD274 structural abnormality functions as an appropriate transcript.
  • the entire sequence shown in FIG. 5 is shown in SEQ ID NO: 1, and the sequence of 3′UTR is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequence of an example in which the CD274 transcript is cleaved (Method) NP_054862 was referred as a reference sequence. 5.
  • the amino acid sequence was identified in silico.
  • CD274 is composed of an extracellular domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain, but for the immune evasion of tumor cells by the PD1 / PD-L1 mechanism, the former two Domain is considered important.
  • FIG. 6 shows a sequence in the middle of the transmembrane domain (sequence shown by a portion surrounded by a frame).
  • the portion surrounded by a frame is the transmembrane domain sequence
  • the underlined italicized portion is the intracellular domain sequence.
  • “CD274 Wt” in the upper part of FIG. 6 represents a wild type sequence.
  • CD274 cuts (Miya15, Miya24, Miya26, Miya30, Sas8, Kyo4), the former two domains are maintained, and alternative transcripts may also function as CD274. Was suggested to be high.
  • CD274 protein expression on membrane surface using ATL patient-derived cells The expression of CD274 on the cell surface was evaluated by flow cytometry using tumor cells of cases where CD274 structural abnormalities were identified by RNA sequencing. Tumor cells were stained with PE / Cy7 anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody (clone: 29E.2A3, BioLegend) and analyzed with LSR2 Fortessa (BD Biosciences).
  • CD274 was also lowly expressed in structural abnormality ( ⁇ ) cases, but markedly high expression of CD274 was confirmed in structural abnormality (+) cases, and the expression level was increased about 100 times.
  • ACC Adrenal cancer
  • BLCA Bladder cancer
  • CESC Cervical cancer
  • COAD Colon cancer
  • DLBC Diffuse large B-cell lymphoma
  • ESCA Esophageal cancer
  • GBM Glioblastoma
  • HNSC Head and neck cancer
  • KICH Renal chromophore cell carcinoma
  • KIRC Clear gastric cell carcinoma
  • KIRP Papillary renal cell carcinoma
  • LAML Acute myeloid leukemia
  • LGG Low grade glioma
  • LIHC hepatocellular carcinoma
  • LUAD lung adenocarcinoma
  • LUSC lung squamous cell carcinoma
  • MESO malignant mesothelioma
  • OV ovarian cancer
  • PAAD pancreatic cancer
  • PCPG pheochromocytoma
  • PRAD prostate Cancer
  • READ Colon cancer
  • PCPG pheochromocytoma
  • PRAD prostate Cancer
  • READ Colon cancer
  • TCGA also publishes expression data calculated from RNA sequence data (RSEM values are used, and RPKM values are only used for gastric cancer). Using the data, the expression of CD274 (after logarithmic conversion) was displayed as a histogram for each case in each cancer.
  • FIG. 9 shows the results of four types of cancer as an example. High expression of CD274 was observed only in some cases in various cancers. Therefore, the cut-off value was determined based on the expression value, and detailed analysis was performed. As the cut-off values, RSEM values other than gastric cancer, RPKM values for gastric cancer were each logarithmically converted, 8 was used for non-gastric cancer, and 11 was used for gastric cancer. It is a value set appropriately.)
  • SKCM is cutaneous malignant melanoma (FIG. 9A)
  • COADREAD is colon cancer (FIG. 9B)
  • STAD is stomach cancer (FIG. 9C)
  • DLBC diffuse large B-cell lymphoma
  • bladder cancer BLCA 1 case
  • cervical cancer CEC 1 case
  • kidney cancer KIRC 1 case
  • lung adenocarcinoma LAD 2 cases
  • colon cancer COAD
  • RTD Rectal cancer
  • SKCM cutaneous malignant melanoma
  • STAD gastric cancer
  • FIG. 11 also shows two examples of B cell lymphoma (DLBC) as an example (FIGS. 11A and B).
  • DLBC B cell lymphoma
  • FIGS. 10 and 11 indicate that structural abnormality of CD274 including 3′UTR and accompanying CD274 high expression occur in various cancers.
  • tumor samples were collected according to a protocol approved by the Ethics Committee of Kyoto University, and comprehensive gene mutation analysis was performed.
  • copy number analysis was performed by SNP array using ATL426 tumor samples (Affymetrix 250K 282 cases, Illumina 610K 144 cases).
  • the algorithm used CNAG / AsCNAR and GISTIC2.0 to identify local copy number amplification / decrease sites.
  • Fig. 13 shows the results of CNAG.
  • the upper row shows amplification of copy number
  • the lower row shows decrease in copy number.
  • Much of the copy number amplification in the 9p24.1 region called by GISTIC includes part of the CD274 gene, which causes copy number amplification such that the 3 'UTR is deleted.
  • a copy number decrease including a part of the CD274 gene on the 3 'side is also observed, confirming that the 3' UTR deficiency is also caused by the copy number decrease.
  • At least in cases with copy number amplification of Miya23, Miya24, and Miya26 structural abnormalities (+) with 3′UTR deletion in the whole genome sequence and high expression of CD274 were confirmed in the RNA sequence. It was also confirmed in cases with reduced copy numbers of Miya37, Miya38, and Sas2.
  • RNA is extracted from ATL tumor specimens using RNeasy Mini Kit (QIAGEN), reverse transcription is performed using ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT RT Kit (TOYOBO), and PCR reaction is performed using SYBR Premix E Ex Taq II (TAKARA) went.
  • the sequence of the forward primer was GGCATCCAAGATACAAACTCAA (SEQ ID NO: 10)
  • the sequence of the reverse primer was CAGAAGTTCCAATGCTGGATTA (SEQ ID NO: 11).
  • PCR was performed at a holding temperature of 95 ° C. for 10 sec, Cycling (95 ° C. for 5 sec, 60 ° C. for 30 sec, 72 ° C. for 30 sec) ⁇ 50 cycels.
  • Detection was performed using a LightCycler (registered trademark) 480® System (Roche® Applied Science).
  • the ratio with CD274 was shown using 18S as an internal control.
  • the antigen-antibody complex was visualized using Histofine (registered trademark) Simple Stain MAX PO (Nichirei Bioscience).
  • FIG. 15A shows ATL059 without PD-L1 SV (ATL059: PD-L1 SV (-)), and Fig. 15B shows ATL075 with PD-L1 SV (+) and ORF maintained (ATL075: PD-L1 SV (+) , intact ORF),
  • FIG. 15C shows the result of ATL012 (ATL012: PD-L1 SV (+), truncated ORF) in which the ORF is cut by SV (+).
  • 15 shows the result of immunostaining using an anti-N-terminal antibody
  • the lower part of FIG. 15 shows the result of immunostaining using an anti-C-terminal antibody.
  • FIG. 15A tumor cells were not stained with ATL059 without PD-L1 SV (FIG. 15A shows large cells that are sporadically stained and appear gray in a monochrome photograph. This is a macrophage).
  • ATL012 in which ORF was cleaved with SV (+) showed strong staining with anti-N-terminal antibody, but no staining was observed with anti-C-terminal antibody.
  • RNA sequence data A total of 1691 cases of RNA sequence data were downloaded and analyzed. Using that data, the expression of CD274 (after logarithmic conversion of the RPKM value of exon IV 4) was displayed for each case in each carcinoma.
  • black circles are cases of CD274 fusion gene (+) and / or CD274 exon 4 / 3'UTR ratio high value, and double circles are cases of virus insertion (+) in the CD274 region.
  • CD274 fusion gene (+) and / or virus insertion (+) and / or high CD274 exon 4 / 3′UTR ratio were observed in the CD274 region. From this result, it became clear that the abnormalities that the 3′UTR of CD274 is cleaved are observed in various cancers. Furthermore, in these cases, there are many cases where CD274 is highly expressed among the respective carcinomas, suggesting that 3′UTR is extremely important in regulating CD274 expression.
  • BLCA Bladder cancer 1 case
  • CESC Cervical cancer 2 cases
  • COAD 2 cases of colon cancer
  • DLBC B-cell lymphoma 4 cases
  • ESCA Esophageal cancer 1 case
  • HNSC head and neck cancer 1 case
  • KIRC renal cancer 1 case
  • LUAD lung adenocarcinoma 2 cases
  • READ Rectal cancer 1 case
  • SKCM Malignant melanoma 1 case
  • STAD 9 cases of stomach cancer
  • UCEC endometrial cancer 1 case
  • FIG. 17 shows the verification results of VS-A9U7-01 case (CESC) (FIG. 17A) and FP-7998-01 case (STAD) (FIG. 17B).
  • CD274 transcript ORF was cleaved by exon 6, and CD274 intron 6 was converted to HPV (human papilloma virus )
  • HPV human papilloma virus
  • CD274 expression is significantly increased by introducing deletions or inversions into CD274 3′UTR using the CRISPR / Cas9 system.
  • Method By transfecting human (upper) or mouse (lower) cell lines with sgRNA and Cas9 that target the 5 ′ and 3 ′ ends of the CD274 3′UTR, Deletions or inversions over almost the entire length (2.7 kb) of CD274 3′UTR were introduced using the CRISPR (clusered regularly interspaced short palindoromic repeats) / Cas9 system. The cells were purified and the expression of CD274 on the cell surface was evaluated by flow cytometry. The introduction of the desired deletion or inversion was confirmed by PCR and sequencing.
  • the target cell lines are HEK293T (fetal kidney), T2 (T cell and B cell hybrid), PC-9 (lung cancer), and mouse cell line EG7-OVA (T cell lymphoma, Ovalbumin). ), P815 (mast cell tumor), B16-F10 (malignant melanoma).
  • cell lines (SgPD-L1 F ⁇ R) introduced with 3'UTR deletion / inversion compared to parent cell lines and Mock-introduced cell lines Markedly increased CD274 expression.
  • High CD274 expression associated with CD274 3'UTR abnormalities induces apoptosis in PD-1-expressing T cells.
  • Method In order to evaluate in vitro the effect of CD274 high expression associated with CD274 3'UTR abnormality on the immune system, the PC-9 cell line in which CD274 high expression associated with CD274 3'UTR abnormality was induced by the CRISPR-Cas9 system or After co-culture of a control cell line (Mock) and a Jurkat T cell line with PD-1 or a control cell line (Mock) without PD-1, the degree of apoptosis of Jurkat T cells was determined with Annexin-V. The flow cytometry used was evaluated.
  • CD274 high expression accompanying CD274 3′UTR abnormality strongly induces apoptosis of T-1 cells expressing PD-1 (result of isotype control on the right in FIG. 19).
  • CD274 high expression associated with CD274 3'UTR abnormality may be involved in evasion from immunity.
  • CD274 associated with CD274 3'UTR abnormality promotes tumorigenesis.
  • EG7-OVA cell line in which CD274 high expression accompanied by CD274 3'UTR abnormality was induced by CRISPR-Cas9 system to evaluate in vivo the effect of CD274 high expression accompanying CD274 3'UTR abnormality on tumorigenicity (SgPd-l1) and control cell line (Mock) were transplanted subcutaneously into syngeneic mice, and immunostimulatory poly (I: C) or PBS as a control was administered from day 7 after transplantation, and tumors were regularly The diameter was measured.
  • poly (I: C) is thought to induce immunity against tumors (especially ovalbumin).
  • FIG. 20-1 shows the experimental protocol
  • FIG. 20-2 shows the tumor diameter in the EG7-OVA cell line (SgPD-L1) (FIG. 20-2B) in which high expression of Mock (FIG. 20-2A) and CD274 was induced. Shows changes.
  • the tumor diameter was reduced by poly (I: C) administration, but in the CD274 highly expressing cell line associated with CD274 3'UTR abnormality, even when poly (I: C) was administered, no administration
  • the tumor growth was comparable.
  • High expression of CD274 accompanying CD274 3'UTR abnormality suppresses infiltration of CD8 positive T cells into the tumor.
  • Method In an experiment of syngeneic transplantation of the EG7-OVA cell line similar to 18 examples, tumors were collected from mice on the 14th or 15th day after transplantation, and CD8 and DAPI immunostaining was performed to inject tumors of CD8 positive T cells into the tumor The degree of infiltration was evaluated. The number of CD8 positive cells was measured from 20 or more fields from sections obtained from 2 to 3 representative mice.
  • FIG. 21-1 shows a stained image
  • FIG. 21-2 shows CD8-positive T cells in the tumor.
  • an increase in the number of CD8 positive T cells stained in green is observed in the stained image (upper right) of the control cell line (Mock) administered with poly (I: C) administration.
  • poly (I: C) administration increased CD8-positive T cell infiltration into the tumor, but CD274 high-expressing cell line (SgPD-L1 ), Only a slight increase in the number of infiltrating cells was observed even when poly (I: C) was administered.
  • PD-1 / PD-L1 inhibition can suppress tumor formation promotion and immunosuppressive effect due to high CD274 expression associated with CD274 3′UTR abnormality.
  • Method In order to verify in vivo the effect of PD-1 / PD-L1 inhibition on the tumorigenic potential of CD274 high expression associated with CD274 3'UTR abnormality, CD274 high expression associated with CD274 3'UTR abnormality was confirmed by CRISPR-Cas9 system.
  • the induced EG7-OVA cell line was implanted subcutaneously into syngeneic mice, and intraperitoneal injection of anti-PD-L1 antibody or isotype control was performed on mice administered with poly (I: C) as an immunostimulator, The effect on EG7-OVA tumor was evaluated. About these recipient mice, the tumor diameter was measured periodically, and the degree of infiltration of CD8 positive T cells into the tumor was evaluated by immunostaining of CD8 and DAPI on the 14th or 15th day after transplantation.
  • FIG. 22-1 shows a graph of changes in tumor diameter over time
  • Fig. 22-2 shows CD8 and DAPI immunostained images
  • Fig. 22-3 shows CD8-positive T cells in the tumor.
  • the anti-PD-L1 antibody was confirmed to inhibit tumor formation and infiltration of CD8 positive T cells into the tumor.
  • FIG. 23A shows the evaluation results of the ATL patient specimen
  • FIG. 23B shows the results of the PC-9 cell line.
  • CD274 SV Independent of CD274 region copy number, CD274 SV is involved in CD274 overexpression.
  • Method CD274 expression obtained from RNA sequence analysis (exon 4 RPKM) and CD274 region copy number obtained from SNP array in DLBC 48 samples downloaded from TCGA, STAD415 samples, and ATL43 sample in our case Considered related to: Covariance analysis was used as a statistical method.
  • FIG. 24A shows the results of DLBC (B-cell lymphoma)
  • FIG. 24B shows the results of STAD (gastric cancer)
  • FIG. 24C shows the results of ATL (adult T-cell leukemia).
  • black circles are cases of CD274 fusion gene (+) and / or CD274 exon 4 / 3′UTR ratio high value
  • double circles are cases of virus insertion (+) in the CD274 region.
  • CD274 SV was significantly independently associated with high CD274 expression.
  • CD274 copy number amplification is known to be related to CD274 high expression, but this result shows that CD274 SV is related to CD274 expression independently of CD274 copy number.
  • the present invention it is possible to determine the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor in various cancers, and to determine the effectiveness of a PD-1 / PD-L1 inhibitor for each malignant tumor patient Can do.
  • the possibility of malignant tumor treatment can be expanded with PD-1 / PD-L1 inhibitors.

Abstract

本発明は、PD-1/PD-L1阻害剤の治療効果を予測するための有効な方法の提供を目的とする、悪性腫瘍を罹患している被験体において、PD-1/PD-L1阻害剤が治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常を検出し、異常が存在する場合に、PD-1/PD-L1阻害剤が前記被験体の治療に有効であると評価する方法である。

Description

ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）の異常を指標としたＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤の治療効果予測方法
　本発明は、腫瘍細胞のPD-L1遺伝子の異常の有無を調べることにより抗PD-1抗体等のPD-1/PD-L1阻害剤の治療効果を予測する方法に関する。
　近年、転移性悪性黒色腫、腎がん、肺がんやホジキン病をはじめとする様々な悪性腫瘍にPD-1/PD-L1阻害剤が有効であることが明らかになってきた。PD-1/PD-L1阻害剤としては、抗PD-1モノクローナル抗体であるニボルマブ（Nivolumab)が既に実用化されている（特許文献１を参照）。現在、この阻害剤の治療効果を予測するためのバイオマーカーの探索が喫緊の課題となっており、免疫染色により腫瘍細胞および周囲の免疫細胞でPD-L1陽性が認められる場合に奏効率が高いことが明らかとなっている。しかし、免疫染色によるPD-L1陽性率の評価は感度・特異度が十分ではなく、今後更なる治療の奏効率予測の改善が望まれる。
　また、PD-1/PD-L1阻害剤はすでに多くの悪性腫瘍において有効であることが明らかになりつつあるが、中には奏効率が低い悪性腫瘍も含まれる。しかし、そのような腫瘍においても一部にPD-L1の構造異常およびそれに伴う高発現を有する症例は存在する可能性が見込まれる。しかし、PD-1/PD-L1阻害剤が有効な可能性がある症例を選別する有用な方法は確立されていない。
特開2006-340714号公報
　本発明は、PD-1/PD-L1阻害剤の治療効果を予測するために有効な方法の提供を目的とする。さらに、これまでPD-1/PD-L1阻害剤が使用されてない腫瘍においても、これらの阻害剤が有効な可能性が高い症例を選別して治療を行うプラットフォームを開発する。
　本発明者らは、成人T細胞白血病/リンパ腫 (adult T-cell leukemia/lymphoma: ATL)の網羅的遺伝子解析(RNAシーケンス 57例、全ゲノムシーケンス 11例)を行うことにより、ATL症例の約20%にPD-L1(CD274)の構造異常が存在することを明らかにした。この構造異常には欠失(deletion), 増幅(tandem duplication), 逆位(inversion), 転座(translocation)の全ての構造異常が含まれ、すべてに共通して3’UTRの欠失が認められた。さらに、構造異常を伴う例では、全例で顕著なPD-L1 mRNAの上昇を認め、フローサイトメトリーにより細胞表面におけるPD-L1蛋白の発現上昇も認めた。さらに、TCGAデータを用いて他のがんにおいて同様の異常が認められないか検索した結果、胃がん、肺がん、大腸がん、子宮頸がん、悪性黒色腫、B細胞リンパ腫など様々な悪性腫瘍において同様の異常が認められることを見出した。この結果は、様々な悪性腫瘍に共通に起こる異常としてPD-L1の3’UTRが欠損する構造異常とそれに伴うPD-L1高発現があることを示唆している。
　これらの結果より、本発明者らはPD-L1遺伝子の3'UTRの欠失を指標にして、PD-1/PD-L1阻害剤の効果を判定評価し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　悪性腫瘍を罹患している被験体において、PD-1/PD-L1阻害剤が治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常を検出し、異常が存在する場合に、PD-1/PD-L1阻害剤が前記被験体の治療に有効であると評価する方法。
[２]　PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常が、PD-L1（CD274）遺伝子の発現亢進に関連するPD-L1遺伝子の異常である、[１]の方法。
[３]　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1遺伝子の3'UTR領域の完全なまたは部分的な欠失である、[２]の方法。
[４]　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1遺伝子の3'UTR領域の欠失を引き起こすコピー数変化である、[２]の方法。
[５]　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1転写物からのエクソン５、エクソン６およびエクソン７の全部または部分的な切断である、[２]の方法。
[６]　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1転写物からのエクソン５、エクソン６およびエクソン７の全部または部分的な切断である、[２]の方法。
[７]　PD-L1遺伝子のエクソン１～エクソン４のいずれかの転写産物とPD-L1遺伝子の3'UTR領域の転写産物を定量し、エクソン転写産物の量と3'UTR領域の転写産物の量の比を算出し、該比が所定の値以上の場合にPD-1/PD-L1阻害剤ががん治療に有効であると評価する、[２]の方法。
[８]　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1 mRNAの発現の亢進である、[２]の方法。
[９]　PD-L1遺伝子の異常が、ウイルスの挿入による異常である、[２]の方法。
[１０]　ウイルスがHuman papilloma virus (HPV)又はEBV (Epstein-barr virus)である、[９]の方法。
[１１]　被験体から採取した腫瘍細胞中のPD-L1タンパク質を、PD-L1に対する抗C末端抗体およびPD-L1に対する抗N末端抗体を使用した免疫組織染色により染色し、PD-L1に対する抗N末端抗体で染色が認められるが、PD-L1に対する抗C末端抗体では染色が認められない場合、PD-1/PD-L1阻害剤が前記被験体の治療に有効であると評価する[２]の方法。
[１２]　悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫、胃がん、大腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、肺腺がん、皮膚悪性黒色腫およびB細胞リンパ腫からなる群から選択される、[１]～[１１]のいずれかの方法。
[１３]　悪性腫瘍が、食道がん、頭頸部がんおよび子宮体がんからなる群から選択される、[１]～[１１]のいずれかの方法。
[１４]　PD-1/PD-L1阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、[１]～[１３]のいずれかの方法。
[１５]　悪性腫瘍を罹患している被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常を検出し、異常が存在する場合に、PD-1/PD-L1阻害剤を用いて治療する方法。
　実施例に示したように、様々な悪性腫瘍においてPD-L1遺伝子の構造異常によりPD-L1が高発現する症例が存在する。すなわち、免疫チェックポイントの中心であるPD-L1の構造異常およびその結果起こる非コーディング領域との融合遺伝子という、通常の予想を超えた遺伝子異常を様々な悪性腫瘍において同定した。本研究におけるpreclinical study(マウスモデル)、およびゲノム異常によりPD-L1の恒常的活性化が起こると唯一知られているホジキン病において、抗PD-1/PD-L1阻害剤が圧倒的に有効であること(奏効率約90%)を鑑みると、PD-L1構造異常を有する患者では抗PD-1/PD-L1阻害剤が極めて有効であると期待され、有望なバイオマーカーとなることが期待される。従って、効果の高い治療に直結する遺伝子異常は臨床検査の対象として極めて有望である。
　すでにPD-1/PD-L1阻害剤が使用されている悪性腫瘍に関しては、PD-L1構造異常を検出することにより、PD-1/PD-L1阻害剤の治療効果を予測できる可能性がある。また、現在PD-1/PD-L1阻害剤が使用されていない腫瘍に関しても、PD-L1遺伝子の異常を有する場合にPD-1/PD-L1阻害剤が有効である可能性が考えられ、そのような症例を選別することにより新規の治療法を確立できる可能性が見込まれる。　また、PD-L1の構造異常を指標として臨床試験を行うことにより、効率的に適応疾患を拡大できる可能性がある。このことは、現在、適応が承認あるいは検討中の悪性腫瘍のみならず、全体としては有効性が不十分である悪性腫瘍に対しても、適応が拡大できる可能性がある。
RNAシーケンス57例および全ゲノムシーケンス11例における9p24.1領域の構造異常の検索の結果を示す図である。 RNAシーケンス 57例の構造異常とCD274発現の関係の解析結果を示す図である。 CD274の各エクソンにおける発現の解析結果を示す図である。 エクソン3における発現、およびエクソン3における発現と3’UTRの発現の比とCD274構造異常の関係を示す図である。 ATLにおいて同定されたCD274の途中で切断された転写産物の解析結果を示す図である。 CD274の転写産物が途中で切断される例のアミノ酸配列を示す図である。 ATL患者由来細胞を用いたCD274蛋白の膜表面での発現を示す図である。 TCGAデータを用いた種々のがんにおけるCD274構造異常と発現の解析結果を示す図である。 悪性黒色腫・大腸がん・胃がん・B細胞リンパ腫におけるCD274の発現を示す図である。 TCGAデータにおける各種悪性腫瘍のCD274の発現解析結果を示す図である（その１）。 TCGAデータにおける各種悪性腫瘍のCD274の発現解析結果を示す図である（その２）。 SNPアレイを用いたCD274異常の検出結果（GISTICの結果）を示す図である。 SNPアレイを用いたCD274異常の検出結果（CNAGの結果）を示す図である。 RQ-PCRを用いたCD274異常の検出結果を示す図である。 ATL患者におけるPD-L1発現の免疫染色結果を示す図である。 TCGAデータを用いた種々のがんにおけるCD274構造異常と発現の解析結果を示す図である（その２）。 発がんウイルスのCD274領域への挿入とCD274 3’UTR異常を示す図である。 ヒト・マウス細胞株においてCD274 3’UTRの異常の導入によりCD274過剰発現が誘導されることを示す図である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現がPD-1発現T細胞にアポトーシスを誘導することを示す図である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が造腫瘍能に与える影響を評価する実験のプロトコルを示す図である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が造腫瘍能に与える影響を示す図である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現はCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤を抑制することを示す図（染色像）である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現はCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤を抑制することを示す図（細胞数のグラフ）である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現による造腫瘍能に対するPD-1/PD-L1阻害剤の効果を腫瘍径の経時的変化により示す図である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現による造腫瘍能に対するPD-1/PD-L1阻害の効果を免疫染色により示す図である。 CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現による造腫瘍能に対するPD-1/PD-L1阻害剤の効果を細胞数により示す図である。 CD274 open reading frameが切断された変異体のPD-1結合能をフローサイトメトリーによる評価により示す図である。 CD274領域のコピー数に独立して、CD274 構造異常はCD274過剰発現に関係することを示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、悪性腫瘍患者におけるPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノム異常を指標にして、該患者におけるPD-1/PD-L1阻害剤の有効性を評価、判定する方法、あるいは該患者におけるPD-1/PD-L1阻害剤の有効性を評価、判定するための補助的データを取得する方法である。本発明において、評価、判定を予測ともいう。PD-L1はCD274、B7-H1とも称する。
　ここで、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノム異常とは、悪性腫瘍患者のゲノムにその異常が認められる場合に、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性が高くなる異常をいう。このような異常として、例えば、PD-L1遺伝子が存在する染色体9p24.1の異常、PD-L1遺伝子の異常が挙げられる。このような異常をPD-L1遺伝子の構造異常（SV：structural variation）とも呼ぶ。これらの異常に伴い、悪性腫瘍患者の腫瘍細胞においてPD-L1の発現異常が引き起こされ得る。PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノム異常には、遺伝子の増幅(tandem duplication), 欠失(deletion), 逆位(inversion), 転座(translocation)などの構造的な異常および増幅・欠失・片親性ダイソミーなどのコピー数および発現産物や転写産物の質的(3’UTRの欠失)、量的な異常も含む。腫瘍細胞におけるPD-L1の発現異常とは、健常人の細胞に比べて、あるいは、PD-L1遺伝子の異常が認められない腫瘍細胞におけるPD-L1遺伝子の発現に比べて亢進していることをいい、例えば、PD-L1の発現がmRNAまたはタンパク質レベルで5倍以上、好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上、さらに好ましくは50倍以上になっている場合をいう。PD-L1の発現異常を検出することにより、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノム異常が存在することを予測することができる。
　生体はＴ細胞が腫瘍細胞を攻撃する抗腫瘍免疫機能を有しているが、腫瘍細胞が発現しているPD-L1リガンドがＴ細胞に発現しているPD-1（Programmed cell death 1)と結合すると、Ｔ細胞の細胞死が誘導され、抗腫瘍免疫機能が抑制される。PD-1/PD-L1阻害剤は、腫瘍細胞のPD-L1とＴ細胞のPD-1の結合を阻害することにより、Ｔ細胞の抗腫瘍免疫機能が抑制されることを防止する。PD-1/PD-L1阻害剤としては、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体が挙げられ、がん治療薬として用いられている抗PD-1/PD-L1抗体として、ニボルマブ（Nivolumab)やMPDL3280A、pembrolizumab(MK-3475)、MEDI4736、MSB0010718C、Pidilizumab、MEDI0680などが挙げられる。PD-1/PD-L1阻害剤は、腫瘍細胞やその周囲の免疫細胞においてPD-L1が高発現している患者において、有効性が高い。従って、PD-L1の発現量を測定することによって、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性を判断できる可能性がある。例えば、免疫染色により、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現を確認することが可能であるが、免疫染色によるPD-L1陽性率の評価は感度、特異度が十分ではなかった。
　悪性腫瘍患者におけるゲノム異常が腫瘍細胞におけるPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連しているか否かは、ゲノム異常がPD-L1遺伝子の発現亢進に関連しているか否かを調べればよく、腫瘍細胞において全ゲノムの構造異常を網羅的に解析するとともに、その腫瘍細胞におけるPD-L1遺伝子の発現をmRNAレベルまたはタンパク質レベルで測定し、ゲノム異常とPD-L1遺伝子の発現亢進を関連付けることにより決定することができる。例えば、腫瘍細胞からDNAを単離し、全ゲノムのシーケンスを行い、増幅(tandem duplication)、逆位（inversion）、転座（translocation）、欠失（deletion）等のゲノムの構造異常を解析し、同時に前記腫瘍細胞の全RNAのシーケンスを行い、PD-L1遺伝子の発現を測定し、ゲノム異常とPD-L1遺伝子の発現との関連を解析すればよい。例えば、あるゲノム異常を有する腫瘍細胞の多くにおいて、PD-L1遺伝子の発現の亢進が認められる場合、その異常はPD-L1遺伝子の発現亢進と関連しており、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連していると決定することができる。
　実際、ゲノム異常によりPD-L1遺伝子の発現が亢進している場合、PD-1を発現するＴ細胞にアポトーシスが誘導される。また、ゲノム異常によりPD-L1遺伝子の発現が亢進している場合、CD8陽性細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍内への浸潤が抑制され、腫瘍の増殖が亢進する。さらに、PD-L1ゲノム異常による免疫からの回避は抗PD-1/PD-L1阻害により抑止される。
　本発明の方法により、PD-L1/PD-1阻害剤の有効性を評価、判定し得る腫瘍は限定されず、少なくとも、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫、胃がん、大腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、肺腺がん、皮膚悪性黒色腫、B細胞リンパ腫、食道がん、頭頸部がん、子宮体がん等が挙げられる。大腸がんは結腸がんおよび直腸がんも含む。
　本発明の方法においては、悪性腫瘍に罹患している被験体の腫瘍検体を採取し、該検体の腫瘍細胞のゲノム異常を解析すればよい。
　本発明の方法において、解析対象とする、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノム異常の具体的な例として、以下の異常が挙げられる。
（１）PD-L1遺伝子の3'UTR（3'非翻訳領域）欠失を伴うゲノム異常
　PD-L1遺伝子は9p24.1領域に存在し、その構造異常として、増幅(tandem duplication)、逆位（inversion）、転座（translocation）、欠失（deletion）が挙げられる。PD-L1遺伝子の構造異常により3'UTRに欠失がある場合、PD-L1の高発現が引き起こされる。これは、3'UTRがmRNAの安定性や翻訳調節に重要な役割を果たす領域であり、この領域の欠失によりこれらの機能が失われるからである。PD-L1遺伝子の3'UTRの欠失とは、完全な欠失も部分的な欠失も含まれる。また、PD-L1遺伝子を含む9p24.1領域のコピー数の異常（CNV)として増幅や減少・片親性ダイソミーが挙げられる。コピー数の異常は構造異常に伴って起きるが、3’UTRが欠損する場合にはPD-L1の高発現が引き起こされる。
　3’UTRを欠失したPD-L1遺伝子の一部はエクソン領域の途中で切断されており、野生型のPD-L1とは異なるタンパク質が産生される。PD-L1は細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの３つのドメインからなり、PD-1との結合には細胞外ドメインと膜貫通ドメインが関与する。PD-L1遺伝子がエクソン領域の途中で切断された場合においても、PD-L1はPD-1との結合能を保持している。すなわち、PD-L1遺伝子がエクソン領域の途中で切断された場合においても、PD-L1は細胞外ドメインと膜貫通ドメインを保持している限り抗腫瘍免疫を抑制する機能は有している。従って、PD-L1タンパク質の切断の有無に関わらず、PD-L1遺伝子のゲノム異常によりPD-L1タンパク質を高発現している腫瘍細胞はPD-1/PD-L1阻害剤により腫瘍免疫を抑制する機能を阻害され得る。従って、PD-1/PD-L1阻害はPD-L1遺伝子のゲノム異常を有する悪性腫瘍の治療に有効である。
　PD-L1遺伝子の塩基配列は、NM_014143として登録されている。PD-L1遺伝子の3'UTRの塩基配列を配列番号２に示す。
（２）PD-L1遺伝子の転写産物および翻訳産物の異常
　PD-L1のmRNAの異常として、mRNAの3’UTRの全部または部分的な切断およびそれに伴う高発現が挙げられる。さらに、エクソン５または６以降の切断を伴う場合がある。エクソンの切断として、エクソン６およびエクソン７全体の切断、エクソン７全体の切断、エクソン７の途中からの切断が挙げられる。本発明において、このようなエクソンの切断をエクソン６またはエクソン７の全部または部分的な切断という。さらに、エクソン４以降の切断、すなわち、エクソン５、エクソン６およびエクソン７全体の切断が生じ得る。
　PD-L1タンパク質の異常として、高発現が挙げられる。PD-L1タンパク質の高発現は、PD-L1遺伝子のコピー数の増幅とは独立して、PD-L1遺伝子の構造異常と関係している。また、エクソン５または６はPD-L1タンパクの細胞内ドメインを構成するので、エクソン４以降の欠失を伴う場合、PD-L1タンパク質の異常は細胞内ドメインの部分的欠失を含む。
　また、Human papilloma virus (HPV) 16等のHPVやEBV (Epstein-barr virus)等の発がんウイルス遺伝子がPD-L1遺伝子領域に挿入され、構造異常を引き起こすこともある。例えば、Human papilloma virus (HPV)がPD-L1遺伝子のintron 6に挿入されることがあり、また、Epstein-Barr virus(EBV)遺伝子がPD-L1遺伝子に隣接した上流の遺伝子に挿入され、PD-L1転写産物が3’UTRで切断されることがある。
　PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノム異常の解析は、悪性腫瘍患者から採取した腫瘍細胞を用いて、通常のゲノムの構造異常や遺伝子の異常の解析方法によって行うことができる。例えば、腫瘍細胞からDNAまたはRNAを抽出し、PCR/サンガーシーケンス法、ジデオキシ法やMaxam-Gilbert法等の公知の方法により直接配列決定するシーケンス解析による解析法、全ゲノムシーケンス、全エクソンシーケンス、標的シーケンス等を含む次世代シーケンサーを用いた網羅的な遺伝子解析法、FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）法、SNPアレイやCGHアレイ等を用いるコピー数解析法などの遺伝子の異常が存在する領域に特異的なプローブや該プローブを固定化したマイクロアレイ（DNAチップ）などを用いるハイブリダイゼーション法、遺伝子の異常が存在する領域に特異的なプライマーを用いる種々の方法があげられる。プライマーを用いる方法として、PCR法、NASBA法、LCR法、SDA法、LAMP法、制限断片長多型（RFLP）を利用する方法、プライマー伸長法（TaqMan（登録商標）法）等が挙げられる。次世代シーケンサーとしては、Genome Sequencer FLX(GD FLX）（Roche社）、Illumina HiSeq/MiSeq（Illumina社）等を用いることができる。
　PD-L1遺伝子の3'UTRの欠失は、プローブやプライマーを用いた方法により検出することができる。また、RNAシーケンスやFISH法によって検出することもできる。
　mRNAにおける3'UTRの欠失の検出は、欠失が認められていないPD-L1遺伝子のエクソン(エクソン１～５)の転写量と3'UTRの転写量の比を算出することにより実施可能である。例えば、PD-L1遺伝子のエクソン１～５のいずれか、例えばエクソン３またはエクソン４のmRNAと、3'UTR領域のmRNAをRNAシーケンスや定量的PCRにより定量し、エクソン３またはエクソン４の発現/3'UTRの発現の比を算出することにより、3'UTRの発現の有無、すなわち、3'UTRの欠失の有無を決定することができる。該比が大きい場合、3'UTRが欠失していると判断することができる。エクソン３の発現/3'UTRの発現の比が大きいとは、PD-L1遺伝子の異常が認められない腫瘍細胞におけるエクソン３の発現/3'UTRの発現の比に対して大きい場合をいい、例えば、エクソン３の発現/3'UTRの発現の比が所定の値以上の場合、例えば、２倍以上、好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上になっている場合をいう。また、エクソン４の発現/3'UTRの発現の比が大きいとは、PD-L1遺伝子の異常が認められない腫瘍細胞におけるエクソン４の発現/3'UTRの発現の比に対して大きい場合をいい、例えば、エクソン４の発現/3'UTRの発現の比が所定の値以上の場合、例えば、２倍以上、好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上になっている場合をいう。
　PD-L1遺伝子の発現異常は、腫瘍細胞中のPD-L1のmRNAをRQ-PCRやRT-PCR等の(半)定量的PCRを用いて検出することができる。RQ-PCRはPCR過程の間に連続的にPCR産物の蓄積を検出し、それによってPCRの初期の指数関数相における容易かつ正確な定量を可能にする手法である。
　上記の手法で用いるプローブやプライマーは、PD-L1遺伝子の発現亢進に関連するゲノム異常部位を含む塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列或いはストリンジェント条件下でそれらの配列にハイブリダイズし得る配列からなるヌクレオチド断片（好ましくは、DNA断片）からなり、塩基の数は5～50、好ましくは10～30、さらに好ましくは10～25である。
　また、PD-L1遺伝子の構造異常により、エクソン４以降が欠失され、すなわち、PD-L1タンパク質のC末端領域が欠失し、ORFが切断された場合、発現した異常タンパク質はPD-L1タンパク質のC末端領域に対する抗体（PD-L1に対する抗C末端抗体）とは反応するが、PD-L1タンパク質のN末端領域に対する抗体（PD-L1に対する抗N末端抗体）とは反応しない。従って、PD-L1に対する抗C末端抗体およびPD-L1に対する抗N末端抗体を用いて、両抗体を産生されたPD-L1タンパク質との反応性を調べることにより、PD-L1遺伝子の構造異常を同定することができる。具体的には、例えば、蛍光色素等で染色したPD-L1に対する抗C末端抗体およびPD-L1に対する抗N末端抗体を用いて腫瘍細胞中のPD-L1タンパク質を染色し、可視化すればよい。抗N末端抗体で染色が認められるが、抗C末端抗体では染色が認められない場合、PD-L1遺伝子に構造異常があると判断することができる。
　本発明の方法により、被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-L1遺伝子の発現亢進に関連するPD-L1遺伝子の異常の存在が認められた場合、該被験体の悪性腫瘍の治療にPD-1/PD-L1阻害剤が有効である可能性が高いと評価、判定することができる。また、ある悪性腫瘍の腫瘍細胞において、PD-L1遺伝子の発現亢進に関連するPD-L1遺伝子の異常の存在が認められた場合、該悪性腫瘍の治療にPD-1/PD-L1阻害剤が有効である可能性が高いと評価、判定することができる。
　悪性腫瘍によって、PD-1/PD-L1阻害剤が有効である患者の割合は異なると考えられる。例えば、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫、胃がん、大腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、肺線がん、皮膚悪性黒色腫、B細胞リンパ腫、食道がん、頭頸部がん、子宮体がんでは、転写産物の3'UTR異常例において、PD-L1の発現が亢進していることが判明している。これらの悪性腫瘍を罹患している患者については、本発明の方法により、PD-1/PD-L1阻害剤が有効か否かを評価、判定することができる。また、これら以外の悪性腫瘍に罹患している患者についても、本発明の方法により、悪性腫瘍に罹患している患者に対して、PD-1/PD-L1阻害剤が有効か否かを評価、判定することができる。
　さらに、例えば、成人Ｔ細胞白血病、胃がん等ではPD-1/PD-L1阻害剤が有効である患者の割合は高いが、悪性黒色腫、肺がん、腎がん等では低い可能性がある。本発明の方法により、PD-1/PD-L1阻害剤が有効である患者の割合が高い悪性腫瘍において、悪性腫瘍に罹患している患者に対してPD-1/PD-L1阻害剤の有効性を評価、判定することができるばかりでなく、PD-1/PD-L1阻害剤が有効である患者の割合が低く、従来はPD-1/PD-L1の適用を行わなかった悪性腫瘍において、悪性腫瘍に罹患している患者に対して、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性を評価、判定することができるようになる。
　すなわち、本発明は、悪性腫瘍を罹患している被験体において、PD-1/PD-L1阻害剤が治療に有効であるか否かを予測する方法において、悪性腫瘍が、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性が低い悪性腫瘍であり、被験体から採取した被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常を検出し、異常が存在する場合に、PD-1/PD-L1阻害剤が前記被験体の治療に有効であると評価することにより、PD-1/PD-L1阻害剤の有効性が低い腫瘍に、PD-1/PD-L1阻害剤の適応を拡大する方法も包含する。
　以上のように、本発明の方法により、種々の悪性腫瘍について、あるいは種々の悪性腫瘍に罹患している患者個人についてPD-1/PD-L1阻害剤が有効か否かを評価、判定することができ、患者に対して適した治療法を選択することが可能になる。
　被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-L1遺伝子の発現亢進に関連するPD-L1遺伝子の異常の存在が認められ、該被験体の悪性腫瘍の治療にPD-1/PD-L1阻害剤が有効である可能性が高いと評価、判定することができた場合、該被験体に、抗PD-1モノクローナル抗体、抗PD-L1モノクローナル抗体を含むPD-1/PD-L1阻害剤等の免疫チェックポイント阻害剤を投与すればよい。
　投与量は、年齢、体重、症状等により異なるが、数日、数週間あるいは数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg～100mgを静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射等の非経口投与や経口投与によって投与すればよい。投与する阻害剤は、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含んでいてもよい。また、阻害剤の形態は限定されず、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤などによる非経口投与等が挙げられる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
１．RNAシーケンス57例および全ゲノムシーケンス11例における9p24.1領域の構造異常の検索
(方法)
　ATL（成人Ｔ細胞白血病）57例の腫瘍検体を用いたRNAシーケンスとATL11例の腫瘍・正常(頬粘膜)ペアの全ゲノムシーケンスを行った。
　腫瘍検体のRNAはRNeasy Mini kit(QIAGEN)により抽出し、Agilent RNA ScreenTape System（Agilent)を用いてRINeを測定した。
　RNAシーケンス用のライブラリ作成は、200～500ngかつRINe 7以上のRNAを用いてNEBNext Ultra RNA Library Prep Kit (New England Biolabs)により行い、HiSeq2000/2500を用いて塩基配列を決定した。そのデータを東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターが公開しているGenomon Fusion(http://genomon.hgc.jp/rna/)というアルゴリズムを用いて解析し、融合遺伝子の同定および発現解析を行った。
　全ゲノムシーケンスのライブラリ作成はWGS using NEBNext DNA Library Prep Reagent (New England Biolabs)を用いて行い、HiSeq2000/2500を用いて塩基配列を決定した。
　解析はTOTOKI Y. et al,. NATURE GENETICS 46, 1267-1273 (2014)(doi:10.1038/ng.3126)の記載の通りに実施した。
(結果)
　結果を図１に示す。ATL患者57例中11例に9p24.1領域の構造異常(融合遺伝子)を認めた。
　構造異常はtandem duplication (増幅)（右上から左下への太い斜線） 3例、inversion (逆位)（左上から右下への細い斜線） 3例、translocation (転座)（白） 3例、deletion (欠失)（右上から左下への細い斜線） 2例と多岐に渡っていた。
　しかし、それら全ての例で3’UTR(untranslated region: 非翻訳領域→転写後調節に関与する)の欠損を認めるという共通点があった。
　また、CD274のエクソン5までは全例で保たれているが、それ以降は症例により一部切断されていた。
２．RNAseq 57例の構造異常とCD274発現の関係の解析
(方法)
　１．のATL57例の腫瘍検体を用いたRNAシーケンスの結果を用いて、構造異常とCD274発現の関係について解析した。
　発現値としてはFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments sequenced)を用いた。
(結果)
　結果を図２に示す。図２の棒グラフの模様（右上から左下への太い斜線、左上から右下への細い斜線、白、右上から左下への細い斜線）は図１の模様に対応している。
　構造異常(１．と共通)を認める例でCD274の高発現が認められた。
　構造異常がない例(黒)と比較して、構造異常(+)の場合は、ほとんどの症例でCD274を著明に高発現していた。
３．CD274の各エクソンにおける発現の解析
(方法)
　２．のATL57例のRNAシーケンスデータをIGV(integrative genome viewer)（提供：Broad Institute）を用いて、シーケンスリードをCD274(NM_014143)の各エクソン毎に表示した。
　CD274は7個のエクソンからなり、エクソン7の大部分を3’UTRが占める。
(結果)
　結果を図３に示す。図３の下の１～７の数字はエクソンの番号を示す。構造異常(-)例(Miya31)では他のエクソンと比較して相対的に3’UTRにおける発現が高かった。一方、構造異常(+)例(Miya26 & 30)では3’UTRにおける発現が消失していた。他の構造異常(+)例も同様であった。この結果は、構造異常(+)例では、3'UTRの欠失に伴い、同部位の発現も消失していることを示す。
４．エクソン3における発現、およびエクソン3における発現と3’UTRの発現の比とCD274構造異常の関係
(方法)
　構造異常(+)例では3’UTRの発現が消失するので、３．のように遺伝子全体で発現を評価する場合、発現が過小評価されて、構造異常との関係が不明瞭になっている可能性がある。そのため、３．のATL57例のRNAシーケンスデータを用いて、CD274の各エクソンの発現および3’UTRの発現との比を計算した。その中で、構造異常との関係が最も明確であったエクソン3の発現およびエクソン3の発現/3’UTRの発現（ex3 exp/3'UTR exp）を散布図として表示した。
(結果)
　結果を図４に示す。図４中、白丸は構造異常(+)、黒丸は構造異常(-)の例を示す。「ex3」はエクソン3を示し、「exp」は発現（expression）を示す。CD274のエクソン3のみの発現、エクソン3の発現と3’UTRの発現の比を見ると、構造異常(+)例で、ex3 exp/3'UTR expが高く、構造異常(+)例（白丸）が明確に分離された。
５．ATLにおいて同定されたCD274の途中で切断された転写産物の解析
(方法)
　ATL57例のRNAシーケンスの結果から同定された11例のCD274構造異常(+)症例の中で、約半数ではエクソン5またはエクソン6で転写産物が切断されていた。それらの例で、RNAシーケンスで配列を確認し、転写産物の配列の同定を試みた。
(結果)
　結果を図５に示す。図５下部の塩基配列は構造異常(+)の症例(Miya26)における転写産物の配列である。エクソン6の3’末端までは野生型CD274が転写されるが、それ以降は3番染色体上のCBLB遺伝子のイントロン領域に繋がる(枠で囲んだ部分)。その領域では、終止コドン(イタリックで表したTGA)、polyAシグナル配列（AATAAA: polyAが結合するのに必要な配列、下線部）、polyA配列(二重下線部)を含んでいる。この結果は、CD274の構造異常により形成されたalternativeな転写産物が適切な転写産物として機能することを示している。これらの、図５に示した配列の全体を配列番号１に示し、3'UTRの配列を配列番号２に示す。
６．CD274の転写産物が途中で切断される例のアミノ酸配列
(方法)
　リファレンス配列としてNP_054862を参照した。５．の転写産物の配列を元に、CD274が途中で切断される例において、そのアミノ酸配列をin silicoで同定した。
(結果)
　結果を図６に示す。CD274はExtracellular domain(細胞外ドメイン), Transmembrane domain(膜貫通ドメイン), Cytoplasmic domain(細胞内ドメイン)で構成されるが、PD1/PD-L1 機構による腫瘍細胞の免疫回避には、前2者のドメインが重要と考えられている。
　図６においては、膜貫通ドメイン（枠で囲んだ部分で示す配列）の途中の配列から示してある。枠で囲んだ部分が膜貫通ドメインの配列であり、下線部のイタリック体で示した部分が細胞内ドメインの配列を示す。また、図６の上の「CD274 Wt」は野生型配列を示す。
　これらのCD274が途中で切断されている例（Miya15、Miya24、Miya26、Miya30、Sas8、Kyo4）においても前2者のドメインは保たれており、alterativeな転写産物もCD274として機能的し得る可能性が高いことが示唆された。
７．ATL患者由来細胞を用いたCD274蛋白の膜表面での発現の評価
(方法)
　RNAシーケンスでCD274構造異常が同定された症例の腫瘍細胞を用いてフローサイトメトリーにより細胞表面におけるCD274の発現を評価した。腫瘍細胞はPE/Cy7 anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody (clone: 29E.2A3, BioLegend)を用いて染色し、LSR2 Fortessa(BD Biosciences)を用いて解析した。
(結果)
　結果を図７に示す。図７の枠で囲んだものが構造異常(+)例である。構造異常(-)例でもCD274の低発現が認められるが、構造異常(+)例ではCD274の顕著な高発現が確認され、発現量は100倍程度に増加していた。
　この結果は、構造異常(+)例でタンパク質レベルでCD274高発現があることを示している。
８．TCGAデータを用いた種々の悪性腫瘍におけるCD274構造異常と発現の解析
(方法)
　米国の様々な悪性腫瘍の次世代シーケンスデータのデータベースであるTCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)に蓄積されているRNAシーケンスデータを用いて様々な悪性腫瘍におけるCD274の構造異常と発現の解析を行った。
(結果)
　結果を図８に示す。図中の略語は以下のがん腫を表す。ACC：副腎がん、BLCA：膀胱がん、CESC：子宮頸がん、COAD：大腸がん、DLBC：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ESCA：食道がん、GBM：神経膠芽腫、HNSC：頭頸部がん、KICH：腎嫌色素性細胞がん、KIRC：胃淡明細胞がん、KIRP：乳頭状腎細胞がん、LAML:急性骨髄性白血病、LGG：低悪性度神経膠腫、LIHC：肝細胞がん、LUAD：肺腺がん、LUSC：肺扁平上皮がん、MESO：悪性中皮腫、OV：卵巣がん、PAAD：膵がん、PCPG：褐色細胞腫、PRAD：前立腺がん、READ：結腸がん、SARC：肉腫、SKCM：皮膚悪性黒色腫、STAD：胃がん、TGCT：精巣腫瘍、THCA：甲状腺がん、THYM：胸腺腫、UCEC：子宮体がん、UCS：子宮肉腫、UVM：ぶどう膜悪性黒色腫 　　　　　　
(CTRL:コントロール)
　図中の数字は各腫瘍におけるRNAシーケンスの例数であり、合計で10,000例以上を解析した。
９．各がんにおけるCD274の発現
(方法)
　TCGAでは、RNAシーケンスデータより算出した発現データ(RSEM値を採用、胃がんのみRPKM値を採用)も公表している。そのデータを用いて、各がんにおいて症例ごとにCD274の発現(対数変換後)をヒストグラムとして表示した。
(結果)
　図９に４種類のがんの結果を例として示す。様々ながんにおいて一部の症例のみにCD274の高発現が認められた。そのため、発現値でカットオフ値を決めて、詳細な解析を行うこととした。カットオフ値としては、胃がん以外はRSEM値、胃がんはRPKM値をそれぞれ対数変換した値を用いて、胃がん以外の場合は8、胃がんの場合は11を用いた（カットオフ値は評価のために適宜設定した値である）。図９中、SKCMは皮膚悪性黒色腫を（図９Ａ）、COADREADは大腸がんを（図９Ｂ）、STADは胃がんを（図９Ｃ）、DLBCはびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（図９Ｄ）を示す。
１０．TCGAデータにおけるCD274の発現解析
(方法)
　TCGAのカットオフ値以上の症例(CD274高発現例)について、４．と同じ方法を用いて、既にマッピング済みのRNAシーケンスデータにおける各エクソン毎の発現を評価し、IGV(integrative genome viewer)（提供：Broad Institute）で表示した。
(結果)
　結果を図１０に示す。その中で、一部でATLと同様の発現パターン(高発現かつ3’UTRの発現が欠損)が認められた。さらに、それらの症例でRNAシーケンスデータを用いて配列を詳細に解析すると、CD274の構造異常が確認できた。例として胃がん(STAD)（図１０Ａ）、大腸がん(COAD)（図１０Ｂ）を挙げている。それ以外に膀胱がん(BLCA)1例、子宮頸がん(CESC)1例、腎がん(KIRC)1例、肺腺がん(LUAD)2例、結腸がん(COAD)1例(計2例)・直腸がん(READ)1例、皮膚悪性黒色腫(SKCM)1例、胃がん(STAD)3例(計4例)にATLと同様のCD274高発現かつ3’UTRの発現が欠損が確認できた。
　図１１には、同様にB細胞リンパ腫(DLBC)2例を例として示した（図１１ＡおよびＢ）。DLBCにおいては、RNAシーケンスデータがある48例中CD274高発現2例中2例で同様の構造異常が認められた。
　図１０および１１の下の１～７はエクソンの番号を示している。
　図１０および１１に示す結果は、様々ながんにおいて３‘UTRを含むCD274の構造異常とそれに伴うCD274高発現が起きていることを示している。
１１．SNPアレイを用いたCD274異常の検出
(方法)
　ATL426例においてSNPアレイを用いたコピー数解析(手法：GISTIC)を行った。
　ATLと診断されインフォームドコンセントが得られた患者について、京都大学の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って、腫瘍検体を採取し、網羅的な遺伝子変異解析を行った。
　まず、ATL426例の腫瘍検体を用いてSNPアレイによるコピー数解析を行った(Affymetrix 250K 282例、Illumina 610K 144例)。アルゴリズムとしてはCNAG/AsCNARおよびGISTIC2.0を用いて局所的なコピー数増幅・減少部位の同定を行った。
(結果)
　GISTICの結果を図１２に示す。ATL患者において26個の局所的なコピー数増幅および50個の局所的なコピー数減少を同定した。その一つに9p24.1領域のCD274（PD-L1）に増幅(14%)を認めた。
　CNAGの結果を図１３に示す。図１３中、上段がコピー数の増幅を示し、下段がコピー数減少を示す。GISTICでコールされる9p24.1領域のコピー数増幅の多くがCD274遺伝子の途中まで含み、3’UTRが欠損するようなコピー数増幅を引き起こしている。CD274遺伝子の3’側の一部を含むコピー数減少も認められ、3’UTRの欠損がコピー数減少によっても引き起こされることが確認される。少なくともMiya23, Miya24, Miya26のコピー数増幅を伴う症例では、全ゲノムシーケンスにて3’UTRの欠損を伴う構造異常(+)およびRNAシーケンスにてCD274高発現が確認された。また、Miya37, Miya38, Sas2のコピー数減少を伴う症例でも同様に確認された。
１２．RQ-PCRを用いたCD274異常の検出
(方法)
　ATL13例においてRQ-PCRを用いてCD274の発現を評価した。
　ATL腫瘍検体からRNeasy Mini kit(QIAGEN)によりRNAを抽出し、ReverTra Ace（登録商標）qPCR RT Kit（TOYOBO)を用いて逆転写を行い、SYBR Premix Ex Taq II（TAKARA)を用いてPCR反応を行った。フォワードプライマーの配列は、GGCATCCAAGATACAAACTCAA（配列番号１０）であり、リバースプライマーの配列は、CAGAAGTTCCAATGCTGGATTA（配列番号１１）であった。PCRはHolding 95℃ 10sec, Cycling (95℃ 5sec, 60℃ 30sec, 72℃ 30sec)×50cycelsで行った。検出はLightCycler（登録商標）480 System(Roche Applied Science)を用いて行った。Internal controlとして18Sを用いて、CD274との比を示した。
(結果)
　結果を図１４に示す。ATL患者において構造異常を認める3例（棒グラフの右上から左下への太斜線のバーの２例(増幅(tandem duplication)が認められたもの)および左上から右下への細斜線のバーの１例(逆位(inversion)が認められたもの）)においてCD274の高発現を認めた。
１３．ATLにおけるPD-L1の免疫染色
(方法)
　PD-L1 構造異常（SV： structural variation）がないATL059, PD-L1 SV(+)でORFが保たれているATL075, SV(+)でORFが切断されているATL012の3症例で、PD-L1に対する抗N末端抗体(E1J2J, Cell Signaling Technology)と抗C末端抗体(SP142, Spring Bioscience)を用いて免疫染色を実施した。
　抗原抗体複合体はHistofine（登録商標） Simple Stain MAX PO (Nichirei Bioscience)を用いて可視化した。
(結果)
　結果を図１５に示す。図１５ＡはPD-L1 SVがないATL059（ATL059: PD-L1 SV(-)）、図１５ＢはPD-L1 SV(+)でORFが保たれているATL075（ATL075: PD-L1 SV(+), intact ORF)、図１５ＣはSV(+)でORFが切断されているATL012(ATL012: PD-L1 SV(+), truncated ORF)の結果を示す。また、図１５の上段は、抗N末端抗体を用いた免疫染色の結果を示し、図１５の下段は、抗C末端抗体を用いた免疫染色の結果を示す。図１５Ａに示すように、PD-L1 SVがないATL059では腫瘍細胞の染色は認められなかった(図１５Ａには、散発的に染色されておりモノクロ写真ではグレーに見える大型の細胞が認められるが、これはマクロファージである)。
　図１５Ｂに示すように、PD-L1 SV(+)でORFが保たれているATL075では、抗N末端抗体、抗C末端抗体の両者で強い染色が認められた。
　また、図１５Ｃに示すように、SV(+)でORFが切断されているATL012では、抗N末端抗体で強い染色が認められたが、抗C末端抗体では染色は認められなかった。
　この結果は、PD-L1 SVがあるとPD-L1発現が蛋白レベルで強く増加することを示しており、ATL012で抗C末端抗体で染色されないことはORFが切断されていることと一致している。さらに、この結果は、抗N末端抗体と抗C末端抗体の2重染色によりPD-L1 SVが同定可能であることを示している。
　ウエスタンブロットでも、PD-L1に対する抗N末端抗体と抗C末端抗体を用いることにより、同様の結果が得られることを示している。
１４．様々ながん腫におけるPD-L1の発現
(方法)
　TCGAで公開されている33のがん腫（固形がん）、10210例のRNAシーケンスデータより算出した発現データ(RSEM値)に基づいて上位10%(最低30例)の症例を抽出し、RNAシーケンスデータをダウンロードし、CD274融合遺伝子(+)および/またはCD274領域にウイルスの挿入(+)および/またはCD274 エクソン 4 / 3’UTR比高値の症例を抽出した。DLBCおよびSTADについては頻度が高かったため、全症例を対象とした。
　合計1691例のRNAシーケンスデータをダウンロードして解析した。そのデータを用いて、各がん腫において症例ごとにCD274の発現(エクソン 4のRPKM値を対数変換後)を表示した。
(結果)
　結果を図１６に示す。
　図１６中、黒丸はCD274融合遺伝子(+)および/またはCD274 エクソン 4 / 3’UTR比高値の症例であり、二重丸はCD274領域にウイルスの挿入(+)の症例である。
　合計12組織(計26例)のがんにおいてCD274融合遺伝子(+)および/またはCD274領域にウイルスの挿入(+)および/またはCD274 エクソン 4 / 3’UTR比高値が認められた。この結果から、CD274の3’UTRが切断される異常は様々ながんで認められることが明らかとなった。さらに、これらの症例は、各がん腫の中でも、最もCD274高発現である症例が多く、CD274発現調節において3’UTRが極めて重要であることが示唆される。
BLCA: 膀胱がん　1例
CESC: 子宮頸がん　2例
COAD: 結腸がん　2例
DLBC: B細胞性リンパ腫　4例
ESCA: 食道がん　1例
HNSC: 頭頸部がん　1例
KIRC: 腎がん　1例
LUAD: 肺腺がん　2例
READ: 直腸がん　1例
SKCM: 悪性黒色腫　1例
STAD: 胃がん　9例
UCEC: 子宮体がん　1例
１５．発がんウイルスのCD274領域への挿入とCD274 3’UTR異常
(方法)
　TCGAよりダウンロードした1,691例のRNAシーケンスデータで、がん関連ウイルスのゲノムへの挿入がCD274遺伝子内または周囲で認められるかを検証した。
(結果)
　その中で、前述の26例の中で、3例(CESC 1例、HNSC 1例、STAD 1例)で発がんウイルスのCD274領域への挿入を認めた。
　図１７にVS-A9U7-01症例(CESC)（図１７Ａ）およびFP-7998-01症例(STAD)（図１７Ｂ）の検証結果を示す。
　Human papilloma virus (HPV) 16の挿入をCD274のイントロン 6に認めたVS-A9U7-01症例(CESC)では、CD274転写産物のORFはエクソン 6で切断されて、CD274 イントロン6からHPV (human papilloma virus) E2/E5遺伝子へと続く転写産物が形成されていた。
　またはEpstein-Barr virus(EBV)の挿入をCD274の隣接した上流の遺伝子であるPLGRKT イントロン 3に認めるFP-7998-01症例(STAD)では、その領域を含むtandem duplicationが生じ、CD274転写産物が3’UTRで切断されていた。
　これらの結果はCD274領域への発がんウイルスの挿入とCD274 3’UTR異常の関連があることを示している。
１６．　CRISPR/Cas9システムを用いてCD274 3’UTRに欠失または逆位を導入することにより、CD274発現が顕著に上昇する。
(方法)
　ヒト(上段)またはマウス(下段)の細胞株に対して、CD274 3’UTRの5’末端および3’末端の2ヵ所を標的とするsgRNAおよびCas9をトランスフェクションすることにより、これらの細胞株にCD274 3’UTRのほぼ全長(2.7kb)に渡る欠失または逆位をCRISPR(clusered regularly interspaced short palindoromic repeats)/Cas9システムを用いて導入した。その細胞を純化して、フローサイトメトリーによりCD274の細胞表面での発現を評価した。目的の欠失または逆位が導入されていることは、PCRおよびシーケンスにて確認した。
　対象としては、ヒト細胞株であるHEK293T(胎児腎)、T2(T細胞とB細胞のハイブリッド)、PC-9(肺がん)および、マウス細胞株であるEG7-OVA(T細胞リンパ腫、Ovalbuminを発現)、P815(マスト細胞腫)、B16-F10(悪性黒色腫)を選択した。
(結果)
　結果を図１８に示す。上段はヒト細胞株の結果を、下段はマウス細胞株の結果を示す。
　その結果、対象とした全てのヒト・マウス細胞株で、親細胞株やMock導入細胞株と比較して、３‘UTRの欠失・逆位を導入した細胞株(SgPD-L1 F×R)で顕著なCD274の発現上昇を認めた。
　これらの結果は、遺伝子解析により同定されたCD274 3’UTRの構造異常とCD274高発現の間に因果関係があることを実験的に証明している。すなわち、CD274 3’UTRの異常によりCD274過剰発現が誘導されることを示している。
１７．　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現はPD-1発現T細胞にアポトーシスを誘導する。
(方法)
　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が免疫系に与える影響をin vitroで評価するために、CRISPR-Cas9システムによりCD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が誘導されたPC-9細胞株またはコントロール細胞株(Mock)と、PD-1を導入したJurkat T細胞株またはPD-1を導入していないコントロール細胞株(Mock)を共培養後に、Jurkat T細胞のアポトーシスの程度をAnnexin-Vを用いたフローサイトメトリーにより評価した。
(結果)
　結果を図１９に示す。横軸の「PC-9」の「SgPD-L1」は、CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が誘導されているPC-9細胞株を示し、「(-)」はCD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が誘導されていないPC-9細胞株を示す。横軸の「Jurkat」のPD-1はPD-1を導入したJurkat T細胞株を示し、「Mock」はPD-1を導入していないコントロール細胞株を示す。
　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現はPD-1を発現するT細胞のアポトーシスを強く誘導することが示された（図１９の右のアイソタイプコントロールの結果）。
　この結果は、CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が免疫からの回避に関与する可能性を示唆している。
１８．　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現は腫瘍形成を促進する。
(方法)
　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が造腫瘍能に与える影響をin vivoで評価するために、CRISPR-Cas9システムによりCD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が誘導されたEG7-OVA細胞株（SgPd-l1）およびコントロール細胞株(Mock)を同系マウスに皮下移植し、免疫賦活化剤であるpoly(I:C)またはコントロールとしてPBSを移植後7日目より投与し、定期的に腫瘍径を測定した。この実験では、poly(I:C)は腫瘍(特にovalbumin)に対する免疫が誘導されると考えられる。
(結果)
　図２０－１に実験のプロトコルを示し、図２０－２にMock(図２０－２Ａ）およびCD274高発現が誘導されたEG7-OVA細胞株（SgPD-L1）（図２０－２Ｂ）における腫瘍径の変化を示す。
　コントロール細胞株では、poly(I:C)投与により腫瘍径の縮小が認められたが、CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現細胞株では、poly(I:C)投与しても、投与なしと同程度の腫瘍の増大が認められた。
　この結果は、in vivoにおいて、CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現は抗腫瘍免疫による腫瘍抑制効果を克服することができることを示している。
１９．　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現はCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤を抑制する。
(方法)
　１８の実施例と同様のEG7-OVA細胞株の同系移植の実験において、移植後14または15日目にマウスから腫瘍を採取し、CD8およびDAPIの免疫染色によりCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤の程度を評価した。CD8陽性細胞数は代表的な2～3匹のマウスから得られた切片より20視野以上計測した。
(結果)
　図２１－１に染色像を示し、図２１－２に腫瘍内のCD8陽性T細胞を示す。図２１－１の染色像では、poly(I:C)投与を投与したコントロール細胞株（Mock）の染色像（右上）において、緑色に染色されたCD8陽性T細胞の数の増加が認められる。
　コントロール細胞株（Mock）では、poly(I:C)投与によりCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤の増加が認められたが、CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現細胞株（SgPD-L1）では、poly(I:C)投与しても浸潤細胞数のわずかな増加が認められたのみであった。
　この結果は、in vivoにおいて、CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現はCD8陽性細胞傷害性T細胞の腫瘍内への浸潤を抑制する効果があることを示唆している。
２０．　PD-1/PD-L1阻害はCD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現による腫瘍形成促進および免疫抑制効果を抑制することができる。
(方法)
　CD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現による造腫瘍能に対するPD-1/PD-L1阻害の効果をin vivoで検証するために、CRISPR-Cas9システムによりCD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現が誘導されたEG7-OVA細胞株を同系マウスに皮下移植し、免疫賦活化剤であるpoly(I:C)を投与したマウスに対して抗PD-L1抗体またはアイソタイプコントロールの腹腔内注射を行い、EG7-OVA腫瘍に与える影響を評価した。これらのレシピエントマウスについては、定期的に腫瘍径を測定し、移植後14または15日目にCD8およびDAPIの免疫染色によりCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤の程度を評価した。
(結果)
　図２２－１に腫瘍径の経時的変化のグラフを、図２２－２にCD8およびDAPIの免疫染色像を、図２２－３に腫瘍内のCD8陽性T細胞を示す。図２２－２の染色像では、抗PD-L1抗体を投与したマウスにおいて（図２２－３Ｂ）、アイソタイプコントロールを投与したマウス（図２２－３Ａ）よりも、緑色に染色されたCD8陽性T細胞の数の増加が認められる。
　図に示すように、抗PD-L1抗体により腫瘍形成能およびCD8陽性T細胞の腫瘍内への浸潤の抑制が認められた。
　この結果は、in vivoにおいて、PD-1/PD-L1阻害はCD274 3’UTR異常に伴うCD274高発現による腫瘍形成および免疫抑制効果を抑制することが可能であることを示している。
２１．　CD274 SVによりCD274 ORFが切断された変異体はPD-1結合能を保っている。
(方法)
　ATL患者検体(ATL049、ATL050、ATL022およびATL079の５検体）またはレトロウイルスによりCD274野生型（WT)または切断変異体を導入したPC-9細胞株を用いて、PD-1 Igに対する結合能をフローサイトメトリーにて評価した。ATL患者検体において、ATL050はORF切断がなく（Intact)、ATL022およびATL079はORF切断が認められた（Truncated)。PC-9に導入した変異体はATL020(Ex7を欠損)、ATL079(Ex6および7欠損)由来であった。
(結果)
　図２３に結果を示す。図２３ＡはATL患者検体の評価結果を示し、図２３ＢはPC-9細胞株の結果を示す。
　ATL患者検体およびCD274遺伝子導入PC-9細胞株のいずれにおいても、ORF切断の有無に関わらず、PD-L1の受容体であるPD-1に対する結合が認められた。
　この結果は、CD274構造異常によるCD274 ORF切断がPD-1結合能には影響を及ぼさず、CD274 SV(+)例に認められる過剰発現したCD274の機能が保たれていることを示している。
２２．　CD274領域のコピー数に独立して、CD274 SVはCD274過剰発現に関係する。
(方法)
　TCGAからダウンロードしたDLBC 48検体、STAD415検体、自験例であるATL43検体で、RNAシーケンス解析により求めたCD274発現(エクソン　4　RPKM)とSNPアレイより求めたCD274領域のコピー数がCD274発現とどのように関係する検討した。統計手法としては共分散分析を用いた。
(結果)
　図２４に結果を示す。図２４ＡがDLBC（B細胞性リンパ腫）の結果、図２４ＢがSTAD（胃がん）の結果、図２４CがATL（成人Ｔ細胞白血病）の結果を示す。図２４中、黒丸はCD274融合遺伝子(+)および/またはCD274 エクソン 4 / 3’UTR比高値の症例であり、二重丸はCD274領域にウイルスの挿入(+)の症例である。
　DLBC、STAD、ATLのいずれにおいても、CD274 SVは有意に独立してCD274高発現と関係していた。
　CD274コピー数増幅はCD274高発現と関係することが知られているが、この結果は、CD274 SVはCD274コピー数と独立してCD274発現と関係することを示している。
　本発明により、種々のがんにおけるPD-1/PD-L1阻害剤の有効性を判断することができ、さらに悪性腫瘍患者ごとにPD-1/PD-L1阻害剤の有効性を判断することができる。その結果、PD-1/PD-L1阻害剤により悪性腫瘍治療の可能性を拡大することができる。
配列番号１０、１１　プライマー

Claims (14)

  1. 　悪性腫瘍を罹患している被験体において、PD-1/PD-L1阻害剤が治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記被験体から採取した腫瘍細胞においてPD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常を検出し、異常が存在する場合に、PD-1/PD-L1阻害剤が前記被験体の治療に有効であると評価する方法。
  2. 　PD-1/PD-L1阻害剤の有効性に関連するゲノムの異常が、PD-L1（CD274）遺伝子の発現亢進に関連するPD-L1遺伝子の異常である、請求項１記載の方法。
  3. 　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1遺伝子の3'UTR領域の完全なまたは部分的な欠失である、請求項２記載の方法。
  4. 　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1遺伝子の3'UTR領域の欠失を引き起こすコピー数変化である、請求項２記載の方法。
  5. 　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1転写物からのエクソン６およびエクソン７の全部または部分的な切断である、請求項２記載の方法。
  6. 　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1転写物からのエクソン５、エクソン６およびエクソン７の全部または部分的な切断である、請求項２記載の方法。
  7. 　PD-L1遺伝子のエクソン１～エクソン５のいずれかの転写産物とPD-L1遺伝子の3'UTR領域の転写産物を定量し、エクソン転写産物の量と3'UTR領域の転写産物の量の比を算出し、該比が所定の値以上の場合にPD-1/PD-L1阻害剤ががん治療に有効であると評価する、請求項２記載の方法。
  8. 　PD-L1遺伝子の異常が、PD-L1 mRNAの発現の亢進である、請求項２記載の方法。
  9. 　PD-L1遺伝子の異常が、ウイルスの挿入による異常である、請求項２記載の方法。
  10. 　ウイルスがHuman papilloma virus (HPV)又はEBV (Epstein-barr virus)である、請求項９記載の方法。
  11. 　被験体から採取した腫瘍細胞中のPD-L1タンパク質を、PD-L1に対する抗C末端抗体およびPD-L1に対する抗N末端抗体を使用した免疫組織染色により染色し、PD-L1に対する抗N末端抗体で染色が認められるが、PD-L1に対する抗C末端抗体では染色が認められない場合、PD-1/PD-L1阻害剤が前記被験体の治療に有効であると評価する、請求項２に記載の方法。
  12. 　悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫、胃がん、大腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、腎がん、肺腺がん、皮膚悪性黒色腫およびB細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　悪性腫瘍が、食道がん、頭頸部がん、直腸がんおよび子宮体がんからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　PD-1/PD-L1阻害剤が抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。 
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