JP2015505669A - ナチュラルキラー／ｔ細胞リンパ腫（ｎｋｔｃｌ）の感受性予測、診断および治療 - Google Patents

ナチュラルキラー／ｔ細胞リンパ腫（ｎｋｔｃｌ）の感受性予測、診断および治療 Download PDF

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Abstract

ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性予測、診断および治療。本発明は、ＪＡＫ突然変異について試験するステップを含む、対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／または、ＮＫＴＣＬを診断するための方法に関する。本発明はまた、少なくとも１つのＪＡＫ突然変異を含む細胞株を用いて、ＮＫＴＣＬを治療することが可能な候補薬剤をスクリーニングする方法に関する。本発明は、少なくとも１つのＪＡＫ突然変異を含むＮＫＴＣＬ動物モデルを含む。本発明はまた、ＮＫＴＣＬの治療のためのＪＡＫ阻害剤を含む。

Description

本発明は、がん治療および／または診断に関する。具体的には、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療および／または診断に関する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の一種である。ほとんどのＮＨＬ（９０％）は、Ｂ細胞起源である。ＮＫ細胞リンパ腫は、Ｂ細胞からは発生しない。しかしながら、ＮＫ細胞リンパ腫が発生する正常細胞については、未だ議論がされている。特に、ＮＫ細胞リンパ腫が真のＮＫ細胞の存在を意味するのか、または、単に異常な細胞マーカーを有するＴ細胞の存在を意味するのかどうかが議論されている。ＮＫ細胞リンパ腫の正確な系列に関する明白な証拠が存在しないので、多くの研究者は、この状態を分類するときにはＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）という用語を用いることを好む。
ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）は、特に、アジア諸国および一部の中南米で見られる。それは、アジアにおける成熟Ｔ細胞リンパ腫の全事例の半分までを占める（１）。しかしながら、より一般的なＢ細胞リンパ腫と比べて、その分子特性および病因についてはほとんど知られていない。ＮＫＴＣＬに関して承認された標準的な第一選択治療が現在のところないために、リンパ腫の当該サブタイプについての基礎科学および臨床研究はほとんど進展がなく、これらの患者の扱いにおいて大きな挑戦を構成し続ける。多剤化学療法および領域照射療法にもかかわらず、５年の全生存は非鼻型ＮＫＴＣＬではおよそ９％であり、鼻型ＮＫＴＣＬでは４２％である（２，３）。
比較的より一般的なＢ細胞リンパ腫と比べて、ＮＫＴＣＬの分子特性および病因についてはほとんど知られていない。これは、西洋で相対的に希少であり十分なバイオプシーを得ることが困難であることに一部起因し得る。このように、従来の化学療法でのＮＫＴＣＬの治療は、これまで芳しくない結果が得られており、結果はほとんど常に、ステージＩＩＩまたはＩＶ疾患を有する患者に関して致命的である。
ＮＫＴＣＬにおける新規の遺伝子異常および潜在的な治療標的、ならびに、ＮＫＴＣＬのための潜在的な治療剤を同定することが望ましい。
本発明は、がん治療および／または診断、具体的には、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療および／または診断に関する。
第一の態様によれば、本発明は、少なくとも１つのＪＡＫ遺伝子について対象の遺伝子型を試験するステップを含む、対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／またはＮＫＴＣＬを診断するための方法に関し、ここで、突然変異型ＪＡＫ遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／または、ＮＫＴＣＬを有することを示す。
本発明はまた、対象が野生型または突然変異型ＪＡＫタンパク質を発現するかどうか試験するステップを含む、対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／またはＮＫＴＣＬを診断するための方法に関し、ここで、突然変異型ＪＡＫタンパク質の発現は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／または、ＮＫＴＣＬを有することを示す。
第二の態様によれば、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を含むＮＫＴＣＬ細胞株を準備するステップ；
（ｉｉ）ＮＫＴＣＬ細胞株を薬剤に接触させるステップ；および
（ｉｉｉ）哺乳類ＮＫＴＣＬ細胞株に対する薬剤の効果を判定するステップ；
を含む、ＮＫＴＣＬを治療することが可能な薬剤をスクリーニングするための方法に関し、
ここで、薬剤が、ＮＫＴＣＬ細胞株の生存能力、生育および／または増殖を減少させる能力、および／または、ＮＫＴＣＬ細胞株のアポトーシスを増加させる能力は、薬剤がＮＫＴＣＬを治療する能力を示す。
第三の態様によれば、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）突然変異型ＪＡＫ遺伝子を保有するＮＫＴＣＬ細胞株を準備するステップ；
（ｉｉ）ＮＫＴＣＬ細胞株を薬剤に接触させるステップ；および
（ｉｉｉ）ＮＫＴＣＬ細胞株に対する薬剤の効果を判定するステップ；
を含む、少なくとも１つのＪＡＫタンパク質の活性を低下させることが可能な薬剤をスクリーニングするための方法に関し、
ここで、薬剤が、生存能力、生育および／または増殖を減少させる能力、および／または、アポトーシスを増加させる能力は、候補薬剤が少なくとも１つのＪＡＫタンパク質の活性を低下させる能力を示す。
第四の態様によれば、少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を含むＮＫＴＣＬ動物モデルが提供される。
第五の態様によれば、本発明は、ＪＡＫ阻害剤を対象に投与するステップを含む、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）を治療する方法に関する。
本発明はまた、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療のための薬剤の調製でのＪＡＫ阻害剤の使用を含む。
本発明はさらに、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療に用いるためのＪＡＫ阻害剤を含む。
図１は、ＮＫＴＣＬサンプルでのＪＡＫ３ Ａ５７２ＶおよびＡ５７３Ｖ突然変異の同定に導く、高解像度融解（ＨＲＭ）およびサンガーシーケンスのデータを示す。図１（ａ）は、ＪＡＫ３遺伝子のＪＨ２シュードキナーゼドメイン上のＡ５７２ＶおよびＡ５７３Ｖ突然変異の位置を示す。ＪＡＫ３突然変異を確認するために用いた高解像度融解（ＨＲＭ）およびサンガーシーケンスのデータを図１（ｂ）〜（ｈ）に示す。具体的には：図１（ｂ）は、ＪＡＫ３ Ａ５７２ＶとＡ５７３Ｖ突然変異の比率を円グラフで示す（ｎ＝６５）。図１（ｃ）は、３つの遺伝子型：野生型ＪＡＫ３、ヘテロ接合性ＪＡＫ３（ｃ．１７１５Ｃ>Ｔ，ｐ．Ａｌａ５７２Ｖａｌ）およびホモ接合性ＪＡＫ３（ｃ．１７１５Ｃ>Ｔ，ｐ．Ａｌａ５７２Ｖａｌ）について、野生型サンプルに標準化したＨＲＭ差分プロット（反復試験）を示す。図１（ｄ）は、配列決定されてヘテロ接合性ＪＡＫ３（ｃ．１７１８Ｃ>Ｔ，ｐ．Ａｌａ５７３Ｖａｌ）突然変異と確認されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＮＫＴＣＬサンプルの、代表的なＨＲＭ差分曲線を示す。とりわけ、ＪＡＫ３ Ａ５７２ＶまたはＡ５７３Ｖ突然変異のいずれかを有するサンプルに関するＨＲＭ差分プロットは、Ｃ>Ｔ突然変異が同一のため、同様であった。また、代表的なシーケンスクロマトグラムを、ＪＡＫ３野生型対立遺伝子に関して図１（ｅ）に、Ａ５７２Ｖヘテロ接合性突然変異型に関して図１（ｆ）に、Ａ５７３Ｖヘテロ接合性突然変異型に関して図１（ｇ）に、およびＡ５７２Ｖホモ接合性突然変異型に関して図１（ｈ）に示す。 図２は、ＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化に対するＩＬ−２の効果、および、ＮＫＴＣＬ細胞株に対するＣＰ−６９０，５５０処理の効果を示すデータを示す。図２（ａ）は、組み換えヒトＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌ）有りまたは無しで培養して、４８時間の時点で採取して、ＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化をイムノブロッティングによりアッセイした、ＮＫ−Ｓ１（ＪＡＫ突然変異型）およびＫＨＹＧ−１（野生型）細胞に関するイムノブロッティングの結果を示す。ＮＫ−Ｓ１、ＫＨＹＧ−１およびＫ５６２（コントロール）細胞株を、ｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤ＣＰ−６９０，５５０で処理した評価の結果を図２（ｂ）〜２（ｄ）に示す。図２（ｂ）は、４８時間の時点でイムノブロッティングにより評価した、サンプルでのＳＴＡＴ５リン酸化を示す。図２（ｃ）は、７２時間の時点でＭＴＳアッセイにより分析した、細胞生存能力を示す。図２（ｄ）は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色により評価してフローサイトメトリーにより分析した、７２時間における薬剤誘導アポトーシスを示す。実験は少なくとも３回繰り返した。（ｃ）および（ｄ）における結果は、トリプリケート±ｓ．ｅ．ｍ．の平均を示す。＊は、対応のあるスチューデントｔ検定によるｐ<０．０５を示す。 図３は、突然変異型ＮＫＴＣＬ細胞株ＮＫ−Ｓ１の、サイトカイン非依存性の生育を示すデータを提供する。具体的には、ＮＫ−Ｓ１（ＪＡＫ３突然変異型）およびＫＨＹＧ−１（ＪＡＫ３野生型）は、組み換えヒトＩＬ−２（０〜２００ＩＵ／ｍｌ）有りまたは無しで培養した。細胞生存能力データを、ＮＫ−Ｓ１に関して図３（ａ）に、ＫＨＹＧ−１に関して図３（ｂ）に示す。細胞生存能力を７日間毎日、ＭＴＳアッセイによりモニターし、細胞生育を（４９０ｎｍでの吸光度）−（６５０ｎｍにおけるリファレンス）として示した。（ａ）および（ｂ）における結果は、トリプリケート±ｓ．ｄ．の平均を示す。 図４は、ＪＡＫ３ Ａ５７２Ｖの突然変異が、構成的なＪＡＫ３の活性およびＩＬ−２非依存性のＮＫＴＣＬ細胞増殖を生じさせることを示すデータを示す。図４Ａは、１００ｎＭのＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＪＡＫ３）またはコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉ−Ｃｔｒｌ）で２４時間事前処理して７２時間まで増殖アッセイを行なった、ＮＫ−Ｓ１細胞に関するデータを示す（右パネル）。同時に、これらの細胞を採取して、タンパク質抽出物を、リン酸化ＪＡＫ３（ｐＪＡＫ３）、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ５、または標準化コントロールとしてのβ−アクチンに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。図４Ｂは、野生型ＪＡＫ３（ＪＡＫ３ ＷＴ）または突然変異型ＪＡＫ３発現ベクター（すなわちＪＡＫ３ Ａ５７２Ｖ）で一時的にトランスフェクトされた、ＫＨＹＧ−１細胞に関するデータを示す。これらの細胞におけるｐＪＡＫ３、ｐＳＴＡＴ５、ＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５の相対的レベルをウェスタンブロッティングにより検出して（上パネル）、これらの細胞を用いた増殖分析を、ＩＬ−２有りまたは無しで４８時間行なった（下パネル）。全ての結果は、３回の非依存的実験の平均ＳＥＭとして示す。＊は、ビヒクルコントロール（ビヒクル）と比較したｐ<０．０５である。
（定義）
本明細書で用いられる用語「阻害剤」は、タンパク質の活性を低下させることが可能な任意の物質を指し、例えば、ＪＡＫ阻害剤はＪＡＫタンパク質の活性を低下させることが可能である。具体的には、ＪＡＫ３阻害剤は、ＪＡＫ３タンパク質の活性を低下させることが可能である。タンパク質の活性の低下は、例えばタンパク質の発現または生物学的状況でタンパク質が機能するメカニズムの阻害によるなど、直接的または間接的であってよい。例えば、ＪＡＫ３キナーゼは、ＡＴＰ分子がＡＴＰ結合部位に結合することを必要とし得るので、特にＡＴＰ結合部位に結合してブロッキングすることにより、ＪＡＫ３キナーゼの活性は減少する。ＪＡＫタンパク質の活性もまた、別のタンパク質、例えばサイトカイン受容体の活性を必要とし得るので、このタンパク質の活性の阻害もまた、ＪＡＫタンパク質の活性を低下させ得る。あるいは、ＪＡＫ３キナーゼタンパク質は、対応するｍＲＮＡの翻訳など関連のある核酸ドメインの遺伝子発現の阻害により、より少なく発現され得る。
ＮＫＴＣＬは、ＷＨＯ分類に従ったＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫を指す（６）。用語「ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫」、ＮＫＴＣＬおよび「ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫」は互換的に用いられ、Ｂ細胞起源でない非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の一種を指す。ＮＫＴＣＬは、腫瘍壊死、血管中心性および適切な免疫表現型、特に、ＣＤ５６、細胞質ＣＤ３の存在、およびＥＢＥＲのほぼ普遍的な存在、の典型的形態を有する。ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫は、Ｔ細胞系統の疾患でありＨＴＬＶ−Ｉ感染と関連する成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫とは異なる。
用語「治療」は、疾患、例えばナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）と関連する１つまたは複数の症状を緩和、予防および／または除去することを含む。
本発明は、がん治療および／または診断、具体的には、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療および／または診断に関する。
第一の態様によれば、少なくとも１つのＪＡＫ遺伝子に関して対象の遺伝子型について試験するステップを含む、対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／または、ＮＫＴＣＬを診断するための方法が提供され、ここで、突然変異型ＪＡＫ遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。ヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかの突然変異型ＪＡＫ遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。
ＪＡＫ遺伝子の任意の１つまたは任意の組み合わせが試験され得る。試験されるＪＡＫ遺伝子は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２からなる群から選択されてよい。例えば、ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１遺伝子が試験され得る。概して、配列番号１は野生型ＪＡＫ３遺伝子を示す。一例では、配列番号１のヌクレオチド１５７９２におけるＣとＴの置換、および／または、ヌクレオチド１５７９５におけるＣとＴの置換を含む突然変異型ＪＡＫ３遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。
概して、配列番号３は野生型ＪＡＫ１遺伝子を示す。別の例では、配列番号３のヌクレオチド１２４８２３におけるＴとＧの置換を含む突然変異型ＪＡＫ１遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。突然変異型のＪＡＫ１およびＪＡＫ３遺伝子の両方の存在もまた、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。
前記の方法は、対象由来の分離細胞サンプルに対して行なってよい。分離細胞サンプルは、血液由来および／または腫瘍サンプルであってよい。したがって、前記の方法は、試験するために対象から分離細胞サンプルを準備するステップをさらに含んでよい。前記の方法は、前記の試験のために、対象、血液サンプルおよび／または分離細胞サンプルから核酸分子を分離するステップをさらに含んでよい。分離核酸分子は、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを含んでよい。特に、試験は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡについて行われてよい。
任意の適切な技術を試験に用いてよい。例えば、試験は、配列解析、制限断片長多型分析、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または逆転写ＰＣＲによってよい。特に、サンガーシーケンスおよび高解像度融解のような技術を、試験のために用いてよい。
本発明の別の態様では、対象が野生型または突然変異型ＪＡＫタンパク質を発現するかどうか試験するステップを含む、対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／またはＮＫＴＣＬを診断するための方法が提供され、ここで、突然変異型ＪＡＫタンパク質の発現は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。
ＪＡＫタンパク質の任意の１つまたは任意の組み合わせが試験され得る。試験されるＪＡＫタンパク質は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２からなる群から選択されてよい。例えば、ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１タンパク質が試験され得る。概して、配列番号２は野生型ＪＡＫ３タンパク質を示す。一例では、配列番号２のアミノ酸５７２におけるＡとＶの置換、および／または、アミノ酸５７３におけるＡとＶの置換を含む突然変異型ＪＡＫ３遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。
概して、配列番号４は野生型ＪＡＫ１タンパク質を示す。別の例では、配列番号４のアミノ酸６５２におけるＹとＤの置換を含む突然変異型ＪＡＫ１タンパク質の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。突然変異型のＪＡＫ３およびＪＡＫ１タンパク質の両方の存在もまた、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す。
前記の方法は、対象由来の分離血液および／または細胞サンプルに対して行なってよい。分離細胞サンプルは腫瘍由来であってよい。したがって、前記の方法は、試験のために対象から分離血液および／または細胞サンプルを準備するステップをさらに含んでよい。前記の方法は、前記試験のために、対象、血液サンプルおよび／または分離細胞サンプルからタンパク質分子を分離するステップをさらに含んでよい。
任意の適切な方法を用いて、関連のある野生型および／または突然変異型ＪＡＫタンパク質を発現しているかどうか検出してよい。例えば、試験は、タンパク質配列決定および／または抗体検出によってよい。特に、関連のある野生型および／または突然変異型ＪＡＫタンパク質に対して特異性を有する少なくとも１つの抗体を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が用いられてよい。
本発明の第二の態様では、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を含むＮＫＴＣＬ細胞株を準備するステップ；
（ｂ）ＮＫＴＣＬ細胞株を薬剤に接触させるステップ；および
（ｃ）ＮＫＴＣＬ細胞株に対する、薬剤の効果を判定するステップ；
を含む、ＮＫＴＣＬを治療することが可能な薬剤をスクリーニングするための方法が提供され、
ここで、薬剤が、ＮＫＴＣＬ細胞株の生存能力、生育および／または増殖を減少させる能力、および／または、ＮＫＴＣＬ細胞株のアポトーシスを増加させる能力は、薬剤がＮＫＴＣＬを治療する能力を示し得る。
本発明の第三の態様では、以下のステップ：
（ｉ）少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を保有するＮＫＴＣＬ細胞株を準備するステップ
（ｉｉ）ＮＫＴＣＬ細胞株を薬剤に接触させるステップ；および
（ｉｉｉ）ＮＫＴＣＬ細胞株に対する薬剤の効果を判定するステップ；
を含む、少なくとも１つのＪＡＫタンパク質の活性を低下させることが可能な薬剤をスクリーニングするための方法が提供され、
ここで、薬剤が、細胞株の生存能力、生育および／または増殖を減少させる能力、および／または、細胞株のアポトーシスを増加させる能力は、候補薬剤が、少なくとも１つのＪＡＫタンパク質の活性を低下させる能力を示す。
ＮＫＴＣＬ細胞株は、突然変異型ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３またはＴＹＫ２遺伝子の任意の１つまたは任意の組み合わせを保有してよい。例えば、ＮＫＴＣＬ細胞株は、突然変異型ＪＡＫ３遺伝子および／または突然変異型ＪＡＫ１遺伝子を保有してよい。特に、哺乳類のＮＫＴＣＬ細胞株は、以下の突然変異：
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９２におけるＣとＴの置換（ＪＡＫ３遺伝子中）；
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９５におけるＣとＴの置換（ＪＡＫ３遺伝子中）；および
（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１２４８２３におけるＴとＧの置換（ＪＡＫ１遺伝子中）
の少なくとも１つを保有してよい。
第四の態様によれば、本発明はまた、少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を含むＮＫＴＣＬ動物モデルに関する。例えば、ＮＫＴＣＬ動物モデルは、突然変異型ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含んでよい。具体的には、ＮＫＴＣＬ動物モデルは、突然変異型ＪＡＫ３遺伝子および／または突然変異型ＪＡＫ１遺伝子を含む。より具体的には、ＮＫＴＣＬ動物モデルは、少なくとも１つの以下：
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９２におけるＣとＴの置換；
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９５におけるＣとＴの置換；または
（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１２４８２３におけるＴとＧの置換
の突然変異を含む。
ＮＫＴＣＬ動物モデルはまた、ＮＫＴＣＬを治療することができる候補薬剤のスクリーニングに有用であり得る。
第五の態様によれば、少なくとも１つのＪＡＫ阻害剤を対象に投与するステップを含む、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）を治療する方法が提供される。任意の適切なＪＡＫ阻害剤が用いられ得る。本発明の別の態様では、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療のための薬剤を調製するための、少なくとも１つのＪＡＫ阻害剤の使用が提供される。本発明の別の態様では、ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療に用いるためのＪＡＫ阻害剤が提供される。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ３タンパク質の活性を低下させることが可能であり得る。
例えば、ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２の少なくとも１つを阻害し得る。したがって、前記の阻害剤はｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤であり得る。１つの具体的な例では、ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１を阻害し得る。より具体的には、ＪＡＫ阻害剤はＪＡＫ３を阻害し得て、または、ＪＡＫ阻害剤はまたＪＡＫ１も阻害し得る。
第一の具体例では、ＪＡＫ阻害剤は、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０としても知られる）を含んでよい。第二の具体例では、（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４としても知られる）を含んでよい。
ＪＡＫ阻害剤が投与される対象は哺乳類を含んでよい。対象はヒトを含んでよい。対象は、ホモ接合性またはヘテロ接合性の突然変異を、少なくとも１つのＪＡＫ遺伝子／ＪＡＫタンパク質に保有してよい。例えば、対象は、ホモ接合性またはヘテロ接合性の突然変異を、ＪＡＫ１／ＪＡＫ１、ＪＡＫ２／ＪＡＫ２、ＪＡＫ３／ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２／ＴＹＫ２に保有してよい。具体的には、対象は、ホモ接合性またはヘテロ接合性の突然変異を、ＪＡＫ１／ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ３／ＪＡＫ３に保有してよい。より具体的には、対象は、ＪＡＫ３−Ａ５７２Ｖ、ＪＡＫ３−Ａ５７３ＶおよびＪＡＫ１−Ｙ６５２Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有してよい。しかしながら、対象は、ホモ接合性の野生型表現型を含んでもよい。対象は、ホモ接合性の野生型、ヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異型遺伝子を保有していようとなかろうと、ＪＡＫ遺伝子のうちの任意の１つ、その転写および／または翻訳産物（タンパク質）の発現が増加してよい。
ＣＰ−６９０，５５０はＪＡＫ阻害剤である。それは、トファシチニブ、タソシチニブ、または商品名ＸＥＬＪＡＮＺとして知られる。その化学名は、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリルであり、その構造式は：

である。
ＷＰ−１０３４は、急性骨髄性白血病においてアポトーシス促進および白血病抑制の効果を有すると記載されている（Ｆａｄｅｒｌら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：１８４１−１８５０（２００５））（８）。それはチロシンキナーゼ阻害剤のチルホスチンファミリーのメンバーであり、主にＪａｋ−Ｓｔａｔパスウェイの阻害剤として研究されている。その化学構造および名称は以下である：

ＷＰ１０３４−（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド
本発明を一般的に記載したが、説明の目的で提供されて本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照することにより、同一のものがより容易に理解されるであろう。
ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の分子論的病因はよく知られていない。ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫を生じさせる遺伝子変異は、完全には同定されていない。本研究では、Ｊａｎｕｓキナーゼ３（ＪＡＫ３）体細胞活性化の突然変異（Ａ５７２ＶおよびＡ５７３Ｖ）を、４人のＮＫＴＣＬ患者のうち２人の全エキソーム配列決定により同定した。さらに、ＪＡＫ３突然変異の有病率の検証を、サンガーシーケンスおよび高解像度融解（ＨＲＭ）分析により追加の６１事例で決定した。合計で、６５事例のうち２３事例（３５．４％）が、ＪＡＫ３突然変異を有していた。ＪＡＫ３ Ａ５７２Ｖ突然変異を有する突然変異型ＮＫＴＣＬ細胞株は、ＩＬ−２非依存性の生育および構成的なＪＡＫ３とＳＴＡＴ５のリン酸化を示し、その発がんの役割を示唆した。ＪＡＫ３突然変異の機能的特性は、細胞生育の増加を導くサイトカイン非依存性のＪＡＫ／ＳＴＡＴの構成的な活性化におけるその関与を支持する。これらの突然変異は、ＮＫＴＣＬの病因において重大な役割を果たし得る。さらに、ＪＡＫ３突然変異型および野生型ＮＫＴＣＬ細胞株は、いずれも、新規のｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤ＣＰ−６９０，５５０で処理すると、用量依存的にリン酸化ＳＴＡＴ５が減少し、細胞生存能力が低下し、アポトーシスが増加した。ＣＰ−６９０，５５０はｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤であり、ＪＡＫ３に対してだけでなくＪＡＫ１に対しても阻害作用を有する。このことは、重要であり得る。なぜならば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナリングパスウェイ系でのそれらの機能において、ＪＡＫ１とＪＡＫ３はクロストークしており、一方の阻害に応答して、もう一方の何らかの補完的な上方制御があり得るからである。例えば、ＪＡＫ３が阻害される場合は、ＪＡＫ３の減少した活性を補うためにＪＡＫ１が上方制御され得て、このことは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナリングを保ち得る。逆もまた当てはまる。さらに例を挙げると、ＪＡＫ１だけでなくＪＡＫ３の活性も低下させることが可能なｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤を用いたＮＫＴＣＬの治療は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナリングの阻害に特に効果的であり得る。
それ故に、脱調節化ＪＡＫ／ＳＴＡＴパスウェイを標的とすることは、ＮＫＴＣＬ患者の有望な治療となり得る。これらの知見は、ＮＫＴＣＬ患者の扱いに対して重要な暗示を有する。
（材料および方法）
<組織サンプル>
対応する新鮮な凍結組織および末梢血サンプルを、４人の承諾を得たＮＫＴＣＬ患者から取得した。本発明者らは、検証のために、さらに６１人のＮＫＴＣＬ患者由来のパラフィン包埋組織ブロックを確認した。ＮＫＴＣＬの診断は、造血およびリンパ組織の腫瘍の２００８年世界保健機関（ＷＨＯ）分類に従って行なった（６）。全てのサンプルは、シングヘルスの血液病理学者により中心的にレビューされた。本研究は、シンガポールのシングヘルスを中心とした治験審査委員会により承認された。
<ＤＮＡの分離>
凍結組織および対応する血液サンプル（ｐａｉｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ）のＤＮＡを、それぞれ、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、メーカーの説明書に従って分離した。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルに関しては、各サンプル由来の１つまたは２つの１０μＭスライスからゲノムＤＮＡを抽出して、パラフィンをキシレンにより除去して、組織を１００％エタノールで２回洗浄した後、一晩、プロテイナーゼＫで消化した。それから、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。
<Ｊａｎｕｓキナーゼにおける体細胞突然変異の検出>
各サンプルから抽出されたゲノムＤＮＡは、全ゲノムがＲＥＰＬＩ−ｇ ＷＧＡ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で増幅された。ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴｙｋ２のコーディングエキソン配列をサンガーシーケンスにより配列決定して突然変異を検出した。突然変異が腫瘍においてのみ検出されたが対応する血液サンプルでは検出されなかった場合に、突然変異の体細胞起源を確証した。
突然変異の配列情報を以下の表１および添付のゲノムＤＮＡ、タンパク質およびｃＤＮＡ配列リスト（配列番号１〜配列番号６）に、以下の配列名称とともに示す：
配列番号１−ＪＡＫ３野生型ゲノムＤＮＡ
配列番号２−ＪＡＫ３野生型アミノ酸配列
配列番号３−ＪＡＫ１野生型ゲノムＤＮＡ
配列番号４−ＪＡＫ３野生型アミノ酸配列
配列番号５−ＪＡＫ３野生型ｃＤＮＡ
配列番号６−ＪＡＫ１野生型ｃＤＮＡ
<高解像度融解（ＨＲＭ）および双方向のサンガーシーケンス分析を用いた突然変異検証>
高解像度融解（ＨＲＭ）およびサンガーシーケンスを用いてＪＡＫ１およびＪＡＫ３の突然変異を確認し、ＮＫＴＣＬ患者個体群でのそれらの有病率を検証した。両方の方法を組み合わせれば、ＦＦＰＥサンプルにおける突然変異検出の精度が非常に改善する。ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ突然変異もまた、両方の方法で配列決定した。検証に用いたプライマーセットの配列を表２にリスト化し（下記参照）、対応する配列名称で添付の配列リストに含ませる。
ＨＲＭ曲線分析を用いて点変異の存在を判別した。関連のある突然変異を含む標的ＤＮＡフラグメントをゲノムＤＮＡサンプルから増幅するために、ＳｓｏＦａｓｔ（商標）ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７２−５２００）を用いた。ＨＲＭプライマーを終濃度６００ｎＭで用いて、ＢｉｏＲａｄのＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムを用いて反復して反応を行なった。サイクルおよび融解条件は以下のとおりにした：１サイクルの９８℃２分；３９サイクルの９８℃５秒、５８℃１０秒；１サイクルの９５℃３０分、および、０．２℃／秒で７２℃から９５℃まで上昇させる融解。Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｌｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを用いてＨＲＭ曲線を分析した。野生型の曲線から外れるＨＲＭ差分曲線を、突然変異有りとみなした。
サンガーシーケンスのために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９６６−０８３）を用いて、９５℃１０分；３９サイクルの９５℃３０秒；６０℃３０秒、７２℃１分、そして７２℃１０分の最後の伸長のサイクルでＰＣＲを行なった。ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（Ｃａｔ．Ｎｏ．４３３７４５７）を用いて、９６℃１分；２９サイクルの９６℃１０秒；５０℃５秒および６０℃４分のサイクルでシーケンスＰＣＲを行なった。結果として生じた産物をＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡアナライザーに供した。
<細胞株、細胞生存能力およびアポトーシス分析>
ＮＫ−Ｓ１は、以前に報告されたＮＫＴＣＬ異種移植片から確立された細胞株である（７）。異種移植片は、ＪＡＫ１（Ｙ６５２Ｄ）およびＪＡＫ３（Ａ５７２Ｖ）突然変異の両方を有することが分かった同一患者由来の精巣の転移腫瘍から取得した。抗生物質、熱不活化ＦＢＳ（１０％）およびウマ血清（ＥＳ）（１０％）で補充されたＤＭＥＭ培地中で、６０よりも多い継代培養でＮＫ−Ｓ１を培養した。表現型分析は、細胞内染色により、表面ＣＤ３−ＣＤ５６＋、およびグランザイムＢ＋を示した。ＮＫ−Ｓ１ ＮＫＴＣＬ細胞株をシーケンスして、ＪＡＫ３ Ａ５７２Ｖに関してホモ接合性突然変異、およびＪＡＫ１コドン６５２の突然変異を有することを確認した。ＫＨＹＧ−１は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓから取得したＩＬ−２依存性の侵襲性ＮＫ白血病細胞株であり、抗生物質、熱不活化ＦＢＳ（１０％）、ＥＳ（１０％）および２００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（プロロイキン、ノバルティス）で補充されたＲＰＭＩ培地中で培養した７。ＫＨＹＧ−１をシーケンスして、ＪＡＫ３のコドン５７２とコドン５７３、およびＪＡＫ１のコドン６５２とコドン６５８に関して野生型であることが分かった。Ｋ５６２（ＣＣＬ−２３４，ＡＴＣＣ）は、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子陽性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株である。
ｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤であるＣＰ−６９０，５５０（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ５００１）に対するＮＫＴＣＬ細胞株の感受性を試験するために、細胞を２×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにまいて、様々な濃度のＣＰ−６９０，５５０で、またはビヒクルコントロールで処理した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＭＴＳアッセイにより生存能力を評価して、吸光度を４９０ｎｍと６５０ｎｍの両方で読み取った（参考文献どおり）。薬剤誘導アポトーシスの程度を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）染色により評価した。データの取得は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行なった。
<イムノブロッティング>
組み換えヒトＩＬ−２（プロロイキン、ノバルティス）有りまたは無しで、または、ＣＰ−６９０，５５０の存在下または不存在下で、インキュベート後、指示された時間間隔で細胞を採取した。細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、５０μｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．６，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ノニデットＰ−４０，１％デオキシコレートナトリウム，０．１％ＳＤＳ，１×ホスファターゼ阻害剤（Ｃａｔ．Ｎｏ．７８４２０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２９７８０００，ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１ｍＭオルトバナデートナトリウム］中で溶解させた。その後、細胞溶解物を氷上で１０秒間、２０Ａｍｐで２回超音波処理して、氷上でさらに１５分間撹拌した。１４，０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離後、上清を除去して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｃａｔ．Ｎｏ．５００−０００６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてタンパク質濃度を決定した。Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６５−８００６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、タンパク質サンプルを、５％スタッキングおよび８％分離のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離して、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０−３９３０ＥＤＵ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて１００Ｖで１２０分間、０．４５μＭニトロセルロース膜（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６２−０１１５，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上にトランスファーした。ＰＢＳＴ中５％ミルクで膜をブロッキングして、その後、ＰＢＳＴ中５％のＢＳＡおよび５ｍＭのオルトバナデートナトリウム中で、ウサギ抗−ホスホ−ｊａｋ１（Ｔｙｒ １０２２／１０２３）（Ｃａｔ．Ｎｏ．３３３１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗−ホスホ−ＪＡＫ３（Ｔｙｒ ９８０／９８１）（Ｄ４４Ｅ３）（Ｃａｔ．Ｎｏ．５０３１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウス抗−ホスホ−Ｓｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃａｔ．Ｎｏ．９３５６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびウサギ抗−ホスホ−ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ ７０５）（Ｄ３Ａ７）（Ｃａｔ．Ｎｏ．９１４５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で一晩インキュベーションして、エンハンスド化学発光（ＥＣＬ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０７，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ ２１３２，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。Ｊａｋ１に対する抗体（６Ｇ４）（Ｃａｔ．Ｎｏ．３３４４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｊａｋ３に対する抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．３７７５，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｓｔａｔ５に対する抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．９３６３，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびβ−アクチンに対する抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１９７８，Ｓｉｇｍａ）を用いて、非リン酸化タンパク質を検出し、またはローディングコントロールとした。全ての抗体は、推奨される希釈で用いた。
（結果）
サンガーシーケンスを用いて、リンパ節外ＮＫＴＣＬを有する４人の患者由来の新鮮な凍結腫瘍および血液検体におけるＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴｙｋ２のエキソン領域をシーケンスした。２つのＪＡＫ３突然変異、Ａ５７２Ｖ（ｐ．Ａｌａ５７２Ｖａｌ，ｃ．１７１５Ｃ>Ｔ）およびＡ５７３Ｖ（ｐ．Ａｌａ５７３Ｖａｌ，ｃ．１７１８Ｃ>Ｔ）、および新規のＪＡＫ１突然変異、Ｙ６５２Ｄ（ｐ．Ｔｙｒ６５２Ａｓｐ，ｃ．１９５４Ｔ>Ｇ）を同定した。興味深いことに、ＪＡＫ３ Ａ５７２ＶおよびＪＡＫ１ Ｙ６５２Ｄの突然変異は同一サンプルに見いだされた。ＪＡＫ３突然変異の両方とも、ＪＨ１キナーゼドメインに対して自己抑制的作用を有することが知られているＪＨ２シュードキナーゼドメイン上のエクソン１２に位置する（図１ａ）。ＪＡＫ１およびＪＡＫ３において同定された３つのミスセンス突然変異は、全て、起源が体細胞であることが確認されて、ポリフェン（Ｐｏｌｙｐｈｅｎ）により、おそらく損傷であると予測された。
同定された突然変異を、追加の６１人のＥＮＫＴＣＬ患者のＦＦＰＥサンプル中で検証して、それらの有病率を確認した。この検証試験から、ＪＡＫ３突然変異を有する別の２１人の患者をサンガーシーケンスにより同定した。合計で、６５人のＮＫＴＣＬ患者のうち、２３人の患者（３５．４％）が、ＪＡＫ３突然変異を有することが分かった（図１ｂ）。高解像度融解（ＨＲＭ）分析を４０個のＦＦＰＥサンプルについて実施し、１４個のＪＡＫ３突然変異型を検出した（３５％）。ＪＡＫ３突然変異を有する２３人の患者のうち、ヘテロ接合性Ａ５７２Ｖが１７人、ホモ接合性Ａ５７２Ｖが２人、ヘテロ接合性Ａ５７３Ｖ突然変異型が２人、ホモ接合性Ａ５７３Ｖ突然変異型が１人、そして、Ａ５７２ＶとＡ５７３Ｖの両方のヘテロ接合性突然変異を有する患者が１人いた（図１ｃ〜ｈ）。さらにＪＡＫ１ Ｙ６５２Ｄ突然変異型は見られなかった。加えて、典型的なＢＣＲ／ＡＢＬ陰性の慢性骨髄増殖性障害を有する患者および他のクローン性血液がん、例えば骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病を有する、様々な患者の大部分に存在することが最近になって判明した、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ（ｐ．Ｖａｌ６１７Ｐｈｅまたはｃ．１８４９Ｇ>Ｔ）突然変異を有する患者は見られなかった。
（考察）
<ＪＡＫ３Ａ５７２Ｖ活性化突然変異は、サイトカイン非依存性の生育をもたらす>
ＩＬ−２は、ＮＫ細胞の増殖および活性化に必要とされる必須のサイトカインである（４）。ＪＡＫ１およびＪＡＫ３は、ＳＴＡＴ転写因子のリン酸化を介してＩＬ−２受容体シグナリングを仲介する（５）。同定された活性化ＪＡＫ３突然変異の機能的重要性を踏まえて、我々は、ＪＡＫ３突然変異が、ホモ接合性ＪＡＫ３Ａ５７２Ｖ突然変異を有するＮＫＴＣＬ細胞株（ＮＫ−Ｓ１）に対してＩＬ−２非依存性の生育をもたらすことができるか試験した。ＪＡＫ−突然変異型（ＮＫ−Ｓ１）細胞は、ＩＬ−２非依存性の生育（図３）およびＪＡＫ３とＳＴＡＴ５の両方の構成的なリン酸化（図２ａ）を示した。対照的に、ＪＡＫ３−野生型ＫＨＹＧ−１細胞は、明らかにＩＬ−２依存性であった（図３および図２ａ）。重要なことに、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡで処理したＮＫ−Ｓ１細胞は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、細胞増殖が有意に低減し、また、ＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５の自己リン酸化も減少した（図４Ａ）。相反的に、突然変異型ＪＡＫ３（ＪＡＫ３Ａ５７２Ｖ）ｃＤＮＡを一時的に過剰発現するＫＨＹＧ−１細胞は、ＩＬ−２非依存性の増殖およびＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５の自己リン酸化を示した（図４Ｂ）。これらの結果は、ＪＡＫ３活性化の突然変異は機能対立遺伝子によるものであり、ＩＬ−２非依存的な様式でＪＡＫ／ＳＴＡＴパスウェイの構成的活性に寄与することを示す。
本研究は、ＪＡＫ突然変異が、ＪＡＫ３ Ａ５７２ＶとＪＡＫ１ Ｙ６５２Ｄの両方の突然変異を有する患者サンプル由来の異種移植片から確立されたＮＫＴＣＬ細胞株において、サイトカイン非依存性の生育をもたらすことを証明した。ＮＫ−Ｓ１は、同定されたＪＡＫ１およびＪＡＫ３突然変異を有さないことが試験された野生型ＫＨＹＧ−１と対照的に（図２ａ）、ＩＬ−２非依存性な生育（図３）、構成的なＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化（図２ａ）を示した。
<ＮＫＴＣＬ細胞株に対するＣＰ−６９０，５５０の効果>
ｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤であるＣＰ−６９０，５５０がＪＡＫ−ＳＴＡＴパスウェイを抑制する能力を評価した。活性化ＪＡＫタンパク質は、ＳＴＡＴタンパク質を直接リン酸化するので、ＪＡＫ突然変異型細胞株（ＮＫ−Ｓ１）および野生型ＮＫＴＣＬ細胞株（ＫＨＹＧ−１）を増加する濃度のＣＰ−６９０，５５０で処理して、イムノブロッティングによりｐＳＴＡＴ５を分析した（図２ｂ）。ＮＫ−Ｓ１とＫＨＹＧ−１の両方の細胞株は、阻害剤で治療すると、用量依存的なｐＳＴＡＴ５の低減（図２ａ）および細胞生存能力の低下（図２ｂ）を示した。ＣＰ−６９０，５５０は、そのＳＴＡＴ５リン酸化は活性化ＪＡＫ３とは独立であるので、コントロールＫ５６２細胞株においてｐＳＴＡＴ５を阻害しなかった（図２ｂ）。アネキシンＶ染色により示されるように、ＮＫ−Ｓ１の生存能力の低下は、アポトーシスの増加と相関した（図２ｃ）。
要するに、ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）のＪａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）のエキソン配列決定により、ＪＡＫ３ Ａ５７２とＡ５７３ＶおよびＪＡＫ１ Ｙ６５２Ｄの突然変異型がＮＫＴＣＬ患者で同定されて、ＪＡＫ３突然変異型の有病率は３５．４％であることが確認された。ＪＡＫ３ Ａ５７２Ｖ突然変異を有する突然変異型ＮＫＴＣＬ細胞株は、ＩＬ−２非依存性の生育および構成的なＪＡＫ３とＳＴＡＴ５のリン酸化を示し、対応する核酸ドメインにおける突然変異に関する発がんの役割を示唆した。インビトロの試験は、ｐａｎ−Ｊａｋ阻害剤がＮＫＴＣＬ患者の新規治療薬となり得ることを示唆する。ｐａｎ−ＪＡＫ−阻害剤であるＣＰ−６９０，５５０は、細胞の生存能力を低下させて、ＪＡＫ３野生型（ＫＨＹＧ−１）および突然変異型（ＮＫ−Ｓ１）細胞株の両方でアポトーシスを引き起こすことが示された。ＫＨＹＧ−１はＩＬ−２依存的なＮＫＴＣＬ細胞株であり、したがって、ｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤に対するその感受性。
［参考文献］

Claims (56)

  1. 対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／またはＮＫＴＣＬを診断するための方法であって、
    少なくとも１つのＪＡＫ遺伝子について、前記対象の遺伝子型を試験するステップを含み、
    ここで、突然変異型ＪＡＫ遺伝子の存在は、対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す、
    方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２遺伝子のうちの少なくとも１つについて、前記対象の遺伝子型を試験するステップを含むことを特徴とする、
    方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、
    ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１遺伝子のうちの少なくとも１つについて、前記対象の遺伝子型を試験するステップを含むことを特徴とする、
    方法。
  4. 先行する請求項のいずれか１つに記載の方法であって、
    野生型ＪＡＫ３遺伝子が配列番号１を含み、突然変異型ＪＡＫ３遺伝子が配列番号１のヌクレオチド１５７９２におけるＣとＴの置換および／またはヌクレオチド１５７９５におけるＣとＴの置換を含むことを特徴とする、
    方法。
  5. 先行する請求項のいずれか１つに記載の方法であって、野生型ＪＡＫ１遺伝子が配列番号３を含み、突然変異型遺伝子が配列番号３のヌクレオチド１２４８２３におけるＴとＧの置換を含むことを特徴とする、
    方法。
  6. 先行する請求項のいずれか１つに記載の方法であって、
    前記試験のために、前記対象由来の分離血液および／または細胞サンプルを準備するステップをさらに含むことを特徴とする、
    方法。
  7. 先行する請求項のいずれか１つに記載の方法であって、
    前記試験のために、前記対象、前記対象由来の分離血液および／または細胞サンプルから、核酸分子を分離するステップをさらに含むことを特徴とする、
    方法。
  8. 請求項７に記載の方法であって、
    前記の分離された核酸分子が、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを含むことを特徴とする、
    方法。
  9. 先行する請求項のいずれか１つに記載の方法であって、
    前記試験がゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡに対して行なわれることを特徴とする、
    方法。
  10. 請求項８または９に記載の方法であって、
    前記試験が、配列解析、制限断片長多型分析、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または逆転写ＰＣＲを含むことを特徴とする、
    方法。
  11. 対象でのナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の感受性を予測する、および／または、ＮＫＴＣＬを診断するための方法であって、
    前記対象が野生型または突然変異型ＪＡＫタンパク質を発現するかどうか試験するステップを含み、
    ここで、突然変異型ＪＡＫタンパク質の発現は、前記対象がＮＫＴＣＬを発症するリスクがある、および／またはＮＫＴＣＬを有することを示す、
    方法。
  12. 請求項１１に記載の方法であって、
    前記対象が、野生型および／またはＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２タンパク質のうちの少なくとも１つの突然変異型を発現するかどうか試験するステップを含むことを特徴とする、
    方法。
  13. 請求項１１または１２に記載の方法であって、
    前記対象が、野生型または突然変異型のＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１タンパク質を発現するかどうか試験するステップを含むことを特徴とする、
    方法。
  14. 請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、
    野生型ＪＡＫ３タンパク質が配列番号２を含み、前記突然変異型ＪＡＫ３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸５７２におけるＡとＶの置換および／またはアミノ酸５７３におけるＡとＶの置換を含むことを特徴とする、
    方法。
  15. 請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法であって、
    野生型ＪＡＫ１タンパク質が配列番号４を含み、前記突然変異型ＪＡＫ１タンパク質が、配列番号４のアミノ酸６５２におけるＹとＤの置換を含むことを特徴とする、
    方法。
  16. 請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記試験のために、前記対象由来の分離血液および／または細胞サンプルを準備するステップをさらに含むことを特徴とする、
    方法。
  17. 請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記試験のために、前記対象、前記対象由来の分離血液および／または細胞サンプルから、少なくとも１つのタンパク質を分離するステップをさらに含むことを特徴とする、
    方法。
  18. 請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記試験が、タンパク質配列決定および抗体検出法を含むことを特徴とする、
    方法。
  19. ＮＫＴＣＬを治療することが可能な薬剤をスクリーニングするための方法であって、
    以下のステップ：
    （ｉ）少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を含むＮＫＴＣＬ細胞株を準備するステップ；
    （ｉｉ）前記ＮＫＴＣＬ細胞株を前記薬剤に接触させるステップ；および
    （ｉｉｉ）哺乳類のＮＫＴＣＬ細胞株に対する、前記薬剤の効果を判定するステップ；
    を含み、
    ここで、前記薬剤が、前記ＮＫＴＣＬ細胞株の生存能力、生育および／または増殖を減少させる能力、および／または、前記ＮＫＴＣＬ細胞株のアポトーシスを増加させる能力は、薬剤がＮＫＴＣＬを治療する能力を示す、
    方法。
  20. 少なくとも１つのＪＡＫタンパク質の活性を低下させることが可能な薬剤をスクリーニングするための方法であって、以下のステップ：
    （ｉ）少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を保有するＮＫＴＣＬ細胞株を準備するステップ
    （ｉｉ）前記ＮＫＴＣＬ細胞株を前記薬剤に接触させるステップ；および
    （ｉｉｉ）前記ＮＫＴＣＬ細胞株に対する前記薬剤の効果を判定するステップ；
    を含み、
    ここで、前記薬剤が、細胞株の生存能力、生育および／または増殖を減少させる能力、および／または、細胞株のアポトーシスを増加させる能力は、候補薬剤が、少なくとも１つのＪＡＫタンパク質の活性を低下させる能力を示すことを特徴とする、
    方法。
  21. 請求項１９または２０に記載の方法であって、
    前記ＮＫＴＣＬ細胞株が、突然変異型ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２遺伝子のうちの少なくとも１つを保有することを特徴とする、
    方法。
  22. 請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＮＫＴＣＬ細胞株が、突然変異型ＪＡＫ３遺伝子および／または突然変異型ＪＡＫ１遺伝子を保有することを特徴とする、
    方法。
  23. 請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＮＫＴＣＬ細胞株が、以下のＪＡＫ突然変異：
    （ｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９２におけるＣとＴの置換；
    （ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９５におけるＣとＴの置換；および
    （ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１２４８２３におけるＴとＧの置換
    のうち少なくとも１つを保有することを特徴とする、
    方法。
  24. ＮＫＴＣＬ動物モデルであって、
    少なくとも１つの突然変異型ＪＡＫ遺伝子を含む、
    ＮＫＴＣＬ動物モデル
  25. 請求項２４に記載のＮＫＴＣＬ動物モデルであって、
    突然変異型ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２遺伝子のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、
    ＮＫＴＣＬ動物モデル。
  26. 請求項２４に記載のＮＫＴＣＬ動物モデルであって、
    突然変異型ＪＡＫ３遺伝子および／または突然変異型ＪＡＫ１遺伝子を含むことを特徴とする、
    ＮＫＴＣＬ動物モデル。
  27. 請求項２４から２６のいずれか一項に記載のＮＫＴＣＬ動物モデルであって、
    以下の突然変異：
    （ｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９２におけるＣとＴの置換；
    （ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド１５７９５におけるＣとＴの置換；または
    （ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１２４８２３におけるＴとＧの置換
    のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、
    ＮＫＴＣＬ動物モデル。
  28. ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）を治療する方法であって、
    少なくとも１つのＪＡＫ阻害剤を対象に投与するステップを含む、
    方法。
  29. 請求項２８に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２タンパク質のうちの少なくとも１つを阻害することを特徴とする、
    方法。
  30. 請求項２８または２９に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１を阻害することを特徴とする、
    方法。
  31. 請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤がＪＡＫ３を阻害することを特徴とする、
    方法。
  32. 請求項２９から３０のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤がＪＡＫ１を阻害することを特徴とする、
    方法。
  33. 請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０）および／または（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４）を含むことを特徴とする、
    方法。
  34. 請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０）を含むことを特徴とする、
    方法。
  35. 請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４）を含むことを特徴とする、
    方法。
  36. 請求項２８から３５のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記対象が哺乳類を含むことを特徴とする、
    方法。
  37. 請求項２８から３６のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記対象がヒトを含むことを特徴とする、
    方法。
  38. 請求項３７に記載の方法であって、
    前記対象が、ＪＡＫ３−Ａ５７２Ｖ、ＪＡＫ３−Ａ５７３Ｖおよび／またはＪＡＫ１−Ｙ６５２Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする、
    方法。
  39. ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療のための薬剤の調製のための、少なくとも１つのＪＡＫ阻害剤の使用。
  40. 請求項３９に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２タンパク質のうちの少なくとも１つを阻害することを特徴とする、
    使用。
  41. 請求項３９または４０に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ３を阻害することを特徴とする、
    使用。
  42. 請求項３９から４１のいずれか一項に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ３を阻害することを特徴とする、
    使用。
  43. 請求項３９から４１のいずれか一項に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ１を阻害することを特徴とする、
    使用。
  44. 請求項３９から４３のいずれか一項に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０）および／または（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４）を含むことを特徴とする、
    使用。
  45. 請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０）を含むことを特徴とする、
    使用。
  46. 請求項３９から４４のいずれか一項に記載の使用であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４）を含むことを特徴とする、
    使用。
  47. 請求項３９から４６のいずれか一項に記載の使用であって、
    前記薬剤が、ＪＡＫ３−Ａ５７２Ｖ、ＪＡＫ３−Ａ５７３ＶおよびＪＡＫ１−Ｙ６５２Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む対象でのＮＫＴＣＬの治療のための薬剤であることを特徴とする、
    使用。
  48. ナチュラルキラーＴ細胞リンパ腫（ＮＫＴＣＬ）の治療での使用のための、
    ＪＡＫ阻害剤。
  49. 請求項４８に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３および／またはＴＹＫ２タンパク質のうちの少なくとも１つを阻害することを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  50. 請求項４８または４９に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ３および／またはＪＡＫ１を阻害することを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  51. 請求項４８から５０のいずれか一項に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ３を阻害することを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  52. 請求項４８から５０のいずれか一項に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ１を阻害することを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  53. 請求項４８から５２のいずれか一項に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０）および／または（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４）を含むことを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  54. 請求項４８から５３のいずれか一項に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、３−［（３Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ］ピペリジン−１−イル］−３−オキソプロパンニトリル（ＣＰ−６９０，５５０）を含むことを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  55. 請求項４８から５３のいずれか一項に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＪＡＫ阻害剤が、（Ｅ）−２−シアノ−３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−（（Ｒ）−１−フェニルエチル）アクリルアミド（ＷＰ−１０３４）を含むことを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
  56. 請求項４８から５５のいずれか一項に記載のＪＡＫ阻害剤であって、
    前記ＮＫＴＣＬが、ＪＡＫ３−Ａ５７２Ｖ、ＪＡＫ３−Ａ５７３ＶおよびＪＡＫ１−Ｙ６５２Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む対象におけるものであることを特徴とする、
    ＪＡＫ阻害剤。
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